CN102093954B - 一种细胞培养装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种细胞培养装置，包括集成在一个机体内的控制系统、冷藏箱、加液机构、第一离心机、第二离心机、血浆制备器、培养箱、视频检视系统和层流洁净系统。本发明细胞培养装置，装置中集成有血浆制备器，用于进行血浆的激活得到激活血浆，进行细胞培养时，在诱导期以及生长培养期均加入激活血浆，由于激活血浆与被培养细胞同源，可使被培养细胞更易接受培养环境，从而提高培养细胞的产量。另外，由于本发明细胞培养装置的各个部件均集成在一起，无需特殊的空间环境场所，整个过程全部有装置自动执行，隔离人体接触，减少操作污染的机会，最大程度保障细胞培养过程的清洁，可提高培养出的细胞的质量。

Description

一种细胞培养装置及方法

技术领域

本发明涉及细胞体外培养，特别是涉及一种大规模自动培养细胞的细胞培养装置及方法。

背景技术

恶性肿瘤是目前危害人类身体健康的主要疾病之一，1990年，恶性肿瘤已成为中国人病死率第一位的疾病，到2008年，年间每10万人中有153.6人因恶性肿瘤死亡，占病死率的27.12%，高于心脏病、脑血管疾病的19.65%和19.62%。目前，恶性虽通过外科根治性切除，结合放射线治疗和化学药物治疗，依然有近50%癌正患者死于术后复发和转移。而放疗和化疗虽然能够作用于无法进行手术治疗的肿瘤，但均具有严重的副作用，对机体组织伤害大，而且某些肿瘤细胞对其不敏感，疗效也不理想。

免疫细胞治疗作为一种癌症新型治疗手段，得到日益广泛的应用。免疫细胞治疗是指将自身或异体的抗肿瘤效应细胞的前体细胞，在体外采用激活剂进行诱导、激活和扩增，然后输入给肿瘤患者，从而提高患者的抗肿瘤免疫力，以达到治疗和预防复发的目的。与传统的治疗方法相比，该方法具有疗效确切、对人体损伤小、不良反应低、疗效维持时间长以及能有效防止术后复发等优点。

然而抗癌免疫细胞的培养不同于药物生产，免疫细胞无法灭菌处理，因此要求更高的无菌操作环境和无菌操作技术。抗癌免疫细胞的生产既受患者个体差异的影响，也受培养技术的限制。如何进行免疫细胞的大规模培养是免疫细胞治疗的新挑战。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：弥补上述现有技术的不足，提出一种细胞培养装置及方法，可进行细胞的大规模批量生产。

本发明的技术问题通过以下的技术方案予以解决：

一种细胞培养装置，包括集成在一个机体内的控制系统、冷藏箱、加液机构、第一离心机、第二离心机、血浆制备器、培养箱、视频检视系统和层流洁净系统。

优选的技术方案中， 

所述控制系统控制所述加液机构、所述第一离心机、所述第二离心机、所述血浆制备器、所述培养箱和所述视频检视系统的工作，并设置所述培养箱和所述冷藏箱内的环境；所述冷藏箱用于存放细胞培养所需的材料；所述加液机构在所述控制系统的控制下将材料定量加入到相应的器皿中；所述第一离心机对加入的血液进行分离、漂洗和收集；所述第二离心机对培养好的细胞进行出库前的清洗和分离；所述血浆制备器对所述第一离心机分离得到的血浆进行血浆激活；所述培养箱用于细胞的培养繁殖；所述视频检视系统用于观察所述培养箱内细胞的生长状态；所述层流洁净系统控制所述培养装置内的洁净度。

所述控制系统控制所述加液机构、所述第一离心机和所述血浆制备器针对不同来源的血液依次制备各来源血液的淋巴细胞和激活血浆，并控制所述加液机构将制备的所述淋巴细胞和激活血浆按来源不同分别送入所述培养箱中不同的培养瓶中同时进行诱导培养，并待诱导期培养结束后将不同来源的细胞溶液转移至不同的培养袋中同时进行生长期培养。

所述血浆制备器包括加热装置和离心装置；所述加热装置用于对所述离心机分离得到的血浆进行加热至56℃，并保持该温度30-60min；所述控制系统控制所述加液机构将加热后的血浆送入4摄氏度条件下冷却30-60min后送入所述离心装置，所述离心装置用于对冷却后的血浆进行离心操作。

所述培养箱为水车式转动二氧化碳培养箱，所述控制系统设置所述水车式转动二氧化碳培养箱内温度为25-37摄氏度，控制所述水车式转动二氧化碳培养箱内空气中二氧化碳的体积浓度百分比为5%。

所述冷藏箱包括两个冷藏柜，所述控制系统设置其中一个冷藏柜的温度为-20摄氏度，设置另一个冷藏柜的温度为4摄氏度。

所述控制系统、冷藏箱、加液机构、离心机、血浆制备器、培养箱和视频检视系统集成在超净工作空间内。

所述冷藏箱、离心机、培养箱、视频检视系统设置在万级超净工作柜内部，所述加液机构设置在百级超净工作柜内部。

本发明的技术问题通过以下进一步的技术方案予以解决：

一种细胞培养方法，包括以下步骤：1）取血液导入离心机中分离得到血浆及血细胞；2）将步骤1）中分离得到的血浆进行血浆激活得到激活血浆；3）将步骤1）中分离得到的血细胞中加入缓冲液、分离液后重新导入所述离心机中分离，得到中层淋巴细胞溶液；4）所述淋巴细胞溶液中的淋巴细胞经培养液漂洗后，加入诱导培养液和所述激活血浆后进行诱导培养；5）诱导培养期完成后将步骤4）中细胞溶液转移至大规模培养瓶或培养袋中，加入培养液及所述激活血浆，进行生长期培养；6）待生长期培养完成后使用生理盐水稀释漂洗淋巴细胞，进行质量检测、出库。

优选的技术方案中，

所述步骤2）中血浆激活包括如下步骤：2-1）将分离得到的血浆加热至56℃，保持该温度30-60min；2-2）将加热后的血浆在4℃条件下冷却30-60min；2-3）将冷却后的血浆进行离心操作。

本发明与现有技术对比的有益效果是：

本发明的细胞培养装置及方法，将细胞培养所需的部件，如控制系统、冷藏箱、加液机构、离心机、培养箱、视频检视系统和层流洁净系统均集成在一个机体内的，可实现细胞的培养生产。同时装置中集成有血浆制备器，用于进行血浆的激活得到激活血浆，进行细胞培养时，在诱导期以及生长培养期均加入激活血浆，由于激活血浆与被培养细胞同源，可使被培养细胞更易接受培养环境，从而提高培养细胞的产量。另外，由于本发明中，细胞培养装置的各个部件均集成在一起，无需特殊的空间环境场所，整个过程全部有装置自动执行，隔离人体接触，减少操作污染的机会，最大程度保障细胞培养过程的清洁，可提高培养出的细胞的质量。

附图说明

图1是本发明具体实施方式中细胞培养装置的结构示意图；

图2是本发明具体实施方式中细胞培养装置的各部件在控制系统的控制下的工作流程图；

图3是本发明具体实施方式中细胞培养方法的流程图。 

具体实施方式

下面结合具体实施方式并对照附图对本发明做进一步详细说明。

本具体实施方式中细胞培养装置的结构示意图如图1所示，包括控制系统、冷藏箱、加液机构、第一离心机、第二离心机、血浆制备器、培养箱、视频检视系统、层流洁净系统和废液箱，上述部件均集成在机体内。

其中，细胞培养装置所需的材料，如血液、缓冲液、分离液、培养液、诱导培养液、生理盐水等，通过入库接口进入装置内冷藏箱中储藏。培养好的细胞溶液通过出库接口转移出去。

控制系统控制加液机构、离心机、培养箱和视频检视系统的工作，并设置培养箱和冷藏箱内的环境。优选地，冷藏箱包括两个冷藏柜，控制系统设置其中一个冷藏柜的温度为-20摄氏度，用于储藏血液、缓冲液、分离液、生理盐水等；控制系统设置另一个冷藏柜的温度为4摄氏度，用于储藏培养液和诱导培养液。而培养箱为水车式转动二氧化碳培养箱，通过培养箱的转动使得培养液流动，可提高被培养的细胞的活力，从而提高培养成功率和效率。控制系统设置水车式转动二氧化碳培养箱内温度为25-37摄氏度，控制箱内空气中二氧化碳的体积浓度百分比为5%。

加液机构在控制系统的控制下将材料定量加入到相应的器皿中。

离心机对加入的细胞进行分离、漂洗和收集。

血浆制备器对离心机分离得到的血浆进行血浆激活，该激活后的血浆作为后续细胞的诱导培养期和生长期的材料之一。优选地，血浆制备器包括加热装置和离心装置；加热装置和离心装置均在控制系统的控制下进行相应操作。

培养箱用于细胞的培养繁殖。

视频检视系统用于观察培养箱内细胞的生长状态。

层流洁净系统控制整个培养装置内的洁净度，包括对空气和相关物品的消毒。

优选地，控制系统、冷藏箱、加液机构、离心机、血浆制备器、培养箱和视频检视系统集成在超净工作空间内。进一步优选地，冷藏箱、离心机、培养箱、视频检视系统设置在万级超净工作柜内部，加液机构设置在百级超净工作柜内部。

各部件在控制系统控制下，工作流程如图2所示，包括以下步骤：

1）分离离心：加液机构从冷藏箱中取一定量的血液导入离心机中，离心机对加入的血液进行离心分离操作，得到血浆和血细胞。

2）激活血浆：加液机构将上层血浆导入血浆制备器中进行血浆激活，该激活的血浆由加液机构移送至冷藏箱中存储，控制系统记录激活后血浆的储存位置。

具体地，血浆激活步骤包括：加热装置将上层血浆加热至56℃，保持该温度30-60min；然后控制系统控制加液机构将加热后的血浆送入4摄氏度条件下冷却30-60min后送入离心装置，离心装置对冷却后的血浆进行离心操作。对离心操作后的血浆抽取上层血浆溶液，该上层血浆溶液即为激活的血浆。

3）分离血细胞溶液：加液机构从冷藏箱中取一定量的缓冲液、分离液加入到上述剩余的血细胞溶液中，由离心机离心分离得到淋巴细胞溶液，剩余溶液回收至废液箱。

4）漂洗淋巴细胞：由加液机构从冷藏箱中取一定量培养液对离心机的离心瓶中的淋巴细胞溶液进行漂洗。

5）诱导期培养：由加液机构从冷藏箱中取一定量诱导培养液、过程2）中的激活血浆以及步骤4）中离心瓶中漂洗后的淋巴细胞至水车式转动二氧化碳培养箱的培养瓶内进行诱导期培养。于此同时，控制系统记录培养瓶的储存位置。

6）生长期培养：待诱导期培养完成后，加液机构将水车式转动二氧化碳培养箱的培养瓶中的细胞溶液转移至水车式转动二氧化碳培养箱的培养袋中，并从冷藏箱中取一定量诱导培养液、过程2）中的激活血浆加入其中，进行生长期培养。

7）分离细胞溶液：待生长期培养完成后，加液机构将水车式转动二氧化碳培养箱的培养袋中的细胞溶液转移至离心机进行分离，得到含有大批量细胞的细胞溶液，废液由离心瓶底部接口到处至废液箱。

8）冲洗细胞：加液机构从冷藏箱中取一定量生理盐水，冲洗离心瓶内细胞，冲洗后由离心机进行分离操作得到细胞和清洗液，清洗液由离心瓶底部接口到处至废液箱。

9）稀释细胞：加液机构从冷藏箱中取一定量生理盐水，稀释离心瓶内细胞，得到细胞生理盐水溶液。

10）出库：加液机构将离心瓶内细胞生理盐水溶液，通过出库接口转移至出库容器，完成出库。

整个工作过程中，可以通过视频检视系统监控操作过程以及细胞的培养状况。在培养过程中，也可以通过控制系统修改培养计划，随时调整细胞的培养过程。另一方面，也可通过控制系统的控制实现不同来源，如a病人个体和b病人个体的血液的同时培养。具体地，通过控制系统先控制加液机构、第一离心机和血浆制备器针对a个体和b个体的血液依次制备a病人个体的淋巴细胞和激活血浆、b病人个体的淋巴细胞和激活血浆，并控制加液机构将制备的a病人个体的淋巴细胞和激活血浆送入培养箱中的一个培养瓶中，将制备的b病人个体的淋巴细胞和激活血浆送入培养箱中的另一个培养瓶中，同时进行a病人个体和b病人个体细胞的诱导培养。待诱导期培养结束后将a病人个体和b病人个体的细胞溶液转移至不同的培养袋中同时进行生长期培养，从而实现不同源细胞的同时培养，节约培养时间。

本具体实施方式中，细胞培养装置中集成有血浆制备器，能激活血浆。在诱导期以及生长培养期均加入激活血浆到细胞培养溶液中，由于激活血浆与被培养细胞同源，可使被培养细胞更易接受培养环境，从而提高培养细胞的产量。另一方面，由于细胞培养装置的各个部件均集成在一起，无需特殊的空间环境场所，整个过程全部有装置自动执行，隔离人体接触，减少操作污染的机会，最大程度保障细胞培养过程的清洁，可提高培养出的细胞的质量。

本具体实施方式在，还提出一种细胞培养方法，包括以下步骤：1）取血液导入离心机中分离得到血浆及血细胞；2）将步骤1）中分离得到的血浆进行血浆激活得到激活血浆；3）将步骤1）中分离得到的血细胞中加入缓冲液、分离液后重新导入离心机中分离，得到中层淋巴细胞溶液；4）淋巴细胞溶液中的淋巴细胞经培养液漂洗后，加入诱导培养液和激活血浆后进行诱导培养；5）诱导培养期完成后将步骤4）中细胞溶液转移至大规模培养瓶或培养袋中，加入培养液及激活血浆，进行生长期培养；6）待生长期培养完成后使用生理盐水稀释漂洗淋巴细胞，进行质量检测、出库。

优选地，步骤2）中血浆激活包括如下步骤：2-1）将分离得到的血浆加热至56℃，保持该温度30-60min；2-2）将加热后的血浆在4℃条件下冷却30-60min；2-3）将冷却后的血浆进行离心操作。抽取离心后的上层血浆溶液，该上层血浆溶液即为激活的血浆。

如图3所示，为针对50ml的血液，采用本具体实施方式的细胞培养方法进行大批量细胞培养生产的流程示意图：

1）抽取50ml血并离心分离，分离过程中采用光照、视频观察。

2）进行血浆激活：抽取25ml上层溶液，加热至56℃，保持该温度30-60min；于4℃条件下冷却30-60min；离心操作，抽取23ml上层血浆溶液，该上层血浆溶液即为激活的血浆。

3）分离血浆溶液：将步骤1）剩余的25ml下层溶液加入25ml缓冲液混合，加入50分离液离心，抽取中层淋巴细胞溶液。分离过程中也采用光照、视频观察。

4）淋巴细胞经培养液漂洗3次后，加入培养液和步骤2）中的血浆，置入培养瓶，培养3-7天。

5）待诱导培养期结束后，将步骤4）中的细胞溶液转移至生产培养袋培养，每3天田炯培养液、血浆，培养约14-28天。

6）待生长期培养结束后，离心细胞溶液，用生理盐水漂洗淋巴细胞3次。

7）再次加入生理盐水混合稀释淋巴细胞，进行质量检测、出库。

由于本具体实施方式中，增加激活血浆的步骤，在后续进行诱导期培养和生长期培养时均加入激活血浆，可提高培养出的细胞的产量。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下做出若干替代或明显变型，而且性能或用途相同，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种细胞培养装置，其特征在于：包括集成在一个机体内的控制系统、冷藏箱、加液机构、第一离心机、第二离心机、血浆制备器、培养箱、视频检视系统和层流洁净系统；所述控制系统控制所述加液机构、所述第一离心机、所述第二离心机、所述血浆制备器、所述培养箱和所述视频检视系统的工作，并设置所述培养箱和所述冷藏箱内的环境；所述冷藏箱用于存放细胞培养所需的材料；所述加液机构在所述控制系统的控制下将材料定量加入到相应的器皿中；所述第一离心机对加入的血液进行分离、漂洗和收集；所述第二离心机对培养好的细胞进行出库前的清洗和分离；所述血浆制备器对所述第一离心机分离得到的血浆进行血浆激活；所述培养箱用于细胞的培养繁殖；所述视频检视系统用于观察所述培养箱内细胞的生长状态；所述层流洁净系统控制所述培养装置内的洁净度；所述细胞培养装置还包括入库接口、出库接口和废液箱，所述细胞培养装置所需的材料通过所述入库接口进入装置内冷藏箱中储藏；培养好的细胞溶液通过所述出库接口转移出去；所述废液箱用于存放细胞培养过程中的废弃液。

2.根据权利要求1所述的细胞培养装置，其特征在于：所述控制系统控制所述加液机构、所述第一离心机和所述血浆制备器针对不同来源的血液依次制备各来源血液的淋巴细胞和激活血浆，并控制所述加液机构将制备的所述淋巴细胞和激活血浆按来源不同分别送入所述培养箱中不同的培养瓶中同时进行诱导培养，并待诱导期培养结束后将不同来源的细胞溶液转移至不同的培养袋中同时进行生长期培养。

3.根据权利要求1所述的细胞培养装置，其特征在于：所述血浆制备器包括加热装置和离心装置；所述加热装置用于对所述离心机分离得到的血浆进行加热至56℃，并保持该温度30-60min；所述控制系统控制所述加液机构将加热后的血浆送入4摄氏度条件下冷却30-60min后送入所述离心装置，所述离心装置用于对冷却后的血浆进行离心操作。

4.根据权利要求1所述的细胞培养装置，其特征在于：所述培养箱为水车式转动二氧化碳培养箱，所述控制系统设置所述水车式转动二氧化碳培养箱内温度为25-37摄氏度，控制所述水车式转动二氧化碳培养箱内空气中二氧化碳的体积浓度百分比为5%。

5.根据权利要求1所述的细胞培养装置，其特征在于：所述冷藏箱包括两个冷藏柜，所述控制系统设置其中一个冷藏柜的温度为-20摄氏度，设置另一个冷藏柜的温度为4摄氏度。

6.根据权利要求1所述的细胞培养装置，其特征在于：所述控制系统、冷藏箱、加液机构、离心机、血浆制备器、培养箱和视频检视系统集成在超净工作空间内。

7.根据权利要求6所述的细胞培养装置，其特征在于：所述冷藏箱、离心机、培养箱、视频检视系统设置在万级超净工作柜内部，所述加液机构设置在百级超净工作柜内部。

8.一种如权利要求1所述的细胞培养装置中的细胞培养方法，其特征在于：包括以下步骤：1）取血液导入所述第一离心机中分离得到血浆及血细胞；2）将步骤1）中分离得到的血浆导入所述血浆制备器进行血浆激活得到激活血浆；3）将步骤1）中分离得到的血细胞中加入缓冲液、分离液后重新导入所述第一离心机中分离，得到中层淋巴细胞溶液；4）所述淋巴细胞溶液中的淋巴细胞经培养液漂洗后，加入诱导培养液和所述激活血浆后进行诱导培养；5）诱导培养期完成后将步骤4）中细胞溶液转移至所述培养箱的大规模培养瓶或培养袋中，加入所述培养液及所述激活血浆，进行生长期培养；6）待生长期培养完成后，在所述第二离心机中使用生理盐水稀释漂洗淋巴细胞，进行质量检测、出库。

9.根据权利要求8所述的细胞培养方法，其特征在于：所述步骤2）中血浆激活包括如下步骤：2-1）将分离得到的血浆加热至56℃，保持该温度30-60min；2-2）将加热后的血浆在4℃条件下冷却30-60min；2-3）将冷却后的血浆进行离心操作。

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