CN106834239A - 一种无血清Vero细胞制备狂犬病疫苗原液的方法以及无血清狂犬病疫苗制品 - Google Patents

一种无血清Vero细胞制备狂犬病疫苗原液的方法以及无血清狂犬病疫苗制品 Download PDF

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Abstract

提供一种无血清Vero细胞制备狂犬病疫苗原液的方法。用无血清培养基培养Vero细胞，获得无血清培养基适应细胞株；利用无血清培养基适应细胞株，建立无血清Vero细胞种子库；利用无血清培养基适应细胞株，建立无血清人用狂犬病疫苗毒株工作种子库；使用无血清培养基复苏、培养、传代、扩增Vero细胞工作种子库细胞，作为生物反应器培养的基础细胞，细胞扩增后，应用生物反应器和微载体，使用无血清培养基，连续灌流培养高密度Vero细胞；接种狂犬病疫苗毒株工作种子库毒种后，进行生物反应器微载体无血清培养，在病毒扩增至高峰时，开始连续灌流收获病毒液，收获液病毒滴度，经澄清、超滤浓缩、灭活和纯化处理，得到无血清人用狂犬病疫苗原液。

Description

一种无血清Vero细胞制备狂犬病疫苗原液的方法以及无血清 狂犬病疫苗制品
技术领域
本发明涉及狂犬病疫苗原液的制备方法，尤其涉及用生物反应器微载体培养无血清Vero细胞制备狂犬病疫苗原液的方法以及无血清狂犬病疫苗制品。
背景技术
目前，大量生产人用狂犬病疫苗所利用的细胞基质包括原代细胞，如地鼠肾原代细胞(PHKCV)和鸡胚原代成纤维细胞(PCECV)等；连续传代细胞，如非洲绿猴肾细胞(Vero)和人二倍体细胞等。Vero细胞是世界卫生组织认可的疫苗生产细胞系。与用作疫苗生产的原代细胞、二倍体细胞和其他一些传代细胞基质相比较，Vero细胞具有可连续传代、生长速度快、遗传性状稳定，恶性转化程度低、生物安全性较高、培养条件要求不苛刻、易于在生物反应器实施大规模培养等优势。
作为贴壁成纤维细胞，Vero细胞对血清有依赖性，因为血清能为细胞的体外培养提供必要的生长因子，激素，细胞贴附因子和营养成分，现在中国大陆上市的Vero细胞基质的狂犬病疫苗都需要含血清培养基制备。
利用牛血清作为Vero细胞培养和疫苗制备的培养基补充成分,具有诸多不利因素：血清组分的复杂性和不确定性，导致血清生产批次间的质量差异，增加了病毒疫苗生产的不稳定性和产品质量控制的难度，影响着病毒疫苗的生产工艺和疫苗质量；血清中存在病毒(如朊病毒)等病原微生物污染的潜在风险，给疫苗的使用带来了不容忽视的安全隐患；血清对病毒有一定的抑制作用，特别是一些需要胰酶激活才能很好感染细胞的病毒(如轮状病毒等)，有血清培养基中的血清中和了胰酶，使病毒不能充分激活，从而降低了所收获病毒的滴度。由于以上情况，美国、欧盟和日本等发达国家已经全面停止在生物制药中应用血清，FDA将停止含血清细胞培养工艺生产的生物技术新药的申报受理。无血清培养已成为包括疫苗在内的生物技术药物生产的总趋势。
现有的无血清培养技术多停留在方瓶、转瓶和细胞工厂(多层静止瓶)水平。而方瓶、转瓶及细胞工厂作为培养容器，存在工艺参数不容易控制，无法实现细胞的高密度培养和获得较高滴度的病毒液，产品的均一性也得不到保证。因此，开发能够大规模生产的生物反应器微载体无血清培养Vero细胞人用狂犬病疫苗病毒原液的制备方法是十分必要的。
现有技术的缺陷可归纳成如下几点。
1.有血清疫苗生产不稳定、质量难以控制；
2.血清中潜在的病毒微生物有不安全隐患；
3.血清对病毒有一定的抑制作用，使用有血清培养基培养Vero细胞和制备病毒液，使病毒收获液滴度较低。
4.方瓶、转瓶及细胞工厂作为培养容器，不能很好地控制工艺参数，不利于细胞生长过程中的气体交换及营养充分供应，不能很好地控制工艺过程，无法实现细胞的高密度培养和获得较高滴度的病毒液，也难以实现产品的均一性。
发明内容
本发明的目的在于解决上述现有技术的缺陷，提供一种无血清培养Vero细胞狂犬病疫苗病毒原液的制备方法以及无血清狂犬病疫苗制品，制备出均一性好、滴度高、无血清成分和安全性高的无血清病毒性疫苗原液，为大规模生产无血清培养生产Vero细胞基质的人用狂犬病疫苗奠定基础。
本发明的第一技术方案为一种无血清Vero细胞制备狂犬病疫苗原液的方法，其特征在于，包含以下步骤，
步骤1.用无血清培养基培养Vero细胞，获得无血清培养基适应细胞株；
步骤2.利用获得的所述无血清培养基适应细胞株，建立无血清Vero细胞种子库；
步骤3.利用获得的所述无血清培养基适应细胞株，建立无血清人用狂犬病疫苗毒株工作种子库；
步骤4.使用无血清培养基复苏、培养、传代、扩增Vero细胞工作种子库细胞，作为生物反应器培养的基础细胞，细胞扩增后，应用生物反应器和微载体，使用无血清培养基，连续灌流培养高密度Vero细胞；
步骤5.接种狂犬病疫苗毒株工作种子库毒种后，进行生物反应器微载体无血清培养，在病毒扩增至高峰时，开始连续灌流收获病毒液，收获液病毒滴度，经澄清、超滤浓缩、灭活和纯化处理，得到无血清人用狂犬病疫苗原液。
第二技术方案基于第1技术方案，其特征在于，所述步骤2中，直接以无血清培养基复苏、培养和传代扩增所述无血清培养基适应细胞株，建立无血清Vero细胞主种子库和工作种子库。
第三技术方案基于第二技术方案，其特征在于，所述步骤3中，使用无血清培养基，复苏、传代和扩增所述无血清Vero细胞工作种子库细胞，接种人用狂犬病疫苗毒株，培养扩增后收获冻存，建立无血清人用狂犬病疫苗毒株主种子库，再以无血清人用狂犬病疫苗毒株主种子库毒种接种无血清Vero细胞工作种子库细胞，无血清培养扩增后收获冻存，建立无血清人用狂犬病疫苗毒株工作种子库。
第四技术方案基于第三技术方案，其特征在于，所述步骤4中，使用无血清培养基，复苏、传代和扩增所述无血清Vero细胞工作种子库细胞，作为生物反应器培养的基础细胞，称取适量微载体，加入无血清培养基平衡过夜，将收获的细胞转入到细胞接种瓶中，无菌连接细胞接种瓶和生物反应器，使用正压将细胞接种到罐内，补充无血清培养液至工作体积，调整生物反应器培养参数，细胞接种一定时间后，调整搅拌桨转速，开始灌流细胞扩增培养基，在细胞数量达到规定量时，做好接种病毒的准备。
第五技术方案基于第四技术方案，其特征在于，所述步骤5中，在微载体上满球率达80％以上，换液，取样进行细胞计数，按MOI0.001-0.01加入无血清培养基，进行载体上细胞与病毒的吸附，完成细胞对病毒的吸附之后，在病毒高峰到来时，用无血清培养基进行连续灌流并开始收获病毒液，载体上细胞数近10％左右，停止收获。
第六技术方案基于第三技术方案，其特征在于，所述步骤3中，从液氮中取出无血清Vero细胞工作种子库细胞,核对标签后立即放入38-40℃的温水中速溶；低速离心约3-5分钟后取出，无菌条件下，弃去冻存管中的上清液，用吸管加入适量无血清培养基轻轻吹打细胞沉淀后，吸出沉淀悬液置入一次性无菌中，补足无血清培养基，摇匀盖塞，并做好标记，将玻璃方瓶置于37℃恒温室静置培养48-96h，严格按照无菌操作，取适量的VP-SFM培养基，调节pH值为7.0～7.4，备用，
镜检细胞，无菌条件下操作，将玻璃方瓶内的旧培养液弃去，加入适量的0.125％胰酶溶液，使其浸润细胞面及瓶壁，待细胞面呈毛玻璃状态时，弃去消化液；使残余消化液继续作用，待细胞面疏松时，加入适量无血清培养基使细胞分散均匀，根据细胞量进行分种，补足无血清培养基，置37℃恒温室静置培养48-96h，将长至致密单层的细胞依上述方法消化，加入适量无血清培养基，混悬细胞，再次传代、扩增，使用无血清培养基使Vero细胞培养扩增至一定瓶数，接种狂犬病人用疫苗PV毒株毒种，35℃培养3天左右至病毒高峰，收获病毒液加入适当保护剂，分装至毒种瓶，于-80℃冻存，建立无血清培养狂犬病疫苗株PV病毒主种子库，取无血清培养Vero细胞工作种子库细胞1支或几支，使用无血清培养基，复苏并培养扩增至一定瓶数，分别接种无血清培养狂犬病疫苗PV株主种子库毒种，35℃培养3天左右至病毒高峰，收获病毒液加入保护剂，分装至毒种瓶，于-80℃冻存，建立无血清培养狂犬病疫苗PV株病毒工作种子库。
第七技术方案基于第四技术方案，其特征在于，所述步骤4中，使用无血清培养基，复苏、传代和扩增无血清Vero细胞工作种子库细胞，作为生物反应器培养的基础细胞，称取适量微载体，用0.05mol/L PBS浸泡，换液3～4次用PBS于4℃浸泡过夜，经高压灭菌后，载体以加液泵导入罐体内，加入无血清培养基平衡过夜，将收获的细胞转入到细胞接种瓶中，无菌连接细胞接种瓶和生物反应器，使用正压将细胞接种到罐内，补充无血清培养液至工作体积，调整生物反应器培养参数，细胞接种24小时后，调整搅拌桨转速，开始灌流细胞扩增培养基，每天取样镜下观察细胞生长状态，同时结合氧气消耗量和PH变化情况调整灌流量，当第6-7天细胞数量达到0.9-1.1×107个/ml时，做好接种病毒的准备。
第八技术方案基于第五技术方案，其特征在于，所述步骤5中，生物反应器微载体培养Vero细胞7天左右，待微载体上满球率达80％以上，换液，取样进行细胞计数，按MOI0.001-0.01加入无血清培养基，然后以25-30转/分钟进行载体上细胞与病毒的吸附，大约30-60分钟,温度33-35℃，吸附完成后，将搅拌桨转速调至50转/分钟，完成细胞对病毒的吸附之后，搅拌桨转速提至50-60转/分钟，温度35℃，每天取样镜下观察细胞病变情况，三天左右之后，病毒高峰到来，用无血清培养基进行连续灌流并开始收获病毒液，连续收获7-20天或10-20天病毒液之后，载体上细胞数近10％左右，停止收获。
第九技术技术方案基于第一至八中任一技术方案，其特征在于，所述步骤1中，利用由美国疾病预防控制中心提供的PV株建立无血清狂犬病疫苗毒株种子库。
第十技术方案为无血清狂犬病疫苗制品，其特征在于，所述无血清狂犬病疫苗制品由权利要求1至9中任一方法制得。
附图说明
图1为用生物反应器微载体无血清培养Vero细胞制备狂犬病疫苗病毒原液以及成品的工艺流程图；
图2为无血清Vero细胞工作库细胞状态的图；
图3为无血清Vero细胞工作库支原体检定结果及阳性对照(DNA染色法)的图；
图4为生物反应器微载体无血清培养Vero细胞贴壁及生长情况的图；
图5为狂犬病病毒接种后连续灌流生物反应器微载体无血清条件下的细胞病变情况的图；
图6为狂犬病病毒抗原纯化凝胶层析图谱。
具体实施方式
以下对本发明的实施方式进行说明。在下述实施方式中描述的具体实施例仅作为示例性说明，不构成对本发明范围的限制。
首先，对本发明的技术方案进行说明。
利用从ATCC引进的CCL-81Vero细胞，直接用GIBCO公司生产的无血清培养基VP-SFM的培养，获得无血清培养基适应细胞株。
再此基础上建立无血清培养Vero细胞种子库和无血清病毒性疫苗毒株种子库。
使用无血清培养基VP-SFM对Vero细胞工作种子库细胞复苏、培养、传代、扩增。
细胞扩增后，应用NBS(New Brunswich Scientific)公司7.5L-50L生物反应器(Celligen 310或Celligen 310 Bioreactor System With Cell Lift Impeller)和由GE公司(General Electric Company)生产的微载体cytodex-1，以8-20g/L高密度微载体培养技术，使用无血清培养基，连续灌流培养高密度Vero细胞。通过这种方法，可达到1.5x107/毫升的细胞密度，约6-8天后，满球率大于85％。
接种狂犬病疫苗毒株工作种子库毒种(如狂犬病毒PV株、PM株、CTN株等毒株工作库毒种)，进行生物反应器微载体无血清培养，约3-5天后，病毒扩增至高峰时，开始连续灌流收获病毒液，收获液病毒滴度可达到8.0LD50/毫升以上。经澄清、超滤浓缩、灭活和纯化等步骤，制备无血清人用狂犬病疫苗原液。
图1为用生物反应器微载体无血清培养Vero细胞制备狂犬病疫苗病毒原液以及成品的工艺流程图
以下，根据图1的工艺流程图，对本发明的制备方法进行说明。
1.CCL-81Vero细胞在无血清培养基VP-SFM培养基中的适应
利用从ATCC引进的CCL-81Vero细胞，直接用GIBCO公司生产的无血清培养基VP-SFM的培养，获得无血清培养基适应细胞株。
2.建立无血清Vero细胞种子库
对ATCC引进的CCL-81Vero细胞，直接以VP-SFM无血清培养基复苏、培养和传代扩增。建立无血清Vero细胞主种子库和工作种子库。无血清Vero细胞工作种子库细胞状态见图2，支原体给定情况见图3
3.建立无血清病毒性疫苗毒株种子库
使用VP-SFM无血清培养基，复苏、传代和扩增无血清Vero细胞工作种子库细胞，接种人用狂犬病疫苗毒株(如狂犬病毒PV株、PM株、CTN株等毒株工作库毒种)，培养扩增后收获冻存，建立无血清人用狂犬病疫苗毒株主种子库，再以无血清人用狂犬病疫苗毒株主种子库毒种接种无血清Vero细胞工作种子库细胞，无血清培养扩增后收获冻存，建立无血清人用狂犬病疫苗毒株工作种子库。
4.用生物反应器微载体无血清培养基对Vero细胞的培养、扩增
4-1无血清Vero细胞工作种子库细胞的复苏、培养、和传代扩增
使用VP-SFM无血清培养基，复苏、传代和扩增无血清Vero细胞工作种子库细胞，作为生物反应器培养的基础细胞。
4-2微载体准备
称取适量微载体，用0.05mol/L PBS(pH 7.2)浸泡，换液3～4次。用PBS于4℃浸泡过夜。经高压灭菌后，载体以加液泵导入罐体内，加入无血清培养基平衡过夜。
4-3生物反应器微载体细胞培养
4-3-1细胞导入生物反应器及细胞贴壁
将收获的细胞转入到细胞接种瓶中，无菌连接细胞接种瓶和生物反应器，使用正压将细胞接种到罐内。补充无血清培养液至工作体积。调整生物反应器培养参数。
4-3-2生物反应器微载体无血清细胞培养
细胞接种24小时后，调整搅拌桨转速。开始灌流细胞扩增培养基。每天取样镜下观察细胞生长状态，同时结合氧气消耗量和PH变化情况调整灌流量。当第6-7天细胞数量达到0.9-1.1×107个/ml时，做好接种病毒的准备。
5.用无血清人用狂犬病疫苗毒株的生物反应器微载体无血清培养、扩增及病毒液收获
5-1生物反应器微载体培养细胞病毒接种、培养及病毒收获
5-1-1病毒接种
生物反应器微载体培养Vero细胞7天左右，待微载体上满球率达80％以上，换液，取样进行细胞计数，按MOI0.001-0.01加入无血清培养基，然后以25-30转/分钟进行载体上细胞与病毒的吸附，大约30-60分钟,温度33-35℃。吸附完成后，将搅拌桨转速调至50转/分钟。
5-2病毒培养及收获
完成细胞对病毒的吸附之后，搅拌桨转速提至50-60转/分钟，温度35℃。每天取样镜下观察细胞病变情况。三天左右之后，病毒高峰到来，用无血清培养基(VP-SFM)进行连续灌流并开始收获病毒液(狂犬病疫苗株、脊髓灰质炎病毒株等无需冻融细胞能够释放病毒的情况适合灌流培养)，一般情况下，连续收获7-20天或10-20天病毒液之后，载体上细胞数近10％左右，停止收获。可以对单次收获液进行无菌检查，支原体检查，病毒滴定，抗原含量检测。
6.病毒液的澄清和超滤浓缩(超滤浓缩)
以0.45-0.8μm进行深层过滤，以除去细胞碎片，然后用300KD-1000KD膜包,(5mmol/L磷酸盐，pH7.2，0.9％NaCl)，浓缩30-80倍。可以对浓缩液进行抗原、蛋白含量检测。
7.灭活
每1000ml超滤浓缩液按终浓度1/4000，加10％稀释的β-丙内酯2.5ml，充分摇匀，置4℃24小时。8.2置37℃2小时水解。之后可进行无菌检查,灭活效果验证。
8.纯化(凝胶层析)
浓缩并检定合格后的病毒液经index-20Sepharose 4FF琼脂糖凝胶柱层析进行纯化。每次上样量800ml～1500ml。根据紫外检测仪监测，通过记录仪直观反映相应峰形，及时收取，为纯化后原液。
9.原液配制
根据测定的蛋白质含量和抗原含量进行配制、除菌，将疫苗原液与稀释液混合，加入终浓度为1％人血白蛋白、5％乳糖、5％蔗糖、1.8％右旋糖酐、0.1％谷氨酸钠作稳定剂，即为原液。原液应置于2-8℃条件下保存备用。原液可进行无菌检查,灭活效果验证，蛋白含量检测，抗原含量检测。
10.半成品
原液经过配比和无菌检查后，形成半成品。
11.成品
半成品经过水分、外观、无菌检查鉴别试验、PH、效价、鉴别试验、Vero细胞DAN残留量检测、Vero细胞蛋白残留量检测、异常毒性、细菌内毒素、热稳定性试验、成为狂犬病疫苗制品。
以上是本发明的生物反应器微载体培养无血清Vero细胞制备狂犬病疫苗原液以及狂犬病疫苗制品的方法。
本发明的关键点和效果
1.由于使用无血清培养基培养Vero细胞和以Vero细胞为宿主的病毒来制备人用狂犬病疫苗：1)免除了动物源性血清(主要是牛血清)带来的安全性风险；2)剔除了血清对病毒生长的抑制，利于提高病毒滴度。
2.由于以生物反应器微载体培养Vero细胞和以Vero细胞为宿主的病毒来制备病毒性疫苗：1)工艺过程更加可控，产品均一性更好；2)由于使用生物反应器微载体培养细胞和病毒可以保证细胞的气体交换及营养成分供应，可以增加所培养细胞密度，提高所培养病毒的滴度。3)通过无血清培养与生物反应器微载体培养相结合，进行以Vero细胞为基质的病毒性疫苗的制备，能够制备出均一性好、高滴度、高质量和高安全性的无血清人用狂犬病疫苗原液，为大规模生产无血清培养基生产Vero细胞基质的人用狂犬病疫苗奠定基础。
3.生物反应器和无血清培养，增加了细胞培养密度，提高了病毒抗原滴度，细胞密度达到1.5-2×107cells/ml,使狂犬病疫苗PV株病毒原液滴度达到8.0LogLD50/mL。
4.疫苗终产品无需进行牛血清蛋白残留的检定。临床疫苗接种中不存在接种对象对牛血清过敏的不良反应，提高了最终产品的安全性。《药典》规定使用牛血清作为培养基辅助成分，则牛血清残留量不得超过50ng/ml，本发明产品不含牛血清，产品规程将不设定牛血清残留检定项目。
5.生物反应器微载体培养技术与无血清培养技术的结合，利于产品的质量控制，疫苗产品均一性更好。为生物反应器微载体无血清培养人用狂犬病疫苗的制备奠定了基础。
实施例
在实施例中，利用由美国疾病预防控制中心(CDC)提供的PV株建立无血清狂犬病疫苗毒株种子库。
在已经建立无血清Vero细胞主种子库和工作种子库的基础上，利用从美国疾病预防控制中心(CDC)提供的PV株建立无血清狂犬病疫苗毒株种子库。
使用无血清培养基VP-SFM对Vero细胞工作种子库细胞复苏、培养、传代、扩增。细胞扩增后，应用NBS(New Brunswich Scientific)公司7.5L生物反应器(Celligen 310Bioreactor System With Cell Lift Impeller)和由GE公司(General ElectricCompany)生产的微载体cytodex-1，以8-20g/L高密度微载体培养技术，使用无血清培养基，大规模连续灌流培养高密度Vero细胞。这种方法可达到1.5x107/毫升的细胞密度，约6-8天后，满球率大于85％，接种无血清狂犬病疫苗PV毒株工作种子库毒种进行无血清培养，约3天后，病毒扩增至高峰时，开始连续灌流收获病毒液，收获液病毒滴度达到7.5-8.5LD50/毫升以上，经澄清、超滤浓缩、灭活和纯化等步骤，制备无血清人用狂犬病疫苗原液。
具体实施方法如下
实验材料
1-1细胞和毒种：Vero细胞为无血清Vero细胞工作库细胞；毒种为美国疾病控制和预防中心提供的狂犬病病毒PV或PM疫苗毒株。
1-2主要试剂和耗材：VP-SFM无血清培养基和胰酶购自GIBCO公司；T75、T175、T225细胞培养瓶为CORNING公司产品；微载体cytodex-1、cytodex-3，由GE公司(GeneralElectric Company)生产。
1-3主要仪器设备：荧光倒置显微镜购自重庆光电有限公司，型号为IBE2003；倒置生物显微镜，型号XDS-1B，由上海蔡康光学仪器厂生产；电热恒温水浴锅购自上海精宏有限公司，型号为DK-8D；二氧化碳培养箱，型号MCO-20AIC，三洋公司生产；14L生物反应器，型号Celligen 310 Bioreactor System With Cell Lift Impeller为NBS(New BrunswichScientific)公司生产；洁净工作台：苏净安泰，型号：VS-1300L-U；酶标仪：MICRO PLATEREADER/BIO-RAD，型号：Mode 1550。
3.无血清狂犬病疫苗毒株种子库建立
3-1无血清狂犬病疫苗毒株主种子库的建立
3-1-1无血清Vero细胞工作种子库细胞的复苏及传代
从液氮中取出无血清Vero细胞工作种子库细胞,核对标签后立即放入38-40℃的温水中速溶(细胞必须在1～2分钟内完全溶解)；低速(1000rpm)离心约3-5分钟后取出。无菌条件下，弃去冻存管中的上清液，用吸管加入适量无血清培养基轻轻吹打细胞沉淀后，吸出沉淀悬液置入一次性无菌方瓶中，补足无血清培养基，摇匀盖塞，并做好标记。将玻璃方瓶置于37℃恒温室静置培养48-96h。严格按照无菌操作，取适量的VP-SFM培养基，调节pH值为7.0～7.4，备用。
镜检细胞，无菌条件下操作，将玻璃方瓶内的旧培养液弃去，加入适量的0.125％胰酶溶液(含0.04％EDTA-2Na)，使其浸润细胞面及瓶壁。待细胞面呈毛玻璃状态时，弃去消化液；使残余消化液继续作用，待细胞面疏松时，加入适量无血清培养基使细胞分散均匀，根据细胞量进行分种(1：2～4)，补足无血清培养基，置37℃恒温室静置培养48-96h。将长至致密单层的细胞依上述方法消化，加入适量无血清培养基，混悬细胞，再次传代、扩增。
3-1-2无血清狂犬病毒疫苗株主种子库的建立。
使用无血清培养基VP-SFM，使Vero细胞培养扩增至一定瓶数。接种从美国疾病控制和预防中心(CDC)引进的狂犬病人用疫苗PV毒株毒种，35℃培养3天左右至病毒高峰，收获病毒液加入适当保护剂，分装至毒种瓶，于-80℃冻存，建立无血清培养狂犬病疫苗株PV病毒主种子库。
3-2无血清狂犬病疫苗毒株工作种子库的建立
取无血清培养Vero细胞工作种子库细胞1支或几支，使用无血清VP-SFM培养基，复苏并培养扩增至一定瓶数，分别接种无血清培养狂犬病疫苗PV株主种子库毒种，35℃培养3天左右至病毒高峰，收获病毒液加入适当保护剂，分装至毒种瓶，于-80℃冻存，建立无血清培养狂犬病疫苗PV株病毒工作种子库。无血清培养狂犬病疫苗PV株病毒工作种子库病毒感染细胞情况及支原体检定情况分别见图4和图5。
4.生物反应器微载体无血清培养基对Vero细胞的培养、扩增
4-1无血清Vero细胞工作种子库细胞的复苏、培养、和传代扩增
4-1-1细胞复苏
将水浴箱温度调至38-40℃备用或准备40℃的注射用水备用。严格按照无菌操作，取适量的VP-SFM培养基，调整pH为7.0～7.4，备用。从工作细胞库中取出要复苏的细胞一支，核对标签后立即放入38-40℃的温水中速溶(细胞必须在1～2分钟内完全溶解)；低速(1000rpm)离心约3-5分钟后取出。无菌条件下，弃去冻存管中的上清液，用吸管加入适量生长液轻轻吹打细胞沉淀后，吸出沉淀悬液置入一次性无菌方瓶中，补足生长液，摇匀盖塞，并做好标记。将玻璃方瓶置于37℃恒温室静置培养48-96h。
4-1-2细胞传代与扩增
4-1-2-1严格按照无菌操作，取适量的VP-SFM培养基，调节pH值为7.0～7.4，备用。
4-1-2-2镜检细胞，无菌条件下操作，将玻璃方瓶内的旧培养液弃去，加入适量的0.125％胰酶溶液(含0.04％EDTA-2Na)，使其浸润细胞面及瓶壁。
4-1-2-3待细胞面呈毛玻璃状态时，弃去消化液；使残余消化液继续作用，待细胞面疏松时，加入适量生长液使细胞分散均匀，根据细胞量进行分种(1：2～4)，补足生长液，置37℃恒温室静置培养48-96h。
4-1-2-4将长至致密单层的细胞依上述方法消化，加入适量生长液，混悬细胞，取适量细胞悬液接种至细胞培养瓶中，补足无血清培养基至需要量，盖塞封口，置37℃恒温室6-8rph旋转培养48-96h。
4-1-2-5依上述方法扩增细胞至所需数量。
4-2微载体准备
4-2-1微载体处理
7.5L反应器工作体积5L，按载体投入量8-18g/L计算，称取适量微载体，用0.05mol/L PBS(pH 7.2)浸泡，搅拌几分钟，放置30min，弃上清，加入PBS，换液3～4次。用PBS于4℃浸泡过夜。将处理好的微载体倒能无菌通气且耐高压的PV桶中，与清洗好的反应器玻璃罐体(PH电极预先校正好)及其它附属管件同进行高压灭菌。
4-2-2载体平衡
经高压灭菌，待高压灭菌柜内室温度冷却至70℃以下后，取出反应器罐体和载体，安装生物反应器罐体，校正DO电极，载体以加液泵导入罐体内，加入无血清培养基，转速50转/分钟，温度37℃，PH7.2－7.6，DO20－60，平衡过夜。
4-3生物反应器微载体细胞培养
4-3-1细胞导入生物反应器及细胞贴壁
无菌连接细胞扩增培养基容器和生物反应罐，向7.5L罐内补充无血清培养基至3.0L。在百级超净台下，将收获的细胞转入到细胞接种瓶中，控制细胞悬液的体积，7.5L罐的种子细胞为2.0L。取样进行细胞计数，保证接种后的细胞密度不低于1.0-1.5×106个/ml。无菌连接细胞接种瓶和生物反应罐，使用正压将细胞接种到罐内。补充无血清培养液至5L工作体积。调整生物反应器培养参数：温度为37℃，DO20-60，通气量为0.5LPM，搅拌桨转速25-35转/分钟，温度37℃，PH7.2-7.6。在较慢转速条件下使细胞对载体贴壁，4-6个小时后，调整搅拌速度至50-60转/分钟，每天取样，观察微载体上细胞吸附和生长情况，并采用结晶紫方法计数细胞。生物应器微载体无血清培养Vero细胞贴壁及生长情况见图4。
4-3-2生物反应器微载体无血清细胞培养
4-3-2-1细胞接种24小时后，调整搅拌桨转速至50-60转/分钟。开始灌流细胞扩增培养基。
4-3-2-2培养基流加的速度取决于细胞的生长速率：通常第一天为2个罐体积，第二天为2.5个罐体积，第三天至第七天为3个罐体积。
4-3-2-3根据培养基使用进度，安排连接新的培养基储液灌和废液灌。
4-3-2-4在细胞培养的第1天、第4天、第6天和第7天从反应罐中取样，观察细胞生长状态，计算细胞数量。当第6-7天细胞数量达到0.9-1.1×107个/ml时，做好接种病毒的准备。
5.狂犬病病毒的生物反应器微载体无血清培养、扩增及病毒液收获
5-1生物反应器微载体培养细胞病毒接种
生物反应器微载体培养Vero细胞7天左右，待微载体上满球率达80％以上，换液，取样进行细胞计数，按MOI0.001-0.01加入无血清培养狂犬病疫苗PV株病毒工作种子库毒种，然后以25-30转/分钟进行载体上细胞与病毒的吸附，大约30-60分钟,温度33-35℃。吸附完成后，将搅拌桨转速调至50转/分钟。
5-2病毒培养及收获
完成细胞对病毒的吸附之后，搅拌桨转速提至50-60转/分钟，温度35℃。每天取样镜下观察细胞病变情况。三天左右之后，病毒高峰到来，用无血清培养基进行连续灌流并开始收获病毒液。一般情况下，连续收获7-20天病毒液之后，载体上细胞数近10％左右，停止收获。狂犬病病毒接种后连续灌流生物反应器微载体无血清条件下的细胞病变情况见图5。
6.病毒液的澄清及超滤浓缩(超滤浓缩)
以0.45-0.8μm进行深层过滤，以除去细胞碎片，然后用300KD-1000KD膜包,(5mmol/L磷酸盐，pH7.2，0.9％NaCl)，浓缩30-80倍
7.灭活
每1000ml超滤浓缩液按终浓度1/4000，加10％稀释的β-丙内酯2.5ml，充分摇匀，置4℃24小时。8.2置37℃2小时水解。取样做纯化前蛋白质含量测定、抗原含量测定。7.3病毒灭活情况及β-丙内酯水解情况验证。
8.纯化
8-1凝胶层析(纯化)
狂犬病疫苗为经浓缩并检定合格后的病毒液经index-20 Sepharose 4FF琼脂糖凝胶柱层析进行纯化。每次上样量800ml～1500ml。根据紫外检测仪监测，通过记录仪直观反映相应峰形，及时收取，为纯化后原液。取样做纯化后原液检定，杂蛋白去除率不低于99％。
狂犬病毒分子量为4.75×108，远远大于病毒培养液中的杂蛋白分子量。根据凝胶柱层析原理，病毒颗粒最先被洗脱下来，在样品蛋白浓度较小时，病毒与杂蛋白被彻底分开.但当样品蛋白浓度大于40mg/ml时。由于浓度过大使液体粘度增高，扩散速度降低，使正常的交换规律受阻，造成液流图形不规则，形成了扩散较大的区带，病毒尚未完全流出凝胶拄，后面的杂蛋白分子已追上来，致使纯化效果不佳。因此，用凝胶柱层析法纯化Vero细胞狂犬病疫苗，样品蛋白浓度应在40mg/ml以下。洗脱曲线见图6(第一个峰即为狂犬病毒所在位置)。
9.原液配制
根据测定的蛋白质含量和抗原含量进行配制、除菌，将疫苗原液与稀释液混合，加入终浓度为1％人血白蛋白、5％乳糖、5％蔗糖、1.8％右旋糖酐、0.1％谷氨酸钠作稳定剂，和终浓度不高于0.08mg/ml硫柳汞为防腐剂纯化原液加入终浓度为0.3％人血白蛋白作稳定剂，每1000ml原液中加5％的硫柳汞1.4ml为防腐剂，即为原液。原液应置于2-8℃条件下保存备用。
原液滴度检定
将单次病毒收获液作10倍系列稀释，每个稀释度脑内接种体重为11-13g小鼠4只，每只脑内接种0.03ml，观察14天，按相关公式计算LgLD50/ml。连续三批检定结果如下表。
四种培养形式3次连续批次的病毒滴度检测结果
小结
从滴度检定结果可以看出，连续三次生物反应器微载体无血清培养Vero细胞狂犬病PV株疫苗原液平均滴度为8.75lgLD50/mL，三批有血清反应器培养原液的平均滴度为7.75lgLD50/mL，三批有血清T225方瓶培养原液的平均滴度为6.83lgLD50/mL，三批有血清3L转瓶培养原液的平均滴度为7.25lgLD50/mL，表明无血清培养有利于病毒对细胞的感染，是滴度得以提高的因素之一，同时，反应器微载体培养形式，为细胞和病毒培养提供了良好的气体交换条件和充足的营养供应，是滴度提高的另外一个因素。
中华人民共和国药典(三部，2015年版)规定牛残不得超过50ng/ml，无血清疫苗产品检定项目中不设定牛血清残留蛋白检定，不仅减少了检定成本，也免除了临床使用产品时，个体对牛血清的过敏反应，提高了疫苗产品的安全性。
方瓶和转瓶培养，每个批次需要多个方瓶或转瓶，瓶和瓶这间的细胞生长状态及病毒培养状况不尽一致，收获病毒液时把同批的多瓶的病毒液合并算做一个批次，因此不同批间或有较大差异。生物反应器微载体培养，一个培养周期所收获的病毒液算作一个批次，由于培养条件一致，批间差较一，不仅能够对整个工艺过程进行良好的控制，产品批间差异也较小，产品均一性好。为大规模生产无血清培养生产Vero细胞基质的人用狂犬病疫苗奠定了基础。
以上对本发明的实施方式以及实施例进行了说明，制备时的各种条件以及参数并不是唯一的，本领域的技术人员可以根据其知识加以调整，疫苗毒株和无血清培养基等也可根据需要进行改变，这种调整和改变均属于本发明的范围之内。

Claims (10)

1.一种无血清Vero细胞制备狂犬病疫苗原液的方法，其特征在于，包含以下步骤，
步骤1.用无血清培养基培养Vero细胞，获得无血清培养基适应细胞株；
步骤2.利用获得的所述无血清培养基适应细胞株，建立无血清Vero细胞种子库；
步骤3.利用获得的所述无血清培养基适应细胞株，建立无血清人用狂犬病疫苗毒株工作种子库；
步骤4.使用无血清培养基复苏、培养、传代、扩增Vero细胞工作种子库细胞，作为生物反应器培养的基础细胞，细胞扩增后，应用生物反应器和微载体，使用无血清培养基，连续灌流培养高密度Vero细胞；
步骤5.接种狂犬病疫苗毒株工作种子库毒种后，进行生物反应器微载体无血清培养，在病毒扩增至高峰时，开始连续灌流收获病毒液，收获液病毒滴度，经澄清、超滤浓缩、灭活和纯化处理，得到无血清人用狂犬病疫苗原液。
2.根据权利要求1所述的一种无血清Vero细胞制备狂犬病疫苗原液的方法，其特征在于，
所述步骤2中，直接以无血清培养基复苏、培养和传代扩增所述无血清培养基适应细胞株，建立无血清Vero细胞主种子库和工作种子库。
3.根据权利要求2所述的一种无血清Vero细胞制备狂犬病疫苗原液的方法，其特征在于，
所述步骤3中，使用无血清培养基，复苏、传代和扩增所述无血清Vero细胞工作种子库细胞，接种人用狂犬病疫苗毒株，培养扩增后收获冻存，建立无血清人用狂犬病疫苗毒株主种子库，再以无血清人用狂犬病疫苗毒株主种子库毒种接种无血清Vero细胞工作种子库细胞，无血清培养扩增后收获冻存，建立无血清人用狂犬病疫苗毒株工作种子库。
4.根据权利要求3所述的一种无血清Vero细胞制备狂犬病疫苗原液的方法，其特征在于，
所述步骤4中，使用无血清培养基，复苏、传代和扩增所述无血清Vero细胞工作种子库细胞，作为生物反应器培养的基础细胞，称取适量微载体，加入无血清培养基平衡过夜，将收获的细胞转入到细胞接种瓶中，无菌连接细胞接种瓶和生物反应器，使用正压将细胞接种到罐内，补充无血清培养液至工作体积，调整生物反应器培养参数，细胞接种一定时间后，调整搅拌桨转速，开始灌流细胞扩增培养基，在细胞数量达到规定量时，做好接种病毒的准备。
5.根据权利要求4所述的一种无血清Vero细胞制备狂犬病疫苗原液的方法，其特征在于，
所述步骤5中，在微载体上满球率达80％以上，换液，取样进行细胞计数，按MOI0.001-0.01加入无血清培养基，进行载体上细胞与病毒的吸附，完成细胞对病毒的吸附之后，在病毒高峰到来时，用无血清培养基进行连续灌流并开始收获病毒液，载体上细胞数近10％左右，停止收获。
6.根据权利要求3所述的一种无血清Vero细胞制备狂犬病疫苗原液的方法，其特征在于，
所述步骤3中，从液氮中取出无血清Vero细胞工作种子库细胞,核对标签后立即放入38-40℃的温水中速溶；低速离心约3-5分钟后取出，无菌条件下，弃去冻存管中的上清液，用吸管加入适量无血清培养基轻轻吹打细胞沉淀后，吸出沉淀悬液置入一次性无菌方瓶中，补足无血清培养基，摇匀盖塞，并做好标记，将玻璃方瓶置于37℃恒温室静置培养48-96h，严格按照无菌操作，取适量的VP-SFM培养基，调节pH值为7.0～7.4，备用，
镜检细胞，无菌条件下操作，将玻璃方瓶内的旧培养液弃去，加入适量的0.125％胰酶溶液，使其浸润细胞面及瓶壁，待细胞面呈毛玻璃状态时，弃去消化液；使残余消化液继续作用，待细胞面疏松时，加入适量无血清培养基使细胞分散均匀，根据细胞量进行分种，补足无血清培养基，置37℃恒温室静置培养48-96h，将长至致密单层的细胞依上述方法消化，加入适量无血清培养基，混悬细胞，再次传代、扩增，使用无血清培养基使Vero细胞培养扩增至一定瓶数，接种狂犬病人用疫苗PV毒株毒种，35℃培养3天左右至病毒高峰，收获病毒液加入适当保护剂，分装至毒种瓶，于-80℃冻存，建立无血清培养狂犬病疫苗株PV病毒主种子库，取无血清培养Vero细胞工作种子库细胞1支或几支，使用无血清培养基，复苏并培养扩增至一定瓶数，分别接种无血清培养狂犬病疫苗PV株主种子库毒种，35℃培养3天左右至病毒高峰，收获病毒液加入保护剂，分装至毒种瓶，于-80℃冻存，建立无血清培养狂犬病疫苗PV株病毒工作种子库。
7.根据权利要求4所述的一种无血清Vero细胞制备狂犬病疫苗原液的方法，其特征在于，
所述步骤4中，使用无血清培养基，复苏、传代和扩增无血清Vero细胞工作种子库细胞，作为生物反应器培养的基础细胞，称取适量微载体，用0.05mol/L PBS浸泡，换液3～4次，用PBS于4℃浸泡过夜，经高压灭菌后，载体以加液泵导入罐体内，加入无血清培养基平衡过夜，将收获的细胞转入到细胞接种瓶中，无菌连接细胞接种瓶和生物反应器，使用正压将细胞接种到罐内，补充无血清培养液至工作体积，调整生物反应器培养参数，细胞接种24小时后，调整搅拌桨转速，开始灌流细胞扩增培养基，每天取样镜下观察细胞生长状态，同时结合氧气消耗量和PH变化情况调整灌流量，当第6-7天细胞数量达到0.9-1.1×107个/ml时，做好接种病毒的准备。
8.根据权利要求5所述的一种无血清Vero细胞制备狂犬病疫苗原液的方法，其特征在于，
所述步骤5中，生物反应器微载体培养Vero细胞7天左右，待微载体上满球率达80％以上，换液，取样进行细胞计数，按MOI0.001-0.01加入无血清培养基，然后以25-30转/分钟进行载体上细胞与病毒的吸附，大约30-60分钟,温度33-35℃，吸附完成后，将搅拌桨转速调至50转/分钟，完成细胞对病毒的吸附之后，搅拌桨转速提至50-60转/分钟，温度35℃，每天取样镜下观察细胞病变情况，三天左右之后，病毒高峰到来，用无血清培养基进行连续灌流并开始收获病毒液，连续收获7-20天或10-20天病毒液之后，载体上细胞数近10％左右，停止收获。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的一种无血清Vero细胞制备狂犬病疫苗原液的方法，其特征在于，
所述步骤1中，利用由美国疾病预防控制中心提供的PV株建立无血清狂犬病疫苗毒株种子库。
10.无血清狂犬病疫苗制品，其特征在于，所述无血清狂犬病疫苗制品由权利要求1至9中任一方法制得。
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