CN114026217A - 细胞回收方法及细胞培养装置 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种不需要离心机的细胞回收方法，以抑制对细胞的损害。当回收在含有液体培养基的至少一个容器中培养的并粘附在所述容器内表面的细胞时，执行培养基排出步骤(步骤S11)，其从所述容器中排出所述培养基；剥离液供应步骤(步骤S12)，其在排出所述培养基后，向所述容器供应用于从所述容器内表面剥离细胞的剥离液；剥离液排出步骤(步骤S14)，其在从所述容器内表面完全剥离所述细胞之前，从所述容器中排出所述剥离液；等待步骤(步骤S15)，其在所述剥离液排出之后，等待直到所述细胞在残留的剥离液的作用下被剥离；以及回收液供应步骤(步骤S16)，其在所述等待步骤完成之后，向所述容器供应用于回收细胞的回收液。

Description

细胞回收方法及细胞培养装置
技术领域
本发明涉及一种细胞回收方法，用于回收在含有液体培养基的容器中培养并粘附在容器内表面的细胞，以及一种能够执行该细胞回收方法的细胞培养装置。
背景技术
当在含有液体培养基的容器中培养细胞时，容器中的细胞需要在培养过程中被转移到另一个容器中的传代培养(subculture)时或在培养完成后收获细胞时被回收。传统上，这种细胞回收操作是按以下方式进行的。也就是说，在排出容器中的培养基后，向容器中供应剥离液，在剥离液的作用下，粘附在容器内表面的细胞被剥离。接下来，将含有细胞的剥离液转移到离心管中，并通过离心机将离心管中的细胞与剥离液分离，从而回收细胞。
近年来，自动培养iPS细胞和ES细胞的细胞培养装置的发展得到了促进。然而，当离心机被引入到这样的细胞培养装置中时，会带来问题，即装置变得很大，成本增加。鉴于此，专利文献1中记载的细胞培养装置采用了一种不需要离心机的细胞回收方法。具体地说，在供应剥离液后，当细胞的粘附力减弱时，剥离液被排出，然后将培养基供入容器。细胞在这个时候被流动的培养基的力从容器的内表面剥离。这样就不需要将细胞从剥离液中分离出来，从而不需要离心机。
现有技术文件
专利文件
专利文献1：日本发明专利公开第2017-6058号
发明内容
本发明要解决的问题
然而，在专利文献1所述的细胞回收方法中，具有弱粘附力的细胞被流动的培养基的力从容器的内表面剥离。因此，对细胞施加了过大的力，这可能会损坏细胞。此外，在专利文件1中，细胞在剥离液的作用充分施加在细胞上之前就被剥离了。因此，被剥离的细胞是以附聚物的形式存在。因此，在细胞被回收后，通过让含有细胞的培养基(细胞悬浮液)通过管泵来破坏细胞附聚物。在这一步骤中，细胞也可能因被管泵处理而被损坏。
本发明考虑了上述事项，并提供了不需要离心机并能减少对细胞的损害的细胞回收方法的一些实施方式。
解决问题的手段
根据本发明的一个实施方式，提供了一种细胞回收方法，用于回收在含有液体培养基的至少一个容器中培养的并粘附在该容器的内表面上的细胞，该方法包括执行：培养基排出步骤，其从容器中排出液体培养基；剥离液供应步骤，其在液体培养基排出后，向容器供应用于从容器内表面剥离细胞的剥离液；剥离液排出步骤，其在从容器内表面完全剥离细胞之前，从容器中排出所述剥离液；等待步骤，其在剥离液排出之后，等待直到细胞在残留的剥离液的作用下被剥离；以及回收液供应步骤，其在所述等待步骤完成之后，向所述容器供应用于回收细胞的回收液。
在根据本发明的细胞回收方法中，在剥离液排出后，在等到细胞被残余剥离液的作用下被剥离后，供应回收液。因此，没有必要将细胞从剥离液中分离出来，而且有可能消除对离心机的需求。此外，由于该过程要等到细胞在残留剥离液的作用下被分离，因此没有必要在流动的回收液的作用下强行分离粘附在容器内表面的细胞。此外，由于细胞在残留剥离液的作用下被充分地相互分离，因此没有必要用管泵等来分解细胞附聚物。因此，根据本发明，有可能在消除对离心机的需求的同时，抑制对细胞的损害。
根据本发明的另一个实施方式，提供了一种被配置为执行上述细胞回收方法的细胞培养装置，包括：培养基供应/排出装置，配置为向容器供应液体培养基和从容器中排出液体培养基；剥离液供应/排出装置，配置为向容器供应剥离液和从容器中排出剥离液，回收液供应/排出装置，配置为向容器供应回收液和从容器中排出回收液；以及控制器，其中细胞回收方法通过控制器控制培养基供应/排出装置、剥离液供应/排出装置和回收液供应/排出装置的操作来执行。
根据本发明的细胞培养装置，上述的细胞回收方法可以在没有人工干预的情况下自动执行。
在根据本发明的细胞培养装置中，至少一个容器可以包括至少两个容器，至少两个容器可以通过连接路径连接，并且在至少两个容器中的一个容器中执行细胞回收方法后，通过向至少两个容器中的一个容器输入气体，可以将至少两个容器中的一个容器中含有细胞的回收液转移到至少两个容器中的另一个容器。
根据这样的配置，在将细胞悬浮液(含有细胞的回收液)从至少两个容器中的一个容器转移到至少两个容器中的另一个容器的传代培养过程中，可以不通过管泵等转移细胞悬浮液。因此，有可能抑制对细胞的损害。
附图说明
图1是示出根据本发明的实施方式的细胞培养装置的配置的示意性正视图。
图2是示出培养器配置的正视图。
图3是示出细胞培养装置内部形成的培养回路的图。
图4是示出传代培养的一系列流程的流程图。
图5是示出细胞回收操作的示意图。
具体实施方式
现在将参照附图详细描述本发明的实施方式。
(细胞培养装置的配置)
如图1所示，根据本实施方式的细胞培养装置1包括冷藏储存器2、加热器3、培养器4和控制器5。细胞培养装置1是根据输入并存储在控制器5中的数据来培养细胞的装置。在下面的描述中，前后方向被定义为垂直于图1中纸面的方向。
冷藏储存器2和加热器3是其中形成用于设置容纳介质或试剂的容器的架子的外壳。虽然没有显示，但冷藏储存器2和加热器3的前表面设有门，该门可以打开和关闭形成在外壳前表面的开口。冷藏储存器2设有冷却机构(未显示)，并且该冷却机构内部温度保持在低于室温的任意温度。加热器3设置在培养器4内，加热器3内的温度与培养器4内的温度基本相等。此外，管与设置在冷藏储存器2内的容器和设置在加热器3内的容器相连，使得容器内的液体可以通过管流出。容器内的液体可以通过后述泵102排出。容器的实例包括瓶子、袋子等。
如图1和图2所示，培养器4包括第一室11，包括其前表面上的第一开/关器21；第二室12，包括其前表面上的第二开/关器22和环境调节器13。第一开/关器21、第二开/关器22以及第一室11和第二室12的壁面是由隔热材料制成。因此，在第一开/关器21和第二开/关器22关闭的状态下，第一室11和第二室12内的温度保持不变。此外，如图2所示，在第一室11内安装了密闭容器50，在第二室12内安装了密闭容器60。密闭容器50和60的内部是无菌的。容器的实例包括烧瓶、多层容器、袋子，等等。此外，在本实施方式中，密闭容器50和60是由具有CO2渗透性的材料制成。然而，密闭容器50和60可以由不允许CO2通过的材料制成。此外，密闭容器60的体积比密闭容器50的体积大。这是因为当在密闭容器50中培养的、具有高浓度的细胞被转移到密闭容器60中并在密闭容器60中进一步培养时，密闭容器60中容纳的培养基的量需要大于密闭容器50中容纳的培养基的量。然而，密闭容器60的体积比密闭容器50的体积大并不是必须的。密闭容器60的体积可以小于或等于密闭容器50的体积。图2中的虚线部分表示某些部件被设置在第一室11和第二室12内。
环境调节器13包括内置的加热装置和CO2供应装置，并且可以根据控制器5发出的信号来调节第一室11和第二室12内的温度和CO2浓度。此外，用于检测温度和CO2浓度的传感器23被设置在第一室11和第二室12内。由传感器23检测的信息被输出到控制器5。用于调整其他内部环境的装置可以安装在环境调节器13中。在这种情况下，传感器23是也能检测其他内部环境的传感器。
进一步，如图2所示，培养器4包括用于将密闭容器50和密闭容器60相互连接的连接路径30，以及用于通过连接路径30在密闭容器50和密闭容器60之间移动细胞的驱动器40。连接路径30包括管71和搅拌器32，其内部保持在无菌状态。搅拌器32通过管71与密闭容器50和60连接。此外，驱动器40包括泵101和与泵101连接并在其中容纳气体的气罐33。气罐33通过管72与密闭容器50和60连接。气罐33中容纳的气体可以是例如CO2，也可以是另一种气体或由多种类型的气体组成的混合气体。在图2中，省略了一些管和泵的图示。
(培养回路)
图3显示了密闭培养回路70，该电路能够在密闭容器50和60内进行细胞培养，同时保持密闭容器50和60内的无菌状态。培养回路70除了上面已经描述的密闭容器50和60、搅拌器32和气罐33之外，还设有培养基容器34、剥离液容器35、废液容器36等。这些部件通过管71至74连接。下面，将进行详细描述。
搅拌器32通过管71与密闭容器50和60连接。在密闭容器50和搅拌器32之间的管71上设置有阀门V1，在密闭容器60和搅拌器32之间的管71上设置有阀门V2。此外，气罐33通过管72与密闭容器50和60连接。在密闭容器50和气罐33之间的管72上设置有阀门V3，在密闭容器60和气罐33之间的管72上设置有阀门V4。
培养基容器34和剥离液体容器35被设置在加热器3内部。培养基容器34容纳用于培养细胞的液体培养基。剥离液容器35容纳用于剥离粘附在密闭容器50和60的内表面的细胞的剥离液。虽然没有显示，但培养基容器34通过管与设置在冷藏储存器2内的培养基罐相连，且培养基从培养基罐适当地供应到培养基容器34。同样地，剥离液容器35通过管连接到设置在冷藏储存器2内部的剥离液罐，并且培养基从剥离液罐适当地被供应到剥离液容器35。
培养基容器34和剥离液容器35通过管73连接到密闭容器50和60以及搅拌器32。在培养基容器34和剥离液体容器35与密闭容器50和60以及搅拌器32之间的管73的部分中设置有泵102。阀门V5至V9被设置在管73上。阀门V5被设置在培养基容器34和泵102之间，以切换来自培养基容器34的培养基供应状态。阀门V6被设置在剥离液容器35和泵102之间，以切换来自剥离液容器35的剥离液的供应状态。阀门V7被设置在密闭容器50和泵102之间，以将培养基或剥离液的供应状态切换到密闭容器50。阀门V8被设置在密闭容器60和泵102之间，以将培养基或剥离液的供应状态切换到密闭容器60。阀门V9设置在搅拌器32和泵102之间，以将培养基或剥离液的供应状态切换到搅拌器32。
废液容器36是将废液从密闭容器50和60以及搅拌器32排出的容器。废液容器36由与外部空气相通的脱气器37构成。废液容器36内的气体通过脱气器37被释放到大气中。如有必要，可在脱气器37上安装止回阀、过滤器等。
废液容器36通过管74与密闭容器50和60以及搅拌器32连接。阀门V10至V12被设置在管74上。阀门V10设置在密闭容器50和泵103之间，以切换来自密闭容器50的废液的排出状态。阀门V11被设置在密闭容器60和泵103之间，以切换来自密闭容器60的废液的排出状态。阀门V12被设置在搅拌器32和泵103之间，以切换来自搅拌器32的废液的排出状态。如果来自密闭容器50和60的废液和搅拌器32在重力作用下到达废液容器36，则可以省略泵103。
(细胞回收操作)
作为根据本发明的细胞回收方法的实例，将参照图4和图5描述在传代培养时的操作，其中在密闭容器50中培养的细胞被转移到密闭容器60中。图4是显示传代培养的一系列流程的流程图，图5是显示细胞回收操作的示意图。在本实施方式中，控制器5自动控制泵101至103的驱动和阀门V1至V12的打开/关闭以自动进行传代培养。与培养和传代培养有关的各种条件由操作者事先输入到控制器5。在传代培养开始时，假定所有的阀门V1至V12都关闭，并且培养回路70的内部保持在无菌状态。
当从密闭容器50到密闭容器60进行传代培养时，首先，如图5的a所示，培养基M从密闭容器50中排出(步骤S11)。具体地说，控制器5打开阀门V10并驱动泵103将密闭容器50中的培养基M通过管74排出到废液容器36中。此时，细胞C粘附在密闭容器50的内表面。因此，细胞C不会和培养基M一起排出。当密闭容器50中的培养基M排出后，控制器5关闭阀门V10并停止泵103。
接下来，如图5的b所示，向密闭容器50供应剥离液L(步骤S12)。具体而言，控制器5通过打开阀门V6和V7并驱动泵102，将剥离液容器35中的剥离液L通过管73供应到密闭容器50。当向密闭容器50供应了预定量的剥离液体L时，控制器5关闭阀门V6和V7并停止泵102。
在向密闭容器50供应剥离液体L完成后，该过程在该状态下等待第一预定时间(步骤S13)。第一预定时间是直到粘附在密闭容器50的内表面上的细胞C进入即将被剥离液体L的化学作用完全剥离之前的状态的时间。第一预定时间根据细胞C的类型和剥离液体L的类型适当地确定，例如可以是大约2至3分钟。
当第一预定时间已过(步骤S13：YES)，如图5的c所示(步骤S14)，将剥离液体L从密闭的容器50中排出。具体来说，控制器5打开阀门V10并驱动泵103将密闭容器50中的剥离液L通过管74排出到废液容器36中。此时，细胞C粘附在密闭容器50的内表面。因此，细胞C不会与剥离液L一起排出。如果在剥离液L被排出之前将一些细胞C被剥离，它们可能与剥离液L一起排出。但是，如果有的话，这种细胞C非常少。在密闭容器50中的剥离液L被排出后，控制器5关闭阀门V10并停止泵103。
在剥离液体L从密闭容器50中排出后，该过程在该状态下等待第二预定时间(步骤S15)。在步骤S14中，剥皮液体L的全部量基本上从密闭容器50中排出。然而，在现实中，如图5的d所示，由于表面张力，残留的剥离液L粘附在密闭容器50的内表面和细胞C上。第二预定时间是直到通过步骤S13保持在即将被完全剥离之前的状态的细胞C被残留剥离液L的化学作用完全剥离为止的时间。第二预定时间根据细胞C的类型和剥离液体L的类型适当地确定，例如约为2至3分钟。
在第二预定时间已过(步骤S15：YES)，如图5的e所示(步骤S16)，向密闭的容器50供应新鲜的培养基M。具体来说，控制器5通过打开阀门V5和V7并驱动泵102，将培养基容器34中的培养基M通过管73供应到密闭容器50中。由于步骤S15，粘附在密闭容器50内表面的细胞C被完全剥离，细胞C处于解体状态，而不是附聚状态。因此，当供应液体培养基M时，密闭容器50中的细胞C与培养基M混合，形成细胞悬浮液S。由于残留的剥离液L是少量的，残留的剥离液L被所供应培养基M充分稀释，在以后的步骤中不会构成问题。在向密闭的容器50供应预定量的培养基M后，控制器5关闭阀门V5和V7并停止泵102。
接下来，密闭容器50中的细胞悬浮液S被移动到搅拌器32(步骤S17)。具体而言，控制器5打开阀门V1和V3并驱动泵101将气罐33中的CO2通过管72送入密闭容器50。结果，密闭容器50中的细胞悬浮液S通过管71移动到搅拌器32。在细胞悬浮液S移动到搅拌器32后，控制器5关闭阀门V1和V3并停止泵101。
随后，调整搅拌器32中的细胞悬浮液S的浓度(步骤S18)。具体而言，将少量的细胞悬浮液S，该细胞悬浮液S的浓度通过被搅拌器32搅拌而变得均匀，被带到细胞计数器(未示出)，在该细胞计数器测量细胞悬浮液S的浓度。根据这个测量结果，控制器5计算使细胞悬浮液S达到预定浓度所需的额外的培养基M的量。然后，控制器5打开阀门V5和V9，驱动泵102将预定量的培养基M从培养基容器34供应到搅拌器32。因此，容纳在搅拌器32中的细胞悬浮液S的浓度可以被调整到预定的水平。在向搅拌器32供应预定量的培养基M之后，控制器5关闭阀门V5和V9并停止泵102。
最后，搅拌器32中的浓度调整的细胞悬浮液S被移动到新的密闭容器60中(步骤S19)。具体而言，控制器5打开阀门V1至V3并驱动泵101将气罐33中的CO2通过密闭容器50送入搅拌器32。结果，搅拌器32中的细胞悬浮液S通过管71被移到密闭容器60中。在细胞悬浮液S被移动到密闭容器60中后，控制器5关闭阀门V1至V3，并停止泵101。这样就完成了传代培养。通过用新的密闭容器替换密闭容器50和60，可以重复传代培养。
当用新的密闭容器替换密闭容器50和60时，与密闭容器50和60相连的管、搅拌器32等可以替换成新的，或者管和搅拌器32等的内部可以替换成新的，或者在清洗其内部后可以重新使用。当更换密闭容器50和60时，密闭容器50和60从管上移走，同时在培养回路70内保持无菌状态，并将额外的新的密闭容器连接到管上的同时在额外的新的密闭容器内保持无菌状态。在这种情况下，例如可以使用诸如BioWelder(由日本Sartorius Stedim制造)或OPTA无菌连接器(由日本Sartorius Stedim制造)的焊接机。
上述传代培养操作中的步骤S11至S16对应于根据本发明的细胞回收方法。具体而言，步骤S11对应于本发明的培养基排出步骤，步骤S12对应于本发明的剥离液供应步骤，步骤S14对应于本发明的剥离液排出步骤，步骤S15对应于本发明的等待步骤，步骤S16对应于本发明的回收液供应步骤。此外，培养基M被用作本发明的回收液。进一步地，本发明的培养基供应/排出装置和回收液供应/排出装置包括培养基容器34、废液容器36、管73和74、泵102和103、阀门V5、V7、V8、V10和V11。此外，本发明的剥离液供应/排出装置包括剥离液容器35、废液容器36、管73和74、泵102和103、阀门V6、V7、V8、V10和V11。
(效果)
在本实施方式中，在剥离液L排出后，在等到细胞C被残留的剥离液L作用下被剥离后，供应作为回收液的培养基M。因此，没有必要将细胞C从剥离液L中分离出来，并且可以消除对离心机的需要。此外，由于该过程等到细胞C在残留剥离液L的作用下被分离，因此没有必要通过流动培养基M的力强行分离粘附在密闭容器50的内表面的细胞C。此外，由于残留剥离液L的作用使细胞C彼此充分分离，因此不需要用管泵等将细胞附聚物破碎。因此，根据本发明的实施方式，在消除对离心机的需求的同时，可以抑制对细胞C的损害。
在本实施方式中，根据本发明的细胞回收方法由控制器5适当地控制泵101至103的驱动和阀门V1至V12的开/关来执行。因此，根据本发明的细胞回收方法可以在没有人工干预的情况下自动执行。
在本实施方式中，至少两个密闭容器50和60通过连接路径30连接。在密闭容器50中执行根据本发明的细胞回收方法后，通过将气体(CO2)送入密闭容器50，密闭容器50中的细胞悬浮液S被转移到另一个密闭容器60中。根据这样的配置，在细胞悬浮液S从密闭容器50转移到密闭容器60的传代培养过程中，细胞悬浮液S可以在不通过管泵等的情况下转移。因此，可以抑制对细胞C的损害。
(其他实施方式)
现在将描述对上述实施方式做出各种改变的修改。
在上述实施方式中，已经描述了根据本发明的细胞回收方法被应用于传代培养时的操作的实例。或者，可以在培养完成后收获细胞时应用根据本发明的细胞回收方法。
在上述实施方式中，液体培养基被用作本发明的回收液。然而，回收液体的类型并不限于此。例如，如果在收获细胞时将冷冻液体作为细胞回收操作中的回收液体，那么在回收细胞后可以对细胞进行冷冻保存。
在上述实施方式中，根据本发明的细胞回收方法的每个步骤由控制器5自动执行。然而，至少一部分步骤可由操作者执行。
附图标记的说明
1：细胞培养装置
5：控制器
30：连接路径
50、60：密闭容器(容器)
C：细胞
M：培养基(回收液)
L：剥离液
S：细胞悬浮液

Claims (3)

1.一种细胞回收方法，用于回收在含有液体培养基的至少一个容器中培养的并粘附在所述容器内表面的细胞，所述方法包括执行：
培养基排出步骤，从所述容器中排出所述液体培养基；
剥离液供应步骤，在排出所述液体培养基后，向所述容器供应用于从所述容器内表面剥离所述细胞的剥离液；
剥离液排出步骤，在从所述容器内表面完全剥离所述细胞之前，从所述容器中排出所述剥离液；
等待步骤，在所述剥离液排出之后，等待直到所述细胞在残留的剥离液的作用下被剥离；以及
回收液供应步骤，在所述等待步骤完成之后，向所述容器供应用于回收所述细胞的回收液。
2.一种细胞培养装置，被配置为执行根据权利要求1所述的细胞回收方法，包括：
培养基供应/排出装置，被配置为向所述容器供应所述液体培养基和从所述容器中排出所述液体培养基；
剥离液供应/排出装置，被配置为向所述容器供应所述剥离液和从所述容器中排出所述剥离液；
回收液供应/排出装置，被配置为向所述容器供应所述回收液和从所述容器中排出所述回收液；以及
控制器，
其中，所述细胞回收方法通过所述控制器控制所述培养基供应/排出装置、所述剥离液供应/排出装置和所述回收液供应/排出装置的操作来执行。
3.根据权利要求2所述的细胞培养装置，其中，所述至少一个容器包括至少两个容器，并且所述至少两个容器通过连接路径连接，并且
其中，在所述至少两个容器中的一个容器中执行细胞回收方法后，通过向所述至少两个容器中的一个容器输入气体，将所述至少两个容器中的一个容器中含有细胞的回收液转移到所述至少两个容器中的另一个容器中。
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