CN104826101A - 冻干人用狂犬病疫苗及其制备方法 - Google Patents
冻干人用狂犬病疫苗及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104826101A CN104826101A CN201510236934.XA CN201510236934A CN104826101A CN 104826101 A CN104826101 A CN 104826101A CN 201510236934 A CN201510236934 A CN 201510236934A CN 104826101 A CN104826101 A CN 104826101A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- vaccine
- freeze
- bioreactor
- rabies
- virus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
冻干人用狂犬病疫苗及其制备方法，涉及疫苗生产制备工艺领域，解决了现有只采用生物反应器生产狂犬疫苗存在的有效病毒抗原表达含量低、疫苗接种者副反应发生率高、疫苗产量和质量都达不到标准要求的问题。该疫苗是在Vero细胞上接种aG株狂犬病毒，依次经超滤浓缩、分离纯化、冻干后获得的；该疫苗的装量为0.5ml/剂；冻干时所用疫苗冻干保护剂的各成分及其终浓度为：海藻糖60～90g/l、谷氨酸钠6～14g/l、尿素3～6g/l、L-精氨酸2～3g/l、199培养基10g/l，该疫苗冻干保护剂中不含有明胶、人血白蛋白和右旋糖酐。本发明成本低、操作简单、不易污染，大幅度提高了疫苗的质量和产量，降低了疫苗内杂质的含量，不易发生过敏等反应，极大地提高了疫苗的安全性。
Description
技术领域
本发明属于疫苗生产制备工艺技术领域，具体涉及一种冻干人用狂犬病疫苗及其制备方法。
背景技术
狂犬病(Rabies)，是由狂犬病毒所致的自然疫源性或动物源性人畜共患急性传染病，流行性广、病死率极高，对人民生命健康造成严重威胁。狂犬病的典型临床表现为恐水症，故狂犬病又称恐水病。初期对声、光、风等刺激敏感而喉部有发紧感，进入兴奋期可表现为极度恐怖、恐水、怕风、发作性咽肌痉挛、呼吸困难等，最后痉挛发作停止而出现各种瘫痪，可迅速因呼吸和循环衰竭而死亡。狂犬病主要通过患病动物咬伤、抓伤或由粘膜感染引起，在特定的条件下还可通过呼吸道气溶胶传染，受染动物唾液内含狂犬病毒，传染动物主要是犬(超过90％)，其次是猫。
对犬进行严格管理、犬免疫或灭犬是控制人狂犬病的有效方法。目前对狂犬病尚无特殊有效的治疗方法，病死率几乎100％。狂犬病疫苗是一个历史悠久的疫苗，接种狂犬病疫苗后，人体血液中可出现抗狂犬病毒抗体，这些抗体可防止狂犬病毒在细胞间直接传播，减少狂犬病毒的增殖量，同时还能清除游离的狂犬病毒，阻止狂犬病毒的繁殖和扩散，从而达到预防狂犬病的目的。
目前狂犬病疫苗还存在着一些急需解决的问题。国内上市的狂犬病疫苗大多都含有明胶和右旋糖酐，大多数对狂犬病疫苗的接种过敏反应是由疫苗中作为保护剂的明胶所致，保护剂中的明胶成分也是疫苗内毒素的主要来源，可导致接种者产生发热反应，所以从保护剂中去除明胶已经成为业界共识。同时，右旋糖酐本身也是一种强有力的抗原，它存在于食糖中，并且在正常人的肠道里发现了可产生右旋糖酐的细菌。少部分人虽然从未接受过右旋糖酐的治疗，而循环中却存在着多糖的沉淀素，这就是为什么首次用药就能出现变态反应的原因。低分子右旋糖酐(如右旋糖酐40)过敏反应可在用药后半小时、几分钟甚至几秒钟内发生，来势凶猛，抢救难度大，用药量几滴到几毫升即可发生过敏性休克反应，甚至死亡。低分子右旋糖酐过敏反应的发生率为0.03％～4.70％，其过敏致死发生率较青霉素高2～4倍。在因抢救无效死亡的右旋糖酐过敏病例中，因过敏性休克引起的死亡占有相当大的比例。据国家药品不良反应监测中心发布的药品不良反应信息通报第3期中警惕“右旋糖酐40与过敏性休克”显示：右旋糖酐40、低分子右旋糖酐引起的可疑不良反应主要有皮疹、肺水肿、肾功能衰竭、过敏性休克等，其中过敏性休克53例，死亡10例。可见右旋糖酐的危险程度远远大于明胶，甚至接近于青霉素，已经上市的使用右旋糖酐作为保护剂的狂犬病疫苗制品，不良反应率均有一定程度的升高。现有的狂犬病疫苗冻干制品或含有明胶、或采用右旋糖酐替代了明胶，但至少含有上述两种成分中的一种。
近年来国内疫苗界普遍采用的细胞培养模式为“静止培养”和“转瓶培养”，缺点是劳动强度和占地空间大，不利于疫苗产量和质量的提高。目前，出现了只单纯采用生物反应器生产狂犬疫苗的方法，但是这种方法存在以下缺点：有效病毒抗原表达含量低、疫苗接种者副反应发生率高、疫苗产量和质量都达不到标准要求。目前，利用细胞工厂培养特定的细胞，再结合利用生物反应器接种特定的狂犬病毒株进行病毒连续培养和收获制备狂犬病疫苗，还未见报道。
发明内容
为了解决现有只采用生物反应器生产狂犬疫苗存在的有效病毒抗原表达含量低、疫苗接种者副反应发生率高、疫苗产量和质量都达不到标准要求的问题，本发明提供一种冻干人用狂犬病疫苗及其制备方法。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
本发明提供的一种冻干人用狂犬病疫苗，该疫苗是在Vero细胞上接种aG株狂犬病毒，依次经超滤浓缩、分离纯化、冻干后获得的；该疫苗的装量为0.5ml/剂；冻干时所用疫苗冻干保护剂的各成分及其终浓度为：海藻糖60～90g/l、谷氨酸钠6～14g/l、尿素3～6g/l、L-精氨酸2～3g/l、199培养基10g/l，该疫苗冻干保护剂中不含有明胶、人血白蛋白和右旋糖酐。
本发明的冻干人用狂犬病疫苗中不含有任何抗生素及防腐剂。
本发明还提供了上述的冻干人用狂犬病疫苗的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)毒种采用aG株狂犬病毒，培养基质采用Vero细胞；
(2)将复苏后的Vero细胞采用0.25％胰蛋白酶消化分散均匀，加入199培养液混合均匀后加入到细胞工厂中，置于37℃培养至均匀单层Vero细胞；所述细胞工厂采用美国Nunc或CORNING公司生产的细胞工厂；
(3)采用含10％新生牛血清的199培养液洗换生物反应器内的PBS溶液，生物反应器参数设定：温度37℃，转速50rpm，PH7.0，溶氧50％，待各参数稳定后，接种已消化分散均匀的单层Vero细胞，接种细胞数量即工作体积控制在2×105～5×105个/ml范围内；所述生物反应器采用美国NBS公司生产的14L固定床式BIOFLO CELLIGEN 310型生物反应器；
(4)根据Vero细胞的生长繁殖情况调整生物反应器的灌注量，当Vero细胞密度在2×107～4×107个/ml范围内时，接种aG株狂犬病毒；
(5)弃去生物反应器内细胞培养8～10天的细胞生长液，加入病毒生长液即含3％新生牛血清的199培养液，将工作种子批按0.025～0.125MOI接种于生物反应器内，连续灌注收获病毒液，生物反应器参数设定：温度35℃，转速90rpm，PH7.5，溶氧50％；
(6)接种aG株狂犬病毒后第二天开始采用不含有任何血清成分的199维持液连续收获病毒液，收获20天，取样做无菌检查及病毒滴定试验，置于2～8℃保存；
(7)将同批细胞生产的多次病毒液在无菌条件下合并，采用300KD超滤膜浓缩，浓缩后的病毒液中蛋白含量不超过20mg/ml，若超过该标准则需要进行稀释，再进行无菌检查；
(8)浓缩后的病毒液加入浓度为1:4000的β-丙内酯进行灭活，置于2～8℃连续振摇24小时，2～8℃放置7天使残余的β-丙内酯水解，病毒液灭活后分别取样进行灭活验证试验；
(9)将灭活后的病毒液经4000rpm离心30分钟，吸取上清液，采用柱色谱法进行纯化，色谱介质为琼脂糖凝胶Sepharose 4FF，采用PH7.4、浓度为0.01mol/L且含有0.14mol/L NaCl的PBS溶液洗脱，每次上样量不超过层析柱体积的5％，流速为100～170L/h，280nm紫外监测收集第一峰，起峰后当紫外监测数值升到0.1AU时开始收集，峰回落后当紫外监测数值降至0.1AU时结束收集，然后加入终浓度为1％的人血白蛋白，即获得冻干人用狂犬病疫苗原液，抽样做原液检定后，置于2～8℃保存；
(10)冻干人用狂犬病疫苗原液经检定合格后，根据测定的原液抗原量和蛋白质含量加入疫苗冻干保护剂进行稀释，成为疫苗半成品，然后采用低温真空冷冻干燥法进行分装冻干：导热油温度设定10℃，保持10℃进行疫苗半成品分装，分装结束后，冷冻干燥箱预冷冻至-45～-50℃，使制品温度达到-40℃以下保持至少2个小时，对后箱凝结器预冷至-50℃后，开始抽真空，真空控制设定为8Pa±2Pa，真空报警为18Pa，真空抽至10Pa以下进行第一阶段干燥即升华干燥，导热油温度先设定为-15℃，维持1个小时，然后导热油温度设定为-5℃，维持5个小时，当制品温度上升到导热油出口温度且冻干箱和凝结器的压力接近并维持不变时，在此基础上再维持1小时，以去除制品中的冰晶，然后进入第二阶段干燥即解析干燥，导热油温度设定为45℃，制品温度控制在32～35℃，维持5～7个小时后结束冻干，即制成冻干人用狂犬病疫苗；
所述疫苗冻干保护剂的各成分及其终浓度为：海藻糖60～90g/l、谷氨酸钠6～14g/l、尿素3～6g/l、L-精氨酸2～3g/l、199培养基10g/l，该保护剂中不含有明胶、人血白蛋白和右旋糖酐。
优选的，步骤(4)中，Vero细胞密度为3×107～4×107个/ml，更优选的，步骤(4)中，Vero细胞密度为3×107个/ml。
优选的，步骤(5)中，将工作种子批按0.05～0.125MOI接种于生物反应器内，更优选的，步骤(5)中，将工作种子批按0.1MOI接种于生物反应器内。
进一步的，步骤(10)中，所述疫苗冻干保护剂，采用以下方法制备：按照海藻糖60～90g/l、谷氨酸钠6～14g/l、尿素3～6g/l、L-精氨酸2～3g/l、199培养基10g/l的比例称取各物质，充分溶解于适量灭菌注射用水后，定容，采用1N盐酸调节PH值至7.2～7.4，除菌过滤，即得；置于2～8℃条件保存备用。
进一步的，步骤(9)中，所述层析柱采用美国GE公司生产的AKTA600。
本发明的有益效果是：
1、本发明的冻干人用狂犬病疫苗的制备方法，其制备过程中采用了细胞工厂(Cell Factories，美国Nunc或CORNING公司生产)和生物反应器(BIOFLO CELLIGEN 310型，美国NBS公司生产)，简化了工艺步骤、易于操作、节省原材料、减少操作污染。
2、采用细胞工厂(Cell Factories，美国Nunc或CORNING公司生产)进行细胞传代扩增，只改变培养模式，即可真正做到了既操作简便又节省空间，细胞工厂(Cell Factories，美国Nunc或CORNING公司生产)是采用先进的工艺对细胞培养表面进行科学处理，从而确保细胞粘附和生长的最佳条件，细胞培养密度大；采用结构紧密独立密闭系统，可控性好，操作简单，不易污染，适于工业化、规模化生产；显著提高空间利用率3倍以上，节约能耗。
3、采用14L固定床式型生物反应器(BIOFLO CELLIGEN 310，美国NBS公司生产)完成细胞培养、病毒接种、连续收获病毒液等工作。生物反应器使用固定篮筐将片状载体(disk)固定在生物反应器内，细胞粘附在片状载体(disk)上，在生物反应器独特的搅拌方式下使培养基流过片状载体，给细胞提供了所需的营养成份及氧气并带走细胞的代谢产物，使细胞处于相对静止状态，模拟了细胞最适宜的静止生长条件。细胞不像使用微载体培养的生物反应器，细胞粘附在微载体上并随其在生物反应器内上下悬浮，容易导致细胞之间的碰撞造成损伤。细胞在片状载体上所承受的剪切力非常小，这样就既能够保证细胞生长的数量同时也能够保证细胞的质量。14L固定床式型生物反应器可装填500g片状载体(disk)，展开面积达到60m2，细胞生长的数量可达到4×107，能够生产出高病毒滴度的病毒蛋白；良好的细胞质量也保证了在细胞被病毒感染后，减少了DNA及宿主蛋白的释放量，能够大幅度地提高疫苗的质量。
4、本发明的疫苗装量为0.5ml/剂，剂型为冻干注射剂，在保证疫苗效力的同时最大限度提高了疫苗的纯度，降低了疫苗内杂质的含量，从而降低了人体由于接种而引起不良反应的几率。
5、本发明在制备冻干人用狂犬病纯化疫苗的过程中，采用了Nunc或CORNING细胞工厂和生物反应器(BIOFLO CELLIGEN 310型，美国NBS公司生产)，同时在冻干时采用了一种不含明胶、人血白蛋白和右旋糖酐的疫苗冻干保护剂，通过上述方法制备的冻干人用狂犬病纯化疫苗，具有牛血清白蛋白残留量低、无抗生素、疫苗效力稳定，该保护剂中因为不含有大分子过敏原性成分，使疫苗更加安全有效，不易发生过敏及不会出现由于右旋糖酐引起的过敏性休克反应等严重异常反应，极大的提高了疫苗的安全性。
6、本发明制备的狂犬病疫苗在效价测定、热稳定性试验、残余水分含量、内毒素含量、牛血清白蛋白残留量、Vero细胞DNA残留量、Vero细胞蛋白质残留量等方面均达到或者不亚于现有的狂犬病疫苗，这得益于优化的工艺，要点是细胞经细胞工厂传代后接种生物反应器，感染后次日进行洗换后收获病毒液，操作简单，并且大幅度的降低了成本，有利于细胞病变的控制并能够大幅度提高病毒收获液的病毒滴度，从而有效提高疫苗的效力。
具体实施方式
以下通过实施例和对照实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1制备冻干人用狂犬病疫苗
(1)毒种采用aG株狂犬病毒，培养基质采用Vero细胞；
(2)将复苏后的Vero细胞采用0.25％胰蛋白酶消化分散均匀，加入199培养液混合均匀后加入到细胞工厂(Cell Factories，美国Nunc或CORNING公司)中，置于37℃培养至均匀单层Vero细胞；
(3)采用含10％新生牛血清的199培养液洗换生物反应器(BIOFLOCELLIGEN 310型，美国NBS公司生产)内的PBS溶液，生物反应器参数设定：温度37℃，转速50rpm，PH7.0，溶氧50％，待各参数稳定后，接种已消化分散均匀的单层Vero细胞，接种细胞数量(工作体积)控制在2×105个/ml为宜；
(4)根据Vero细胞的生长繁殖情况，适当调整生物反应器的灌注量，当Vero细胞密度为2×107个/ml时，接种aG株狂犬病毒；
(5)弃去生物反应器内细胞培养8～10天的细胞生长液，加入病毒生长液即含3％新生牛血清的199培养液，将工作种子批按0.125MOI接种于生物反应器内，连续灌注收获病毒液，生物反应器参数设定：温度35℃，转速90rpm，PH7.5，溶氧50％；
(6)接种aG株狂犬病毒后第二天开始采用不含有任何血清成分的199维持液连续收获病毒液，一般可收获20天左右，取样做无菌检查及病毒滴定试验，置于2℃保存；
(7)将同批细胞生产的多次病毒液在严格无菌的条件下合并为一批，采用300KD超滤膜浓缩，浓缩后的病毒液中蛋白含量不超过20mg/ml，若超过该标准则需要进行适当稀释，再进行无菌检查；
(8)浓缩后的病毒液加入浓度为1:4000的β-丙内酯进行灭活，置于8℃连续振摇24小时，6℃放置7天使残余的β-丙内酯水解，病毒液灭活后，每个病毒灭活容器应立即取样，分别进行灭活验证试验；
(9)将灭活后的病毒液经4000rpm离心30分钟，吸取上清液，采用柱色谱法进行纯化，色谱介质为琼脂糖凝胶Sepharose 4FF，采用PH7.4、浓度为0.01mol/L(含有0.14mol/L NaCl)的PBS溶液洗脱，每次上样量不超过层析柱(AKTA600，美国GE公司生产)体积的5％，流速为170L/h之间，280nm紫外监测收集第一峰(起峰后当紫外监测数值升到0.1AU时开始收集，峰回落后当紫外监测数值降至0.1AU时结束收集)，然后立即加入终浓度为1％的人血白蛋白，即获得冻干人用狂犬病疫苗原液，抽样做原液检定后，置于8℃保存；
(10)冻干人用狂犬病疫苗原液经检定合格后，根据测定的原液抗原量和蛋白质含量加入疫苗冻干保护剂进行稀释，成为疫苗半成品，并立即分装冻干，采用低温真空冷冻干燥法进行分装冻干：导热油温度设定10℃，保持10℃进行疫苗半成品分装，分装结束后，冷冻干燥箱预冷冻至-45～-50℃，使制品温度达到-40℃以下保持至少2个小时，对后箱凝结器预冷至-50℃后，开始抽真空，真空控制设定为8Pa，真空报警为18Pa，真空抽至10Pa以下进行第一阶段干燥即升华干燥，导热油温度先设定为-15℃，维持1个小时，然后导热油温度设定为-5℃，维持5个小时，当制品温度上升到导热油出口温度且冻干箱和凝结器的压力接近并维持不变时，在此基础上再维持1小时，以彻底去除制品中的冰晶，然后进入第二阶段干燥即解析干燥，导热油温度设定为45℃，制品温度控制在35℃，维持5个小时后结束冻干，即制成冻干人用狂犬病疫苗；
所述疫苗冻干保护剂的各成分及其终浓度为：海藻糖60g/l、谷氨酸钠14g/l、尿素5g/l、L-精氨酸2g/l、199培养基10g/l，该保护剂中不含有明胶、人血白蛋白和右旋糖酐。
实施例2制备冻干人用狂犬病疫苗
(1)毒种采用aG株狂犬病毒，培养基质采用Vero细胞；
(2)将复苏后的Vero细胞采用0.25％胰蛋白酶消化分散均匀，加入199培养液混合均匀后加入到细胞工厂(Cell Factories，美国Nunc或CORNING公司)中，置于37℃培养至均匀单层Vero细胞；
(3)采用含10％新生牛血清的199培养液洗换生物反应器(BIOFLOCELLIGEN 310型，美国NBS公司生产)内的PBS溶液，生物反应器参数设定：温度37℃，转速50rpm，PH7.0，溶氧50％，待各参数稳定后，接种已消化分散均匀的单层Vero细胞，接种细胞数量(工作体积)控制在3×105个/ml范围内为宜；
(4)根据Vero细胞的生长繁殖情况，适当调整生物反应器的灌注量，当Vero细胞密度为3×107个/ml时，接种aG株狂犬病毒；
(5)弃去生物反应器内细胞培养8～10天的细胞生长液，加入病毒生长液即含3％新生牛血清的199培养液，将工作种子批按0.1MOI接种于生物反应器内，连续灌注收获病毒液，生物反应器参数设定：温度35℃，转速90rpm，PH7.5，溶氧50％；
(6)接种aG株狂犬病毒后第二天开始采用不含有任何血清成分的199维持液连续收获病毒液，一般可收获20天左右，取样做无菌检查及病毒滴定试验，置于4℃保存；
(7)将同批细胞生产的多次病毒液在严格无菌的条件下合并为一批，采用300KD超滤膜浓缩，浓缩后的病毒液中蛋白含量不超过20mg/ml，若超过该标准则需要进行适当稀释，再进行无菌检查；
(8)浓缩后的病毒液加入浓度为1:4000的β-丙内酯进行灭活，置于4℃连续振摇24小时，2℃放置7天使残余的β-丙内酯水解，病毒液灭活后，每个病毒灭活容器应立即取样，分别进行灭活验证试验；
(9)将灭活后的病毒液经4000rpm离心30分钟，吸取上清液，采用柱色谱法进行纯化，色谱介质为琼脂糖凝胶Sepharose 4FF，采用PH7.4、浓度为0.01mol/L(含有0.14mol/L NaCl)的PBS溶液洗脱，每次上样量不超过层析柱(AKTA600，美国GE公司生产)体积的5％，流速为150L/h之间，280nm紫外监测收集第一峰(起峰后当紫外监测数值升到0.1AU时开始收集，峰回落后当紫外监测数值降至0.1AU时结束收集)，然后立即加入终浓度为1％的人血白蛋白，即获得冻干人用狂犬病疫苗原液，抽样做原液检定后，置于6℃保存；
(10)冻干人用狂犬病疫苗原液经检定合格后，根据测定的原液抗原量和蛋白质含量加入疫苗冻干保护剂进行稀释，成为疫苗半成品，并立即分装冻干，采用低温真空冷冻干燥法进行分装冻干：导热油温度设定10℃，保持10℃进行疫苗半成品分装，分装结束后，冷冻干燥箱预冷冻至-45～-50℃，使制品温度达到-40℃以下保持至少2个小时，对后箱凝结器预冷至-50℃后，开始抽真空，真空控制设定为8Pa，真空报警为18Pa，真空抽至10Pa以下进行第一阶段干燥即升华干燥，导热油温度先设定为-15℃，维持1个小时，然后导热油温度设定为-5℃，维持5个小时，当制品温度上升到导热油出口温度且冻干箱和凝结器的压力接近并维持不变时，在此基础上再维持1小时，以彻底去除制品中的冰晶，然后进入第二阶段干燥即解析干燥，导热油温度设定为45℃，制品温度控制在34℃，维持6个小时后结束冻干，即制成冻干人用狂犬病疫苗；
所述疫苗冻干保护剂的各成分及其终浓度为：海藻糖70g/l、谷氨酸钠12g/l、尿素4g/l、L-精氨酸2g/l、199培养基10g/l，该保护剂中不含有明胶、人血白蛋白和右旋糖酐。
实施例3制备冻干人用狂犬病疫苗
(1)毒种采用aG株狂犬病毒，培养基质采用Vero细胞；
(2)将复苏后的Vero细胞采用0.25％胰蛋白酶消化分散均匀，加入199培养液混合均匀后加入到细胞工厂(Cell Factories，美国Nunc或CORNING公司)中，置于37℃培养至均匀单层Vero细胞；
(3)采用含10％新生牛血清的199培养液洗换生物反应器(BIOFLOCELLIGEN 310型，美国NBS公司生产)内的PBS溶液，生物反应器参数设定：温度37℃，转速50rpm，PH7.0，溶氧50％，待各参数稳定后，接种已消化分散均匀的单层Vero细胞，接种细胞数量(工作体积)控制在4×105个/ml范围内为宜；
(4)根据Vero细胞的生长繁殖情况，适当调整生物反应器的灌注量，当Vero细胞密度为3.5×107个/ml时，接种aG株狂犬病毒；
(5)弃去生物反应器内细胞培养8～10天的细胞生长液，加入病毒生长液即含3％新生牛血清的199培养液，将工作种子批按0.05MOI接种于生物反应器内，连续灌注收获病毒液，生物反应器参数设定：温度35℃，转速90rpm，PH7.5，溶氧50％；
(6)接种aG株狂犬病毒后第二天开始采用不含有任何血清成分的199维持液连续收获病毒液，一般可收获20天左右，取样做无菌检查及病毒滴定试验，置于6℃保存；
(7)将同批细胞生产的多次病毒液在严格无菌的条件下合并为一批，采用300KD超滤膜浓缩，浓缩后的病毒液中蛋白含量不超过20mg/ml，若超过该标准则需要进行适当稀释，再进行无菌检查；
(8)浓缩后的病毒液加入浓度为1:4000的β-丙内酯进行灭活，置于2℃连续振摇24小时，8℃放置7天使残余的β-丙内酯水解，病毒液灭活后，每个病毒灭活容器应立即取样，分别进行灭活验证试验；
(9)将灭活后的病毒液经4000rpm离心30分钟，吸取上清液，采用柱色谱法进行纯化，色谱介质为琼脂糖凝胶Sepharose 4FF，采用PH7.4、浓度为0.01mol/L(含有0.14mol/L NaCl)的PBS溶液洗脱，每次上样量不超过层析柱(AKTA600，美国GE公司生产)体积的5％，流速为130L/h之间，280nm紫外监测收集第一峰(起峰后当紫外监测数值升到0.1AU时开始收集，峰回落后当紫外监测数值降至0.1AU时结束收集)，然后立即加入终浓度为1％的人血白蛋白，即获得冻干人用狂犬病疫苗原液，抽样做原液检定后，置于4℃保存；
(10)冻干人用狂犬病疫苗原液经检定合格后，根据测定的原液抗原量和蛋白质含量加入疫苗冻干保护剂进行稀释，成为疫苗半成品，并立即分装冻干，采用低温真空冷冻干燥法进行分装冻干：导热油温度设定10℃，保持10℃进行疫苗半成品分装，分装结束后，冷冻干燥箱预冷冻至-45～-50℃，使制品温度达到-40℃以下保持至少2个小时，对后箱凝结器预冷至-50℃后，开始抽真空，真空控制设定为8Pa，真空报警为18Pa，真空抽至10Pa以下进行第一阶段干燥即升华干燥，导热油温度先设定为-15℃，维持1个小时，然后导热油温度设定为-5℃，维持5个小时，当制品温度上升到导热油出口温度且冻干箱和凝结器的压力接近并维持不变时，在此基础上再维持1小时，以彻底去除制品中的冰晶，然后进入第二阶段干燥即解析干燥，导热油温度设定为45℃，制品温度控制在33℃，维持7个小时后结束冻干，即制成冻干人用狂犬病疫苗；
所述疫苗冻干保护剂的各成分及其终浓度为：海藻糖80g/l、谷氨酸钠10g/l、尿素3g/l、L-精氨酸2g/l、199培养基10g/l，该保护剂中不含有明胶、人血白蛋白和右旋糖酐。
实施例4制备冻干人用狂犬病疫苗
(1)毒种采用aG株狂犬病毒，培养基质采用Vero细胞；
(2)将复苏后的Vero细胞采用0.25％胰蛋白酶消化分散均匀，加入199培养液混合均匀后加入到细胞工厂(Cell Factories，美国Nunc或CORNING公司)中，置于37℃培养至均匀单层Vero细胞；
(3)采用含10％新生牛血清的199培养液洗换生物反应器(BIOFLOCELLIGEN 310型，美国NBS公司生产)内的PBS溶液，生物反应器参数设定：温度37℃，转速50rpm，PH7.0，溶氧50％，待各参数稳定后，接种已消化分散均匀的单层Vero细胞，接种细胞数量(工作体积)控制在5×105个/ml范围内为宜；
(4)根据Vero细胞的生长繁殖情况，适当调整生物反应器的灌注量，当Vero细胞密度为4×107个/ml时，接种aG株狂犬病毒；
(5)弃去生物反应器内细胞培养8～10天的细胞生长液，加入病毒生长液即含3％新生牛血清的199培养液，将工作种子批按0.025MOI接种于生物反应器内，连续灌注收获病毒液，生物反应器参数设定：温度35℃，转速90rpm，PH7.5，溶氧50％；
(6)接种aG株狂犬病毒后第二天开始采用不含有任何血清成分的199维持液连续收获病毒液，一般可收获20天左右，取样做无菌检查及病毒滴定试验，置于8℃保存；
(7)将同批细胞生产的多次病毒液在严格无菌的条件下合并为一批，采用300KD超滤膜浓缩，浓缩后的病毒液中蛋白含量不超过20mg/ml，若超过该标准则需要进行适当稀释，再进行无菌检查；
(8)浓缩后的病毒液加入浓度为1:4000的β-丙内酯进行灭活，置于6℃连续振摇24小时，4℃放置7天使残余的β-丙内酯水解，病毒液灭活后，每个病毒灭活容器应立即取样，分别进行灭活验证试验；
(9)将灭活后的病毒液经4000rpm离心30分钟，吸取上清液，采用柱色谱法进行纯化，色谱介质为琼脂糖凝胶Sepharose 4FF，采用PH7.4、浓度为0.01mol/L(含有0.14mol/L NaCl)的PBS溶液洗脱，每次上样量不超过层析柱(AKTA600，美国GE公司生产)体积的5％，流速为100L/h之间，280nm紫外监测收集第一峰(起峰后当紫外监测数值升到0.1AU时开始收集，峰回落后当紫外监测数值降至0.1AU时结束收集)，然后立即加入终浓度为1％的人血白蛋白，即获得冻干人用狂犬病疫苗原液，抽样做原液检定后，置于2℃保存；
(10)冻干人用狂犬病疫苗原液经检定合格后，根据测定的原液抗原量和蛋白质含量加入疫苗冻干保护剂进行稀释，成为疫苗半成品，并立即分装冻干，采用低温真空冷冻干燥法进行分装冻干：导热油温度设定10℃，保持10℃进行疫苗半成品分装，分装结束后，冷冻干燥箱预冷冻至-45～-50℃，使制品温度达到-40℃以下保持至少2个小时，对后箱凝结器预冷至-50℃后，开始抽真空，真空控制设定为8Pa，真空报警为18Pa，真空抽至10Pa以下进行第一阶段干燥即升华干燥，导热油温度先设定为-15℃，维持1个小时，然后导热油温度设定为-5℃，维持5个小时，当制品温度上升到导热油出口温度且冻干箱和凝结器的压力接近并维持不变时，在此基础上再维持1小时，以彻底去除制品中的冰晶，然后进入第二阶段干燥即解析干燥，导热油温度设定为45℃，制品温度控制在32℃，维持5个小时后结束冻干，即制成冻干人用狂犬病疫苗；
所述疫苗冻干保护剂的各成分及其终浓度为：海藻糖90g/l、谷氨酸钠6g/l、尿素6g/l、L-精氨酸2g/l、199培养基10g/l，该保护剂中不含有明胶、人血白蛋白和右旋糖酐。
对照实施例1
采用传统3L转瓶工艺制备人用狂犬病疫苗。
对照实施例2
采用生物反应器工艺制备冻干人用狂犬病疫苗。
对照实施例3
购买的现有市面上其它厂家的冻干人用狂犬病疫苗。
将按照上述实施例1、2、3和4以及对照实施例1、2、3制备的冻干人用狂犬病疫苗进行检定结果比较，结果如下表所示：
由表中数据可以得出，本发明制备的狂犬病疫苗内毒素含量低和无抗生素且稳定性良好，安全有效，在效价测定、热稳定性试验、残余水分含量、内毒素含量、牛血清白蛋白残留量、Vero细胞DNA残留量、Vero细胞蛋白质残留量等方面均达到或者不亚于现有的狂犬病疫苗，这得益于优化的工艺，要点是细胞经细胞工厂传代后接种生物反应器，感染后次日进行洗换后收获病毒液，操作简单，并且大幅度的降低了成本，有利于细胞病变的控制并能够大幅度提高病毒收获液的病毒滴度，从而有效提高疫苗的效力。
本发明制备的狂犬病疫苗无抗生素，且不含有大分子过敏原性成分，不会出现由于右旋糖酐引起的过敏性休克反应等严重异常反应，极大的提高了疫苗的安全性。
Claims (9)
1.冻干人用狂犬病疫苗，其特征在于，该疫苗是在Vero细胞上接种aG株狂犬病毒，依次经超滤浓缩、分离纯化、冻干后获得的；该疫苗的装量为0.5ml/剂；冻干时所用疫苗冻干保护剂的各成分及其终浓度为：海藻糖60～90g/l、谷氨酸钠6～14g/l、尿素3～6g/l、L-精氨酸2～3g/l、199培养基10g/l，该疫苗冻干保护剂中不含有明胶、人血白蛋白和右旋糖酐。
2.根据权利要求1所述的冻干人用狂犬病疫苗，其特征在于，冻干人用狂犬病疫苗中不含有任何抗生素及防腐剂。
3.制备权利要求1所述的冻干人用狂犬病疫苗的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)毒种采用aG株狂犬病毒，培养基质采用Vero细胞；
(2)将复苏后的Vero细胞采用0.25％胰蛋白酶消化分散均匀，加入199培养液混合均匀后加入到细胞工厂中，置于37℃培养至均匀单层Vero细胞；所述细胞工厂采用美国Nunc或CORNING公司生产的细胞工厂；
(3)采用含10％新生牛血清的199培养液洗换生物反应器内的PBS溶液，生物反应器参数设定：温度37℃，转速50rpm，PH7.0，溶氧50％，待各参数稳定后，接种已消化分散均匀的单层Vero细胞，接种细胞数量即工作体积控制在2×105～5×105个/ml范围内；所述生物反应器采用美国NBS公司生产的14L固定床式BIOFLO CELLIGEN 310型生物反应器；
(4)根据Vero细胞的生长繁殖情况调整生物反应器的灌注量，当Vero细胞密度在2×107～4×107个/ml范围内时，接种aG株狂犬病毒；
(5)弃去生物反应器内细胞培养8～10天的细胞生长液，加入病毒生长液即含3％新生牛血清的199培养液，将工作种子批按0.025～0.125MOI接种于生物反应器内，连续灌注收获病毒液，生物反应器参数设定：温度35℃，转速90rpm，PH7.5，溶氧50％；
(6)接种aG株狂犬病毒后第二天开始采用不含有任何血清成分的199维持液连续收获病毒液，收获20天，取样做无菌检查及病毒滴定试验，置于2～8℃保存；
(7)将同批细胞生产的多次病毒液在无菌条件下合并，采用300KD超滤膜浓缩，浓缩后的病毒液中蛋白含量不超过20mg/ml，若超过该标准则需要进行稀释，再进行无菌检查；
(8)浓缩后的病毒液加入浓度为1:4000的β-丙内酯进行灭活，置于2～8℃连续振摇24小时，2～8℃放置7天使残余的β-丙内酯水解，病毒液灭活后分别取样进行灭活验证试验；
(9)将灭活后的病毒液经4000rpm离心30分钟，吸取上清液，采用柱色谱法进行纯化，色谱介质为琼脂糖凝胶Sepharose 4FF，采用PH7.4、浓度为0.01mol/L且含有0.14mol/L NaCl的PBS溶液洗脱，每次上样量不超过层析柱体积的5％，流速为100～170L/h，280nm紫外监测收集第一峰，起峰后当紫外监测数值升到0.1AU时开始收集，峰回落后当紫外监测数值降至0.1AU时结束收集，然后加入终浓度为1％的人血白蛋白，即获得冻干人用狂犬病疫苗原液，抽样做原液检定后，置于2～8℃保存；
(10)冻干人用狂犬病疫苗原液经检定合格后，根据测定的原液抗原量和蛋白质含量加入疫苗冻干保护剂进行稀释，成为疫苗半成品，然后采用低温真空冷冻干燥法进行分装冻干：导热油温度设定10℃，保持10℃进行疫苗半成品分装，分装结束后，冷冻干燥箱预冷冻至-45～-50℃，使制品温度达到-40℃以下保持至少2个小时，对后箱凝结器预冷至-50℃后，开始抽真空，真空控制设定为8Pa±2Pa，真空报警为18Pa，真空抽至10Pa以下进行第一阶段干燥即升华干燥，导热油温度先设定为-15℃，维持1个小时，然后导热油温度设定为-5℃，维持5个小时，当制品温度上升到导热油出口温度且冻干箱和凝结器的压力接近并维持不变时，在此基础上再维持1小时，以去除制品中的冰晶，然后进入第二阶段干燥即解析干燥，导热油温度设定为45℃，制品温度控制在32～35℃，维持5～7个小时后结束冻干，即制成冻干人用狂犬病疫苗；
所述疫苗冻干保护剂的各成分及其终浓度为：海藻糖60～90g/l、谷氨酸钠6～14g/l、尿素3～6g/l、L-精氨酸2～3g/l、199培养基10g/l，该保护剂中不含有明胶、人血白蛋白和右旋糖酐。
4.根据权利要求3所述的冻干人用狂犬病疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，Vero细胞密度为3×107～4×107个/ml。
5.根据权利要求4所述的冻干人用狂犬病疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，Vero细胞密度为3×107个/ml。
6.根据权利要求3所述的冻干人用狂犬病疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，将工作种子批按0.05～0.125MOI接种于生物反应器内。
7.根据权利要求6所述的冻干人用狂犬病疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，将工作种子批按0.1MOI接种于生物反应器内。
8.根据权利要求3所述的冻干人用狂犬病疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(10)中，所述疫苗冻干保护剂，采用以下方法制备：按照海藻糖60～90g/l、谷氨酸钠6～14g/l、尿素3～6g/l、L-精氨酸2～3g/l、199培养基10g/l的比例称取各物质，充分溶解于适量灭菌注射用水后，定容，采用1N盐酸调节PH值至7.2～7.4，除菌过滤，即得；置于2～8℃条件保存备用。
9.根据权利要求3所述的冻干人用狂犬病疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(9)中，所述层析柱采用美国GE公司生产的AKTA600。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510236934.XA CN104826101B (zh) | 2015-05-12 | 2015-05-12 | 冻干人用狂犬病疫苗及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510236934.XA CN104826101B (zh) | 2015-05-12 | 2015-05-12 | 冻干人用狂犬病疫苗及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104826101A true CN104826101A (zh) | 2015-08-12 |
| CN104826101B CN104826101B (zh) | 2015-12-09 |
Family
ID=53804542
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510236934.XA Active CN104826101B (zh) | 2015-05-12 | 2015-05-12 | 冻干人用狂犬病疫苗及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104826101B (zh) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106834239A (zh) * | 2017-01-20 | 2017-06-13 | 江苏中慧元通生物科技有限公司 | 一种无血清Vero细胞制备狂犬病疫苗原液的方法以及无血清狂犬病疫苗制品 |
| CN107583044A (zh) * | 2017-10-31 | 2018-01-16 | 山东亦度生物技术有限公司 | 一种人用狂犬病疫苗的免疫方法 |
| CN107760647A (zh) * | 2017-11-20 | 2018-03-06 | 大连雅立峰生物制药有限公司 | 一种制备人用狂犬病疫苗的方法 |
| CN110101864A (zh) * | 2019-05-31 | 2019-08-09 | 辽宁茂康源生物科技有限公司 | 一种无血清人用狂犬病疫苗的保护剂及其应用 |
| CN110274982A (zh) * | 2019-06-27 | 2019-09-24 | 中牧实业股份有限公司 | 狂犬病毒灭活抗原的定量检测方法 |
| CN110339351A (zh) * | 2019-08-22 | 2019-10-18 | 武汉科前生物股份有限公司 | 一种兽用狂犬病灭活疫苗的制备方法及该疫苗包含的稳定剂 |
| CN111770986A (zh) * | 2017-09-27 | 2020-10-13 | 尤尼沃尔塞尔斯股份公司 | 用于制备生物分子（如病毒疫苗）的系统和方法 |
| CN117756959A (zh) * | 2024-02-22 | 2024-03-26 | 北京民海生物科技有限公司 | 一种肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104258404A (zh) * | 2014-09-11 | 2015-01-07 | 长春长生生物科技股份有限公司 | 疫苗冻干保护剂、冻干水痘减毒活疫苗及其制备方法 |
| CN104357406A (zh) * | 2014-09-30 | 2015-02-18 | 施耐克江苏生物制药有限公司 | 狂犬病毒snk-ctn株及其应用 |
-
2015
- 2015-05-12 CN CN201510236934.XA patent/CN104826101B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104258404A (zh) * | 2014-09-11 | 2015-01-07 | 长春长生生物科技股份有限公司 | 疫苗冻干保护剂、冻干水痘减毒活疫苗及其制备方法 |
| CN104357406A (zh) * | 2014-09-30 | 2015-02-18 | 施耐克江苏生物制药有限公司 | 狂犬病毒snk-ctn株及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 汝东宇: "狂犬病疫苗病毒株aGV生物学特性研究及规模化培养", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 * |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106834239A (zh) * | 2017-01-20 | 2017-06-13 | 江苏中慧元通生物科技有限公司 | 一种无血清Vero细胞制备狂犬病疫苗原液的方法以及无血清狂犬病疫苗制品 |
| CN111770986A (zh) * | 2017-09-27 | 2020-10-13 | 尤尼沃尔塞尔斯股份公司 | 用于制备生物分子（如病毒疫苗）的系统和方法 |
| CN107583044A (zh) * | 2017-10-31 | 2018-01-16 | 山东亦度生物技术有限公司 | 一种人用狂犬病疫苗的免疫方法 |
| CN107760647A (zh) * | 2017-11-20 | 2018-03-06 | 大连雅立峰生物制药有限公司 | 一种制备人用狂犬病疫苗的方法 |
| CN110101864A (zh) * | 2019-05-31 | 2019-08-09 | 辽宁茂康源生物科技有限公司 | 一种无血清人用狂犬病疫苗的保护剂及其应用 |
| CN110274982A (zh) * | 2019-06-27 | 2019-09-24 | 中牧实业股份有限公司 | 狂犬病毒灭活抗原的定量检测方法 |
| CN110274982B (zh) * | 2019-06-27 | 2021-09-14 | 中牧实业股份有限公司 | 狂犬病毒灭活抗原的定量检测方法 |
| CN110339351A (zh) * | 2019-08-22 | 2019-10-18 | 武汉科前生物股份有限公司 | 一种兽用狂犬病灭活疫苗的制备方法及该疫苗包含的稳定剂 |
| CN110339351B (zh) * | 2019-08-22 | 2023-02-14 | 武汉科前生物股份有限公司 | 一种兽用狂犬病灭活疫苗的制备方法及该疫苗包含的稳定剂 |
| CN117756959A (zh) * | 2024-02-22 | 2024-03-26 | 北京民海生物科技有限公司 | 一种肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法 |
| CN117756959B (zh) * | 2024-02-22 | 2024-05-14 | 北京民海生物科技有限公司 | 一种肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104826101B (zh) | 2015-12-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104826101B (zh) | 冻干人用狂犬病疫苗及其制备方法 | |
| EP2330189B1 (en) | Method for large scale production of virus | |
| CN104258404B (zh) | 疫苗冻干保护剂、冻干水痘减毒活疫苗及其制备方法 | |
| CN104491855B (zh) | 一种大规模制备高产率、高纯度、高安全的口蹄疫全病毒颗粒标记疫苗的方法及其产品 | |
| CN107142249B (zh) | 一种全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的方法 | |
| CN107267466B (zh) | 一种大规模生产猪伪狂犬病灭活疫苗的方法 | |
| CN111471103A (zh) | 一种新冠病毒（2019-nCOV）的异源抗体及其制备方法 | |
| CN1970080A (zh) | 用悬浮的Vero细胞生产病毒疫苗的方法 | |
| CN101716341B (zh) | 一种人用二倍体细胞狂犬灭活疫苗及其制备方法 | |
| CN102190722B (zh) | 一种纯化重组人血白蛋白的方法 | |
| CN101352570B (zh) | 二倍体细胞狂犬疫苗及纯化狂犬疫苗的制备方法 | |
| CN106540249A (zh) | 一种禽流感(h5n1)或猪繁殖与呼吸综合征(prrs)病毒疫苗的抗原浓缩纯化方法 | |
| CN100333793C (zh) | 二倍体细胞狂犬疫苗及纯化狂犬疫苗，剂型冻干及水针 | |
| CN110257344B (zh) | 无动物源性和人源性成分的狂犬病疫苗的制备方法 | |
| EP2075005B1 (en) | Ipv-dpt vaccine | |
| CN109395074A (zh) | 一种乙型脑炎灭活疫苗冻干制剂及其制备方法 | |
| CN103160458A (zh) | 一种适合Vero细胞生长的低血清培养基 | |
| CN102671192A (zh) | 一种人二倍体细胞狂犬病疫苗及其制备方法 | |
| CN101352569A (zh) | 二倍体细胞乙型脑炎疫苗及纯化乙型脑炎疫苗的制备方法 | |
| CN115040656B (zh) | 狂犬疫苗冻干保护剂、应用和疫苗及其制备方法 | |
| CN102526729A (zh) | 病毒灭活处理的抗毒素血清制备工艺 | |
| CN111494615A (zh) | 用于预防新型冠状病毒的重组腺病毒基因疫苗的生产方法 | |
| CN102586195A (zh) | 一种利用Vero传代细胞制备禽流感病毒及其灭活疫苗的方法 | |
| CN116162601A (zh) | 一种流感病毒裂解疫苗的制备方法 | |
| CN111662881B (zh) | 新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒液及其生产方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C56 | Change in the name or address of the patentee | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 130103 Jilin province Changchun high tech Zone more Road No. 1615 Patentee after: Changchun Changsheng Life Sciences Limited Address before: 130103 Jilin province Changchun high tech Zone more Road No. 1615 Patentee before: Changchun Changsheng Life Sciences Limited |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20210531 Address after: 518000 Room 401, 29 Yangmen Industrial Zone, DAHAO community, Xili street, Nanshan District, Shenzhen City, Guangdong Province Patentee after: Jiangsheng (Shenzhen) biotechnology R & D Center Co.,Ltd. Address before: No.1615, Yueda Road, high tech Zone, Changchun City, Jilin Province Patentee before: CHANGCHUN CHANGSHENG BIO-TECHNOLOGY Co.,Ltd. |