CN113788822B

CN113788822B - 一种新型柚皮素嘧啶腙衍生物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN113788822B
Application number: CN202111199130.9A
Authority: CN
Inventors: 苑娟; 李恺昊; 宋军营; 邢爱萍; 王俊敏
Original assignee: Henan University of Traditional Chinese Medicine HUTCM
Current assignee: Henan University of Traditional Chinese Medicine HUTCM
Priority date: 2021-10-14
Filing date: 2021-10-14
Publication date: 2023-01-17
Anticipated expiration: 2041-10-14
Also published as: CN113788822A

Abstract

本发明公开了一种新型柚皮素嘧啶腙衍生物及其制备方法和应用，分子式为C₁₉H₁₆N₄O₄。本发明采用MTT法研究了柚皮素‑4‑嘧啶腙衍生物的抗肿瘤活性，结果表明，本发明制备的柚皮素‑4‑嘧啶腙对人胃癌细胞BGC‑823及人肺癌细胞A549的增殖均具有抑制作用，抑制活性比原料药柚皮素本身提高了2～5倍，抑制作用大大增强，与对照例柚皮素‑4‑吡啶腙相比也有明显增强，尤其对人胃癌细胞BGC‑823的IC₅₀仅为8.59μM。结果表明，本发明柚皮素‑4‑嘧啶腙对实验的两种肿瘤细胞增殖均具有良好的抑制作用，尤其对人胃癌细胞BGC‑823的抑制活性更加显著，明显强于原料药柚皮素和对照例柚皮素‑4‑吡啶腙，是具有重要应用前景的抗肿瘤化合物。

Description

一种新型柚皮素嘧啶腙衍生物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种新型柚皮素嘧啶腙衍生物及其制备方法和抗肿瘤应用，属于药物化学领域。

背景技术

恶性肿瘤已成为导致人类死亡的一大杀手，据预测2035年全球癌症死亡人数将增加到1315万人。胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，每年约有17万人死于胃癌，接近全部恶性肿瘤死亡人数的1/4，严重威胁人类的健康和生命，因此抗肿瘤药物，尤其是抗胃癌药物的研发，是当今医药和生命科学领域极富挑战性和重大研究意义的课题。然而肿瘤细胞的耐药性和一系列不良反应仍是困扰医药工作者的一大难题，因此开发对人体危害较小的新疗法和新药物成为目前肿瘤研究的目标之一。

中药活性成分是抗肿瘤药物发现的重要途径。1940～2014年全球上市的175种小分子抗肿瘤药物中131种来自天然产物或其衍生物。以天然产物活性成分为先导化合物，进行结构修饰，合成强活性、高生物利用度和低毒性的抗肿瘤药物是新抗肿瘤药物设计的重要思路之一。黄酮类中药活性成分作为一类重要的天然产物，广泛存在于自然界中。黄酮类化合物因其对正常细胞毒性小及来源广泛价廉易得等优点受到国内外学者的极大关注。

柚皮素是一种广泛存在于各种水果和中草药的有效、安全、耐受性好、口服可用的生物黄酮类化合物。柚皮素具有抗菌、抗炎、清除自由基、抗氧化、止咳祛痰、降血脂等多种生物活性。但由于柚皮素自身的脂溶性和水溶性都较差，导致其生物利用率不高，因此，对其进行化学修饰以获得高效、低毒、溶解性好的药物分子一直是科研工作者努力的方向。目前对柚皮素的结构修饰主要集中在羟基甲基化、醚化、酯化，卤代，羰基酰化以及利用其分子上酚氧强的配位能力，构筑其过渡金属、稀土金属和铂族金属配合物等，但在4位羰基部位通过化学反应构筑嘧啶腙类抗肿瘤衍生物还未见相关文献报道。4位羰基可以与肼基嘧啶端基-NH₂通过缩合反应，巧妙地构筑多配位点的NNO型N杂环嘧啶腙衍生物，通过发挥双官能团的协同作用，有望显著提高其生物活性，降低毒副作用，充分发挥中西药的共同优势，获得具有重要应用前景的抗肿瘤化合物。因此，对柚皮素-4-嘧啶腙的抗肿瘤活性研究具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种新型柚皮素嘧啶腙衍生物及其制备方法和应用，该衍生物制备步骤简单，反应条件温和，产率高，且对人胃癌细胞BGC-823及人肺癌细胞A549这两种肿瘤细胞增殖均具有抑制活性，尤其对BGC-823细胞的抑制活性非常显著，有望成为潜在的抗BGC-823药物。

为了实现上述目的，本发明的技术方案之一是：

一种新型柚皮素嘧啶腙衍生物，其为柚皮素-4-嘧啶腙，分子式为C₁₉H₁₆N₄O₄，其分子结构式为：

本发明的技术方案之一是：一种柚皮素嘧啶腙衍生物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将2-氯嘧啶溶于无水乙醇中，加入过量的80％水合肼，室温搅拌反应，得到中间体粗品；

(2)中间体粗品用无水乙醇重结晶，得到无色针状晶体2-肼基嘧啶中间体；

(3)将2-肼基嘧啶中间体与柚皮素分别溶于无水乙醇后混合，滴加冰醋酸催化，回流温度反应，TLC监测反应进程，随反应进行析出黄色沉淀；

(4)反应结束后，趁热抽滤，无水乙醇洗涤，得到黄色粉末，即为柚皮素-4-嘧啶腙粗品。

室温搅拌反应的时间为2h～4h。

2-肼基嘧啶中间体和柚皮素的摩尔比为1.2:1～1.5:1。

所述柚皮素嘧啶腙衍生物的制备方法，还包括将柚皮素-4-嘧啶腙粗品加入无水乙醇中，搅拌条件下加热至回流温度，趁热抽滤，重复数次，得到黄色粉末，即为柚皮素-4-嘧啶腙。

本发明的技术方案之一是：一种柚皮素嘧啶腙衍生物在制备抗肿瘤药物方面的应用。

所述肿瘤细胞为人胃癌细胞BGC-823及人肺癌细胞A549。

优选的，所述的肿瘤细胞为人胃癌细胞BGC-823。

本发明的技术方案之一是：一种柚皮素-4-嘧啶腙在抑制肿瘤细胞增殖方面的应用。

本发明柚皮素-4-嘧啶腙的合成路线如下：

本发明的有益效果：

1、本发明新型柚皮素衍生物柚皮素-4-嘧啶腙与目前报道的柚皮素羟基甲基化、醚化、酯化、卤代、羰基酰化及生成配合物的结构明显不同，本发明是基于柚皮素4位羰基与2-肼基嘧啶缩合制备的N杂环腙类衍生物，该衍生物尚未见文献报道，该衍生物的抗肿瘤活性研究也未有文献报道，衍生物合成方法简单，无需大型仪器设备，产率较高，易于产业化。

2、本发明通过2-肼基嘧啶对4位羰基进行修饰，构筑了新型的嘧啶N杂环柚皮素腙衍生物，克服了文献报道的柚皮素酰肼类衍生物中氨基对机体毒性的问题，且腙键的形成提高了化合物的抗氧化活性，进而对提高其抗肿瘤活性起到了促进作用。N杂环化合物通常可以造成DNA损伤，触发DNA-损伤-修复机制响应，引起细胞周期阻滞和/或诱导细胞凋亡，因此本发明同时拓宽了柚皮素衍生物抗肿瘤的作用靶点和作用机制，显著提高其抗肿瘤活性。

3、本发明将具有抗肿瘤活性的天然药物活性成分柚皮素与抗肿瘤活性官能团嘧啶N杂环利用药物拼合原理统一在一个分子中，充分发挥双官能团及其中西药的共同疗效，协同其抗肿瘤活性，同时保留了分子主体骨架中的酚羟基结构，保证其好的抗肿瘤活性。

4、本发明新型柚皮素-4-嘧啶腙衍生物中5位酚羟基上的O原子，嘧啶环上N原子、C＝N双键上的N原子均可以与金属离子配位，进而形成稳定的螯合结构，为构筑协同衍生物和金属离子的抗肿瘤配合物提供了可能。

5、本发明采用MTT法研究了柚皮素-4-嘧啶腙衍生物的抗肿瘤活性，结果表明，本发明制备的柚皮素-4-嘧啶腙对人胃癌细胞BGC-823及人肺癌细胞A549的增殖均具有抑制作用，抑制活性比原料药柚皮素本身提高了2～5倍，抑制作用大大增强，与对照例柚皮素-4-吡啶腙相比也有明显增强，尤其对人胃癌细胞BGC-823的IC₅₀仅为8.59μM。结果表明，本发明柚皮素-4-嘧啶腙对实验的两种肿瘤细胞增殖均具有良好的抑制作用，尤其对人胃癌细胞BGC-823的抑制活性更加显著，明显强于原料药柚皮素和对照例柚皮素-4-吡啶腙，是具有重要应用前景的抗肿瘤化合物。

6、本发明制备方法简单、原料廉价易得，易于工艺化推广，具有很好的社会和经济效益。

附图说明

图1为本发明柚皮素-4-嘧啶腙的IR图谱。

图2为本发明柚皮素-4-嘧啶腙的UV-vis图谱。

图3为本发明柚皮素-4-嘧啶腙的HNMR图谱。

图4为本发明柚皮素-4-嘧啶腙的MS图。

图5为本发明柚皮素-4-嘧啶腙的晶体结构图。

图6为本发明柚皮素-4-嘧啶腙及柚皮素对人胃癌细胞BGC-823及人肺癌细胞A549的IC₅₀柱状图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例

柚皮素-4-嘧啶腙，分子式为C₁₉H₁₆N₄O₄，其分子结构式为：

柚皮素-4-嘧啶腙的制备方法，包括以下步骤：

(1)将20mmol 2-氯嘧啶溶于无水乙醇中，加入质量分数80％的水合肼8mL(过量)，室温搅拌反应4h，得到中间体粗品；

(3)将12mmol 2-肼基嘧啶中间体与10mmol柚皮素分别溶于无水乙醇后混合，滴加2～5滴冰醋酸催化，回流温度反应，TLC监测反应进程，随反应进行析出黄色沉淀；

(4)反应结束后，趁热抽滤，无水乙醇洗涤，得到黄色粉末，即为柚皮素-4-嘧啶腙粗品；

(5)将柚皮素-4-嘧啶腙粗品加入适量无水乙醇中，搅拌条件下加热至回流温度，趁热抽滤，重复数次，得到黄色粉末，即为柚皮素-4-嘧啶腙。

本发明柚皮素-4-嘧啶腙的IR光谱(cm^-1，KBr)：3322,3316,1406,1353,1331,1296,1194,1079,1058,928,828,793,758,647(如图1所示)。

本发明柚皮素-4-嘧啶腙的UV-vis图谱(如图2所示)：在220nm和320nm处分别有一吸收峰，来源于分子内部的n/π→π^*跃迁。

本发明柚皮素-4-嘧啶腙的HNMR图谱(如图3所示)：1H NMR(500MHz,DMSO)δ13.10(s,1H),10.61(s,1H),9.78(s,1H),9.53(s,1H),8.49(s,2H),7.31(s,2H),6.87(s,1H),6.81(s,2H),5.88(d,J＝24.0Hz,2H),5.09(d,J＝9.0Hz,1H),3.35(s,1H)。

本发明柚皮素-4-嘧啶腙的MS图谱(如图4所示)：m/z 365.12[(C₁₉H₁₆N₄O₄₎+H⁺]⁺。

本发明柚皮素-4-嘧啶腙的X射线单晶衍射结构的实验条件和结果如下：

单晶结构数据在带有石墨单色器的SuperNova Dual衍射仪上测定。选择合适大小(0.3×0.13×0.1mm³)的晶体固定在玻璃毛上收集晶体数据。采用CuKα射线

和ω扫描方式，在4.4060°<θ<64.6320°范围内收集到4916个衍射点，其中独立衍射点个数为2728(R_int＝0.0310)。经验吸收校正采用SADABS程序。化合物的分子结构由直接法解出，用SHELXTL全矩阵最小二乘法精修。所有的非氢原子采用各向异性热参数精修，最后用理论加氢法确定氢原子的位置。

所制备的柚皮素-4-嘧啶腙的详细晶体数据见表1，重要的键长键角见表2，晶体结构见图5，该化合物为三斜晶系，P_-1空间群。晶胞参数为

α＝112.356(8)°，β＝99.715(8)°，γ＝94.511(9)°，

表1柚皮素-4-嘧啶腙的晶体结构数据

表2柚皮素-4-嘧啶腙的主要键长

和键角(°)

对照例

选用与本发明结构和合成方法相似的柚皮素衍生物柚皮素-4-吡啶腙作为对照例。其分子式为C₂₀H₁₇N₃O₄，分子结构式为：

本对照例柚皮素-4-吡啶腙的制备方法，包括以下步骤：

(1)将12mmol 2-肼基吡啶和10mmol柚皮素分别溶于无水乙醇后混合，滴加2～5滴冰醋酸催化，回流温度反应，TLC监测反应进程，随反应进行析出淡黄色沉淀；

(2)反应结束后，趁热抽滤，无水乙醇洗涤，得到淡黄色粉末，即为柚皮素-4-吡啶腙粗品；

(3)将柚皮素-4-吡啶腙粗品加入适量无水乙醇中，搅拌条件下加热至回流温度，趁热抽滤，重复数次，得到淡黄色粉末，即为柚皮素-4-吡啶腙。

本对照例柚皮素-4-吡啶腙的IR光谱(cm^-1，KBr)：3322,1406,1353,1331,1296,1189,1079,1058,928,828,793,647。

实验例

本发明用于体外抗肿瘤活性实验，测定方法(MTT法)如下：

1、细胞培养

本实验所选择进行实验的人胃癌细胞BGC-823、人肺癌细胞A549在含1％(v/v)双抗生素(100U/mL链霉素和100U/mL青霉素)、89％(v/v)1640基础培养液和10％(v/v)胎牛血清的完全培养基中培养。在37℃下含5％CO₂的培养箱中培养，第二天换液，第三天传代，实验研究取对数时期的稳定生长的细胞。

2、细胞传代

观察细胞的密度，当细胞增殖到80％左右，弃去原培养液，加入无菌PBS溶液洗1～2次，加0.25％的胰酶，消化5min，再加完全培养基，轻吹细胞，将细胞收入2mL的离心管中，离心5min，弃去上清液。加入完全培养基，将细胞轻吹为单细胞悬液后平均分到三个培养皿中，标记并置于培养箱中。

3、细胞计数

弃去原培养液，加PBS溶液洗1～2次，加0.25％的胰酶，消化5min，再加完全培养基，轻吹细胞，将细胞收入2mL的离心管中，离心5min，弃去上清液。加入完全培养基，将细胞轻吹为单细胞悬液，取10μL滴加到计数板上。数出4个大方格内的细胞总数(每个大方格的体积为0.1μL)。细胞浓度的计算公式如下所示：

细胞浓度(细胞数/ml)＝(四大格细胞总数/4)×10⁴

4、细胞冻存

弃去原培养液，加入无菌PBS溶液洗1～2次，加0.25％的胰酶，消化5min，再加完全培养基，轻吹细胞，将细胞收入2mL的离心管中，离心5min，弃去上清液。加入1mL的冻存液，将细胞轻吹为单细胞悬液，再将重悬细胞转入冻存管，标记。将冻存管转到液氮罐中保存。

5、细胞复苏

将冻存管从液氮灌中拿出，置于37℃的水浴锅中轻轻摇晃。离心，弃上清液。用对应完全培养基重悬，种在新的培养皿中，标记，放置在培养箱中。

6、样品试剂对细胞活性的影响

(1)排板：取对数时期稳定生长细胞，弃去原培养液，加入无菌PBS溶液洗1～2次，加0.25％的胰酶，消化5min，再加完全培养基，轻吹细胞，将细胞收入2mL的离心管中，离心5min，弃去上清液。加入完全培养基，将细胞轻吹为单细胞悬液。计数，将细胞的密度调到3×10⁴个/mL，以每孔加200μL标准，加入96孔板中，培养箱中培养24h。

(2)分组：实验分别设对照组(加完全培养基)、加药组(加不同浓度柚皮素、柚皮素-4-吡啶腙及柚皮素-4-嘧啶腙的细胞组)。

(3)加药：将柚皮素、柚皮素-4-吡啶腙及柚皮素-4-嘧啶腙，分别用DMSO溶解，用完全培养基稀释至5个浓度梯度组：20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL和1.25μg/mL。将原培养液吸出，依次加入含柚皮素、柚皮素-4-吡啶腙及柚皮素-4-嘧啶腙的培养液，每孔加200μL。培养48h后，避光，每孔加入20μL的MTT。

(4)检测：吸去原培养液，加DMSO。调整测量波长为490nm，酶标仪中测量各个孔的光密度值(OD)。

7、IC₅₀值计算

按照寇氏改良公式法计算药物的IC₅₀值其计算方法如下：

抑制率计算方法：抑制率＝1－加药组/对照组

寇氏改良法：lg IC₅₀＝X_m-I[P-(3-P_m-P_n)/4]

X_m:lg最大剂量 I:lg(最大剂量/相临剂量)

P:阳性反应率之和

P_m:最大阳性反应率 P_n:最小阳性反应率

通过以上公式可测出本发明的柚皮素-4-嘧啶腙的体外抗肿瘤活性IC₅₀(μM)值，并与原料药柚皮素和对照例柚皮素-4-吡啶腙的IC₅₀值进行对比，结果见表4，柱状图见图6。

表4本发明柚皮素-4-嘧啶腙及其对照例在BGC-823和A549中的IC₅₀(μM)

从体外抗肿瘤活性实验的测定结果来看，本发明制备的柚皮素-4-嘧啶腙对人胃癌细胞BGC-823及人肺癌细胞A549的增殖均具有抑制作用，抑制活性比原料药柚皮素本身提高了2～5倍，抑制作用大大增强，与对照例柚皮素-4-吡啶腙相比也有明显增强，尤其对人胃癌细胞BGC-823的IC₅₀仅为8.59μM。结果表明，本发明柚皮素-4-嘧啶腙对实验的两种肿瘤细胞增殖均具有良好的抑制作用，尤其对人胃癌细胞BGC-823的抑制活性更加显著，明显强于原料药柚皮素和对照例柚皮素-4-吡啶腙，是具有重要应用前景的抗肿瘤化合物。

Claims

1.一种新型柚皮素嘧啶腙衍生物，其特征在于，所述的柚皮素嘧啶腙衍生物为柚皮素-4-嘧啶腙，分子式为C₁₉H₁₆N₄O₄，其分子结构式为：

2.一种如权利要求1所述柚皮素嘧啶腙衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述柚皮素嘧啶腙衍生物的制备方法，其特征在于，室温搅拌反应的时间为2h～4h。

4.根据权利要求2所述柚皮素嘧啶腙衍生物的制备方法，其特征在于，2-肼基嘧啶中间体和柚皮素的摩尔比为1.2:1～1.5:1。

5.根据权利要求2所述柚皮素嘧啶腙衍生物的制备方法，其特征在于，还包括将柚皮素-4-嘧啶腙粗品加入无水乙醇中，搅拌条件下加热至回流温度，趁热抽滤，得到黄色粉末，即为柚皮素-4-嘧啶腙。

6.一种如权利要求1所述柚皮素-4-嘧啶腙在制备抑制肿瘤细胞增殖药物方面的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞为人胃癌细胞BGC-823及人肺癌细胞A549。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤细胞为人胃癌细胞BGC-823。