KR20220024054A - 세포 회수 방법 및 세포 배양 장치 - Google Patents

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다이치 호리이
하루키 다케우치
요시마사 스다
유지 우라베
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신포니아 테크놀로지 가부시끼가이샤
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Abstract

원심 분리기가 불필요한 세포 회수 방법에 있어서 세포에의 대미지를 억제하는 것을 목적으로 한다. 액상의 배지가 들어 있는 용기 내에서 배양되어, 용기의 내면에 부착되어 있는 세포를 회수할 때 용기로부터 배지를 배출하는 배지 배출 공정(스텝 S11)과, 배지의 배출 후에, 세포를 용기의 내면으로부터 박리시키기 위한 박리액을 용기에 공급하는 박리액 공급 공정(스텝 S12)과, 세포가 용기의 내면으로부터 완전히 박리되기 전에, 박리액을 용기로부터 배출하는 박리액 배출 공정(스텝 S14)과, 박리액의 배출 후에, 박리액의 잔액의 작용에 의해 세포가 박리될 때까지 대기하는 대기 공정(스텝 S15)과, 대기 공정의 종료 후, 세포를 회수하기 위한 회수액을 용기에 공급하는 회수액 공급 공정(스텝 S16)을 실행한다.

Description

세포 회수 방법 및 세포 배양 장치
본 발명은, 액상의 배지가 들어 있는 용기 내에서 배양되어, 당해 용기의 내면에 부착되어 있는 세포를 회수하는 세포 회수 방법, 및 당해 세포 회수 방법을 실행 가능한 세포 배양 장치에 관한 것이다.
액상의 배지가 들어 있는 용기 내에서 세포를 배양할 경우, 배양 과정에서 세포를 다른 용기에 옮겨 담는 계대 시나, 배양 종료 후에 세포를 수확할 때는, 용기 내의 세포를 회수할 필요가 있다. 이러한 세포 회수 작업은, 종래, 다음과 같이 행하여지고 있었다. 즉, 용기 내의 배지를 배출하고 나서 박리액을 용기에 공급하여, 박리액의 작용에 의해 용기의 내면에 부착되어 있는 세포를 박리시킨다. 이어서, 세포를 포함하는 박리액을 원침관에 옮겨 담아, 원심 분리기에 의해 원침관 내의 세포와 박리액을 분리함으로써 세포를 회수하고 있었다.
근년, iPS 세포나 ES 세포의 배양을 자동으로 행하는 세포 배양 장치의 개발이 진행되고 있는데, 원심 분리기를 이러한 세포 배양 장치에 도입하면, 장치가 대형으로 됨과 함께 비용이 증대한다는 문제가 있었다. 그래서, 특허문헌 1에 기재된 세포 배양 장치에서는, 원심 분리기를 필요로 하지 않는 세포 회수 방법이 채용되어 있다. 구체적으로는, 박리액의 공급 후, 세포의 부착력이 약해진 시점에서 박리액을 배출하고, 계속해서 용기 내에 배지를 공급한다. 그리고, 이때의 배지가 흐르는 기세에 의해, 세포를 용기의 내면으로부터 박리하고 있다. 이렇게 함으로써, 세포를 박리액으로부터 분리할 필요가 없어지므로, 원심 분리기가 불필요하게 된다.
일본 특허 공개 제2017-6058호 공보
그러나, 특허문헌 1에 기재된 세포 회수 방법에서는, 부착력이 약해진 세포를 배지가 흐르는 기세에 의해 용기의 내면으로부터 박리시키고 있기 때문에, 세포에 무리한 힘이 가해져서, 세포에 대미지를 끼칠 우려가 있었다. 또한, 특허문헌 1에서는, 박리액의 작용이 충분히 미치기 전에 세포를 박리시키고 있으므로, 박리된 세포는 괴상으로 되어 있다. 이 때문에, 세포 회수 후에 세포를 포함하는 배지(세포 현탁액)를 튜브 펌프에 통과시킴으로써 세포 덩어리를 붕괴시키고 있다. 이 공정에서도, 세포가 튜브 펌프에서 훑어짐으로써, 세포에 대미지를 끼칠 우려가 있었다.
본 발명은, 상술한 과제를 감안하여, 원심 분리기가 불필요한 세포 회수 방법에 있어서 세포에의 대미지를 억제하는 것을 목적으로 한다.
본 발명에 따른 세포 회수 방법은, 액상의 배지가 들어 있는 용기 내에서 배양되어, 상기 용기의 내면에 부착되어 있는 세포를 회수하는 세포 회수 방법이며, 상기 용기로부터 상기 배지를 배출하는 배지 배출 공정과, 상기 배지의 배출 후에, 상기 세포를 상기 용기의 내면으로부터 박리시키기 위한 박리액을 상기 용기에 공급하는 박리액 공급 공정과, 상기 세포가 상기 용기의 내면으로부터 완전히 박리되기 전에, 상기 박리액을 상기 용기로부터 배출하는 박리액 배출 공정과, 상기 박리액의 배출 후에, 상기 박리액의 잔액의 작용에 의해 상기 세포가 박리될 때까지 대기하는 대기 공정과, 상기 대기 공정의 종료 후, 상기 세포를 회수하기 위한 회수액을 상기 용기에 공급하는 회수액 공급 공정을 실행하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 세포 회수 방법에서는, 박리액을 배출한 후, 박리액의 잔액의 작용에 의해 세포가 박리될 때까지 대기하고 나서, 회수액을 공급하도록 하고 있다. 이 때문에, 세포를 박리액으로부터 분리할 필요가 없어, 원심 분리기를 불필요로 할 수 있다. 또한, 박리액의 잔액의 작용으로 세포가 박리될 때까지 대기하고 있으므로, 용기의 내면에 부착되어 있는 세포를, 회수액이 흐르는 기세에 의해 무리하게 박리시킬 필요가 없다. 또한, 박리액의 잔액의 작용으로 세포가 충분히 흐트러진 상태로 되므로, 세포 덩어리를 튜브 펌프 등으로 붕괴시킬 필요가 없다. 따라서, 본 발명에 따르면, 원심 분리기를 요하지 않으면서, 세포에의 대미지를 억제할 수 있다.
본 발명에 따른 세포 배양 장치는, 상기 세포 회수 방법을 실행 가능한 세포 배양 장치이며, 상기 용기에 상기 배지를 급배하는 배지 급배 장치와, 상기 용기에 상기 박리액을 급배하는 박리액 급배 장치와, 상기 용기에 상기 회수액을 급배하는 회수액 급배 장치와, 제어부를 구비하고, 상기 제어부가, 상기 배지 급배 장치, 상기 박리액 급배 장치 및 상기 회수액 급배 장치의 동작을 제어함으로써, 상기 세포 회수 방법이 실행되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 세포 배양 장치에 의하면, 사람 손을 거치지 않고 자동으로 상기 세포 회수 방법을 실행할 수 있다.
본 발명에 따른 세포 배양 장치에 있어서, 적어도 2개의 상기 용기가 접속 경로를 통해서 접속되어 있어, 어떤 상기 용기에 있어서 상기 세포 회수 방법이 실행된 후, 상기 어떤 용기에 기체를 압송함으로써, 상기 어떤 용기 내의 상기 세포를 포함하는 상기 회수액이 다른 상기 용기에 옮겨 담겨지면 된다.
이와 같은 구성에 의하면, 세포 현탁액(세포를 포함하는 회수액)을 어떤 용기로부터 다른 용기로 옮겨 담는 계대 시에, 세포 현탁액을 튜브 펌프 등을 통과시키지 않고 옮겨 담을 수 있다. 따라서, 세포에의 대미지를 억제할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시 형태에 따른 세포 배양 장치의 구성을 도시한 개략 정면도이다.
도 2는 배양부의 구성을 도시하는 정면도이다.
도 3은 세포 배양 장치의 내부에 형성되는 배양 회로를 도시한 도면이다.
도 4는 계대의 일련 흐름을 나타내는 흐름도이다.
도 5는 세포 회수 작업을 도시하는 모식도이다.
이하, 본 발명의 적합한 실시 형태에 대해서 도면을 참조하면서 설명한다.
(세포 배양 장치의 구성)
본 실시 형태에 따른 세포 배양 장치(1)는, 도 1에 도시하는 바와 같이, 냉장 보존부(2)와, 가온부(3)와, 배양부(4)와, 제어부(5)를 포함하고 있다. 세포 배양 장치(1)는, 제어부(5)에 입력되어 보존된 데이터에 따라서 세포를 배양하는 장치이다. 또한, 이하의 설명에서, 도 1의 지면에 수직인 방향을 따라 전후 방향이 정의된다.
냉장 보존부(2) 및 가온부(3)는, 내부에 배지 또는 시약이 수용된 용기를 배치하는 선반이 형성된 하우징이다. 또한, 도시는 생략하지만, 냉장 보존부(2) 및 가온부(3)의 전방면에는, 하우징의 전방면에 마련된 개구를 개폐 가능한 도어가 마련되어 있다. 냉장 보존부(2)는, 냉각 기구(도시하지 않음)를 구비하여, 내부의 온도는 상온보다 낮은 임의의 온도로 유지되어 있다. 가온부(3)는, 배양부(4)의 내부에 배치되고, 가온부(3)의 내부의 온도는, 배양부(4)의 내부의 온도와 거의 동등하다. 또한, 냉장 보존부(2)의 내부에 배치된 용기 및 가온부(3)의 내부에 배치된 용기는, 내부의 액체가 유출 가능하게 되도록 튜브가 접속되어 있어, 후술하는 펌프(102)에 의해 유출 가능하다. 용기로서는, 보틀, 백 등을 들 수 있다.
배양부(4)는, 도 1 및 도 2에 도시하는 바와 같이, 전방면에 제1 개폐부(21)를 갖는 제1 방(11)과, 전방면에 제2 개폐부(22)를 갖는 제2 방(12)과, 환경 조정부(13)를 포함한다. 제1 방(11) 및 제2 방(12)의 벽면, 그리고, 제1 개폐부(21) 및 제2 개폐부(22)는 각각 단열재로 이루어진다. 이에 의해, 제1 방(11) 및 제2 방(12)의 내부의 온도는, 제1 개폐부(21) 및 제2 개폐부(22)가 폐쇄되어 있는 상태에서 일정하게 유지된다. 또한, 도 2에 도시하는 바와 같이, 제1 방(11)의 내부에는 밀폐 용기(50)가 설치되고, 제2 방(12)의 내부에는 밀폐 용기(60)가 설치되어 있다. 밀폐 용기(50 및 60)는 내부가 무균 상태이며, 용기로서는, 플라스크나 다층식 용기, 백 등을 들 수 있다. 또한, 본 실시 형태에 있어서, 밀폐 용기(50 및 60)는 CO2 투과성을 갖는 재질로 이루어진다. 단, 밀폐 용기(50 및 60)를, CO2를 투과하지 않는 재료로 구성해도 된다. 또한, 밀폐 용기(60)의 용적은, 밀폐 용기(50)의 용적보다도 크다. 이것은, 밀폐 용기(50)에서 배양되어 농도가 높아진 세포를, 밀폐 용기(60)에 옮겨서 더 배양할 경우, 밀폐 용기(60)에 수용되는 배지의 양은, 밀폐 용기(50)에 수용되는 배지의 양보다 많게 할 필요가 있기 때문이다. 단, 밀폐 용기(60)의 용적을 밀폐 용기(50)의 용적보다 크게 하는 것은 필수는 아니며, 밀폐 용기(60)의 용적이 밀폐 용기(50)의 용적보다 작아도 동일하여도 된다. 또한, 도 2에서의 점선 부분은, 제1 방(11) 및 제2 방(12)의 내부에 배치되어 있는 것을 의미한다.
환경 조정부(13)는, 가온 장치 및 CO2 공급 장치를 내장하고 있어, 제어부(5)로부터 보내진 신호에 따라서, 제1 방(11) 및 제2 방(12)의 내부의 온도 및 CO2 농도를 조정 가능하다. 또한, 제1 방(11) 및 제2 방(12)의 내부에는, 온도 및 CO2 농도를 검지하는 센서(23)가 배치되어 있다. 센서(23)가 검지한 정보는 제어부(5)에 출력된다. 또한, 환경 조정부(13)에는, 그 밖의 내부 환경을 조정하는 장치가 내장되어 있어도 된다. 이 경우, 센서(23)는, 그 밖의 내부 환경을 아울러 검지 가능한 센서이다.
또한, 배양부(4)는, 도 2에 도시하는 바와 같이, 밀폐 용기(50)와 밀폐 용기(60)를 서로 접속하는 접속 경로(30)와, 접속 경로(30)를 통해서 밀폐 용기(50)와 밀폐 용기(60)의 사이에서 세포를 이동시키는 구동부(40)를 구비하고 있다. 접속 경로(30)는, 함께 내부가 무균 상태인 튜브(71) 및 교반부(32)로 이루어진다. 교반부(32)는, 튜브(71)를 통해서 밀폐 용기(50 및 60)와 접속되어 있다. 또한, 구동부(40)는, 펌프(101)와, 펌프(101)에 접속되고, 내부에 기체가 수용된 가스 탱크(33)로 이루어진다. 가스 탱크(33)는, 튜브(72)를 통해서 밀폐 용기(50 및 60)와 접속되어 있다. 또한, 가스 탱크(33)의 내부에 수용된 기체는, 예를 들어 CO2를 들 수 있지만, 그 밖의 기체이어도 되며, 복수 종류의 기체로 이루어지는 혼합 기체이어도 된다. 또한, 도 2에서는, 일부의 튜브 및 펌프의 기재를 생략하고 있다.
(배양 회로)
도 3은, 밀폐 용기(50, 60)의 내부의 무균 상태를 유지하면서, 밀폐 용기(50, 60)의 내부에서의 세포의 배양을 가능하게 하는 폐쇄계의 배양 회로(70)를 도시한다. 배양 회로(70)에는, 이미 설명한 밀폐 용기(50, 60), 교반부(32) 및 가스 탱크(33) 이외에, 배지 용기(34), 박리액 용기(35) 및 폐액 용기(36) 등이 마련되어 있고, 이들 각 부가 튜브(71 내지 74)에 의해 접속된 구성으로 되어 있다. 이하, 상세하게 설명한다.
교반부(32)는, 튜브(71)를 통해서 밀폐 용기(50, 60)와 접속되어 있다. 튜브(71) 중, 밀폐 용기(50)와 교반부(32)의 사이에는 밸브(V1)가 배치되고, 밀폐 용기(60)와 교반부(32)의 사이에는 밸브(V2)가 배치되어 있다. 또한, 가스 탱크(33)는, 튜브(72)를 통해서 밀폐 용기(50, 60)와 접속되어 있다. 튜브(72) 중, 밀폐 용기(50)와 가스 탱크(33)의 사이에는 밸브(V3)가 배치되고, 밀폐 용기(60)와 가스 탱크(33)의 사이에는 밸브(V4)가 배치되어 있다.
배지 용기(34) 및 박리액 용기(35)는, 가온부(3)의 내부에 배치되어 있다. 배지 용기(34)에는, 세포를 배양하기 위한 액상 배지가 수용되어 있다. 박리액 용기(35)에는, 밀폐 용기(50, 60)의 내면에 부착되어 있는 세포를 박리시키기 위한 박리액이 수용되어 있다. 도시는 생략하지만, 배지 용기(34)는, 튜브를 통해서 냉장 보존부(2)의 내부에 배치된 배지 탱크와 접속되어 있어, 적절히, 배지 탱크로부터 배지 용기(34)에 배지가 공급된다. 마찬가지로, 박리액 용기(35)는, 튜브를 통해서 냉장 보존부(2)의 내부에 배치된 박리액 탱크와 접속되어 있어, 적절히, 박리액 탱크로부터 박리액 용기(35)에 배지가 공급된다.
배지 용기(34) 및 박리액 용기(35)는 각각, 튜브(73)를 통해서 밀폐 용기(50, 60) 및 교반부(32)와 접속되어 있다. 튜브(73) 중, 배지 용기(34) 및 박리액 용기(35)와, 밀폐 용기(50, 60) 및 교반부(32)의 사이의 부분에는, 펌프(102)가 배치되어 있다. 튜브(73)에는 밸브(V5 내지 V9)가 배치되어 있다. 밸브(V5)는, 배지 용기(34)와 펌프(102)의 사이에 배치되어 있어, 배지 용기(34)로부터의 배지의 공급 상태를 전환한다. 밸브(V6)는, 박리액 용기(35)와 펌프(102)의 사이에 배치되어 있어, 박리액 용기(35)로부터의 박리액의 공급 상태를 전환한다. 밸브(V7)는, 밀폐 용기(50)와 펌프(102)의 사이에 배치되어 있어, 밀폐 용기(50)에의 배지 또는 박리액의 공급 상태를 전환한다. 밸브(V8)는, 밀폐 용기(60)와 펌프(102)의 사이에 배치되어 있어, 밀폐 용기(60)에의 배지 또는 박리액의 공급 상태를 전환한다. 밸브(V9)는, 교반부(32)와 펌프(102)의 사이에 배치되어 있어, 교반부(32)에의 배지 또는 박리액의 공급 상태를 전환한다.
폐액 용기(36)는, 밀폐 용기(50, 60) 및 교반부(32)로부터의 폐액이 배출되는 용기이다. 폐액 용기(36)에는, 외기와 연통하는 가스 배출부(37)가 형성되어 있어, 폐액 용기(36)의 내부의 기체는, 가스 배출부(37)를 통해서 대기 개방된다. 가스 배출부(37)에는, 필요에 따라 역지 밸브나 필터 등이 설치되는 경우도 있다.
폐액 용기(36)는, 튜브(74)를 통해서 밀폐 용기(50, 60) 및 교반부(32)와 접속되어 있다. 튜브(74)에는 밸브(V10 내지 V12)가 배치되어 있다. 밸브(V10)는, 밀폐 용기(50)와 펌프(103)의 사이에 배치되어 있어, 밀폐 용기(50)로부터의 폐액의 배출 상태를 전환한다. 밸브(V11)는, 밀폐 용기(60)와 펌프(103)의 사이에 배치되어 있어, 밀폐 용기(60)로부터의 폐액의 배출 상태를 전환한다. 밸브(V12)는, 교반부(32)와 펌프(103)의 사이에 배치되어 있어, 교반부(32)로부터의 폐액의 배출 상태를 전환한다. 또한, 밀폐 용기(50, 60) 및 교반부(32)로부터의 폐액이 중력에 의해 폐액 용기(36)에 이르는 구성으로 되어 있을 경우에는, 펌프(103)를 생략하는 것도 가능하다.
(세포 회수 작업)
본 발명에 따른 세포 회수 방법의 일례로서, 밀폐 용기(50)에서 배양한 세포를 밀폐 용기(60)에 옮겨 담는 계대 시의 작업에 대해서, 도 4 및 도 5를 참조하면서 설명한다. 도 4는, 계대의 일련의 흐름을 나타내는 흐름도이며, 도 5는, 세포 회수 작업을 도시하는 모식도이다. 본 실시 형태에서는, 제어부(5)가 펌프(101 내지 103)의 구동 및 밸브(V1 내지 V12)의 개폐를 적절히 제어함으로써, 자동으로 계대가 행하여진다. 또한, 배양이나 계대에 관한 각종 조건은, 작업자에 의해 미리 제어부(5)에 입력된다. 계대를 시작함에 있어서, 모든 밸브(V1 내지 V12)는 폐쇄 상태로 되어 있어, 배양 회로(70)의 내부는 무균 상태로 유지되어 있는 것으로 한다.
밀폐 용기(50)로부터 밀폐 용기(60)에의 계대를 행할 때는, 먼저, 도 5의 (a)에 도시하는 바와 같이, 밀폐 용기(50)로부터 배지(M)를 배출한다(스텝 S11). 구체적으로는, 제어부(5)는, 밸브(V10)를 개방 상태로 하고, 펌프(103)를 구동시킴으로써, 밀폐 용기(50) 내의 배지(M)를 튜브(74)를 통해서 폐액 용기(36)에 배출한다. 이때, 세포(C)는 밀폐 용기(50)의 내면에 부착되어 있기 때문에, 배지(M)와 함께 배출되지는 않는다. 밀폐 용기(50) 내의 배지(M)가 배출되면, 제어부(5)는 밸브(V10)를 폐쇄 상태로 하고, 펌프(103)를 정지시킨다.
이어서, 도 5의 (b)에 도시하는 바와 같이, 밀폐 용기(50)에 박리액(L)을 공급한다(스텝 S12). 구체적으로는, 제어부(5)는, 밸브(V6, V7)를 개방 상태로 하고, 펌프(102)를 구동시킴으로써, 박리액 용기(35) 내의 박리액(L)을 튜브(73)를 통해서 밀폐 용기(50)에 공급한다. 밀폐 용기(50)에 박리액(L)이 소정량 공급되면, 제어부(5)는, 밸브(V6, V7)를 폐쇄 상태로 하고, 펌프(102)를 정지시킨다.
밀폐 용기(50)에의 박리액(L)의 공급이 끝나면, 그 상태에서, 제1 소정 시간만큼 대기한다(스텝 S13). 이 제1 소정 시간은, 밀폐 용기(50)의 내면에 부착되어 있는 세포(C)가, 박리액(L)의 화학적 작용에 의해 완전히 박리되기 직전의 상태로 될 때까지의 시간이다. 제1 소정 시간은, 세포(C)의 종류나 박리액(L)의 종류에 따라 적절히 정해지지만, 예를 들어 2 내지 3분 정도이다.
제1 소정 시간이 경과하면(스텝 S13: "예"), 도 5의 (c)에 도시하는 바와 같이, 밀폐 용기(50)로부터 박리액(L)을 배출한다(스텝 S14). 구체적으로는, 제어부(5)는, 밸브(V10)를 개방 상태로 하고, 펌프(103)를 구동시킴으로써, 밀폐 용기(50) 내의 박리액(L)을 튜브(74)를 통해서 폐액 용기(36)에 배출한다. 이때, 세포(C)는 밀폐 용기(50)의 내면에 부착되어 있기 때문에, 박리액(L)과 함께 배출되지는 않는다. 가령 박리액(L)을 배출할 때까지 일부 세포(C)가 박리되어 있었을 경우에는, 그 일부 세포(C)가 박리액(L)과 함께 배출될 수는 있지만, 그러한 세포(C)는 있다고 해도 극히 약간이다. 밀폐 용기(50) 내의 박리액(L)이 배출되면, 제어부(5)는 밸브(V10)를 폐쇄 상태로 하고, 펌프(103)를 정지시킨다.
밀폐 용기(50)로부터 박리액(L)이 배출되면, 그 상태에서, 제2 소정 시간만큼 대기한다(스텝 S15). 스텝 S14에서 박리액(L)은 기본적으로 전량이 밀폐 용기(50)로부터 배출되지만, 실제로는, 도 5의 (d)에 도시하는 바와 같이, 박리액(L)의 잔액이 표면 장력에 의해 밀폐 용기(50)의 내면이나 세포(C)에 부착되어 있다. 제2 소정 시간은, 스텝 S13을 거쳐서 완전히 박리되기 직전의 상태로 되어 있는 세포(C)가, 박리액(L)의 잔액의 화학적 작용에 의해 완전히 박리될 때까지의 시간이다. 제2 소정 시간은, 세포(C)의 종류나 박리액(L)의 종류에 따라 적절히 정해지지만, 예를 들어 2 내지 3분 정도이다.
제2 소정 시간이 경과하면(스텝 S15: "예"), 도 5의 (e)에 도시하는 바와 같이, 밀폐 용기(50)에 신선한 배지(M)를 공급한다(스텝 S16). 구체적으로는, 제어부(5)는, 밸브(V5, V7)를 개방 상태로 하고, 펌프(102)를 구동시킴으로써, 배지 용기(34) 내의 배지(M)를 튜브(73)를 통해서 밀폐 용기(50)에 공급한다. 스텝 S15에 의해 밀폐 용기(50)의 내면에 부착되어 있던 세포(C)는 완전히 박리되어, 세포(C)가 괴상이 아니라 흐트러진 상태로 되어 있다. 따라서, 액상의 배지(M)를 공급하면, 밀폐 용기(50) 내의 세포(C)가 배지(M)에 혼합되어 세포 현탁액(S)으로 된다. 또한, 박리액(L)의 잔액은 얼마 안되는 양이므로, 배지(M)를 공급함으로써 충분히 희석되어, 후속 공정에서 문제가 되지는 않는다. 밀폐 용기(50)에 배지(M)가 소정량 공급되면, 제어부(5)는, 밸브(V5, V7)를 폐쇄 상태로 하고, 펌프(102)를 정지시킨다.
이어서, 밀폐 용기(50) 내의 세포 현탁액(S)을 교반부(32)로 이동시킨다(스텝 S17). 구체적으로는, 제어부(5)는, 밸브(V1, V3)를 개방 상태로 하고, 펌프(101)를 구동시킴으로써, 가스 탱크(33) 내의 CO2를 튜브(72)를 통해서 밀폐 용기(50)에 압송한다. 이에 의해, 밀폐 용기(50) 내의 세포 현탁액(S)이 튜브(71)를 통해서 교반부(32)로 이동한다. 세포 현탁액(S)이 교반부(32)로 이동한 후, 제어부(5)는, 밸브(V1, V3)를 폐쇄 상태로 하고, 펌프(101)를 정지시킨다.
계속해서, 교반부(32) 내의 세포 현탁액(S)의 농도 조정을 행한다(스텝 S18). 구체적으로는, 교반부(32)에서 교반됨으로써 농도가 균일해진 세포 현탁액(S) 중 미량이 도시하지 않은 세포 카운트부로 운반되어, 세포 현탁액(S)의 농도가 측정된다. 제어부(5)는, 이 측정 결과를 받아서, 세포 현탁액(S)을 소정의 농도로 하기 위해서 필요한 배지(M)의 추가량을 계산한다. 그리고, 제어부(5)는 밸브(V5, V9)를 개방 상태로 하고, 펌프(102)를 구동함으로써, 배지 용기(34)로부터 소정량의 배지(M)를 교반부(32)에 공급한다. 이에 의해, 교반부(32)의 내부에 수용되어 있는 세포 현탁액(S)을 소정의 농도로 할 수 있다. 교반부(32)에 배지(M)가 소정량 공급되면, 제어부(5)는, 밸브(V5, V9)를 폐쇄 상태로 하고, 펌프(102)를 정지한다.
마지막으로, 교반부(32) 내의 농도 조정된 세포 현탁액(S)을 새로운 밀폐 용기(60)로 이동시킨다(스텝 S19). 구체적으로는, 제어부(5)는, 밸브(V1 내지 V3)를 개방 상태로 하고, 펌프(101)를 구동시킴으로써, 가스 탱크(33) 내의 CO2를 밀폐 용기(50)를 경유시켜서 교반부(32)에 압송한다. 이에 의해, 교반부(32) 내의 세포 현탁액(S)이 튜브(71)를 통해서 밀폐 용기(60)로 이동한다. 세포 현탁액(S)이 밀폐 용기(60)로 이동한 후, 제어부(5)는, 밸브(V1 내지 V3)를 폐쇄 상태로 하고, 펌프(101)를 정지시킨다. 이상으로 계대가 완료된다. 밀폐 용기(50, 60)를 새로운 밀폐 용기로 교환하면, 계대를 반복해서 행하는 것도 가능하다.
여기서, 밀폐 용기(50, 60)를 새로운 밀폐 용기로 교환할 때, 밀폐 용기(50, 60)에 연결되는 튜브, 교반부(32) 등을 새로운 것으로 교환해도 되고, 튜브, 교반부(32) 등의 내부를 세정하여 재이용해도 된다. 밀폐 용기(50, 60)를 교환할 때는, 배양 회로(70)의 내부의 무균 상태를 유지하면서, 밀폐 용기(50, 60)를 튜브로부터 분리함과 함께, 다른 새로운 밀폐 용기를 내부의 무균 상태를 유지하면서 튜브에 접속한다. 그 때는, 예를 들어 BioWelder(사토리우스 스테딤 재팬사 제조), OPTA 무균 커넥터(사토리우스 스테딤 재팬사 제조) 등의 용착기를 사용하면 된다.
이상 설명한 계대 작업에서의 스텝 S11 내지 S16은, 본 발명에 따른 세포 회수 방법에 상당한다. 상세하게는, 스텝 S11이 본 발명의 배지 배출 공정에 상당하고, 스텝 S12가 본 발명의 박리액 공급 공정에 상당하고, 스텝 S14가 본 발명의 박리액 배출 공정에 상당하고, 스텝 S15가 본 발명의 대기 공정에 상당하고, 스텝 S16이 본 발명의 회수액 공급 공정에 상당한다. 또한, 본 발명의 회수액으로서 배지(M)가 사용되었다. 또한, 배지 용기(34), 폐액 용기(36), 튜브(73, 74), 펌프(102, 103), 밸브(V5, V7, V8, V10, V11)에 의해, 본 발명의 배지 급배 장치 및 회수액 급배 장치가 구성된다. 또한, 박리액 용기(35), 폐액 용기(36), 튜브(73, 74), 펌프(102, 103), 밸브(V6, V7, V8, V10, V11)에 의해, 본 발명의 박리액 급배 장치가 구성된다.
(효과)
본 실시 형태에서는, 박리액(L)을 배출한 후, 박리액(L)의 잔액의 작용에 의해 세포(C)가 박리될 때까지 대기하고 나서, 회수액으로서의 배지(M)를 공급하도록 하고 있다. 이 때문에, 세포(C)를 박리액(L)으로부터 분리할 필요가 없어, 원심 분리기를 불필요로 할 수 있다. 또한, 박리액(L)의 잔액의 작용으로 세포(C)가 박리될 때까지 대기하고 있으므로, 밀폐 용기(50)의 내면에 부착되어 있는 세포(C)를, 배지(M)가 흐르는 기세에 의해 무리하게 박리시킬 필요가 없다. 또한, 박리액(L)의 잔액의 작용으로 세포(C)가 충분히 흐트러진 상태로 되므로, 세포 덩어리를 튜브 펌프 등으로 붕괴시킬 필요가 없다. 따라서, 본 실시 형태에 따르면, 원심 분리기를 요하지 않으면서, 세포(C)에의 대미지를 억제할 수 있다.
본 실시 형태에서는, 제어부(5)가 펌프(101 내지 103)의 구동 및 밸브(V1 내지 V12)의 개폐를 적절히 제어함으로써, 본 발명에 따른 세포 회수 방법이 실행된다. 따라서, 사람 손을 거치지 않고 자동으로 본 발명에 따른 세포 회수 방법을 실행할 수 있다.
본 실시 형태에서는, 적어도 2개의 밀폐 용기(50, 60)가 접속 경로(30)를 통해서 접속되어 있어, 밀폐 용기(50)에서 본 발명에 따른 세포 회수 방법이 실행된 후, 밀폐 용기(50)에 기체(CO2)를 압송함으로써, 밀폐 용기(50) 내의 세포 현탁액(S)이 다른 밀폐 용기(60)로 옮겨 담겨진다. 이와 같은 구성에 의하면, 세포 현탁액(S)을 밀폐 용기(50)로부터 밀폐 용기(60)로 옮겨 담는 계대 시에, 세포 현탁액(S)을 튜브 펌프 등을 통과시키지 않고 옮겨 담을 수 있다. 따라서, 세포(C)에의 대미지를 억제할 수 있다.
(다른 실시 형태)
상기 실시 형태에 다양한 변경을 가한 변형예에 대해서 설명한다.
상기 실시 형태에서는, 본 발명에 따른 세포 회수 방법을 계대 시의 작업에 적용한 예에 대해서 설명했지만, 본 발명에 따른 세포 회수 방법을 배양 종료 후에 세포를 수확할 때 적용해도 된다.
상기 실시 형태에서는, 본 발명의 회수액으로서, 액상의 배지를 사용하는 것으로 했지만, 회수액의 종류는 이것에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 세포를 수확할 때의 세포 회수 작업에서는, 회수액으로서 동결액을 사용하면, 세포 회수 후에 세포를 동결 보존할 수 있다.
상기 실시 형태에서는, 본 발명에 따른 세포 회수 방법의 각 공정이 제어부(5)에 의해 자동으로 실행되는 것으로 하였다. 그러나, 적어도 일부 공정을 작업자가 행하도록 해도 된다.
1: 세포 배양 장치
5: 제어부
30: 접속 경로
50, 60: 밀폐 용기(용기)
C: 세포
M: 배지(회수액)
L: 박리액
S: 세포 현탁액

Claims (3)

  1. 액상의 배지가 들어 있는 용기 내에서 배양되어, 상기 용기의 내면에 부착되어 있는 세포를 회수하는 세포 회수 방법이며,
    상기 용기로부터 상기 배지를 배출하는 배지 배출 공정과,
    상기 배지의 배출 후에, 상기 세포를 상기 용기의 내면으로부터 박리시키기 위한 박리액을 상기 용기에 공급하는 박리액 공급 공정과,
    상기 세포가 상기 용기의 내면으로부터 완전히 박리되기 전에, 상기 박리액을 상기 용기로부터 배출하는 박리액 배출 공정과,
    상기 박리액의 배출 후에, 상기 박리액의 잔액의 작용에 의해 상기 세포가 박리될 때까지 대기하는 대기 공정과,
    상기 대기 공정의 종료 후, 상기 세포를 회수하기 위한 회수액을 상기 용기에 공급하는 회수액 공급 공정
    을 실행하는 것을 특징으로 하는 세포 회수 방법.
  2. 제1항에 기재된 세포 회수 방법을 실행 가능한 세포 배양 장치이며,
    상기 용기에 상기 배지를 급배하는 배지 급배 장치와,
    상기 용기에 상기 박리액을 급배하는 박리액 급배 장치와,
    상기 용기에 상기 회수액을 급배하는 회수액 급배 장치와,
    제어부
    를 구비하고,
    상기 제어부가, 상기 배지 급배 장치, 상기 박리액 급배 장치 및 상기 회수액 급배 장치의 동작을 제어함으로써, 상기 세포 회수 방법이 실행되는 것을 특징으로 하는 세포 배양 장치.
  3. 제2항에 있어서, 적어도 2개의 상기 용기가 접속 경로를 통해서 접속되어 있고,
    어떤 상기 용기에서 상기 세포 회수 방법이 실행된 후, 상기 어떤 용기에 기체를 압송함으로써, 상기 어떤 용기 내의 상기 세포를 포함하는 상기 회수액이 다른 상기 용기에 옮겨 담겨지는 것을 특징으로 하는, 세포 배양 장치.
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