CN113735840B

CN113735840B - 一种具有抗肿瘤活性的橙皮素喹啉腙衍生物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN113735840B
Application number: CN202111199127.7A
Authority: CN
Inventors: 苑娟; 李恺昊; 兰海荣; 曾岱; 褚意新
Original assignee: Henan University of Traditional Chinese Medicine HUTCM
Current assignee: Henan University of Traditional Chinese Medicine HUTCM
Priority date: 2021-10-14
Filing date: 2021-10-14
Publication date: 2023-01-24
Anticipated expiration: 2041-10-14
Also published as: CN113735840A

Abstract

本发明公开了一种具有抗肿瘤活性的橙皮素喹啉腙衍生物及其制备方法和应用，分子式为C₂₅H₂₁N₃O₅。本发明采用MTT法研究了本发明橙皮素‑4‑喹啉腙衍生物的抗肿瘤活性，实验结果表明，本发明衍生物对人胃癌细胞BGC‑823、人肝癌细胞BEL‑7402、人肺癌细胞A549及人乳腺癌细胞MCF‑7的增殖均有抑制作用，与橙皮素本身相比，活性提高了2～4倍不等，活性大大增强，尤其对BEL‑7402细胞更加敏感，IC₅₀值为10.97μM。这表明，本发明橙皮素‑4‑喹啉腙对实验的四种肿瘤细胞均具有良好的抑制作用，抑制活性均强于对应的原料药橙皮素本身，尤其对人肝癌细胞BEL‑7402的抑制作用具有较好的选择性，抑制活性提高了近4倍，是非常具有应用前景的抗肿瘤化合物。

Description

一种具有抗肿瘤活性的橙皮素喹啉腙衍生物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种具有抗肿瘤活性的橙皮素喹啉腙衍生物及其制备方法和应用，属于医药领域。

背景技术

橙皮素是二氢黄酮类化合物，在植物界分布广泛，具有抗肿瘤、抗氧化、降低胆固醇、治疗糖尿病、保护心血管等多种生物活性，但水溶性较差，导致生物利用度不高，因此对其进行结构修饰以获得高效、低毒、溶解性好的药物分子一直是众多科研工作者关注的重点。目前具有抗肿瘤活性的橙皮素衍生物的结构修饰主要集中在羟基甲基化、醚化、酯化、卤代，羰基酰化等，但在4位羰基部位通过酮胺缩合构筑橙皮素嘧啶腙类抗肿瘤衍生物还未见相关文献报道。

喹啉是具有潜在药理活性的重要氮杂环化合物。据报道，许多喹啉类衍生物都具有良好的抗结核、抗菌、抗HIV、抗疟疾等生物活性。目前，尚未见以橙皮素和肼基喹啉合成橙皮素腙类衍生物的报道，因此对柚皮素-4-喹啉腙的设计合成和抗肿瘤活性研究具有重要意义。本发明将具有抗肿瘤活性的天然药物活性成分橙皮素与抗肿瘤活性官能团喹啉氮杂环构筑在一个分子中，充分发挥双官能团及中西药的共同疗效，协同其抗肿瘤活性。腙类衍生物克服了文献报道的酰肼类衍生物中氨基对机体的毒性，且腙键的形成有助于提高化合物的抗氧化活性，进而将提高其抗肿瘤活性。因此，本发明橙皮素-4-喹啉腙的合成与抗肿瘤活性研究具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种具有抗肿瘤活性的新型橙皮素喹啉腙衍生物即橙皮素-4-喹啉腙及其制备方法和应用，该衍生物合成步骤简单，反应条件温和，易于产业化，且对人胃癌细胞BGC-823、人肝癌细胞BEL-7402、人肺癌细胞A549及人乳腺癌细胞MCF-7的增殖具有较强抑制作用。

为了实现上述目的，本发明的技术方案之一是：

一种具有抗肿瘤活性的橙皮素喹啉腙衍生物，其为橙皮素-4-喹啉腙，分子式为C₂₅H₂₁N₃O₅，分子结构式为：

本发明的技术方案之一是：一种橙皮素喹啉腙衍生物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将2-氯喹啉溶于无水乙醇中，加入过量的80％水合肼，回流温度反应，得到中间体粗品；

(2)中间体粗品用无水乙醇重结晶，得到橘色片状晶体2-肼基喹啉中间体；

(3)将2-肼基喹啉中间体和橙皮素分别溶于无水乙醇后混合，滴加冰醋酸催化，回流温度反应，TLC监测反应进程，随反应进行析出橘黄色沉淀；

(4)反应结束后，趁热抽滤，无水乙醇洗涤，得到橘黄色粉末，即为橙皮素-4-喹啉腙粗品。

步骤(1)中反应的时间为6h～8h。

2-肼基喹啉中间体和橙皮素的摩尔比为1.2:1～1.5:1。

上述橙皮素喹啉腙衍生物的制备方法，还包括将橙皮素-4-喹啉腙粗品用无水乙醇重结晶数次，得橘黄色粉末，即为橙皮素-4-喹啉腙。

本发明的技术方案之一是：一种橙皮素喹啉腙衍生物在制备抗肿瘤药物方面的应用。

所述肿瘤细胞为人胃癌细胞BGC-823、人肝癌细胞BEL-7402、人肺癌细胞A549及人乳腺癌细胞MCF-7。

优选的，所述的肿瘤细胞为人肝癌细胞BEL-7402。

本发明橙皮素-4-喹啉腙的的合成路线如下：

本发明的有益效果：

1、本发明新型橙皮素衍生物橙皮素-4-喹啉腙与目前报道的橙皮素羟基甲基化、醚化、酯化、卤代、羰基酰化及生成配合物的结构明显不同，本发明是基于橙皮素4位羰基与2-肼基喹啉缩合制备的N杂环腙类衍生物，该衍生物的合成和抗肿瘤活性研究尚未有文献报道，该衍生物合成方法简单，产率较高，易于工业化。

2、本发明利用酮胺缩合反应可将橙皮素4位的羰基与肼基喹啉端基-NH₂巧妙结合，构筑了新型的喹啉N杂环橙皮素腙衍生物，克服了文献报道的橙皮素酰肼类衍生物中氨基对机体毒性的问题，且腙键的形成提高了化合物的抗氧化活性，进而对提高其抗肿瘤活性起到了促进作用。N杂环化合物可以造成DNA损伤，触发DNA-损伤-修复机制响应，引起细胞周期阻滞和/或诱导细胞凋亡，因此本发明同时拓宽了橙皮素衍生物抗肿瘤的作用靶点和作用机制，显著提高其抗肿瘤活性。

3、本发明将具有抗肿瘤活性的天然药物活性成分橙皮素与抗肿瘤活性官能团喹啉N杂环利用药物拼合原理统一在一个分子中，充分发挥双官能团及中西药的共同疗效，协同其抗肿瘤活性，同时保留了分子主体骨架中的酚羟基结构，保证其良好的抗肿瘤活性。

4、本发明新型橙皮素-4-喹啉腙衍生物中5位酚羟基上的O原子，喹啉环上N原子、C＝N双键上的N原子均可以与金属离子配位，进而形成稳定的螯合结构，为构筑协同衍生物和金属离子的抗肿瘤配合物提供了可能。

5、本发明采用MTT法研究了本发明橙皮素-4-喹啉腙衍生物的抗肿瘤活性，实验结果表明，本发明制备的橙皮素-4-喹啉腙衍生物对人胃癌细胞BGC-823、人肝癌细胞BEL-7402、人肺癌细胞A549及人乳腺癌细胞MCF-7的增殖均有抑制作用，与原料药橙皮素本身相比，活性提高了2～4倍不等，活性大大增强，尤其对BEL-7402细胞更加敏感，IC₅₀值为10.97μM。这表明，本发明橙皮素-4-喹啉腙对实验的四种肿瘤细胞均具有良好的抑制作用，抑制活性均强于对应的原料药橙皮素本身，尤其对人肝癌细胞BEL-7402的抑制作用具有较好的选择性，抑制活性提高了近4倍，是非常具有应用前景的抗肿瘤化合物。

6、本发明制备方法简单、反应条件温和，易于产业化，具有很好的社会和经济效益。

附图说明

图1为本发明橙皮素-4-喹啉腙的IR图谱。

图2为本发明橙皮素-4-喹啉腙的UV-vis图谱。

图3为本发明橙皮素-4-喹啉腙、橙皮素对人胃癌细胞BGC-823、人肝癌细胞BEL-7402、人肺癌细胞A549及人乳腺癌细胞MCF-7的IC₅₀柱状图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例1

橙皮素-4-喹啉腙，分子式为C₂₅H₂₁N₃O₅，分子结构式为：

橙皮素-4-喹啉腙的制备方法，包括以下步骤：

(1)将20mmol 2-氯喹啉溶于无水乙醇中，加入质量分数80％的水合肼8mL(过量)，回流温度反应8h，得到中间体粗品；

(3)将12mmol 2-肼基喹啉中间体和10mmol橙皮素分别溶于无水乙醇后混合，滴加2～5滴冰醋酸催化，回流温度反应，并用TLC监测反应进程，随反应进行析出橘黄色沉淀；

(4)反应结束后，趁热抽滤，无水乙醇洗涤，得到橘黄色粉末，即为橙皮素-4-喹啉腙粗品；

(5)将橙皮素-4-喹啉腙粗品用无水乙醇重结晶数次，得橘黄色粉末，即为橙皮素-4-喹啉腙。

本发明橙皮素-4-喹啉腙的IR光谱(cm^-1，KBr)：3322,3206,1446,1653,1531,1396,1194,1079,1058,928,928,893(如图1所示)。

本发明橙皮素-4-喹啉腙的UV-vis图谱(如图2所示)：在220nm、310nm和390nm处的吸收峰来源于分子内部的n/π→π^*跃迁。

实验例

本发明用于体外抗肿瘤活性实验，测定方法(MTT法)如下：

1、细胞培养

本实验所选择进行实验的人胃癌细胞BGC-823、人肝癌细胞BEL-7402、人肺癌细胞A549及人乳腺癌细胞MCF-7需在含1％(v/v)双抗生素(100U/mL链霉素和100U/mL青霉素)、89％(v/v)1640基础培养液和10％(v/v)胎牛血清的完全培养基中培养。在37℃下含5％CO₂的培养箱中培养，第二天换液，第三天传代，实验研究取对数时期的稳定生长的细胞。

2、细胞传代

观察细胞的密度，当细胞增殖到80％左右，弃去原培养液，加入无菌PBS溶液洗1～2次，加0.25％的胰酶，消化5min，再加完全培养基，轻吹细胞，将细胞收入2mL的离心管中，离心5min，弃去上清液。加入完全培养基，将细胞轻吹为单细胞悬液，均匀分成三份，将细胞种在三个培养皿中，标记，置于培养箱中。

3、细胞计数

弃去原培养液，加PBS溶液洗1～2次，加0.25％的胰酶，消化5min，再加完全培养基，轻吹细胞，将细胞收入2mL的离心管中，离心5min，弃去上清液。加入完全培养基，将细胞轻吹为单细胞悬液，取10μL滴加到计数板上。数出4个大方格内的细胞总数(每个大方格的体积为0.1μL)。细胞浓度的计算公式如下所示：

细胞浓度(细胞数/ml)＝(四大格细胞总数/4)×10⁴

4、细胞冻存

弃去原培养液，加入无菌PBS溶液洗1～2次，加0.25％的胰酶，消化5min，再加完全培养基，轻吹细胞，将细胞收入2mL的离心管中，离心5min，弃去上清液。加入1mL的冻存液，将细胞轻吹为单细胞悬液，再将重悬细胞转入冻存管，标记。将冻存管转到液氮罐中保存。

5、细胞复苏

将冻存管从液氮灌中拿出，置于37℃的水浴锅中轻轻摇晃。离心，弃上清液。用对应完全培养基重悬，种在新的培养皿中，标记，放置在培养箱中。

6、样品试剂对细胞活性的影响

(1)排板：取对数时期稳定生长细胞，弃去原培养液，加入无菌PBS溶液洗1～2次，加0.25％的胰酶，消化5min，再加完全培养基，轻吹细胞，将细胞收入2mL的离心管中，离心5min，弃去上清液。加入完全培养基，将细胞轻吹为单细胞悬液。计数，将细胞的密度调到3×10⁴个/mL，以每孔加200μL标准，加入96孔板中，培养箱中培养24h。

(2)分组：实验分别设对照组(加完全培养基)、加药组(加不同浓度橙皮素、橙皮素-4-喹啉腙的细胞组)。

(3)加药：将橙皮素、橙皮素-4-喹啉腙，分别用DMSO(二甲基亚砜)溶解，用完全培养基稀释至5个浓度梯度组：20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL和1.25μg/mL。将原培养液吸出，依次加入含橙皮素、橙皮素-4-喹啉腙的培养液，每孔加200μL。培养48h后，避光，每孔加入20μL的MTT。

(4)检测：吸去原培养液，加DMSO。调整测量波长为490nm，酶标仪中测量各个孔的光密度值(OD)。

7、IC₅₀值计算

按照寇氏改良公式法计算药物的IC₅₀值其计算方法如下：

抑制率计算方法：抑制率＝1－加药组/对照组

寇氏改良法：lg IC₅₀＝X_m-I[P-(3-P_m-P_n)/4]

X_m:lg最大剂量I:lg(最大剂量/相临剂量)

P:阳性反应率之和

P_m:最大阳性反应率P_n:最小阳性反应率

依据以上公式测出橙皮素-4-喹啉腙的IC₅₀(μM)，并与对照品橙皮素IC₅₀进行对比，结果见表1，柱状图见图3。

表1本发明橙皮素-4-喹啉腙及橙皮素原料在四种肿瘤细胞中的IC₅₀(μM)

从体外抗肿瘤活性实验的测定结果来看，橙皮素-4-喹啉腙衍生物对以上四种肿瘤细胞的抑制活性相对于橙皮素原料药提高了2～4倍不等，抑制作用大大增强，尤其对人肝癌细胞BEL-7402增殖的抑制作用非常显著，IC₅₀值为10.97μM。这表明，本发明橙皮素-4-喹啉腙对实验的四种肿瘤细胞均具有良好的抑制活性，且活性均强于原料药橙皮素本身，尤其对人肝癌细胞BEL-7402具有较好选择性，活性相对于橙皮素原料药提高了近4倍，是非常具有应用前景的抗肿瘤化合物。

Claims

1.一种具有抗肿瘤活性的橙皮素喹啉腙衍生物，其特征在于，所述的橙皮素喹啉腙衍生物为橙皮素-4-喹啉腙，分子式为C₂₅H₂₁N₃O₅，分子结构式为：

2.一种如权利要求1所述橙皮素喹啉腙衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的橙皮素喹啉腙衍生物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中反应的时间为6h～8h。

4.根据权利要求2所述的橙皮素喹啉腙衍生物的制备方法，其特征在于，2-肼基喹啉中间体和橙皮素的摩尔比为1.2:1～1.5:1。

5.根据权利要求2所述的橙皮素喹啉腙衍生物的制备方法，其特征在于，还包括将橙皮素-4-喹啉腙粗品用无水乙醇重结晶，得橘黄色粉末，即为橙皮素-4-喹啉腙。

6.一种如权利要求1所述橙皮素喹啉腙衍生物在制备抗肿瘤细胞药物方面的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞为人胃癌细胞BGC-823、人肝癌细胞BEL-7402、人肺癌细胞A549及人乳腺癌细胞MCF-7。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤细胞为人肝癌细胞BEL-7402。