JP5294296B2 - 細胞培養方法及びその方法を用いた自動培養装置 - Google Patents

Description

本発明は、細胞培養方法及びその方法を実行する細胞培養装置に係り、特に人体の培養細胞に雑菌等を混入(コンタミネーション)させることなく、大量の培養細胞を得ることができる細胞培養方法及び自動細胞培養装置に関するものである。

近年、人体の損傷した組織や機能が低下した臓器等を再生させる再生医療の研究が数多く報告されている。再生医療においては、人体の組織や臓器を構成する細胞を大量に必要とするが、再生医療に必要とされる細胞は、人工的に培養された培養細胞が用いられる。

従来の細胞培養に関連する装置としては、特許文献1に開示されているように、培養室内の温度、ガス濃度等の雰囲気の制御が可能な培養装置と、特許文献2に開示されているような、培養室内の雰囲気の制御に加え、培養容器への培養組織の投入、培養薬剤の給排、更には培養室内の雰囲気の制御をも可能とした自動培養装置がある。
特許第3021789号公報 国際公開WO2005/059091号公報

上記従来の培養装置の前者においては、培養器内の培地の交換、多量の培養細胞を得るために細胞密度を調整する継代培養等の作業は、研究者等の手作業により行われている。この装置の場合、例えば、培地交換や継代などの作業は、作業者が装置の扉を開放した後、菌を培養器内へ混入させないように注意を払いながら、シャーレなどの培養器の蓋を持ち上げ、滅菌されたピペットを用いて注意深く行っている。また、継代培養を重ねる場合には、増えた培養細胞を複数の培養器へ移植する作業を複数回行う必要があることから、熟練者であってもコンタミネーションを引き起こす可能性があった。

一方、上記従来の培養装置の後者の自動培養装置においては、前述のように、細胞の投入、培養薬剤の給排、更には培養室内の雰囲気の制御をも可能となっている。しかし、培養装置内で培養された細胞を取出し容器内へ注入したままの状態で装置外へ自動搬送する方式を採用しており、培養細胞の取り出し時のコンタミネーションにはまだ解決すべき課題が残されていると考えられる。

また、人体の組織や臓器を再生しようとする場合には、大量の培養細胞を必要とするが、大量の培養細胞を得るためには、培養器を大型化することが必要になり、人体から摘出される細胞の量を増やす必要がある。しかし、培養器を大型化すると、培養装置も当然大型化し設置スペースが大きくなるという問題が生ずる。また、人体から摘出する細胞の量を増やすと、人体に大きなダメージを与えるという問題が生ずる。
なお、ゾウリムシのような実験用細胞を大量に増殖させる継代培養技術に関するものとして、特許文献3がある。この特許文献3に記載された技術では、培地が充填された培養容器内で培養された培養細胞に対して、新しい培地を供給して古くなった培地と培養細胞の一部とを洗い流して、培養容器内の培養細胞を希釈するというものである。しかし、本技術では培地で洗い流した細胞はそのまま計測に供されるというもので、人体の再生医療に供される純粋な細胞を大量に取得するものには適さないように思われる。
特開2004-208663号公報

本発明の目的は、上記問題に対応しつつ、人体の再生医療に用いる培養細胞を大量に得ることができる細胞培養方法および自動培養装置を提供することにある。

上記課題を解決するために、本発明の培養方法は、
(1)人体より摘出した細胞と培地とを培養容器へ注入するステップと、(2)培地と前記細胞が入った前記培養容器内の換気と培地の交換を行いつつ、細胞を培養するステップと、(3)前記培養器内で培養された培養細胞の洗浄を行った後、前記洗浄された細胞をその一部を残して前記培養容器内から細胞回収容器へ回収するステップと、(4)前記ステップ(3)において前記培養容器内に残された培養細胞に対し、培地を注入するステップと、(5)前記ステップ(2)とステップ(4)を繰返し実行するステップにより構成される。

また、上記課題を解決するために、本発明の自動培養装置は、培養に必要な複数の薬品を個別に収納する薬品供給ユニットと、細胞培養容器を収納するインキュベータユニットと、前記培養容器内で培養された培養細胞を回収する回収ユニットと、前記培養容器への細胞の供給と、前記薬品供給ユニットから前記培養容器への薬品の供給と、前記培養容器から前記回収ユニットへの培養細胞の排出を行う給排ユニットと、前記培養容器への薬品供給動作と、前記培養容器における細胞培養動作と、前記培養容器からの培養細胞の排出動作とを制御する制御ユニットであって、培養細胞の回収時に前記培養容器内に残された培養細胞に対し、前記給排ユニットによる薬品供給工程を含む細胞培養工程と、培養細胞の排出工程を少なくとも1回行わせる手段を有した制御ユニット、
を備えている。

本発明によれば、人体の再生医療に用いる培養細胞を大量に得ることが可能である。

本発明の自動培養装置のユニット構成を示すブロック図である。 本発明の第1の実施形態の自動培養装置の概略構成を示すブロック図である。 本発明の第1の実施形態における培養容器の斜視図である。 図3に示す培養容器の詳細な側面図である。 培養容器のノズル配管部を示す断面図である。 本発明の培養方法のフローチャートである。 本発明の第2の実施形態の自動培養装置の概略構成を示すブロック図である。

(第1の実施形態)
以下、本発明を、図面を参照しながら説明するが、先ず初めに、本発明の細胞培養方法を実行するための自動培養装置の第1の実施形態を説明する。
図1は、本発明の第1の実施形態の自動培養装置の構成の概要を示すブロック図である。図1において、200は、人体細胞の細胞培養に必要とされる複数の薬品を個別に収納する薬品供給ユニットで、その内部は収納された薬品が劣化しないように常温よりも低い所定の温度範囲に保つことができるように構成されている。300は、インキュベータユニットで、内部には培養容器が収納されている。400は、回収ユニットで、インキュベータユニット内で培養された細胞や、使用済み薬品を回収するユニットである。500は、薬品供給ユニット200とインキュベータユニット300と回収ユニット400との間で、薬品や細胞を供給、排出させる給排ユニットである。600は、環境保全ユニットで、薬品供給ユニット200から培養器へ供給される薬品の温度や、インキュベータユニット300内の温度、炭酸ガス(CO₂)濃度をコントロールするものである。700は、インキュベータユニット30に収納された培養器内の細胞培養状態を観察するための観察ユニットで、顕微鏡や、顕微鏡の移動機構や、培養容器内を照らす照明器具を備えている。800は、上記回収ユニット400、給排ユニット500、環境保全ユニット600、観察ユニット700をコントロールする中央演算処理ユニット(CPU)である。900は、自動培養装置への操作指令を入力する操作器や、前記観察ユニット700で得られた画像を表示するモニタ等を備えた操作ユニットである。

次に、図2を参照して、上記各ユニットの詳細な説明を行う。
薬品供給ユニット200は、開閉可能な蓋を備えた収納ボックス(図示省略)と、この収納ボックスの内部に支持部材によって所定位置に配置された複数(図示例では3個)の薬品収容用の薬品バッグ5，7，9とを備えている。収納ボックスは、薬品バッグ5，7，9内に入れられた薬品の劣化を防止するために、薬品バッグの収容空間を外部と遮断し、薬品バッグが収容される空間を所定の温度に維持するための断熱材を備えている。薬品バッグ5，7，9は、折り畳み可能な柔軟性を有し、かつ細胞に対して毒性を持たない材料で形成された輸液バッグを用いるのが好ましい。具体的には、例えば、塩化ビニール製、またはシリコンゴム製のバッグを用いることが好ましい。なお、薬品バッグ5，7，9には、培養に必要な薬品、この例では、洗浄液、剥離剤、培地が各々個別に収容されている。なお、薬品バッグ7に収容された剥離剤は、接着性を有した細胞を培養対象とする場合に必要とされる薬品であって、培養対象が遊離性を有した細胞である場合には必要がない。

インキュベータユニット300は、恒温槽であるインキュベータ3と、インキュベータ3に収納された培養容器1とを備えている。インキュベータ3は、薬品供給ユニット200と同様に、開閉可能な蓋を備え、蓋を閉じることによって内部を密閉することが可能となっている。そして、インキュベータ3は、培養容器1に対面する底面が透明な材料で形成された観察窓を有し、インキュベータ3の外部から培養容器1が観察できるようになっている。また、インキュベータ3は、後述のヒータによって内部が所定温度となるように恒温制御がなされる。このために、ヒータの加熱効率を高めるために、前記観察窓を除く周囲は、断熱材で覆われていることが好ましい。培養容器1は、人体から摘出された細胞を培養するもので、細胞に対する毒性を持たない材料であって、かつ透光性を有する材料、例えばポリスチレンやポリエチレンフタレートを用いて成形されたものである。また、培養容器1は、内部に挿入された細胞や培養された細胞と雑菌とのコンタミネーションが生ずることがないように、容器の内部を外部空間に対し密閉状態に維持される。このために、培養容器1へ取り付けられるチューブ類の容器取り付け部にはシールが施される。

回収ユニット400は、培養容器1において培養された培養細胞を回収する複数(この例では3個)の細胞回収バッグ11，13，15と、使用済みの薬品を回収する廃液容器65と、細胞回収バッグ11，13，15のチューブ状の注入部を熱シーリングする公知の熱シーリング機構66とを備えている。細胞回収バッグ11，13，15は、薬品バッグ5，7，9と同様に、折り畳み可能な柔軟性を有し、かつ細胞に対して毒性を持たない材料で形成された輸液バッグを用いるのが好ましい。具体的には、例えば、塩化ビニール製、またはシリコンゴム製のバッグを用いることが好ましい。そして、各細胞回収バッグ11，13，15の大きさは、1回の培養で培養容器1において培養された細胞を収納できる収納量を有したものであることが望ましい。また、回収ユニット400が備える細胞回収バッグの数は、この例では3個を示しているが、この数は、少なくとも同一組織細胞を培養容器1で連続的に複数回繰り返して培養を行うだけの数を備えることが望ましい。

給排ユニット500は、培養容器1内へ薬品、細胞、空気を供給するための供給ポンプ35と、培養容器1内から培養された細胞や使用済み薬品を排出する排出ポンプ61と、薬品バッグ5，7，9と培養容器1の間との流路を形成する送液チューブ23，25，27，29と、前記送液チューブ29とインキュベータ3の内部に設けられた後述のフィルタ37とを接続するガスチューブ38と、前記送液チューブ29と液溜め容器43とを接続する細胞注入チューブ39と、インキュベータ3の内部に設けられたフィルタ77と培養容器1の内部空間とを接続するガス交換チューブ75と、上記配管系に設けられたピンチ弁17，19，21，33，40とを備えている。液溜め容器43は、生体から摘出され、培地等と懸濁状態にされた細胞を貯留するもので、開口部が柔軟性を有したフィルム45で覆われたものである。液溜め容器43の蓋を成すフィルム45は、前記懸濁状態の細胞が入ったシリンジ41を穿刺するために設けられている。したがって、フィルム45は、液溜め容器43内へ雑菌等を混入させないために、シリンジ41の穿刺痕を密閉するような柔軟性を有した所定の厚みを有しているものが望ましい。

さらに、給排ユニット500は、培養容器1内の培養細胞や使用済み薬品を排出するための排出ポンプ61と、培養容器1と細胞回収バッグ11，13，15並びに廃液容器65との間の流路を形成する排出チューブ53，55，57，59と、上記排出流路に設けられたピンチ弁47，49，51，63とを備えている。本実施形態においては、ピンチ弁は、柔軟性を有したチューブを押し潰して流路を閉鎖することができる電磁駆動式開閉弁が用いられる。また、供給ポンプと排出ポンプは、柔軟性を有するチューブを、円筒状に配列された複数のローラに巻きつけ、複数のローラを回転してチューブ内の流体を押し出す、いわゆるしごきポンプが用いられる。

環境保全ユニット600は、剥離剤および培地を収納する薬品バッグ19，21から培養容器1へ薬品を流す送液チューブ29の一部に設けられたヒータ31と、図示を省略されているが、インキュベータ3の内部に設けられたヒータ、温度センサー、炭酸ガス(CO₂)センサー等から成る。またインキュベータ3には、CO₂供給管が接続され、このCO₂接続管はCO₂ボンベへ接続されている。ヒータ31は、剥離剤、培地を培養容器1へ供給する過程で暖めるものである。そして、インキュベータ3内に設けられたヒータと温度センサーは培養容器1内の温度を所定の温度に維持するものである。また、CO₂センサーはインキュベータ3の内部のCO₂濃度を検出するものである。

観察ユニット700は、インキュベータ3の観察窓の外部に設置され、培養容器1内の細胞培養状態を観察するための顕微鏡89と、培養容器１を挟んで顕微鏡1に対向して設けられた照明用の光源(図示省略)と、培養容器1の底面に平行な平面内で前記顕微鏡89を2次元的に移動する顕微鏡移動機構(図示省略)とを備えている。顕微鏡89は、撮像した画像情報を電気信号として出力可能なカメラ、例えばCCDカメラを含んで構成される。顕微鏡移動機構は、モータとリニアモーションガイド機構との組合せからなる移動機構をクロス配置し、各モータを個別にまたは連動することで、顕微鏡を任意の位置へ移動することができるようにしたものでよい。

中央演算処理ユニット800は、後述の操作ユニット900から入力された培養条件に従って、上記回収ユニット400、給排ユニット500、環境保全ユニット600、観察ユニット700をコントロールするもので、CPUから成る。CPU800は、ROMを備えており、そのROMに後述の装置の動作を制御するソフトウェアが格納されている。

操作ユニット900は、自動培養装置の動作(培養)条件の入力用操作器と、この操作器から入力された動作条件や前記顕微鏡89で撮像された画像を表示するモニタとを備えている。なお、以上の自動培養装置に組み込まれたポンプ、弁、モータ、ヒータ他のアクチュエータ類は、駆動回路によって駆動されるが、それらは省略されている。

次に、図3、図4を用いて培養器1の詳細な説明を行う。
培養容器1の横断面形状は、特に限定されるものではないが、本実施形態では円形をしたシャーレで、その上部開口には、フランジが形成されている。このフランジの平面を利用して、蓋67が溶着等により固着され、培養容器1は密閉されている。そして、培養容器1の側面には、ノズル69，71，73が挿入され、ノズル69には送液チューブ29が，ノズル71には排出チューブ59が，ノズル73にはガス交換チューブ75が接続されている。なお、図5は、ノズル69と送液チューブ29の接続状態を更に詳細に示す図である。

次に、上記ノズル69，71，73の先端と培養容器1の底面との位置関係を説明する。送液チューブ29へ接続されたノズル69の先端は、培養容器1内の液層(培養時の液面位置)内又は空気層内に位置させられる。そして、排出チューブ59へ接続されるノズル71の先端は、培養が完了した細胞の一部(少量)を次回の培養のために培養容器1内へ残しておく必要があることから、培養容器1の内部底面から所定の隙間を有した位置へ設定される。また、ガス交換チューブ75へ接続されるノズル73の先端は、培養容器1内のガスとインキュベータ3内のガスとの交換のための給排口と成ることから、培養器1内の液層よりも高い位置へ設定される。

次に、本発明の細胞培養方法を、前述の自動培養装置の動作と関連付けて説明する。なお、以下の説明では、培養対象が接着性を有した細胞の場合を例にとって説明する。
(培養開始の準備)
培養開始前に、操作者は、自動培養装置の回収ユニット400へ細胞回収バッグ11，13，15を装着し、X線やγ線等を放射することによって自動培養装置内を滅菌処理する。なお、細胞回収バッグ11，13，15の無菌状態は、バッグの製造が完了してから梱包時までに放射線を照射することで確保しても良い。そして、前記滅菌処理が完了後、操作者は、洗浄液、剥離剤、培地が貯留された薬品バッグ5，7，9を薬品供給ユニット200へ装着する。また操作者は、細胞と培地等が懸濁状態にされた細胞液を、シリンジ41を用いて液溜め43に注入する。これらの作業を終えると、操作者は自動培養装置の電源を投入し、操作ユニット900から培養開始指令を入力する。すると、図6のフローチャートに従って、CPU800が各ユニットを制御することによって細胞培養が実行される。

(ステップ1：培地注入)
培養開始の指令が入力されると、CPU800は、先ず、培地の注入のための制御を実行する。すなわち、CPU800は、給排ユニット500のピンチ弁21とピンチ弁33を開放させる信号を出力し、次いで供給ポンプ35を動作させる信号を出力する。これにより送液チューブ27，29の流路が開放されるとともに、供給ポンプ35が駆動される。供給ポンプ35が駆動されると、薬品バッグ9に貯留された培地が培養容器1へ向けて送液チューブ27，29内を通って送られる。このとき、ヒータ31にはCPU800の指令によって電流が供給されており、それによって培地がチューブ内で暖められる。培地が培養容器1へ所定量送り込まれると、CPU800は供給ポンプ35を駆動したままで、ピンチ弁21を閉じさせる。すると、インキュベータ3内の空気がフィルタ37を介してガスチューブ38、送液チューブ29に吸い込まれる。送液チューブ29内に残留していた培地が無くなったタイミングで、CPU800の指令によって供給ポンプ35は一旦停止させられ、またピンチ弁33が閉じられる。ピンチ弁21を閉じた後に送液チューブ29へ空気を送り込むことによって、送液チューブ29内に残留していた薬品(培地)は、培養容器1へ速やかに送り込まれる。その結果、送液チューブ29の薬品による目詰まりが防止される。

(ステップ2：細胞液注入)
培地の注入が終了すると、細胞液の注入制御がCPU800によって行われる。細胞液は事前準備として、操作者によって液溜め43に貯留されており、CPU800からピンチ弁40を開放させる指令と、供給ポンプ35を駆動させる指令が出力されると、ピンチ弁40が開放され、供給ポンプ35が駆動される。これによって液溜め43から細胞液が送液チューブ39を通って培養容器1内へ注入される。そして、細胞液の注入が終了すると、CPU800からの指令によりピンチ弁40は閉じられ、供給ポンプ35は停止させられる。

(ステップ3：培養開始)
細胞液の注入が終了すると、CPU800は、インキュベータ3の内部のCO₂の濃度制御及びインキュベータ3の内部の温度制御を行いつつ、予め設定された期間について細胞の培養を行う。この予め設定された期間は、例えば3日程度とされるが、細胞の種類、細胞の増殖スピード等によって変更し得る。

(ステップ4：空気送り)
前記設定期間が経過後、培養容器1内の換気が行われる。本実施形態の培養容器1の内部は、細胞培養中はほぼ密閉状態にあり、適宜な期間について、培養容器1内の換気を行う必要がある。このため、CPU800は、ピンチ弁33を開放させる指令と、供給ポンプ35を駆動させる指令を出力する。ピンチ弁33が開き、供給ポンプ35が駆動されると、フィルタ37を介して吸入されたインキュベータ3内の空気がガスチューブ38、送液チューブ29を介して培養容器1内へ(矢印A方向へ)供給され、それと同時に培養容器1内の空気がガス交換チューブ75、フィルタ77を介してインキュベータ3内へ(矢印B方向へ)排出される。図6のフローチャートでは、空気送りは1回とされているが、後述する培地交換時、細胞回収時を除けば何回でも、連続して行っても良い。また、培養容器1内の空気の交換は、フィルタ77からインキュベータ3内の空気を培養容器1内へ(矢印C方向へ)供給し、培養容器1内の空気をフィルタ37からインキュベータ3内へ(矢印D方向へ)排出しても良い。

(ステップ5：培地交換)
培養容器1内の換気が終了後、所定期間を置いて、培地交換が行われる。培地交換は、培地中に溶出する細胞の代謝物質の排除のために培養容器1内の培地を排出し、新しい培地を培養容器1内へ注入することによって栄養分を補給するために、定期的に行われる。通常、図6のステップ3(S3)からステップ5(S5)までの動作は3日〜7日置きに実施されるが、この期間は、予め設定されるか、または細胞の増殖状態に応じて任意に変更できる。培地の排出のためには、CPU800からピンチ弁63を開放させる指令が出力されるとともに、排出ポンプ61を駆動させる指令が出力される。これにより、ピンチ弁63が開放され、排出ポンプ61が駆動され、排出チューブ59、58を介して培養容器1内から細胞の代謝物質を含んだ培地が廃液容器65へ排出される。そして、培地が培養容器1から排出されると、ピンチ弁６３が閉じられ、排出ポンプ61が停止させられる。

培地の排出が完了すると、薬品バッグ9から新しい培地が培養容器1へ供給される。培地の供給のために、CPU800は、ピンチ弁21、33を開放させる指令を出力するとともに、供給ポンプ35を駆動させる指令を出力する。これにより、薬品バッグ9内の培地が送液チューブ27，29、を介して送られ、ヒータ31で暖められて、培養容器1の内部へ所定量だけ注入される。この培地交換が行われると、CPU800は予め設定された培交換の回数になったか否かの判定を行う。そして、培地交換が設定回数に達していない場合には、ステップ4(S4)へ戻り、ステップ5(S5)の空気送り、ステップ6(S6)の培地交換が繰返し行われる。

(ステップ7：空気送り)
そして、培地交換が設定回数に達した場合には、前記ステップ7(S4)の最後の空気送りがステップ4(S4)と同様に行われる。なお、ステップ3(S3)からステップ7(S7)の間における細胞の培養期間内には、インキュベータ3内のCO₂濃度管理、温度管理がCPU800によって継続的に行われる。また培養期間内に、観察ユニット700が操作者により適宜操作され、それにより培養容器1内の培養状態が撮像され、撮像された画像がモニタへ表示される。操作者はモニタへ表示された画像を観察することで培養の進行状態を確認する。

(ステップ8：細胞の回収回数の判定)
ステップ7の空気送りが所定時間、例えば数日間行われると、培養細胞の回収ステップが行われる。培養細胞の回収ステップでは、先ず、これから行われる細胞回収の設定回数に対する判定が行われる。本実施形態では、細胞は3回回収されるように装置へ設定されている。そして、このステップ8(S8)では、培養細胞の回収が3回目であると判定されれば、次の工程はステップ13(S13)の最終の細胞回収工程へ進む。また、培養細胞の回収が1回目又は2回目であれば、次の工程はステップ9(S9)へ進む。

(ステップ9：細胞の回収回数の判定)
ステップ8(S8)において、細胞回収が2回目か否かの判定が行われる。そしてその判定結果が2回目ではない、すなわち1回目と判定されると、次の工程はステップ10(S10)の細胞回収工程へ進み、またその判定結果が2回目であると判定されると、次の工程はステップ11(S11)の細胞回収工程へ進む。

(ステップ10：1回目の細胞回収)
細胞回収が1回目と判定されると、培養容器1内の培地の排出工程と、薬品バッグ5に貯留された洗浄液の注入工程とそれに続く排出工程が行われ、培養細胞の洗浄が行われる。その後、薬品バッグ7に貯留された剥離剤を培養容器1内へ注入する工程が実行される。培養容器1内へ剥離剤が注入され所定時間が経過すると、培養細胞が培養容器1から剥離される。次いで、細胞回収が1回目と判定された結果に対応して、培養容器1の底面から剥離した培養細胞の細胞回収バッグ11への回収工程が実行される。

このために、CPU800は、先ず培地の排出のために、ステップ5(S5)で述べた培地排出と同様に、ピンチ弁63を開放させる指令と、排出ポンプ61を駆動させる指令を出力する。これによって、培養容器1内の培地が排出される。培地の排出が終了すると、CPU800の指令によって、ピンチ弁63は閉じられ、排出ポンプ61は停止させられる。これに引き続いて、CPU800は、洗浄液を培養容器1内へ注入するために、ピンチ弁17，33を開放させる指令を出力するとともに、供給ポンプ35を駆動させる指令を出力する。これによって、ピンチ弁17，33が開放され、また供給ポンプ35が駆動され、薬品バッグ5に貯留された洗浄液が培養容器1内へ注入される。必要とされる量の洗浄液が培養容器1内へ注入されると、供給ポンプ35が停止され、ピンチ弁17，33が閉じられる。洗浄液によって培養細胞の洗浄が終了した後、洗浄液はステップ5で述べた培地排出と同様に廃液容器65へ送られる。そして、洗浄液が培養容器1から排出されると、CPU800は、剥離剤を培養容器1内へ注入するために、ピンチ弁19，33を開放させる指令と、供給ポンプ35を駆動させる指令を出力する。これによって、ピンチ弁19，33が開放され、供給ポンプ35が駆動され、薬品バッグ7に貯留された剥離剤が培養容器1内へ注入される。剥離剤の注入が終了すると、供給ポンプ35が停止され、ピンチ弁19，33が閉じられる。そして、しばらく時間が経過すると、剥離剤が培養容器1の底面に付着した培養細胞を浮き上がらせる。培養細胞が培養容器1の底面から剥離されたタイミングで、CPU800は、培養容器1内へ培地を注入する。ここでの培地の注入は、細胞に悪影響を与える剥離剤の効き目を弱めるために行われる。このために、CPU800は、ピンチ弁21，33を開放させる指令と、供給ポンプ35を駆動させる指令を出力する。これによって、ピンチ弁21，33が開放され、供給ポンプ35が駆動されて、薬品バッグ9から培地が培養容器1内へ注入される。培地の注入が終了すると、供給ポンプ35が停止され、ピンチ弁21，33が閉じられる。

剥離剤の効き目を弱めるために培地を注入すると、剥離剤による培養細胞への悪影響の減少と引き換えに、培養細胞が再び培養容器1に付着し易くなるので、速やかに培養細胞の回収が行われる必要がある。このために、CPU800は、培地の注入後、速やかにピンチ弁を開放させる指令(ここでは、第1回目の回収であるので、ピンチ弁47が開放される)と、排出ポンプ61を駆動させる指令を出力する。これによって、培養容器1内の培養細胞は排出チューブ59，53を通って細胞回収バッグ11に回収される。排出チューブ59，53へ培養細胞が吸入されなくなると、CPU800は、ピンチ弁47を閉じさせ、また排出ポンプ61を停止させる。その後、CPU800から熱シーリング機構66へ細胞回収バッグ11のチューブ部分を熱圧着する指令を出力する。これによって、細胞回収バッグ11のチューブ部分が熱シールされる。その後、細胞回収バッグ11は、操作者によって装置から切り離される。装置から切り離された培養細胞入りバッグは、保冷庫に保管される。

ここで、培養容器1に取り付けられたノズル71の先端と培養容器1の底面との間には所定の隙間が設けられているので、培養細胞の一部が回収されずに培養容器1内に残されたままとなる。本発明の要旨は、この培養容器1内に残存する、または残存させられた培養細胞を繰返し培養することで、大量の培養細胞を得ることにある。

(2回目の細胞培養)
このために、ステップ10(S10)の1回目の細胞回収が終了すると、CPU800は、培養容器1内に残された細胞に対して、ステップ3(S3)からステップ9(S9)までを再実行する。これによって、培養容器1内に残された細胞が培養される。CPU800はステップ8(S8)、ステップ9(S9)にて今回の細胞回収は何回目かを判定する。ここでの判定結果は2回目となる。

(ステップ11：2回目の細胞回収)
ステップ9(S9)において細胞回収が2回目と判定されると、ステップ11(S11)において、ステップ10(S10)における細胞回収と同様な順序で2回目の細胞回収が行われる。ただし、このステップ11(S11)における2回目の細胞回収においては、ステップ9(S9)の判定結果に対応して、CPU800の指令によって、培養容器1から排出された細胞は細胞回収バッグ13へ回収され、熱シーリング機構66は、細胞回収バッグ13のチューブ部分を熱圧着する点がステップ10(S10)とは異なる。

(3回目の細胞培養)
ステップ11(S11)の2回目の細胞回収が終了すると、CPU800は、培養容器1内に残された細胞に対して、ステップ3(S3)からステップ9(S9)までを再度繰り返し実行する。これによって、培養容器1内に残された細胞が培養される。CPU800はステップ8(S8)、ステップ9(S9)にて今回の細胞回収は何回目かを判定する。ここでの判定結果は3回目となる。

(ステップ12：3回目の細胞回収)
ステップ9(S9)において細胞回収が3回目と判定されると、ステップ12(S12)において、ステップ10(S10)における細胞回収と同様な順序で3回目の細胞回収が行われる。ただし、このステップ12(S12)における3回目の細胞回収においては、ステップ9(S9)の判定結果に対応して、CPU800の指令によって、培養容器1から排出された細胞は細胞回収バッグ15へ回収され、熱シーリング機構62は、細胞回収バッグ15のチューブ部分を熱圧着する点がステップ10(S10)とは異なる。

3回目の培養細胞の回収が終わると、回収された培養細胞が収容された細胞回収バッグ11，13，15は、臨床の場に運ばれて、培養細胞が人体の組織再生に供される。

以上説明したように、本実施形態によれば、培養容器で培養された細胞を回収する際に、その一部を培養容器に残し、培養容器に残された細胞を再度培養することで、細胞を大量に増殖することができる。そして、本実施形態では、培養容器に残された細胞を再度培養することから、小さなサイズの培養容器を使用することができる。これを従来の継代培養のように、一度培養容器で培養された培養細胞を別の複数の培養容器へ移して培養を継続するものと比較して、装置の小型化が計れる。さらに、本実施形態によれば、生体から組織細胞を摘出することは1回でよいことから、生体の損傷を小さくすることができる。

また、本実施形態によれば、生体から摘出した細胞はシリンジによってフィルタつきの液溜めへ注入されるので、培養容器へ細胞を収容する際の細胞と雑菌のコンタミネーションが防止できる。さらに、本実施形態によれば、培養細胞は細胞回収バッグへ自動的に回収されるとともに、細胞回収バッグは、熱シーリングして細胞回収バッグ内と外部環境とを遮断して取出されるので、細胞回収に際しての細胞と雑菌のコンタミネーションが防止できる。

さらに、本実施形態によれば、培養容器内へ薬品を供給する時、培養容器内の空気がインキュベータ内に通じるノズルから、供給される薬品の量に応じた培養容器内の空気が追い出されることから、スムーズに培養容器内へ薬品を注入できる。また、同様に、培養容器内の薬品などの液体を排出する際に、インキュベータ内に通じるノズルから、排出される薬品や細胞を含む液体の排出量に応じて、培養容器内へ空気が供給されるから、スムーズに培養容器内の液体の抜出しができる。

また、本実施形態によれば、培養容器への空気の給排は、フィルタを介して行われるので、クリーンな培養環境が提供され、維持される。

本実施形態では、細胞培養と回収を繰り返して合計3回行う例を挙げて説明したが、本発明はこれに限定されることはない。細胞培養と回収の繰返し回数は、必要とされる細胞の量によって少なくとも2回以上であれば、任意に設定しても良い。その場合、培養細胞を回収する回数に応じて、回収ユニットに設ける細胞回収バッグの数及びピンチ弁の数を変更すれば良い。なお、細胞回収時の細胞と雑菌のコンタミネーションを防止する装置を設けることができれば、予め複数の細胞回収バッグを自動培養装置へ装填する必要はなく、必要なときに、細胞回収バッグを自動培養装置へ装填する方法を採用しても良い。

また、本実施形態では、図5に示すように、培養容器の側面にノズル69，71，73が設けられているので、複数の培養容器を重ねてインキュベータ内に配置するような変形例にも対応が可能である。

さらに、本実施形態の培養装置は、ほぼ継続的に細胞を培養することができ、また所定時間間隔で細胞を回収できる。したがって、患者の臓器や組織等を複数回に分けて再生治療する場合、例えば間葉系幹細胞を補助的に利用する白血病治療等を行う場合に、間葉系幹細胞を所定間隔で数度にわたって供給することができる。

上記実施形態のように、細胞回収バッグ11，13，15と廃液容器65を1台の排出ポンプ61の吐出管路に、それぞれピンチ弁47，49，51，63を介して接続すると、廃液や回収細胞が管路に残っている場合があり得る。これらの廃液や死滅細胞、更には細胞の代謝物質が回収系管路に残っていると、繰り返して行われる次回の培養細胞回収時にコンタミネーションが発生してしまう。このようなコンタミネーションの発生を防止する必要がある。

(第2の実施形態)
図7は、このようなコンタミネーションの発生を防止することができる第2の実施形態の自動培養装置の構成を示している。図7に示すように、本実施形態の自動培養装置は、前記第1の実施形態との比較において、第1の実施形態の培養容器1に設けられた排出系のノズル71に替えて、細胞回収バッグ11，13，15と廃液容器65との数(計4個)に対応するノズル101，103，105，107が設けられている点が異なる。すなわち、ノズル101，103，105，107には、それぞれに排出チューブ119，121，123，125が接続されている。これらの排出チューブ119，121，123には、それぞれに細胞回収バッグ11，13，15が接続され、排出チューブ125には廃液容器65が接続されている。そして、これらの排出チューブ119，121，123，125の中間には、それぞれピンチ弁47，49，51，63並びに排出ポンプ111，113，115，117が図に示すように接続されている。なお、図面ではピンチ弁47，49，51，63は、排出ポンプの吸引側に取り付けられているが、それらは排出ポンプの吐出側に取り付けても良い。なお、本実施形態においても排出ポンプ111，113，115，117及びピンチ弁47，49，51，63はCPU800の指令によって動作がなされる。

上記の如く構成された本実施形態の自動培養装置は、第1の実施形態の自動培養装置とは、培養容器1内の液体を排出する時の動作が異なる。すなわち、培養容器1内の廃液を排出する際には、ピンチ弁63が開放され、排出ポンプ117が駆動される。また、培養容器1内の細胞を回収する際には、1回目の細胞回収時はピンチ弁47が開放され、排出ポンプ111が駆動される。また、2回目の細胞回収時はピンチ弁49が開放され、排出ポンプ113が駆動され、3回目の細胞回収時はピンチ弁５１が開放され、排出ポンプ115が駆動される。

本実施形態によれば、第1の実施形態の効果に加えて、排出チューブ119，121，123，125が独立して設けられているので、2回目以降に回収される細胞に、廃液や細胞の代謝物質が混入することはなくなる。したがって、クリーンな培養細胞が得られる。

上記第2の実施形態は、2回目以降の回収細胞へ前回の回収時に管路に残された廃液と細胞の代謝物質との双方が混入することを避ける実施形態であるが、2回目以降の回収細胞へ廃液のみが混入しないように変形することができる。その実施形態は、上記第2の実施形態を参照して、第1の実施形態に対し廃液の回収系のみを独立して設けることで可能である。

Claims (19)

1. 培養に必要な複数の薬品を個別に収納する薬品供給ユニットと、
   人体細胞培養シャーレを収納するインキュベータユニットと、
   前記培養シャーレ内で培養された培養人体細胞を回収する回収ユニットと、
   前記培養シャーレへの人体細胞の供給と、前記薬品供給ユニットから前記培養シャーレへの薬品の供給と、前記培養シャーレから前記回収ユニットへの培養人体細胞の排出を行う給排ユニットと、
   前記培養シャーレへの薬品供給動作と、前記培養シャーレにおける人体細胞培養動作と、前記培養シャーレからの培養人体細胞の排出動作とを制御する制御ユニットであって、培養人体細胞の回収時に前記培養シャーレ内に残された培養人体細胞に対し、前記給排ユニットによる薬品供給工程を含む人体細胞培養工程と、培養人体細胞の排出工程とを少なくとも１回行わせる手段を有した制御ユニット、
   を備えたことを特徴とする自動培養装置。
2. 前記給排ユニットは、前記薬品供給ユニットに設けられた複数の薬品バッグから選択的に１つの薬品を前記培養シャーレへ供給するための供給用チューブ配管と、このチューブ配管へ設けられた弁と、供給ポンプとを有することを特徴とする請求項１に記載の自動培養装置。
3. 前記複数の薬品バッグに収納された薬品には、培地と、洗浄液とが含まれることを特徴とする請求項２に記載の自動培養装置。
4. 前記複数の薬品バッグに収納された薬品には、更に剥離剤が含まれることを特徴とする請求項３に記載の自動培養装置。
5. 前記給排ユニットは、培養人体細胞を回収する複数の回収バッグと、使用済み薬品を収容する廃液容器と、前記培養シャーレから使用済み薬品と培養人体細胞とを前記回収バッグまたは廃液容器へ選択的に排出するための排出用チューブ配管と、このチューブ配管へ設けられた弁と、排出ポンプとを有することを特徴とする請求項１に記載の自動培養装置。
6. 前記培養シャーレには、前記給排ユニットへ接続されるノズルが複数個設けられていることを特徴とする請求項１に記載の自動培養装置。
7. 前記給排ユニットの排出用チューブ配管へ接続される前記ノズルの培養シャーレ内に位置する先端と前記培養シャーレの底面との間に所定の隙間が設けられ、この隙間によって培養人体細胞の回収時に、培養人体細胞の一部が培養シャーレ内へ残されることを特徴とする請求項６に記載の自動培養装置。
8. 前記回収バッグは、熱圧着性を有した材料から成り、前記排出用チューブ配管へ接続するためのチューブ部分を有すことを特徴とする請求項５に記載の自動培養装置。
9. 前記給排ユニットは、前記制御ユニットからの指令によって特定された回収バッグのチューブ部分を熱圧着する熱シーリング機構を備えていることを特徴とする請求項８に記載の自動培養装置。
10. 前記排出ユニットの排出用チューブ配管は、前記培養シャーレへ接続された単一のチューブと、複数の回収バッグと廃液容器とへ接続された複数のチューブとが接続されて構成され、排出ポンプは前記単一のチューブへ配置され、弁は複数の回収バッグと廃液容器とへ接続されたチューブの各々へ配置されていることを特徴とする請求項５に記載の自動培養装置。
11. 前記排出ユニットの排出用チューブ配管は、前記培養シャーレと廃液容器及び複数の回収バッグとを個別に接続する数のチューブを有し、各々のチューブには排出ポンプと弁が配置されていることを特徴とする請求項５に記載の自動培養装置。
12. 前記排出ユニットの排出用チューブ配管は、前記培養シャーレと廃液容器とを接続する廃液用チューブと、前記培養シャーレへ接続された単一のチューブとこの単一のチューブと複数の回収バッグとを接続する複数のチューブとから成り、前記廃液用チューブと前記培養シャーレへ接続された単一のチューブとの各々へ排出ポンプと弁が配置されていることを特徴とする請求項５に記載の自動培養装置。
13. （１）人体より摘出した人体細胞と培地とを培養シャーレへ注入するステップと、
    （２）培地と前記人体細胞が入った前記培養シャーレ内の換気と培地の交換を行いつつ、人体細胞を培養するステップと、
    （３）前記培養シャーレ内で培養された培養人体細胞の洗浄を行った後、前記洗浄された人体細胞をその一部を残して前記培養シャーレ内から細胞回収容器へ回収するステップと、
    （４）前記ステップ（３）において前記培養シャーレ内に残された培養人体細胞に対し、培地を注入するステップと、
    （５）前記ステップ（２）とステップ（３）を繰返し実行するステップ
    を含む人体細胞培養方法。
14. 前記ステップ（４）とステップ（５）を少なくとも１回行うことを特徴とする請求項１３に記載された人体細胞培養方法。
15. 前記ステップ（３）における人体細胞の回収ステップには、前記培養シャーレ内の培養人体細胞を洗浄するステップに続いて、剥離剤を注入することによって前記培養シャーレから培養人体細胞を剥離するステップを含むことを特徴とする請求項１３に記載の人体細胞培養方法。
16. 前記ステップ（３）における剥離剤注入に続いて、剥離剤の培養人体細胞への影響を弱めるために新しい培地を前記培養シャーレへ注入するステップを含むことを特徴とする請求項１５に記載の人体細胞培養方法。
17. 前記ステップ（５）において回収される培養人体細胞は、ステップ（３）において人体細胞が回収される容器とは異なる容器へ回収されることを特徴とする請求項１３に記載の人体細胞培養方法。
18. 前記ステップ（５）において回収される培養人体細胞は、ステップ（３）において人体細胞が回収される容器とは異なる容器へ回収されることを特徴とする請求項１５に記載の人体細胞培養方法。
19. 前記ステップ（５）において回収される培養人体細胞は、ステップ（３）において人体細胞が回収される容器とは異なる容器へ回収されることを特徴とする請求項１６に記載の人体細胞培養方法。

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