CN107711855B

CN107711855B - 骆驼宁碱a衍生物在制备防治或抗植物病害的药物中的应用

Info

Publication number: CN107711855B
Application number: CN201710813798.5A
Authority: CN
Inventors: 刘映前; 杨冠洲; 张健; 陈诚; 李俊采; 张君香; 张晓帅; 杨程杰; 徐小山
Original assignee: Lanzhou University
Current assignee: Lanzhou University
Priority date: 2017-09-11
Filing date: 2017-09-11
Publication date: 2020-10-09
Anticipated expiration: 2037-09-11
Also published as: CN107711855A

Abstract

本发明涉及天然药物化学领域和生物农药技术领域，公开了一种骆驼宁碱衍生物(Ia)～(Ii)任一化合物在制备防治或抗抗葡萄灰霉病和水稻稻瘟病的药物中的应用。由于本发明的化合物源于中草药骆驼蒿的的天然结构衍生物，具有无公害、安全高效的特点，具备天然源农药的优点能够开发为适用于为生产绿色、无污染农产品的植物源农药，属于新型生物农药。

Description

骆驼宁碱A衍生物在制备防治或抗植物病害的药物中的应用

技术领域

本发明属于天然药物化学领域和生物农药技术领域，公开了骆驼宁碱A衍生物的一种新用途，具体涉及骆驼宁碱A衍生物在制备防治或抗水稻稻瘟病和葡萄灰霉病的药物中的应用。

背景技术

目前，化学防治仍是这两种病害防治的主要技术手段，虽然防治效果好，但由于这些化学农药的广泛使用，导致“3R”问题日趋严重，已引起了社会的极大关注。因此，研究与开发高效安全天然源农药防控植物病害已成为植保工作者的重要课题，也是农业生产可持续发展的必由之路，而植物源农药作为生物源农药的一部分，因公认其具有低毒、无残留、选择性高、易分解、害虫不易产生抗药性等优点，而备受研究者亲睐。因此，从植物资源中寻找和筛选潜在的杀菌次生代谢产物，并以其为先导结构进行结构优化正在成为新型杀菌剂创制的重要途径和研究热点。

骆驼宁碱A生物碱是1997年从中药骆驼蒿(PeganumnigellastrumBunge.)中分离获得的一类天然喹唑啉类生物碱。科研工作者对骆驼宁碱A生物碱的关注源于发现骆驼宁碱A与具有抗癌活性的喜树碱有类似的化学结构，在体外对小鼠肿瘤细胞P388细胞系有抑制作用，并证明了它有类似喜树碱的抑制拓扑异构酶I活性((1)Molecules,2011,16,4861-4883)。据此，近年来科研工作者以骆驼宁碱为先导结构，在骆驼宁碱及其衍生物的全合成、结构优化以及抗肿瘤活性评价研究取得了较大进展((1)Org.Biomol.Chem.,2007,5,2486–2490;(2)Bioorganic&MedicinalChemistry,2007,15,4237–4246；(3)TetrahedronLetters,2011,52,1592–1596;(4)TetrahedronLetters2004,45,6721–6723；(5)TetrahedronLetters，1998,39,9097-9098)。尽管近年来关于骆驼宁碱的医药活性研究报道较多，而对其在抑制农业病菌方面，特别是作为防治或抗抗水稻稻瘟病和葡萄灰霉病的药物中的应用目前尚未见文献报道。本发明基于新类型的天然活性物质，通过抑菌活性测试，发现了骆驼宁碱A生物碱对抗水稻稻瘟病(pyricutariaoryzaeCav)和葡萄灰霉病(BotrytiscinereaPers)具有较好的抑制作用，可作为新型的抗抗水稻稻瘟病和葡萄灰霉病的药物。

发明内容

本发明目的是针对现有技术存在的缺陷，为农业生产提供一种天然植物源杀菌剂-----骆驼宁碱A生物碱的新用途，即骆驼宁碱A生物碱作为生物农药在防治水稻稻瘟病和葡萄灰霉病中的应用。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方法：一种抗水稻稻瘟病和葡萄灰霉病的药物，其中含有治疗有效量的(Ia)～(Ii)中的任一化合物图1所示的骆驼宁碱衍生物。

进一步地，本发明所述的骆驼宁碱A生物碱制备方法按照文献J.Org.Chem.,2007,72(16):6270-6272的报道的合成方法获得的化合物，合成路线见图2。经多次硅胶柱层析等常规方法分离获得纯品，经质谱和核磁共振等波谱技术，确定了权利要求骆驼宁碱化合物(Ia)～(Ii)，其结构式如图1所示。经活性筛选结果表明，本发明所述的骆驼宁碱A生物碱对水稻稻瘟病和葡萄灰霉病表现出较强的抑制作用，可用于制备杀菌剂。

天然源生物碱具有高效、低毒、无污染、对人畜安全、作用方式独特、选择性高、对天敌和有益生物安全及害虫病原菌不易产生抗药性等优点的天然产物，符合人们对理想农药的要求，但目前只有少数植物生物碱在植物保护中得到广泛应用。骆驼宁碱A生物碱作为一类天然源生物碱属于生物农药，与现有抗水稻稻瘟病和葡萄灰霉病的商业化化学药剂相比，本发明所述的抗水稻稻瘟病和葡萄灰霉病药物其优点在于：

1)杀菌活性高，具有防治水稻稻瘟病和葡萄灰霉病危害的作用，可作为新的杀菌先导进行生物合理性开发。

2)以本发明的骆驼宁碱A生物碱为有效成分的药剂是一种新型的农用抗水稻稻瘟病和葡萄灰霉病病药。这种药剂对于防治水稻稻瘟病和葡萄灰霉病显示出较好的效果，同时，该药来自中草药骆驼蒿的天然产物，具有低毒、低残留、环境相容等特点，能够开发为适用于为生产绿色、无污染农产品的植物源农药，属于新型生物农药。本发明化合物合成工艺简单、产品纯度高。

为了更好地理解本发明，以下通过具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明。但不应将此理解为对本发明的限制。

附图说明

图1为骆驼宁碱A衍生物。

图2为骆驼宁碱A合成路线。

具体实施方式

实施例1

骆驼宁碱A(Ia)的合成

合成方法参见文献方法：ZhouHB，LiuGS，YaoZJ.TheJournalofOrganicChemistry，2007，72(16)：6270-6272，其具体合成操作如下：原料中间体1的合成：将邻氨基苯甲酰胺(14.7mmol)和草酸二乙酯(50mL)置于圆底烧瓶中，将混合物加热至185-186℃，回流反应5h，冷却后逐渐有沉淀析出，待沉淀完全析出后，过滤得到中间体1，晾干后不经纯化，直接进行下一步反应。原料中间体2的合成：将中间体1(2.3mmol)溶于四氢呋喃/水＝3∶1，在冰浴条件下将氢氧化锂(3.5mmol)加入到上述溶液中，搅拌过夜，次日，将反应的大部分溶剂蒸除，加入适量的蒸馏水将其溶解，再用1N盐酸将混合物的pH调至4-5，此时出现大量亮白色沉淀，过滤后将滤饼用清水洗涤若干次，晾干后即为白色固体，不用纯化直接进行下一部反应。

原料中间体3的合成：将中间体2(2mmol)先溶于适量干燥的二氯甲烷中，加入催化剂量的DMF，然后将草酰氯(6mmol)溶于适量的干燥二氯甲烷中，在0℃条件下用恒压漏斗将其缓慢滴入上述反应液中，释放出大量气泡，混合液逐渐变均匀，反应1.5h后，将反应液减压浓缩得到固体残渣，然后将其再溶于适量干燥的二氯甲烷中，并在冰浴条件下将其逐滴滴入含苯胺(1mmol)，碳酸氢钠(3mmol)的干燥二氯甲烷中，TLC监测反应进程，待反应完全后加入适量蒸馏水淬灭，并用氯仿萃取反应液，合并有机相，以硫酸镁干燥后减压浓缩得固体残渣，以氯仿/甲醇为洗脱剂经柱层析纯化收得黄色固体产品。

原料中间体4的合成：将中间体3(3.6mmol)溶于甲苯50mL和水0.2mL中，然后依次加入碳酸钾(7.2mmol)，溴化锂(7.2mmol)，TBAB(0.4mmol)，溴丙炔(5.7mmol)，然后将反应液加热至80℃回流，TLC监测。待反应结束后将反应液减压浓缩得固体残渣，以以氯仿/甲醇为洗脱剂经柱层析纯化收得淡黄色固体产品。

骆驼宁碱A(Ia)的合成：将三苯基氧化膦(2.75mmol)溶于干燥的二氯甲烷中，在冰浴条件下将三氟甲磺酸酐(1.38mmol)溶于适量的干燥二氯甲烷中并缓慢滴入上述溶液中，在0℃条件下搅拌反应30分钟，然后将中间体4溶于适量的干燥二氯甲烷中，冰浴条件下缓慢滴加到上述反应液中，TLC监测反应进程，待反应完全后，向反应液中加入10％碳酸氢钠水溶液10mL淬灭反应。并用氯仿反复萃取反应液，合并有机相，以硫酸镁干燥后减压浓缩得固体残渣，以氯仿/丙酮为洗脱剂经柱层析纯化收得白色固体产品。

Ia白色固体，产率47％，熔点：277.8-280.1℃；1HNMR(400MHz，CDCl3)δ：8.55-8.41(m，3H，Ar-H)，8.14(d，J＝8.2Hz，1H，Ar-H)，7.98(d，J＝8.0Hz，1H，Ar-H)，7.90-7.82(m，2H，Ar-H)，7.76-7.67(m，1H，Ar-H)，7.64-7.54(m，1H，Ar-H)，5.37(s，2H，-CH2-)；13C-NMR(100MHz，CDCl3)δ：160.6，152.9，150.9，150.0，149.4，134.6，133.1，131.6，130.7，128.8，127.9，127.5，126.5，121.4，47.4；Anal.CalcdForC18H11N3O：C，75.78；H，3.89；N，14.73.Found：C，75.79；H，3.90；N，14.73.MS-ESIm/z：308.08[M+Na]+.

实施例2

10-氟-骆驼宁碱A(Ib)的合成

实验步骤与实施例1同，仅以对氟苯胺代替苯胺。

Ib白色固体，产率44％，熔点：271.2-274.1℃；1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ：8.72(s，1H，Ar-H)，8.50(d，J＝2.2Hz，1H，Ar-H)，8.28(d，J＝7.8Hz，1H，Ar-H)，8.22(d，J＝9.0Hz，1H，Ar-H)，8.01(dd，J＝9.0，2.2Hz，1H，Ar-H)，7.96(d，J＝3.9Hz，2H，Ar-H)，7.63(dt，J＝8.1，4.4Hz，1H，Ar-H)，5.32(s，2H，-CH2-).13C-NMR(100MHz，CDCl3)δ：160.5，158.2，152.2，149.2，144.7，135.0，134.7，131.6，130.2，125.2，121.4，119.5，115.5，114.2，112.2，111.9，107.75，47.5；Anal.CalcdForC18H10FN3O：C，71.28；H，3.32；N，13.85.Found：C，71.27；H，3.33；N，13.86.MS-ESIm/z：326.07[M+Na]+.

实施例3

10-甲基-骆驼宁碱A(Ic)的合成

实验步骤与实施例1同，仅以对甲基苯胺代替苯胺。

Ic，白色固体，产率60％，熔点：272.5-273.9℃；1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.66(s，1H，Ar-H)，8.38-8.25(m，2H，Ar-H)，7.95(d，J＝4.2Hz，2H，Ar-H)，7.76(d，J＝8.4Hz，2H，Ar-H)，7.22(d，J＝8.1Hz，1H，Ar-H)，5.31(s，2H，-CH2-)，2.58(s，3H，-CH3)；13C-NMR(100MHz，CDCl3)：δ：160.7，152.3，151.1，149.6，134.6，133.2，133.1，130.7，130.4，129.6，128.7，127.3，126.7，126.5，121.3，47.3，21.8；Anal.CalcdForC19H13N3O：C，76.24；H，4.38；N，14.04.Found：C，76.25；H，4.39；N，14.02.MS-ESIm/z：322.10[M+Na]+.

实施例4

11-氯-骆驼宁碱A(Id)的合成

实验步骤与实施例1同，仅以间氯苯胺代替苯胺。

Id，白色固体，产率53％，熔点：274.6-276.8℃；1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ：8.99(s，1H，Ar-H)，8.79(s，1H，Ar-H)，8.27(d，J＝8.1Hz，2H，Ar-H)，8.21(d，J＝8.8Hz，1H，Ar-H)，7.93-7.83(m，2H，Ar-H)，7.78(dd，J＝8.8，2.2Hz，1H，Ar-H)，5.30(s，2H，-CH2-).；13C-NMR(100MHz，CDCl3)δ：160.5，155.1，151.2，149.2，134.7，133.6，131.1，130.4，129.9，129.1，128.8，128.4，127.7，126.5，122.3，121.5，47.5；Anal.CalcdForC18H10ClN3O：C，67.62；H，3.15；N，13.14.Found：C，67.63；H，3.14；N，13.15.MS-ESIm/z：342.04[M+Na]+.

实施例5

12-甲基-骆驼宁碱A(Ie)的合成

实验步骤与实施例1同，仅以邻甲基苯胺代替苯胺。

Ie，白色固体，产率53％，熔点：272.3-274.6℃；1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ：8.73(s，1H，Ar-H)，8.35-8.25(m，1H，Ar-H)，7.96(dt，J＝25.5，7.8Hz，3H，Ar-H)，7.76(d，J＝7.1Hz，1H，Ar-H)，7.63(m，2H，Ar-H)，5.31(s，2H，-CH2-)，2.87(s，3H，-CH3)；13C-NMR(100MHz，CDCl3)δ：160.7，152.9，150.1，149.4，148.6，138.9，134.4，133.1，131.7，130.8，129.3，128.9，127.4，126.3，125.9，121.3，47.2，18.5；Anal.CalcdForC19H13N3O：C，76.24；H，4.38；N，14.04..Found：C，76.25；H，4.37；N，14.05.MS-ESIm/z：322.10[M+Na]+.

实施例6

10-三氟甲基-骆驼宁碱A(If)的合成

实验步骤与实施例1同，仅以对三氟甲基苯胺代替苯胺。

If，白色固体，产率42％，熔点：271.1-273.2℃；1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ：8.98(s，1H，Ar-H)，8.74(s，1H，Ar-H)，8.49(d，J＝8.9Hz，1H，Ar-H)，8.35-8.27(m，1H，Ar-H)，8.20-8.10(m，1H，Ar-H)，7.97(d，J＝6.1Hz，2H，Ar-H)，7.84-7.68(m，1H，Ar-H)，5.38(s，2H，-CH2-)；13C-NMR(100MHz，CDCl3)δ：160.5，152.0，149.2，134.8，133.1，132.7，130.7，128.9，127.9，127.67，126.5，121.4，47.3.Anal.CalcdForC19H10F3N3O：C，64.59；H，2.85；N，11.89.Found：C，64.60；H，2.84；N，11.89.MS-ESIm/z354.07[M+H]+。

实施例7

11-氟-骆驼宁碱A(Ig)的合成

实验步骤与实施例1同，仅以间氟苯胺代替苯胺。

Ig，白色固体，产率41％，熔点：270.2-272.3℃；1HNMR(400MHz，CDCl3)δ：8.72-8.65(m，1H，Ar-H)，8.37(dd，J＝7.9，1.6Hz，1H，Ar-H)，8.23(d，J＝8.7Hz，1H，Ar-H)，8.06(d，J＝8.2Hz，1H，Ar-H)，7.86-7.68(m，2H，Ar-H)，7.53(ddd，J＝8.1，7.1，1.2Hz，1H，Ar-H)，7.31(dd，J＝9.5，8.0Hz，1H，Ar-H)，5.32(s，2H，-CH2-)；13C-NMR(100MHz，CDCl3)δ：160.5，155.6，151.2，149.3，144.8，135.1，133.1，130.8，129.0，128.8，127.7，126.5，124.6，122.5，121.3，47.3；Anal.CalcdForC18H10FN3O：C，71.28；H，3.32；N，13.85.Found：C，71.29；H，3.31；N，13.86.MS-ESIm/z：326.07[M+Na]+.

实施例8

10，11-二甲氧基-骆驼宁碱A(Ih)的合成

实验步骤与实施例1同，仅以3，4-二甲氧基苯胺代替苯胺。

Ih，白色固体，产率38％，熔点：279.6-281.2℃；1HNMR(400MHz，CDCl3)δ：8.44(d，J＝7.9Hz，1H，Ar-H)，8.28(s，1H，Ar-H)，8.09(d，J＝8.2Hz，1H，Ar-H)，7.89-7.81(m，1H，Ar-H)，7.78(s，1H，Ar-H)，7.58(d，J＝1.6Hz，1H，Ar-H)，7.16(s，1H，Ar-H)，5.31(s，2H，-CH2-)，4.08(d，J＝2.1Hz，6H，-OCH3)；13C-NMR(100MHz，CDCl3)δ：160.7，150.1，149.7，149.3，148.4，139.0，134.7，133.2，131.6，129.8，128.7，128.1，127.7，126.8，124.4，122.5，121.5，57.0，55.3，47.3；Anal.CalcdForC20H15N3O3：C，69.56；H，4.38；N，12.17.Found：C，69.57；H，4.39；N，12.18.MS-ESIm/z346.10[M+H]+.

实施例9

10-羟基-9-甲基吗啉骆驼宁碱A(Ii)的合成

将适量的1，4-二氧六环加入圆底烧瓶中，再依次加入吗啉(2mmol)和多聚甲醛(4mmol)，迅速向反应装置中通入氩气保护气，然后将其混合物加热到90℃回流2h，待其充分反应后，将原料10-羟基骆驼宁碱A(1mmol)投入到反应体系中，同样用氩气保护后将温度升高至100℃进行反应2h。TLC监测反应进程。待反应结束后冷却至室温，在40摄氏度以下减压蒸馏除去1，4-二氧六环，将固体残渣以氯仿/丙酮体系为洗脱剂经柱层析纯化，得灰色固体产品10-羟基-9-甲基吗啉骆驼宁碱A。

Ii，黄色固体，产率51％，熔点：273.8-277.2℃；1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ：10.55(s，1H，-OH)，8.77(s，1H，Ar-H)，8.29(d，J＝8.2Hz，1H，Ar-H)，8.07(d，J＝9.3Hz，1H，Ar-H)，7.93(s，3H，Ar-H)，7.62(s，1H，Ar-H)，5.80(s，2H，R-N-CH2-Ar)，5.32(s，2H，Ar-H5)，4.15(s，2H，Morpholine-H)，2.30(s，2H，Morpholine-H)，2.09(s，2H，Morpholine-H).1.57(s，2H，Morpholine-H)；13C-NMR(100MHz，CDCl3)：δ：160.5，158.1，151.3，150.3，148.4，139.7，133.4，131.1，129.7，129.0，128.8，128.1，127.7，127.1，124.1，122.5，121.5，57.7，54.3，53.1；Anal.CalcdForC23H20N4O3：C，68.99；H，5.03；N，13.99.Found：C，68.98；H，5.04；N，13.99.MS-ESIm/z：421.16[M+Na]+.

实施例10：室内抑菌活性测定及结果

1)实验材料：

化学式(Ia)～(Ii)的骆驼宁碱A衍生物为本实验室合成。

本实验中所用的植物病原菌为实验室4℃保存的菌种，采用的培养基为马铃薯培养基(简称PDA)。

PDA培养基配方:马铃薯(去皮)200g，葡萄糖20g，琼脂15g，自来水1000mL，自然PH。

配制方法:将马铃薯洗净去皮，称200g切成小块，加水煮烂(煮沸20-30分钟，能被玻璃棒戳破即可)，用八层纱布过滤于烧杯中，根据实验需要加15-20g琼脂，加入20g葡萄糖，搅拌均匀，充分溶解后稍冷却补足水至1000mL，分装后121℃灭菌20分钟，冷却后备用。2)实验方法

采用生长速率法。

1、先将2种植物病原菌在PDA平板上25℃培养6d左右待用。

2、将PDA培养基加热溶化，冷却至45-50℃，分别加入不同浓度的骆驼宁碱A衍生物制成含200、100和50ppm药液的培养基，并分别倒入培养皿中冷却。

3、以无菌操作手续，用打孔器在培养6d的各菌株菌丝边缘(生长状况尽量一致)打取圆形菌饼(直径0.50cm)，再用接种针挑至含药平板中央，然后将培养皿倒置于培养箱(25℃)中培养。

4、于处理后不同时间观察测定菌丝的生长情况，并采用十字交叉法测得直径并处理数据，计算抑制率。

5、抑制率(％)＝(对照菌丝直径-处理菌丝直径)/对照菌丝直径×100

6、每个处理重复3次。

3)骆驼宁碱A衍生物对稻瘟病病菌、葡萄灰霉菌植物病原菌菌丝生长的抑菌效果

1、稻瘟病病菌：主要危害农作物为水稻，引起稻瘟病。危害范围甚广，凡有水稻的生长的地区均有发生。稻瘟病可引起水稻秧苗、叶片斑点、叶鞘斑点、茎节斑点、穗茎病斑等症状，给世界范围内的水稻产量造成了较大损失。目前稻瘟病防治困难，主要防治方法有：选用抗病良种、种子处理、加强肥水管理、农业防治等。

2、葡萄灰霉病菌：属半知菌亚门真菌。分生孢子梗自寄主表皮、菌丝体或菌核上长出、密集，是一种寄主范围很广的兼性寄生菌，能侵染多种水果、蔬菜和花卉。灰霉菌主要以菌核和分生孢子越冬，属于温凉潮湿型病害，也是葡萄储存期主要病害之一。

3、稻瘟病病菌、葡萄灰霉菌参照生测标准方法NY/T1156.2-2006，采用生长速率法进行室内生物活性测定，明确了骆驼宁碱A衍生物(Ia)～(Ii)对这两种病菌的抑制活性。

表1为骆驼宁碱A衍生物(Ia)～(Ii)对葡萄灰霉菌和稻瘟病病菌的抑制活性测试结果。

表1骆驼宁碱A衍生物对葡萄灰霉菌和稻瘟病病菌的抑制活性试验结果

注:试验中每个处理设三次重复，表中数据为三次重复的平均值。

由表1生测结果可知，本发明制备的骆驼宁碱A衍生物(Ia)～(Ii)对葡萄灰霉菌、稻瘟病病菌表现出较好的抑制活性，其中部分化合物在100ppm下对两种病菌抑制活性达60％以上，甚至表现出更好的活性，因而本发明所述的化合物可用于制备农药中的用途。综上所述，本发明所述的骆驼宁碱A衍生物结构简单，易于合成，且一些化合物对两种病菌表现出显著的抑制活性，具有进一步研究的价值，有望开发成为新型的植物源农药。

Claims

1.一种骆驼宁碱A及其衍生物在制备防治或抗葡萄灰霉病和水稻稻瘟病药物中的应用；其中所述的骆驼宁碱A及其衍生物为(Ia)～(Ii)具有如下所示的分子结构特征：

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