JP2011103832A - 細胞培養システム - Google Patents
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Abstract
【課題】
動物の組織や臓器を形成する細胞の培養操作及び培養された細胞の回収操作を半自動化又は自動化して、培養された細胞への汚染物混入を防止するとともに、初心者であっても容易に細胞培養を行うことができる半自動又は自動細胞培養システムを提供する。
【解決手段】
本発明の細胞培養システムは、細胞培養器Aと、培養液容器B、洗浄液容器C、剥離剤容器D、培養細胞回収容器F及び廃液容器Gの5つの容器と剥離剤収容シリンジEと、2つのポンプP1及びP2と、7つのバルブPV1〜PV7と、細胞培養器と各容器とを接続するプラスチック製チューブからなる流路1〜10と、上記7つのバルブの開閉と2つのポンプの駆動・停止の指令信号をプログラムに従って出力する制御手段Hで構成されている。
【選択図】図1
動物の組織や臓器を形成する細胞の培養操作及び培養された細胞の回収操作を半自動化又は自動化して、培養された細胞への汚染物混入を防止するとともに、初心者であっても容易に細胞培養を行うことができる半自動又は自動細胞培養システムを提供する。
【解決手段】
本発明の細胞培養システムは、細胞培養器Aと、培養液容器B、洗浄液容器C、剥離剤容器D、培養細胞回収容器F及び廃液容器Gの5つの容器と剥離剤収容シリンジEと、2つのポンプP1及びP2と、7つのバルブPV1〜PV7と、細胞培養器と各容器とを接続するプラスチック製チューブからなる流路1〜10と、上記7つのバルブの開閉と2つのポンプの駆動・停止の指令信号をプログラムに従って出力する制御手段Hで構成されている。
【選択図】図1
Description
本発明は、動物の組織や臓器を形成する細胞の培養操作及び培養された細胞の回収操作を半自動化又は自動化して、培養された細胞への汚染物混入を防止した閉鎖系の細胞培養システム、特に再生医療に用いる細胞、動植物細胞の大量培養に適した細胞培養システムに関するものである。以下再生医療に用いられる細胞培養システムについて説明するが、本発明のシステムは動植物細胞の培養にも適用が可能である。
近年、ヒト組織をインビトロ(in vitro)で培養し、培養した組織を患者に適用する技術が数多く報告されている。細胞には、浮遊系細胞と付着系細胞の2種類が存在し、付着系細胞の培養においては、洗浄液、例えばPBS(Phosphate Buffered Salts)を用いて細胞培養器、各流路を洗浄する作業、細胞培養器の各室に培養液を充填する作業、細胞培養器の外室に細胞を注入する作業、細胞培養器の内室に培養液を供給する作業、次に、剥離剤、例えばトリプシンを用いて培養容器及び不織布等の担体付着した細胞を剥離する作業(浮遊系細胞では細胞の剥離作業は不要である)、剥離された細胞を回収する作業等多数の作業が行われる。
なお、細胞培養器へ培養液を循環させることが可能な培養装置(特許文献1及び2)や、細胞培養器内の培養液を自動的に交換することが可能な培養装置(特許文献3及び4)が提案されている。
特開平5−260958号公報
特開平5−276922号公報
特開平8−172956号公報
特開2002−262856号公報
なお、細胞培養器へ培養液を循環させることが可能な培養装置(特許文献1及び2)や、細胞培養器内の培養液を自動的に交換することが可能な培養装置(特許文献3及び4)が提案されている。
しかしながら、細胞培養においては、細胞及び培養液が収容された細胞培養器をインキュベータから取り出して上述の作業を行っていたため、細胞培養器内に雑菌が混入することがあった。
また、細胞培養においては、多数の作業を行うため、初心者にとって難しい作業であった。
したがって、本発明の第一の目的は、細胞培養器内に雑菌が混入することのない細胞培養システムを提供することである。
本発明の第二の目的は、初心者であっても容易に細胞培養を行うことができる半自動又は自動細胞培養システムを提供することである。
また、細胞培養においては、多数の作業を行うため、初心者にとって難しい作業であった。
したがって、本発明の第一の目的は、細胞培養器内に雑菌が混入することのない細胞培養システムを提供することである。
本発明の第二の目的は、初心者であっても容易に細胞培養を行うことができる半自動又は自動細胞培養システムを提供することである。
すなわち、第一の発明は、全流路及び膜で内外2室に区画された細胞培養器に洗浄液を供給して洗浄する工程、細胞培養器の各室に培養液を充填する工程、細胞培養器の外室に細胞を注入する工程、細胞培養器の内室に培養液を供給して細胞培養する工程及び培養された細胞を回収する工程からなる細胞培養システムであって、洗浄液容器と第1の分岐を第2のバルブを介して接続する洗浄液流路と、該第1の分岐の一方と剥離剤容器を第1のバルブを介して接続する剥離剤供給流路と、該第1の分岐の他方と第2の分岐を第2のポンプを介して接続する第2のポンプ流路と、該第2の分岐の一方と第3の分岐を第3のバルブを介して接続する第1の流路と、該第2の分岐の他方と細胞培養器の外室入口とを細胞注入用シリンジ針刺しこみ用の細胞充填ポート及び第4のバルブを介して接続する第2の流路と、該第3の分岐の一方と細培養液容器とを第1のポンプを介して接続する第1の培養液流路と、該第3の分岐の他方と細胞培養器の内室入口を接続する第2の培養液流路と、該細胞培養器の内室出口と第4の分岐を接続する第4の流路と、第4の分岐の一方に第6のバルブを介して廃液を廃液容器に送出する廃液流路と、該第4の分岐の他方にバルブ7を介して培養液回収容器と接続する培養液回収流路と、該細胞培養器の外室出口と第5のバルブを介して接続する培養細胞回収流路と、
上記各バルブ及び各ポンプにバルブ開閉及びポンプ駆動・停止の指令信号を出力する制御手段を具備した細胞培養システムである。
上記各バルブ及び各ポンプにバルブ開閉及びポンプ駆動・停止の指令信号を出力する制御手段を具備した細胞培養システムである。
第二から第六の発明は、上記各バルブ及び各ポンプにバルブ開閉及びポンプ駆動・停止の指令信号を出力する制御手段に関する発明であり、制御手段は洗浄回路、培養液充填回路、細胞充填回路、細胞培養回路及び回収回路から構成されている。
すなわち第二の発明は、制御手段を構成する洗浄回路に関する発明であり、
該洗浄回路は、外部からのプライプミング洗浄スタート信号を受けて、第2、第3及び第6のバルブを開放し、第1、第4、第5及び第7のバルブを閉止するとともに、第1のポンプを停止し、第2のポンプを駆動する細胞培養器の内室洗浄手段と、該第2のポンプからの流量検知信号又はタイマーからの信号を受けて、第2、第3及び第5のバルブを開放し、第1、第4、第6及び第7のバルブを閉止するとともに、第1のポンプを停止し、第2のポンプを駆動する細胞培養器の膜壁洗浄手段と、該第2のポンプからの流量検知信号又はタイマーからの信号を受けて、第2、第4及び第5のバルブを開放し、第1、第3、第6及び第7のバルブを閉止するとともに、第1のポンプを停止し、第2のポンプを駆動する細胞培養器の外室洗浄手段と、該第2のポンプからの流量+検知信号又はタイマーからの信号を受けて、第2、第3及び第7のバルブを開放し、第1、第4、第5及び第6のバルブを閉止するとともに、第1のポンプを停止し、第2のポンプを駆動する洗浄液回収流路洗浄手段と、該第2のポンプからの流量検知信号又はタイマーからの信号を受けて、第2及び第3のバルブを開放し、第1、第4、第5、第6及び第7のバルブを閉止するとともに、第2のポンプを駆動し、第1のポンプを逆方向に駆動する培養液流路洗浄手段と、該第1又は第2のポンプからの流量検知信号、あるいはタイマーからの信号を受けて、第3、第4、第5、第6及び第7のバルブを閉止するとともに、第1及び第2のバルブを開放し、第1及び第2のポンプを停止する剥離剤供給流路洗浄手段を具備している。
該洗浄回路は、外部からのプライプミング洗浄スタート信号を受けて、第2、第3及び第6のバルブを開放し、第1、第4、第5及び第7のバルブを閉止するとともに、第1のポンプを停止し、第2のポンプを駆動する細胞培養器の内室洗浄手段と、該第2のポンプからの流量検知信号又はタイマーからの信号を受けて、第2、第3及び第5のバルブを開放し、第1、第4、第6及び第7のバルブを閉止するとともに、第1のポンプを停止し、第2のポンプを駆動する細胞培養器の膜壁洗浄手段と、該第2のポンプからの流量検知信号又はタイマーからの信号を受けて、第2、第4及び第5のバルブを開放し、第1、第3、第6及び第7のバルブを閉止するとともに、第1のポンプを停止し、第2のポンプを駆動する細胞培養器の外室洗浄手段と、該第2のポンプからの流量+検知信号又はタイマーからの信号を受けて、第2、第3及び第7のバルブを開放し、第1、第4、第5及び第6のバルブを閉止するとともに、第1のポンプを停止し、第2のポンプを駆動する洗浄液回収流路洗浄手段と、該第2のポンプからの流量検知信号又はタイマーからの信号を受けて、第2及び第3のバルブを開放し、第1、第4、第5、第6及び第7のバルブを閉止するとともに、第2のポンプを駆動し、第1のポンプを逆方向に駆動する培養液流路洗浄手段と、該第1又は第2のポンプからの流量検知信号、あるいはタイマーからの信号を受けて、第3、第4、第5、第6及び第7のバルブを閉止するとともに、第1及び第2のバルブを開放し、第1及び第2のポンプを停止する剥離剤供給流路洗浄手段を具備している。
第三の発明は、培養液充填回路に関する発明であり、該培養液充填回路は、外部からの培養液充填スタート信号を受けて、第7のバルブを開放し、第1、第2、第3、第4、第5及び第6のバルブを閉止するとともに、第1のポンプを駆動し、第2のポンプを停止する細胞培養器内室への培養液充填手段と、該第1のポンプからの流量検知信号又はタイマーからの信号を受けて、第1、第2、第3、第4、第5、第6及び第7のバルブを閉止し、第1のポンプを駆動し、第2のポンプを停止する細胞培養器外室への培養液充填手段
を具備している。
を具備している。
第四の発明は、細胞充填回路に関する発明であり、該細胞充填回路は、外部からの細胞充填スタート信号を受けて、第1、第2、第3、第6及び第7のバルブを閉止し、第4及び第5のバルブを開放し、第2、第3、第6及び第7のバルブを閉止するとともに、第1及び第2のポンプを停止し、その後、細胞注入用シリンジを作動させて培養器の外室に細胞を注入する細胞充填手段を具備している。
第五の発明は、細胞培養回路に関する発明であり、該細胞培養回路は、外部からの培養スタート信号を受けて、第7のバルブを開放し、第1、第2、第3、第4、第5及び第6のバルブを閉止するとともに、第1のポンプを駆動し、第2のポンプを停止する細胞培養手段を具備している。
第六の発明は、回収回路に関する発明であり、該回収回路は、外部からの回収スタート信号を受けて、第1、第4、第5及び第7のバルブを開放し、第2、第3及び第6のバルブを閉止するとともに、第1のポンプを停止し、第2のポンプを駆動する剥離剤供給手段と、該第2のポンプからの流量検知信号又はタイマーからの信号を受けて、第1及び第7のバルブを開放し、第2、第3、第4、第5及び第6のバルブを閉止するとともに、第1及び第2のポンプを停止する待機手段と、タイマーからの信号を受けて、第3及び第4のバルブを開放し、第1、第2、第6及び第7のバルブを閉止し、第5のバルブを開放するとともに、第1のポンプを駆動し、第2のポンプを停止する第一回収手段と、第1のポンプからの流量検知信号又はタイマーからの信号を受けて、第5のバルブを開放し、第1、第2、第3、第4、第6及び第7のバルブを閉止するとともに、第1のポンプを駆動し、第2のポンプを停止する第二の回収手段を具備している。
本発明に係る細胞培養システムによれば、各容器に洗浄液、細胞培養液、剥離剤を収容する作業及び細胞注入作業を行えば、その後は自動的に細胞培養に必要な工程に従って一連の処理が実行されるので、初心者であっても容易に細胞培養を行うことができる。
また、全ての処理が完全密閉系で行われるので、細胞培養器内に雑菌が混入することはない。
また、全ての処理が完全密閉系で行われるので、細胞培養器内に雑菌が混入することはない。
次に、付着性細胞の培養システムの一実施例について図面にて説明する。
本発明の細胞培養システムは図1に示す系統図から明らかなように、細胞培養器Aと、培養液容器B、洗浄液容器C、剥離剤容器D、培養細胞回収容器F及び廃液容器Gの5つの容器と剥離剤収容シリンジEと、2つのポンプP1及びP2と、7つのバルブPV1〜PV7と、細胞培養器と各容器とを接続するプラスチック製チューブからなる流路1〜10と、上記7つのバルブの開閉と2つのポンプの駆動・停止の指令信号をプログラムに従っ
て出力する制御手段Hで構成されている。
本発明の細胞培養システムは図1に示す系統図から明らかなように、細胞培養器Aと、培養液容器B、洗浄液容器C、剥離剤容器D、培養細胞回収容器F及び廃液容器Gの5つの容器と剥離剤収容シリンジEと、2つのポンプP1及びP2と、7つのバルブPV1〜PV7と、細胞培養器と各容器とを接続するプラスチック製チューブからなる流路1〜10と、上記7つのバルブの開閉と2つのポンプの駆動・停止の指令信号をプログラムに従っ
て出力する制御手段Hで構成されている。
細胞培養器Aは、図2に平膜モジュール、図3に中空糸モジュールの例を示すように、培養液と剥離剤を透過させ、細胞の透過を阻止する多孔膜20でモジュール内部が内外2室に区画され、内室Xに培養液の入口21と出口22、外室Yに細胞入口24と培養された細胞の出口25が設けられている。
外室Yには細胞を培養するための担体として多孔性担体23が設置されている。多孔性担体23として通常不織布が使用される。細胞培養器Aは、公知のモジュールを使用できる。中空糸モジュールでは、多数の中空糸と不織布を重ね合わせて海苔巻き状に巻いて、両端を接着剤で接着してモジュールを製作する。中空糸モジュールでは培養細胞回収時に細胞が不織布に引っかかって回収率の低下が避けられない。細胞の不織布への引っかかりを防ぐため、例えば、中空糸と該中空糸より短い不織布を重ね合わせ、海苔巻き状に巻いて円筒状ハウジング内に収容し、培養液の入口21側に中空糸と不織布、培養液の出口22側に中空糸のみが埋め込まれるように両端を接着剤で接着すると、培養液出口22側に不織布のない空間が形成される。細胞回収時に培養液出口22側の空間に細胞が集められて培養細胞出口24から排出されるため不織布へ引っかかることはない。
外室Yには細胞を培養するための担体として多孔性担体23が設置されている。多孔性担体23として通常不織布が使用される。細胞培養器Aは、公知のモジュールを使用できる。中空糸モジュールでは、多数の中空糸と不織布を重ね合わせて海苔巻き状に巻いて、両端を接着剤で接着してモジュールを製作する。中空糸モジュールでは培養細胞回収時に細胞が不織布に引っかかって回収率の低下が避けられない。細胞の不織布への引っかかりを防ぐため、例えば、中空糸と該中空糸より短い不織布を重ね合わせ、海苔巻き状に巻いて円筒状ハウジング内に収容し、培養液の入口21側に中空糸と不織布、培養液の出口22側に中空糸のみが埋め込まれるように両端を接着剤で接着すると、培養液出口22側に不織布のない空間が形成される。細胞回収時に培養液出口22側の空間に細胞が集められて培養細胞出口24から排出されるため不織布へ引っかかることはない。
本システム作動中に細胞培養器Aの周囲温度の低下による細胞の活性低下を防ぐため、細胞培養器Aを恒温容器Jに収容するのが好ましい。恒温容器Jに空気循環流路29を接続し、該循環流路にファン30とヒーター31からなる加温ユニット32と恒温容器J内の温度を検知する温度センサー(図示せず)を設ける。ヒーター31は温度センサーからの信号を受けて、温度を調整し恒温容器J内の温度を一定温度に維持する。
培養液容器B、洗浄液容器C、剥離剤容器D、培養細胞回収容器F及び廃液容器Gは外部からの雑菌の侵入を防止するため、通常プラスチック製のバッグが使用される。
培養液容器B、洗浄液容器C、剥離剤容器D、培養細胞回収容器F及び廃液容器Gは外部からの雑菌の侵入を防止するため、通常プラスチック製のバッグが使用される。
洗浄液容器Cに入れる洗浄液としては、カルシゥムを含まず、かつ培養細胞に悪影響を与えないものが用いられており、例えば、PBS(Phosphate Buffered Salts)、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン−塩酸緩衝液(Tris)等の等張緩衝液や培養細胞と浸透圧が同一となる濃度のショ糖溶液、食塩水、塩化カリウム等の等張液が用いられる。通常PBSが用いられる。
剥離剤容器Dに入れる剥離剤としては、不織布に接着した培養細胞に、0.5mM〜10mMのEDTAの他、EGTA、DTPA、NTA、TTHA等の2価金属のキレート剤、又はトリプシンやコラーゲン等のタンパク質分解酵素、又はインテグリンやカドヘリン等のタンパク質の接着を競合的に阻害するペプチドが使用される。かかる剥離剤を細胞培養器に供給し、細胞培養器内壁や不織布に細胞を付着させているインテグリン等の接着因子の切断と、上記細胞同士を接着させているカドヘリン等の接着因子を切断する。接着因子が切断されると付着性細胞が浮遊するため回収が容易となる。
流路を開閉するバルブ(PV1)〜(PV7)は、外部からの雑菌の侵入のない方式、通常ピンチバルブが使用される。ポンプ(P1)〜(P2)は同様な理由でローラーポンプが使用される。
制御手段Hは、周知のようにCPU、ROM、RAM、タイマ等で構成されている。この制御手段はポンプでの流量の測定、又はタイマで計時するとともに,各バルブやポンプに指令信号を発信する。
制御手段Hは、周知のようにCPU、ROM、RAM、タイマ等で構成されている。この制御手段はポンプでの流量の測定、又はタイマで計時するとともに,各バルブやポンプに指令信号を発信する。
次に上記細胞培養システムの一連の動作について、図4〜図10に基づき具体的に説明する。図4は本発明の細胞培養システムにおける一連の動作を表わす工程図である。
まず、本システムに図3に示す中空糸型の細胞培養器A、培養液容器B、洗浄液容器C、剥離剤容器D、培養細胞回収容器F及び廃液容器G及び各流路の装着と、細胞注入用シリンジEの準備を確認した後、スタートスイッチを押すと、全バルブが開となる。その状態を図5に示す。全バルブが開となったことを確認した後、洗浄スタートスイッチを押す。
洗浄工程は6つの工程からなっており、洗浄工程(1)は中空糸の内側(内室X)を洗浄する工程で、図4及び図6(1)に示すように、第2(PV2)、第3(PV3)及び第6のバルブ(PV6)を開放し、第1(PV1)、第4(PV4)、第5(PV5)及び第7のバルブ(PV7)を閉止して、第1のポンプ(P1)を停止し、第2のポンプ(P2)を駆動する。この工程では、洗浄液容器C内の洗浄液は洗浄液流路2、第1の流路3、第2の培養液流路6から細胞培養器Aの中空糸の内室Xを通過して洗浄し、第4の流路7、廃液流路9から廃液容器Gに排出される。
次に洗浄工程(2)は中空糸膜壁を洗浄する工程で、図6(2)に示すように、第2(PV2)、第3(PV3)及び第5(PV5)のバルブを開放し、第1(PV1)、第4(PV4)、第6(PV6)及び第7(PV7)のバルブを閉止して、第1のポンプ(P1)を停止し、第2のポンプ(P2)を駆動する。この工程では、細胞培養器Aの出口側の第6のバルブ(PV6)及び第7のバルブ(PV7)が閉止しているため、中空糸の内側に供給された洗浄液は加圧されて中空糸膜壁を透過して洗浄し、細胞回収流路10から廃液容器Gに排出される。
洗浄工程(3) は中空糸の外室Yを洗浄する工程で、図6(3)に示すように、第2(PV2)、第4(PV4)及び第5のバルブ(PV5)を開放し、第1(PV1)、第3(PV3)、第6(PV6)及び第7(PV7)のバルブを閉止し、第1のポンプ(P1)を停止し、第2のポンプ(P2)を駆動する。この工程では、洗浄液容器C内の洗浄液は洗浄液流路2、第1の流路3、第2の流路4から細胞培養器Aの中空糸の外室Yを通過して洗浄し、細胞回収流路10から廃液容器Gに排出される。その際、外室Yに配置された不織布(図示せず)も同時に洗浄される。
洗浄工程(4) は培養液回収流路8を洗浄する工程で、図6(4)に示すように、第2(PV2)、第3(PV3) 及び第7のバルブ(PV7) を開放し、第1(PV1)、第4(PV4)、第5(PV5)及び第6のバルブ(PV6)を閉止して、第1のポンプ(P1)を停止し、第2のポンプ(P2)を駆動する。この工程では、洗浄液容器C内の洗浄液は洗浄液流路2、第1の流路3、第2の培養液流路6から細胞培養器Aの中空糸の内室(X)を経て、培養液回収流路8から培養液容器Bの代わりに取り付けられた廃液容器(図示せず)に排出される。
洗浄工程(5) は培養液流路5を洗浄する工程で、図6(5)に示すように、第2(PV2)及び
第3のバルブ(PV3)を開放し、第1(PV1)、第1(PV1)、第4(PV4)、第5(PV5)、
第6(PV6)及び第7(PV7)のバルブを閉止して、第2のポンプ(P2)を駆動し、第1のポンプ(P1)を逆方向に駆動する。この工程では、洗浄液容器C内の洗浄液は洗浄液流路2、第1の流路3、第2の流路4から培養液流路5を経て、洗浄液容器Bの代わりに取り付けられた廃液容器(図示せず)に排出される。
第3のバルブ(PV3)を開放し、第1(PV1)、第1(PV1)、第4(PV4)、第5(PV5)、
第6(PV6)及び第7(PV7)のバルブを閉止して、第2のポンプ(P2)を駆動し、第1のポンプ(P1)を逆方向に駆動する。この工程では、洗浄液容器C内の洗浄液は洗浄液流路2、第1の流路3、第2の流路4から培養液流路5を経て、洗浄液容器Bの代わりに取り付けられた廃液容器(図示せず)に排出される。
洗浄工程(6) は剥離剤供給流路1を洗浄する工程で、図6(6)に示すように、第1(PV1) 及び第2のバルブ(PV2)を開放し、第3(PV3)、第4(PV4)、第5(PV5)、第6(PV6)及び第7(PV7)のバルブを閉止し、第1のポンプ(P1)及び第2のポンプ(P2) を停止する。洗浄液容器C内の洗浄液は洗浄液流路2から剥離剤供給流路1を経て剥離剤容器Dの代わりに取り付けられた廃液容器(図示せず)に排出される。
浮遊性細胞を培養する場合には、細胞が不織布等の坦体に付着しないため、洗浄工程(6)は不要である。
浮遊性細胞を培養する場合には、細胞が不織布等の坦体に付着しないため、洗浄工程(6)は不要である。
なお、上記洗浄工程中に洗浄容器C内の洗浄液が途切れることを防止するため図12に示すように、洗浄液流路2の第2のバルブ(PV2)の上流に液切れセンサー27を取り付け、該液切れセンサー27からの検知信号を受けて第2のバルブ(PV2)を閉止する液切れ検出手段と,液切れを知らせるブザー又はランプなどの警報手段及びこれらを制御する液切れ制御部28が設けられている。液切れ警報が出ると操作員はストップキーを押してポンプ(P1)、(P2))を停止し、洗浄液を補充した後、再スタートスイッチを押すとポンプが駆動して洗浄工程が再開する。
上記洗浄工程(1)〜(6)により、本システムの接液部の全てが洗浄されると、次の培養液充填工程に移行する。
上記洗浄工程(1)〜(6)により、本システムの接液部の全てが洗浄されると、次の培養液充填工程に移行する。
洗浄工程が終了したことを確認した後、次の培養液充填工程のスタートスイッチを押す。培養液充填工程は2つの工程からなっており、培養液充填工程(1)は細胞培養器Aの内室(X)に培養液を充填する工程で、図7(1)に示すように、第7のバルブ(PV7)を開放し、第1(PV1)、第2(PV2)、第3(PV3)、第4(PV4)、第5(PV5)及び第6のバルブ(PV6)を閉止し、第1のポンプ(P1)を駆動し、第2のポンプ(P2)を停止する。この工程では、培養液容器A内の培養液は、第1培養液流路5、第2培養液流路6から細胞倍容器Aの内室Xを経て、培養液回収流路8から培養液容器Bへ循環して、細胞倍容器Aの内室Xに培養液を充填する。
培養液充填工程(2)は細胞培養器Aの外室(Y)に培養液を充填する工程で、図7(1)に示すように、第5のバルブ(PV5)を開放し、第1(PV1)、第2(PV2)、第3(PV3)、第4(PV4)、第6(PV6)及び第7のバルブ(PV7)を閉止し、第1のポンプ(P1)を駆動し、第2のポンプ(P2)を停止する。この工程では、培養液容器A内の培養液は、第1培養液流路5、第2培養液流路6から細胞培養器Aの内室Xへ加圧供給されるため、培養液が膜壁を透過して外室Yに移行して外室Yに培養液を充填し、一部が細胞回収流路10から廃液容器Gに排出される。
上記培養液充填工程(1)及び(2)で、細胞培養器Aに培養液が充填されると、次の細胞充填工程に移行する。
上記培養液充填工程(1)及び(2)で、細胞培養器Aに培養液が充填されると、次の細胞充填工程に移行する。
培養液充填工程が終了したことを確認した後、次の細胞充填工程のスタートスイッチを押す。細胞充填工程は細胞培養器Aの外室(Y)に細胞を充填する工程で、図8に示すように、第1(PV1)、第2(PV2)、第3(PV3)、第6(PV6)及び第7のバルブ(PV7)を閉止し、第4(PV4)及び第5のバルブ(PV5)を開放し、第1のポンプ(P1)及び第2のポンプ(P2)を停止し、細胞充填準備完了信号を発信する。細胞充填準備完了信号を確認すると、作業員が第2の流路に取り付けられた細胞充填ポート(混注ボタン)15に細胞注入用シリンジEを刺し込んでシリンジ内の細胞を培養器の外室に注入する。シリンジEの細胞注入作業は、エアシリンダ(図示せず)を使用して自動化することが可能である。
例えばエアシリンダの先端をシリンジの押出部に等接し、細胞充填準備完了信号を受けてエアシリンダを駆動させ、タイマー又はリミットスイッチの作動でエアシリンダを停止させる。
上記細胞充填工程で、細胞培養器Aの外室(Y)に細胞が充填されると、次の培養工程に移行する。
例えばエアシリンダの先端をシリンジの押出部に等接し、細胞充填準備完了信号を受けてエアシリンダを駆動させ、タイマー又はリミットスイッチの作動でエアシリンダを停止させる。
上記細胞充填工程で、細胞培養器Aの外室(Y)に細胞が充填されると、次の培養工程に移行する。
細胞充填工程が終了したことを確認した後、次の培養工程のスタートスイッチを押す。培養工程は培養液容器Bから細胞培養器Aの内室Xに培養液を循環供給し、細胞培養器Aを区画する中空糸膜壁を透過させて内室Xから細胞が注入された外室Yに、細胞の栄養分である培養液を供給する工程で、図9に示すように、第7のバルブ(PV7)を開放し、第1(PV1)、第2(PV2)、第3(PV3)、第4(PV4)、第5
(PV5) 及び第6のバルブ(PV6)を閉止し、第1のポンプ(P1)を駆動し、第2のポンプ(P2)を停止する。この工程では、培養液が培養液容器Bから第1培養液流路5、第2培養液流路6から細胞培養器Aの内室Xに供給され、第4の流路7及び培養液回収流路8を経て、培養液容器Bに循環する。培養液が細胞培養器Aの内室Xへ加圧供給されるため、培養液が膜壁を透過して外室Yに移行し、外室に注入された細胞と接触して、外室Yに注入された細胞と接触し細胞を培養する。第1のポンプ(P1)の回転数を変更すると、培養液循環量を増減して最適な培養状態を維持することができる。培養時間は細胞及び培養液の種類によって決定されるが、通常1〜3週間であ
る。
(PV5) 及び第6のバルブ(PV6)を閉止し、第1のポンプ(P1)を駆動し、第2のポンプ(P2)を停止する。この工程では、培養液が培養液容器Bから第1培養液流路5、第2培養液流路6から細胞培養器Aの内室Xに供給され、第4の流路7及び培養液回収流路8を経て、培養液容器Bに循環する。培養液が細胞培養器Aの内室Xへ加圧供給されるため、培養液が膜壁を透過して外室Yに移行し、外室に注入された細胞と接触して、外室Yに注入された細胞と接触し細胞を培養する。第1のポンプ(P1)の回転数を変更すると、培養液循環量を増減して最適な培養状態を維持することができる。培養時間は細胞及び培養液の種類によって決定されるが、通常1〜3週間であ
る。
細胞は、生存に必要な酸素を培養液から取り込み、かつ培養液のpHを維持して細胞の活性低下を防ぐため、培養液の炭酸ガス濃度を維持することが好ましい。そのため第2培養液流路6にガス交換器Iを設け、ガス交換膜を介して炭酸ガスを培養液側に透過させる。ガス交換器Iは、図11に示すように、ガス交換膜16、例えばシリコンチューブでガス室と培養液室に区画したハウジング17と、ガス交換膜16で区画された培養液室と連通する培養液入口18、出口19、ガス室に連通するガスの入口26、出口27を有している。該ガス入口26にガス供給流路28を接続し、ガス出口27に炭酸ガスセンサー32を設けたガス排出流路30を接続している。ガス供給流路28の端部には分岐29が設けられ、その一方に空気流路31、他方に炭酸ガス流路33が設けられている。炭酸ガス流路33には炭酸ガスセンサー32からの信号を受けて、炭酸ガスの供給量を調整する流量調整バル34が設けられている。炭酸ガスと混合した空気はガス供給流路28からガス交換器Iに供給されて培養液中の炭酸ガス濃度を調整している。
また、培養液の循環中に培養液中の酸素濃度が低下すると細胞の活性が低下するため、培養液容器の培養液を新鮮な培養液と交換することが好ましい。
培養液交換時には、ストップキーを押して第1のポンプ(P1)を停止する。培養液の交換が完了すると再び培養工程のスタートスイッチを押すと第1のポンプ(P1)が駆動して培養工程が再開する。培養が終了すると次の回収工程に移行する。
培養液交換時には、ストップキーを押して第1のポンプ(P1)を停止する。培養液の交換が完了すると再び培養工程のスタートスイッチを押すと第1のポンプ(P1)が駆動して培養工程が再開する。培養が終了すると次の回収工程に移行する。
培養工程が終了したことを確認した後、次の回収工程のスタートスイッチを押す。回収工程は4つの工程からなっている。回収工程(1)は、外室Yに剥離剤を供給する剥離剤供給工程で、図10(1)に示すように、第1(PV1)、第4(PV4)、第5(PV5)及び第7(PV7)のバルブを開放し、第2(PV2)、第3(PV3)及び第6のバルブ(PV6)を閉止し、第1のポンプ(P1)を停止し、第2のポンプ(P2)を駆動する。この工程では、剥離剤が剥離剤容器Dから、剥離剤供給流路1、第2の流路4を経て、細胞培養器Aの外室Yに供給されてYに充満する。外室Yをオーバーフローした剥離剤は細胞回収流路10から回収容器Fに回収される。回収工程(1)で剥離剤の供給が完了すると、次の回収工程(2)に移行する。
浮遊性細胞を培養する場合には、細胞が不織布等の坦体に付着しないため、回収工程(1)は不要である。
浮遊性細胞を培養する場合には、細胞が不織布等の坦体に付着しないため、回収工程(1)は不要である。
第2のポンプからの流量検知信号又はタイマーからの信号を受けて、第1(PV1)及び第7のバルブ(PV7)を開放し、第2(PV2)、第3(PV3)、第4(PV4)、第5(PV5)及び第6のバルブ(PV6)を閉止し、第1(P1)及び第2のポンプ(P2)を停止して、外室Yに剥離剤を充満させた状態を維持し、剥離剤が内壁と不織布等に細胞を付着させるタンパク質を分解して、細胞を剥離させるまで待機する。待機時間は、細胞及び剥離剤の種類によって決定されるが、通常3〜8分間である。回収工程(2)で細胞が剥離されると、次の回収工程(3)に移行する。
回収工程(3)は、培養液で培養細胞を外室Yから追い出して、回収容器Fに回収する工程で、タイマーからの信号を受けて、第3(PV3)、第4(PV4)及び第5バルブ(PV5)を開放し、第1(PV1)、第2(PV2)、第6
(PV6) 及び第7のバルブ(PV7)を閉止し、第1のポンプ(P1)を駆動し、第2ポンプ (P2)を停止する。
この工程では、培養液容器Bから第1の培養液流路5、第2の培養液流路4を経て、培養液を培養器Aの内室Xへ供給するとともに第1の流路、第2の流路4を経て培養液を培養器Aの外室Yへ供給して培養細胞を外室Yから追い出して回収容器Fに回収する。培養液を培養器Aの内室Xへ供給すると内室Xと外室Y内の圧力が等しいため、培養細胞は細胞回収流路10から回収容器Fに確実に回収できる。
(PV6) 及び第7のバルブ(PV7)を閉止し、第1のポンプ(P1)を駆動し、第2ポンプ (P2)を停止する。
この工程では、培養液容器Bから第1の培養液流路5、第2の培養液流路4を経て、培養液を培養器Aの内室Xへ供給するとともに第1の流路、第2の流路4を経て培養液を培養器Aの外室Yへ供給して培養細胞を外室Yから追い出して回収容器Fに回収する。培養液を培養器Aの内室Xへ供給すると内室Xと外室Y内の圧力が等しいため、培養細胞は細胞回収流路10から回収容器Fに確実に回収できる。
培養細胞の回収時に,培養細胞が外室Yに配置された不織布に引っかかり細胞回収率が低下する。培養細胞を不織布から取り外す方法として、細胞培養器Aを揺動させたり、細胞培養器Aの内室Xに供給される培養液を間歇的に加圧することが行われている。例えば第2培養液流路4に圧力センサー28を設け、該圧力センサー28からの信号を受けて、第2培養液流路4の圧力が設定圧力を超えると第5のバルブ(PV5)を開放し、設定圧力以下になると第5のバルブ(PV5)を閉止して、細胞培養器Aの内室Xに供給される培養液の圧力を間歇的に加圧することで不織布に引っかかった培養細胞を取り外す。
回収工程(3)で培養細胞の回収が完了すると、次の回収工程(4)に移行する。
回収工程(3)で培養細胞の回収が完了すると、次の回収工程(4)に移行する。
回収工程(4)では、膜表面に浮遊する培養細胞を外室Yから追い出して、回収容器Fに回収する工程で、タイマーからの信号を受けて、第5のバルブ(PV5)を開放し、第1(PV1)、第2(PV2)、第3(PV3)、第4(PV4)、第6(PV6)及び第7のバルブ(PV7)を閉止し、第1のポンプ(P1)を駆動し、第2のポンプ(P2)を停止する。この工程では、培養液容器Bから第1の培養液流路5、第2の培養液流路4を経て、培養液を培養器Aの内室Xへ供給する。細胞培養器Aの内室Xへ加圧供給された培養液は膜壁を透過して外室Yに移行し、膜表面に浮遊する培養細胞を外室Yから追い出して、回収容器Fに回収する。
回収工程(4)が終了し、最後に廃棄スタートスイッチを押すと全バルブが開放される。全バルブが開放されたことを確認した後、細胞培養器A、ガス交換器J、全流路をシステムから取り外して廃棄すると本発明の細胞培養システムでの細胞培養操作が完了する。
本発明の細胞培養システムで培養された細胞には、タンパク質分解酵素等の剥離剤が含まれ、接着因子以外の細胞表面マーカー、チャネルやレセプターまでも分解、破壊し、培養細胞に悪影響を与えてしまうため、別途培養細胞とともに回収されたタンパク質分解酵素等の剥離剤をPBS等の洗浄液で置換するのが好ましい。図13は回収された培養細胞に含まれる剥離剤を洗浄液で置換するシステムの一例であり、回収容器Fの下部に接続された排水流路33に培養液、剥離剤を透過させ、細胞の透過を阻止する多孔膜を収容したフィルタ34が接続され、その端部は排水容器Kが接続されている。回収容器Fからとり溶液中の培養細胞はフィルタ34に阻止されて、フィルタ34の表面に堆積する。
排水流路33のフィルタ34の上部には細胞取り出し流路35が第9のバルブ(PV9)を介して接続されている。排水流路33のフィルタ34の下部には、第8のバルブ(PV8)と排水ポンプP3が設けられている。また排水流路33のフィルタ34と第8のバルブ(PV8)の間に培養液供給流路36が接続されている。培養液供給流路36には回収容器Fから培養液容器Lへ培養細胞を含むよう溶液の流入を防ぐ逆止弁37と培養液供給ボンプP4が設けられている。
本発明の細胞培養システムにおいては、各容器に培養液、剥離剤、洗浄剤、及びシリンジに細胞を収容する作業を行ない、洗浄工程、培養液充填工程、細胞充填工程、培養工程及び回収工程のスタートスイッチを押すだけで、自動的に各工程が実施されるので、初心者であっても容易に細胞培養を行うことができる。また全ての工程が密閉系で実施されるため、細胞培養器内に雑菌が侵入することはない。
A 細胞培養器
B 培養液容器
C 洗浄液容器
D 剥離剤容器
E シリンジ
F 回収容器
G 廃液容器
H 制御部
I ガス交換器
J 恒温容器
K 廃液容器
L 洗浄液容器
X 内室
Y 外室
PV1〜PV7 第1のバルブ〜第7のバルブ
P1 第1のポンプ
P2 第2のポンプ
1 剥離剤供給流路
2 洗浄液流路
3 第1の流路
4 第2の流路
5 第1の培養液流路
6 第2の培養液流路
7 第4の流路
8 培養液回収流路
9 廃液流路
10 細胞回収流路
11 第1の分岐
12 第2の分岐
13 第3の分岐
14 第4の分岐
15 細胞充填ポート
B 培養液容器
C 洗浄液容器
D 剥離剤容器
E シリンジ
F 回収容器
G 廃液容器
H 制御部
I ガス交換器
J 恒温容器
K 廃液容器
L 洗浄液容器
X 内室
Y 外室
PV1〜PV7 第1のバルブ〜第7のバルブ
P1 第1のポンプ
P2 第2のポンプ
1 剥離剤供給流路
2 洗浄液流路
3 第1の流路
4 第2の流路
5 第1の培養液流路
6 第2の培養液流路
7 第4の流路
8 培養液回収流路
9 廃液流路
10 細胞回収流路
11 第1の分岐
12 第2の分岐
13 第3の分岐
14 第4の分岐
15 細胞充填ポート
Claims (10)
- 全流路及び膜で内外2室に区画された細胞培養器に洗浄液を供給して洗浄する工程、細胞培養器の各室に培養液を充填する工程、細胞培養器の外室に細胞を注入する工程、細胞培養器の内室に培養液を供給して細胞培養する工程及び培養された細胞を回収する工程からなる細胞培養システムであって、
洗浄液容器と第1の分岐を第2のバルブを介して接続する洗浄液流路と、該第1の分岐の一方と剥離剤容器を第1のバルブを介して接続する剥離剤供給流路と、該第1の分岐の他方と第2の分岐を第2のポンプを介して接続する第2のポンプ流路と、該第2の分岐の一方と第3の分岐を第3のバルブを介して接続する第1の流路と、該第2の分岐の他方と細胞培養器の外室入口とを細胞注入用シリンジ針刺しこみ用の細胞充填ポート及び第4のバルブを介して接続する第2の流路と、該第3の分岐の一方と細培養液容器とを第1のポンプを介して接続する第1の培養液流路と、該第3の分岐の他方と細胞培養器の内室入口を接続する第2の培養液流路と、該細胞培養器の内室出口と第4の分岐を接続する第4の流路と、第4の分岐の一方に第6のバルブを介して廃液を廃液容器に送出する廃液流路と、該第4の分岐の他方にバルブ7を介して培養液回収容器と接続する培養液回収流路と、該細胞培養器の外室出口と第5のバルブを介して接続する培養細胞回収流路と、
上記各バルブ及び各ポンプにバルブ開閉及びポンプ駆動・停止の指令信号を出力する制御手段
を具備した細胞培養システム。 - 該制御手段が、外部からのプライプミング洗浄スタート信号を受けて、第2、第3及び第6のバルブを開放し、第1、第4、第5及び第7のバルブを閉止するとともに、第1のポンプを停止し、第2のポンプを駆動する細胞培養器の内室洗浄手段と、
該第2のポンプからの流量検知信号又はタイマーからの信号を受けて、第2、第3及び第5のバルブを開放し、第1、第4、第6及び第7のバルブを閉止するとともに、第1のポンプを停止し、第2のポンプを駆動する細胞培養器の膜壁洗浄手段と、
該第2のポンプからの流量検知信号又はタイマーからの信号を受けて、第2、第4及び第5のバルブを開放し、第1、第3、第6及び第7のバルブを閉止するとともに、第1のポンプを停止し、第2のポンプを駆動する細胞培養器の外室洗浄手段と、
該第2のポンプからの流量検知信号又はタイマーからの信号を受けて、第2、第3及び第7のバルブを開放し、第1、第4、第5及び第6のバルブを閉止するとともに、第1のポンプを停止し、第2のポンプを駆動する洗浄液回収流路洗浄手段と、
該第2のポンプからの流量検知信号又はタイマーからの信号を受けて、第2及び第3のバルブを開放し、第1、第4、第5、第6及び第7のバルブを閉止するとともに、第2のポンプを駆動し、第1のポンプを逆方向に駆動する培養液流路洗浄手段と、
該第1又は第2のポンプからの流量検知信号、あるいはタイマーからの信号を受けて、第3、第4、第5、第6及び第7のバルブを閉止するとともに、第1及び第2のバルブを開放し、第1及び第2のポンプを停止する剥離剤供給流路洗浄手段
を具備した洗浄回路からなる請求項1記載の細胞培養システム。 - 該制御手段が、外部からの培養液充填スタート信号を受けて、第7のバルブを開放し、第1、第2、第3、第4、第5及び第6のバルブを閉止するとともに、第1のポンプを駆動し、第2のポンプを停止する細胞培養器内室への培養液充填手段と、
該第1のポンプからの流量検知信号又はタイマーからの信号を受けて、第5のバルブを開放し、第1、第2、第3、第4、第6及び第7のバルブを閉止し、第1のポンプを駆動し、第2のポンプを停止する細胞培養器外室への培養液充填手段
を具備した培養液充填回路からなる請求項1記載の細胞培養システム。 - 該制御手段が、外部からの細胞充填スタート信号を受けて、第1、第2、第3、第6及び第7のバルブを閉止し、第4及び第5のバルブを開放し、第2、第3、第6及び第7のバルブを閉止するとともに、第1及び第2のポンプを停止し、その後、細胞注入用シリンジを作動させて培養器の外室に細胞を注入する細胞充填手段
を具備した細胞充填回路からなる請求項1記載の細胞培養システム。 - 該制御手段が、外部からの培養スタート信号を受けて、第7のバルブを開放し、第1、第2、第3、第4、第5及び第6のバルブを閉止するとともに、第1のポンプを駆動し、第2のポンプを停止する細胞培養手段
を具備した細胞培養回路からなる請求項1記載の細胞培養システム。 - 該制御手段が、外部からの回収スタート信号を受けて、第1、第4、第5及び第7のバルブを開放し、第2、第3及び第6のバルブを閉止するとともに、第1のポンプを停止し、第2のポンプを駆動する剥離剤供給手段と、
該第2のポンプからの流量検知信号又はタイマーからの信号を受けて、第1及び第7のバルブを開放し、第2、第3、第4、第5及び第6のバルブを閉止するとともに、第1及び第2のポンプを停止する待機手段と、
タイマーからの信号を受けて、第3及び第4のバルブを開放し、第1、第2、第6及び第7のバルブを閉止し、第5のバルブを開放するとともに、第1のポンプを駆動し、第2のポンプを停止する第一回収手段と、
第1のポンプからの流量検知信号又はタイマーからの信号を受けて、第5のバルブを開放し、第1、第2、第3、第4、第6及び第7のバルブを閉止するとともに、第1のポンプを駆動し、第2のポンプを停止する第二回収手段
を具備した回収回路からなる請求項1記載の細胞培養システム。 - 該洗浄液流路に圧力センサーを設け、該圧力センサーからの信号を受けて、細胞培養器の内室の圧力が設定圧力を超えると第5のバルブを開放し、設定圧力以下で第5のバルブを閉止するパルス発生手段を設けた請求項1記載の細胞培養システム。
- 該洗浄液流路の洗浄液容器の下流に、容器内の洗浄水が切れたことを検知する洗浄液切れセンサーを設けるとともに、該センサーからの検知信号を受けて第2のバルブを閉止する液切れ検出手段を設けた請求項1記載の細胞培養システム。
- 該第2の培養液流路に、ガス交換膜でガス室と培養液室に区画され、かつ各室に培養液の入口、出口及びガスの入口、出口を有するガス交換ユニットを設け、該ガス入口にガス供給流路、ガス出口に炭酸ガスセンサーを設けたガス排出流路を接続し、ガス入口流路に設けられた分岐に空気流路と、流量調整バルブを設けた炭酸ガス流路を接続するとともに、該炭酸ガスセンサーからの信号を受けて該流量調整バルブを調整して炭酸ガスの濃度を調整する炭酸ガス濃度調整手段を設けた請求項1記載の細胞培養システム
- 該細胞培養器を収容する恒温容器を設け、該恒温容器に空気循環流路を接続し、該循環流路にファンとヒーターからなる加温ユニットを設けるとともに、該容器内の温度を検知する温度センサーからの信号を受けて、ヒーターへ流れる電流を調整するか、又はヒーターの遮断、接続により恒温容器内を恒温条件に維持する温度調節手段を設けた請求項1記載の細胞培養システム。
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Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JP2015505472A (ja) * | 2012-02-02 | 2015-02-23 | コーニング インコーポレイテッド | 細胞培養システム |
CN109943483A (zh) * | 2018-11-03 | 2019-06-28 | 宁波大学 | 基于实时补充技术的细胞培养装置及方法 |
WO2020255930A1 (ja) * | 2019-06-20 | 2020-12-24 | シンフォニアテクノロジー株式会社 | 細胞回収方法及び細胞培養装置 |
WO2022186237A1 (ja) * | 2021-03-03 | 2022-09-09 | テルモ株式会社 | サンプリング装置、及び細胞培養システム |
-
2009
- 2009-11-19 JP JP2009264124A patent/JP2011103832A/ja active Pending
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