CN103304574A - 抗癌用4’-去甲峨参内酯及其制备方法 - Google Patents

Abstract

抗癌用4’-去甲峨参内酯及其制备方法，属于医药领域。本发明以鬼臼毒素为原料，首先在高压釜中将鬼臼毒素原料溶于乙酸，然后加入钯碳催化剂，在1.1～2个大气压的氢气压力和90～100℃的温度条件下使鬼臼毒素与氢气反应制得峨参内酯，最后将峨参内酯与溴化氢在乙酸溶液中反应脱去甲基得到4’-去甲峨参内酯。研究发现所述4’-去甲峨参内酯对宫颈癌细胞Hela以及小鼠黑色素瘤细胞B16具有明显的抑制和诱导凋亡作用，其制备方法简单、易控、成本低廉、收率高。

Description

抗癌用4’-去甲峨参内酯及其制备方法

技术领域

本发明属于医药领域，涉及一种对宫颈癌细胞Hela以及小鼠黑色素瘤细胞B16有显著抑制作用的4’-去甲峨参内酯及其制备方法。 

背景技术

癌症亦称“恶性肿瘤”，中医学归属于症瘕、积聚、噎膈、反胃、瘿瘤等病证范畴。现代医学认为：癌症是由于机体在环境污染、化学污染（化学毒素）、电力辐射、自由基毒素、微生物（细菌、真菌、病毒）其代谢毒素、遗传特性、内分泌失调、免疫功能紊乱等各种致癌物质、致癌因素的作用下，导致身体正常细胞发生癌变的结果。临床表现为组织细胞异常增生而形成的局部肿块。其特点是癌细胞无限制、无止境地增生，大量消耗患者体内营养物质，并释放多种毒素，导致人体消瘦、无力、贫血、食欲不振、发热以及严重的脏器功能受损，最终由于脏器功能衰竭而死亡。其常规治疗方法包括外科治疗、放射治疗、化学治疗、中医药治疗、中西医结合治疗、靶向治疗等。目前对于癌症病人常用的手段为化学治疗，但由于其副作用大以及耐药性的存在，化疗药物很快就失去了作用。因此寻求毒副作用小、抑瘤率高的药物研发越来越引起重视。 

峨参nthriscμs sylvestris（L.）Hoffm.，伞形科峨参属植物，为川产道地药材，中医认为峨参有补中益气，祛瘀消肿，补肺平喘的作用。药理作用研究提示峨参具有增强机体免疫、抗癌、抗病毒、抗炎、抗过敏以及健脾益气、活血化瘀等作用。本专利申请发明人所在课题组在前期文献考察以及从峨参提取部位活性筛选的结果发现，峨参内酯（去氧鬼臼毒素）具有抑制多种癌细胞增殖的作用，但是毒性较大，开发有一定的局限性。本发明主要通过化学合成途径得到4’-去甲峨参内酯，研究其抗癌活性，目前尚无文献报道。 

发明内容

本发明提供一种抗癌用4’-去甲峨参内酯及其制备方法，研究发现所述4’-去甲峨参内酯对宫颈癌细胞Hela以及小鼠黑色素瘤细胞B16具有明显的抑制和诱导凋亡作用，其制备方法简单、易控、成本低廉、收率高。 

本发明技术方案如下： 

抗癌用4’-去甲峨参内酯，其分子式为C21H20O7，化学名为“5R-5,8,8a,9-四氢-5-（4- 羟基-3,5-二甲氧苯基）呋喃（3’,4’:6,7）萘并-[2,3-d]-1,3-间二氧杂环烯-6(5aH)-酮”，结构式为： 

抗癌用4’-去甲峨参内酯的制备方法，其特征是以鬼臼毒素为原料，首先在高压釜中将鬼臼毒素原料溶于乙酸，然后加入钯碳催化剂，在1.1～2个大气压的氢气压力和90～100℃的温度条件下使鬼臼毒素与氢气反应制得峨参内酯，最后将峨参内酯与溴化氢在乙酸溶液中反应脱去甲基得到4’-去甲峨参内酯。 

在峨参内酯的制备过程中，所述钯碳催化剂质量用量为鬼臼毒素原料质量的5%～10%之间，就可得到收率75%左右的峨参内酯，大于10%的催化剂用量对峨参内酯生产量无影响；氢气压力应大于1.1个大气压，氢气压力的继续提高对反应时间和反应生成的峨参内酯无影响；反应时间超过5小时之后，反应即终止，此时再延长反应时间对峨参内酯的收率和纯度均无影响。峨参内酯在去甲基处理前的峨参内酯粗品，可采用乙酸乙酯:石油醚=1:3的混合溶剂进行重结晶提纯，重结晶提纯后可得到液相纯度大于98%的白色粉末峨参内酯。 

在峨参内酯去甲基制备4’-去甲峨参内酯过程中，可以采用溴化氢或者碘化钠和甲磺酸来制备，碘化钠和甲磺酸制备4’-去甲峨参内酯收率较低，优先选用溴化氢制备（峨参内酯与溴化氢的摩尔比为1:3～1:5），反应溶剂可以是二氯甲烷、氯仿或乙酸，优先选用乙酸做反应溶剂（溶剂质量为峨参内酯质量的5～10倍）；去甲基后的4’-去甲峨参内酯粗品，可采用甲醇进行重结晶提纯，重结晶提纯后可得到液相纯度大于98%的4’-去甲峨参内酯。 

本发明筛选优化了4’-去甲峨参内酯的合成路线和工艺，高收率的制备得到了4’-去甲峨参内酯。 

本发明应用MTT比色法检测到4’-去甲峨参内酯对宫颈癌细胞Hela、小鼠黑色素瘤细胞B16有显著的抑制作用，且抑制率与浓度呈明显的效应关系，随着药物浓度的增加，细胞存活率不断下降。用倒置显微镜观察到，两种肿瘤细胞生长明显受到抑制，细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，细胞由梭形变成圆形细胞脱落，浮悬于培养液中。不同浓度的4’-去甲峨参内酯作用于Hela和B16细胞，48h后用DAPI染色，荧光下可见细胞核发生明显皱缩和断裂。 

综上，本发明公开了一种峨参内酯衍生物，即4’-去甲峨参内酯对癌症的防治方面的用途。本发明制备4’-去甲峨参内酯的制备工艺简单、易控、成本低廉、收率高。所制备的4’-去甲峨参内酯对宫颈癌细胞Hela、小鼠黑色素瘤细胞B16的生长有明显抑制作用，并发现其对以上两种癌细胞凋亡有明显诱导作用。 

附图说明

图1为本发明提供的4’-去甲峨参内酯的化学结构式。 

图2为不同浓度4’-去甲峨参内酯对宫颈癌细胞Hela、小鼠黑色素瘤细胞B16的抑制作用效果图。 

图3为不同浓度4’-去甲峨参内酯处理后细胞形态(×400)图。 

具体实施方式

一、4’-去甲峨参内酯的制备： 

（一）中间体峨参内酯的制备：取鬼臼毒素100g，溶解在500ml冰醋酸中，加入钯碳5～10g，将上述原料一起倒入高压釜中，氮气置换5次后，氢气置换3次，加热至内温95℃，氢气压力提高至1.1atm，反应5小时后，降温，卸压后，过滤掉催化剂，浓缩干溶剂后，得到峨参内酯粗品，粗品用乙酸乙酯:石油醚=1:3的混合溶剂200ml重结晶得到高效液相纯度大于98%的白色粉末峨参内酯75g。 

在峨参内酯的制备过程中，催化剂用量在5%～10%之间，就可以得到收率75%左右的峨参内酯，大于10%的催化剂对峨参内酯生产量无影响。氢气压力大于1.1atm即可，压力继续提高对反应时间和反应生成的峨参内酯无影响。反应时间5小时后反应就终止，延长反应时间对峨参内酯收率和纯度均无影响。 

（二）4’-去甲峨参内酯的制备可以采用溴化氢制备，或者采用碘化钠和甲磺酸来制备，碘化钠和甲磺酸制备4’-去甲峨参内酯收率较低，优先选用溴化氢（峨参内酯与溴化氢的摩尔比为1:3～1:5），反应溶剂可以是二氯甲烷、氯仿或乙酸，优先选用乙酸做反应溶剂（溶剂质量为峨参内酯质量的5～10倍）。具体操作为，10g峨参内酯加入50ml质量浓度为30%的溴化氢的乙酸溶液，室温搅拌0.5小时后，加入200ml水搅拌10分钟，过滤出固体得到4’-去甲峨参内酯粗品8.5g。4’-去甲峨参内酯粗品加入25ml甲醇重结晶后得到7.2g高效液相纯度大于98%的4’-去甲峨参内酯。 

二、医学观察 

1材料与方法 

1.1细胞：宫颈癌细胞Hela、小鼠黑色素瘤细胞B16购自于四川大学华西国家重点实验室。 

1.2药品与试剂：RPMI-1640和胰蛋白酶均采用Gibco进口分装，MTT购自宝信生物有限公司。峨参内酯衍生物0由本实验室合成得到。 

1.3主要仪器：CO2恒温孵箱（3110型，美国Thermo公司）、细胞培养板、培养瓶（美国Coster公司）、酶标仪（Elx-800型，美国Bio-Tek公司）、离心机（L420型，长沙湘仪离心机有限公司）、倒置荧光显微镜（日本奥林巴斯公司）、超净工作台（BSW-880，江苏苏净集团有限公司）。 

1.4实验方法 

1.4.1细胞培养 

从液氮中分别取出Hela、B16两种肿瘤细胞冻存管，75%酒精消毒后，迅速置于37℃恒温水浴箱中，上下轻轻摇动使其融化。在无菌条件下小心打开冻存管，将细胞悬液转入预先加入5mL10%PRMI1640小牛培养基的离心管中，混合后1000rpm×5min离心，用吸痰器吸去上清液，加入含10%小牛血清PRMI1640培养基上下吹打数次细胞后，接种至50ml培养瓶置于37℃、含5%CO2、饱和湿度培养箱内培养，次日更换一次培养液。 

当细胞密度达到80%-90%时，用吸痰器吸去培养液，加入2mL含EDTA0.25%胰酶于37℃培养箱内消化细胞株2min后，取出，轻轻拍打细胞培养皿边缘直至细胞完全脱落下来，再加入3mL含10%新生小牛血清的RPMI1640培养液终止消化，用移液管吸去培养液反复吹打贴壁细胞，使其分散，移入离心管，1000rpm×5min离心后用吸痰器吸去上清液，加入含10%小牛血清的PRMI1640培养液上下吹打数次细胞后接种至培养瓶置于37℃、含5%CO2、饱和湿度培养箱内进行传代培养。 

1.4.2细胞计数 

将细胞从CO2培养箱中取出，加入2mL含EDTA0.25%胰酶消化后，制成单细胞悬液，用20μL移液枪取少量细胞悬液，加入细胞计数板，在倒置显微镜下，用40×物镜观察计数板四角16方格中的细胞数，计算总和。代入以下公式得细胞密度：细胞数（个/mL）=（总和/4）×104。 

1.4.3MTT法测定药物对肿瘤的抑制率 

①取对数生长期细胞按细胞传代培养的方法制作单细胞悬液，用移液枪取20ul细胞悬液，加入细胞计数板，在倒置相差显微镜下计数并调整各细胞株浓度为1×104个/mL。 

②分别取对数生长期的Hela、B16两种细胞接种于加培养基的24孔培养板内，每孔1×104/mL个细胞，3个复孔，CO2恒温养箱培养24h，换新的培养基，加入峨参内酯衍生物0，共设7个药物浓度，分别为0.1%DMSO、2.5、5、10、20、40、80μg/mL，每孔体积500μL，培养48h后，每孔加入2mg/mLMTT工作液200μL，37℃放置4h，弃上清，每孔加入200ulDMSO，200r/min摇床震荡10min溶解结晶，吸取200μL至96孔酶标板于全自动酶标仪检测490nm波长处的各孔吸光度（OD值），0.1%DMSO作为阴性对照，根据0.1%DMSO值绘制曲线，比较不同浓度药物分别对Hela、B16细胞的抑制作用。计算公式：增殖抑制率（%）=（1-加药孔A值/对照组A值）×100%。 

1.4.4DAPI染色：将洁净无菌盖玻片置于6孔板内，种入细胞培养至细胞密度为60％～80％。设对照组、10μg/ml、40μg/ml峨参内酯衍生物组（Hela）和对照组、10μg/ml、40μg/ml峨参内酯衍生物组（B16），分别继续培养48h，吸弃废液，然后用4%多聚甲醛固定细胞爬片35min，1xPBS冲洗3次，每次2min，加入2ml DAPI染色液，染色15min，1xPBS冲洗两次，取出爬片用封片液封片，荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长在350nm左右，发射波长在460nm左右。 

1.4.5统计学分析 

采用SPSS17.0软件进行数据分析，各组数据以x±s表示，实验组及对照组比较用单因素方差分析。 

2结果 

2.14’-去甲峨参内酯对Hela和B16细胞生长的抑制作用 

采用MTT比色法检测峨参内酯对宫颈癌细胞Hela和小鼠黑色素瘤细胞B16生长的抑制作用，结果显示，分别用浓度在2.5-80ug/ml的峨参内酯衍生物0分别作用于Hela、B16细胞48h后，随着药物浓度的升高，细胞存活率不断下降。经统计学软件计算得出药物对Hela和B16细胞的IC50值分别为29.30ug/ml和23.07ug/ml，说明峨参内酯衍生物对B16的抑制作用比对Hela细胞抑制作用明显，结果见图2所示。 

2.24’-去甲峨参内酯对Hela、B16凋亡的影响 

倒置显微镜观察到，经峨参内酯衍生物物处理48h后，两种细胞的生长明显受到抑制， 细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，细胞由梭形变成圆形细胞脱落，浮悬于培养液中。DAPI染色后，荧光显微镜观察到，经峨参衍生物物处理48h后，两种细胞的生长明显受到抑制，有明显的细胞核断裂和皱缩，随剂量增加，细胞凋亡现象越明显，结果见图3所示。 

本实验应用MTT比色法检测4’-去甲峨参内酯对宫颈癌细胞Hela、小鼠黑色素瘤细胞B16的抑制作用，经计算得出其IC50值分别为29.30ug/ml和23.07ug/ml，且抑制率与浓度呈明显的效应关系，随着药物浓度的增加，细胞存活率不断下降。用倒置显微镜观察到，两种肿瘤细胞生长明显受到抑制，细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，细胞由梭形变成圆形细胞脱落，浮悬于培养液中。不同浓度的峨参内酯衍生物作用于Hela和B16细胞，48h后用DAPI染色，荧光下可见细胞核发生明显皱缩和断裂。 

综上，本发明公开了一种峨参内酯衍生物，即4’-去甲峨参内酯对癌症的防治方面的用途。本发明制备4’-去甲峨参内酯的制备工艺简单、易控、成本低廉、收率高。所制备的4’-去甲峨参内酯对宫颈癌细胞Hela、小鼠黑色素瘤细胞B16的生长有明显抑制作用，并发现其对以上两种癌细胞凋亡有明显诱导作用。 

Claims (7)

1.抗癌用4’-去甲峨参内酯，其分子式为C21H20O7，化学名为“5R-5,8,8a,9-四氢-5-（4-羟基-3,5-二甲氧苯基）呋喃（3’,4’:6,7）萘并-[2,3-d]-1,3-间二氧杂环烯-6(5aH)-酮”，结构式为：

2.根据权利要求1所述的抗癌用4’-去甲峨参内酯的制备方法，其特征在于：以鬼臼毒素为原料，首先在高压釜中将鬼臼毒素原料溶于乙酸，然后加入钯碳催化剂，在1.1～2个大气压的氢气压力和90～100℃的温度条件下使鬼臼毒素与氢气反应制得峨参内酯，最后将峨参内酯与溴化氢在乙酸溶液中反应脱去甲基得到4’-去甲峨参内酯。

3.根据权利要求2所述的抗癌用4’-去甲峨参内酯的制备方法，其特征在于：在峨参内酯的制备过程中，所述钯碳催化剂质量用量为鬼臼毒素原料质量的5%～10%之间。

4.根据权利要求2所述的抗癌用4’-去甲峨参内酯的制备方法，其特征在于：鬼臼毒素与氢气反应的时间大于5小时。

5.根据权利要求2所述的抗癌用4’-去甲峨参内酯的制备方法，其特征在于：峨参内酯在去甲基处理前的峨参内酯粗品，可采用乙酸乙酯:石油醚=1:3的混合溶剂进行重结晶提纯，重结晶提纯后可得到液相纯度大于98%的白色粉末峨参内酯。

6.根据权利要求2所述的抗癌用4’-去甲峨参内酯的制备方法，其特征在于：在峨参内酯去甲基制备4’-去甲峨参内酯过程中，峨参内酯与溴化氢的摩尔比为1:3～1:5；乙酸溶剂质量为峨参内酯质量的5～10倍。

7.根据权利要求2所述的抗癌用4’-去甲峨参内酯的制备方法，其特征在于：去甲基后的4’-去甲峨参内酯粗品，可采用甲醇进行重结晶提纯，重结晶提纯后可得到液相纯度大于98%的4’-去甲峨参内酯。

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