CN105693682A - 一种来源于肇庆的橙皮素腙类化合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于地方中草药资源开发利用、提取物结构改造和药物研究领域，涉及一种来源于肇庆的橙皮素腙类化合物及其用途。本发明所述的来源于肇庆的橙皮素腙类化合物，是以肇庆地产柑桔皮为原材料，提取橙皮苷，制备橙皮素，以橙皮素为先导化合物，通过对氯苯肼缩合反应得到的广橙皮素对氯苯甲酰腙化合物。本发明还提供了所述的广橙皮素腙类化合物用于制备抗肿瘤的药物的用途。本发明的抗肿瘤研究结果表明，经化学修饰改造得到的对氯苯甲酰腙具有良好的抗肿瘤效应。

Description

一种来源于肇庆的橙皮素腙类化合物及其用途

技术领域

本发明属于地方中草药资源开发利用、提取物结构改造和药物研究领域，涉及一种来源于肇庆的橙皮素腙类化合物及其用途。

背景技术

橙皮为常用传统中药，为芸香料植物柑橘(CitrusreticulateBlanco)及其栽培变种的干燥成熟果皮，具有理气健脾、燥湿化痰作用。橙皮主含挥发油、黄酮类化合物等化学成分，具有抗肿瘤、抗休克、抗动脉硬化、疏肝利胆、抗过敏、抗肿瘤、避孕、抗血检形成及抗菌等药理作用。已受到人们的青睐。故研究开发橙皮类化合物抗癌制剂将具有重要的理论意义和实践意义。

广橙皮和橙皮是因产地和栽培种不同而分为两个药材品种。广橙皮为广东特产药材之一，是橙皮中质量最好、数量最少且价格最贵的一个品种。过去销售给大城市里有名望的中药店，并有专营广帮药材的字号贩卖经营。上等规格供出口及江、浙、上海等省市。20世纪50年代后，橙皮药用量大增，而广橙皮产少价高，供不应求，逐渐以使用橙皮为主。广橙皮随之淡忘，现在大多数地区不复经营。但广东及出口，仍以广橙皮为主要品种。

普通橙皮主要产于福建、四川、浙江等地。广橙皮作为广东省的道地药材，主要产于广东江门新会、肇庆，约占90％。申请地理标志产品保护的地域范围为北纬22°05′～22°35′，东经112°46′～113°15′，由于产地的气温、湿度、地形等因素影响到橙皮的产量和质量。

从化学成分比较：广橙皮与橙皮挥发油的成分有明显差异。与普通橙皮比较，广橙皮中挥发油的含量更高，所含的化学成分更多，含柠檬烯、β－月桂烯、α－松油烯等药理活性较强的成分，具有镇咳、祛痰、抗菌等重要作用。另外，广橙皮还含有黄酮类成分，例如橙皮甙、新橙皮甙(neohesperidin)、柑橘素(tangeretin，5,6,7,8,4'-pentamethoxyflavone)、二氢川橙皮素(citromitin，5,6,7,8,3',4'-hexamethoxyflavanone)及5-去甲二氢川橙皮素(5-O-desmethyl-citromitin)。有报道，川橙皮含橙皮甙约8.4％，川橙皮素(nobiletin)约0.15％。另含辛弗林(对羟福林)0.28％-2.54％。

广橙皮苷和橙皮素是柑橘类果皮的主要药效成分。近年的研究表明，二者在抗氧化和清除自由基、调节心血管系统功能、保护神经系统、抗过敏、抗皮炎、抗菌抗癌及基因毒性等方面表现出较好的生物活性。由于橙皮腙物质中C＝N双键上的N原子有孤对电子，具有重要的化学与生物学意义，近年来，对其在抗肿瘤、抗氧化和抗菌活性研究方面取得了很大进展。

自由基是生物体生命活动过程中由机体生物化学反应所产生的中间产物，对机体的衰老和疾病、正常的免疫代谢和细胞信号传导等过程均起着重要作用。近年来，人们普遍认为生命过程中氧化代谢反应产生的各种过量自由基与许多疾病，如肿瘤、炎症和衰老等密切相关，因此寻找低毒或无毒的抗氧化物质已成为热点研究课题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种来源于肇庆的橙皮素腙类化合物。

本发明所述的来源于肇庆的橙皮素腙类化合物，是以肇庆地产柑桔皮为原材料，提取橙皮苷，制备橙皮素，以橙皮素为先导化合物，通过对氯苯肼缩合反应得到的广橙皮素对氯苯甲酰腙化合物。

本发明还提供了所述的来源于肇庆的橙皮素腙类化合物的用途。

根据本发明所述的来源于肇庆的橙皮素腙类化合物可用于制备抗肿瘤的药物。

本发明通过UV、IR等图谱对目标化合物的结构经行确证，并对橙皮素腙化合物进行抗肿瘤的研究。

本发明通过对肺癌A549细胞、肝癌SMMC-7721细胞、人结肠癌LOVO细胞、小鼠肺LLC细胞的实验，验证广橙皮素腙类化合物制剂对各种肿瘤细胞的抑制能力，并研究证实抗癌药物治疗个体化为目的的药物敏感试验的重要性。研究证明，广橙皮苷、广橙皮素、对橙皮酰腙类均具有清除自由基的活性，并且随浓度增大而增大，实验表明，由于对氯苯甲酰腙是经过化学修饰的配合物，实验证明，经修饰后，表现出活性基团具有协同作用，提高了其清除自由基的能力，故其活性明显比相同量的橙皮苷、橙皮素的活性高。本发明的抗肿瘤研究结果表明，经化学修饰改造得到的对氯苯甲酰腙具有良好的抗肿瘤效应。

附图说明

图1是本发明所述的橙皮素腙类化合物的制备流程图。

图2是本发明所述的橙皮素腙类化合物对不同肿瘤细胞株的作用图。

图3是本发明所述的橙皮素腙类化合物对A549细胞的生长抑制曲线图。

图4是本发明所述的橙皮素腙类化合物对SMMC-7721细胞的生长抑制曲线图。

图5是本发明所述的橙皮素腙类化合物对人结肠癌LOVO的生长抑制曲线图。

图6是本发明所述的橙皮素腙类化合物对小鼠肺癌LLC细胞的生长抑制曲线图。

具体实施方式

实施例一：本发明所述的广橙皮素腙类化合物的制备

本发明所述的广橙皮素腙类化合物的制备流程详述如下：

1、橙皮苷的提取分离与纯化

流程如下：肇庆柑桔橙皮收集，烘干，粉碎，蒸馏水浸泡，饱和氢氧化钙浸提，提取液酸化，得到粗制橙皮苷；将粗品溶解于含1％NaOH的50％乙醇溶液中，过滤除去不溶物，滤液中加入稀盐酸，收集沉淀，蒸馏水洗至中性，甲醇重结晶，得到白色针状结晶，为橙皮苷，产率1.3％，熔点260～262℃。

2、橙皮素的制备

将橙皮苷1.50g(2.46mmol)加到无水乙醇90mL中，剧烈搅拌下加入浓硫酸3mL，加热回流7.5h。停止反应，减压蒸除大部分乙醇，剩余物倒入蒸馏水中，乙酸乙酯(3×90mL)萃取，将萃取液合并，蒸馏水洗至中性，分出乙酸乙酯层，减压蒸馏，得黄色残渣，粗品用乙醇/水重结晶。得到淡黄色针状结晶，为橙皮素，产率52.1％，熔点224～226℃。

3、广橙皮素腙类化合物的制备和结构鉴定

广橙皮素腙类化合物的制备流程参见图1。

将上述提取的1mmol橙皮素和1.1mmol含氨基化合物(氢氧化氨)溶于20ml无水乙醇中并滴加少量冰醋酸或1滴浓盐酸，混合液搅拌回流24-60小时，薄层层析检测反应进程，得棕黄色溶液，减压除去部分乙醇，有黄色固体析出，抽滤，蒸馏水洗涤固体，再用少量乙醇洗涤，室温晾干，无水乙醇/二甲亚砜重结晶，得到相应的橙皮素腙类化合物，即广橙皮素对氯苯甲酰腙，产率为12.35％。

广橙皮素腙类化合物为棕色粉末，易溶于甲醇、乙醇、二甲基亚砜，N,N-二甲基甲酰胺等溶剂。广橙皮素腙类化合物与1％AlCl₃的纸斑反应显鲜黄色，盐酸-镁粉反应呈红色，这两个显色实验表明结构中含有黄酮母体。结合熔点测定和TLC测定其纯度。用熔点测定仪测得实验所得样品的熔点为159℃，且样品熔程较短，说明经分离、纯化得到的黄酮样品纯度伽高。同时，用样品的乙溶液跑TLC，石油醚/乙酸乙酯(1:1)为展开剂，三次平行测定后。样品在薄层板上均呈现一点，说明样品纯度较高。

4、广橙皮素腙类化合物紫外吸收光谱的测定

将广橙皮素及其腙溶于无水甲醇，配成浓度为1×10⁵mol/l的溶液，测定紫外一可见吸收光谱，测定其波长为200—600nm，结果如下表1。

表1、广橙皮素腙类化合物的紫外吸收光谱数据

化合物	吸收带I(nm)	吸收带II(nm)
			广橙皮素	325	288
广橙皮素腙	339	297

广橙皮素在325、288nm处有两个强吸收峰，腙与母体相比，峰I由325nm红移至339nm，强度略增，这是由于形成腙后，次氨基氮原子的孤对电子与亚氨基双键形成了共轭体系，使得橙皮素母体的共轭体系延长，导致吸收波长向长波方向移动。

5、广橙皮素腙类化合物的红外光谱测定

用KBr压片法扫描对通过氯苯肼缩合反应得到的广橙皮素对氯苯甲酰腙化合物的红外吸收光谱。测量范围400—4000cm^-1，结果见如下表2。

表2、广橙皮素腙类化合物的红外吸收光谱

广橙皮素的振动频率v(c＝0)位于1635cm^-1处出现C＝N特征吸收峰，3326cm^-1出现了NH伸缩振动，1587cm^-1处出现NNH弯曲振动，这均说明合成了广橙皮素对氯苯甲酰腙。

实施例二、广橙皮苷、橙皮素和橙皮素对氯苯甲酰腙清除超氧自由基(O－)的活性

本实施例检测了橙皮苷、橙皮素及通过氯苯肼缩合反应得到的广橙皮素对氯苯甲酰腙化合物清除自由基能力，包括由Fe²⁺-H₂O₂-亚甲蓝体系产生羟自由基和在碱性条件下邻苯三酚自氧化产生的超氧自由基。

本实验测定了橙皮苷、橙皮素及橙皮腙新化合物清除超氧自由基(O^2－)、羟自由基(·OH)和2,2二苯基1苦味酰基自由基(DPPH·)的活性及总还原能力。实验过程中选用了多个浓度，结果发现低浓度时，清除自由基效果较弱，而高浓度时化合物在测定体系中的溶解度小，清除自由基效果也较弱。

表3橙皮苷、橙皮素及其席夫碱类衍生物在1.0g/L浓度下抗氧化活性

表3中，化合物1为橙皮素对氯苯甲酰腙，化合物2为橙皮素对羟基苯甲酰腙，化合物3为橙皮素苯氨基乙酰腙，化合物4为橙皮素对甲基苯氨基乙酰腙。

从表3可以看出，在1.0g/L时，橙皮苷、橙皮素及其席夫碱新化合物均具有清除自由基活性，并且部分席夫碱化合物作用强于橙皮苷和橙皮素，其中橙皮素对甲基苯氨基乙酰腙(化合物4)对DPPH·自由基清除活性较强，清除率为92.66％；橙皮素对氯苯甲酰腙(化合物1)清除羟自由基(·OH)及超氧自由基(O－·2)作用均较强，清除率分别为72.01％和81.61％；橙皮素对氯苯甲酰腙(化合物1)总还原能力较强，其抗氧化活性均强于橙皮苷和橙皮素。本发明选用化合物1。

实施例三：本发明的广橙皮素对氯苯甲酰腙类化合物的抗肿瘤研究

本实施例研究了通过氯苯肼缩合反应得到的广橙皮素对氯苯甲酰腙化合物(广橙皮素腙)对不同肿瘤细胞株的作用。

(1)细胞培养

用含10％胎牛血清和青-链霉素双抗的DMEM完全培养液培养癌细胞，将细胞培养瓶平置于5％CO₂、37度的细胞培养箱内常规养，倒置显微镜下每日观察细胞生长状况。隔日换液，2-3日后观察细胞近融合状态时用0.25％的胰蛋白酶消化传代，待细胞长至80％即对数生长期时进行实验。

(2)MTT法观察药物对细胞的作用

取对数生长期细胞，调整浓度为4-6×10⁴/ml，接种于96孔培养板中，每孔加100ul置于5％CO₂、37度，湿度为80％-90％的二氧化碳培养箱中培养。24小时后待细胞贴壁，阴性对照组加入完全培养基，阳性对照组加入阿霉素，浓度为5ug/ml，调零组不加细胞，加入完全培养液，每孔100ul，每组设4个复孔。实验组加入广橙皮素腙每孔100ul，终浓度为40ug/ml、20ug/ml、10ug/ml、5ug/ml、2.5ug/ml和1.25ug/ml；每组设4个复孔。72小时后，取出96孔板倒掉上清液，每孔加入20ul0.5mg/ml的MTT溶液，置于二氧化碳培养箱中4h后，取出吸掉上清，每孔中加入100ulDMSO，轻轻震荡并放置于室温15min，于酶标仪上测定490nm吸光度值，参考波长630nm，重复实验2次。

细胞生长抑制率＝(阴性对照组—药物实验组)/阴性对照组×100％

半数抑制率IC50为细胞生长抑制率为50％的药物浓度。

(3)细胞形态的观察(Giemsa染色法)

取对数生长期细胞，调整细胞浓度，以每孔2-6×10⁵个细胞接种到6孔培养板中，24h细胞贴壁后，加入不同浓度药物橙皮素，浓度为40ug/ml、20ug/ml、10ug/ml、5ug/ml、2.5ug/ml，设立阴性对照组不加药物，继续培养48小时后，弃掉上清，加入PBS洗2次，甲醇固定15分钟，然后PBS洗2次，加入Giemsa染液染色15分钟，再次用PBS冲净多余的染液，于倒置显微镜下观察并拍。

结果参见图2，未加药前，肺癌A549细胞、肝癌SMMC-7721细胞、人结肠癌LOVO细胞、小鼠肺LLC细胞在镜下多呈扁平不规则多角形及梭形，单层排列、密集、核大、胞质丰富、胞膜光滑完整、明亮。给予药物处理后，见细胞逐渐矮小变细、与其它细胞分离，有的逐渐圆缩、发暗、胞质内可见高折光性颗粒增多、趋边，细胞膜粗糙不完整，有的崩解或漂浮死亡。

(4)细胞生长曲线的绘制

取对数生长期的A549细胞，调整浓度为4×104个/ml，接种于96孔培养板上中，每孔100ul，待24小时细胞贴壁后，加入不同浓度的药物，橙皮素的终浓度为40ug/ml、20ug/ml、10ug/ml、5ug/ml、2.5ug/ml、1.25ug/ml，阳性对照组加入阿霉素，浓度为5ug/ml、0.5ug/ml、0.05ug/ml，每组设3个复孔，每日取4个孔进行酶消化，台盼蓝染色取均值并绘制生长曲线。

每种肿瘤细胞的生长抑制曲线图如下：A549细胞，见图3；SMMC-7721细胞，见图4；结肠细胞，见图5；小鼠LLC细胞，见图6。

(5)抗肿瘤细胞作用

在预实验的基础上，观察广橙皮素腙对肺癌A549细胞、肝癌SMMC-7721细胞、人结肠癌LOVO细胞、小鼠肺LLC细胞等多种肿瘤细胞的影响。

广橙皮素腙对肺癌A549细胞、肝癌SMMC-7721细胞、人结肠癌LOVO细胞、小鼠肺LLC细胞均有作用，且与剂量有关。对肺癌A549细胞、人结肠癌LOVO细胞作用较明显，肝癌SMMC-7721细胞、小鼠肺LLC细胞均有不同程度的抑制作用(见表4)。

表4、橙皮素腙化合物对不同细胞株的IC50

实施例四：广橙皮素对氯苯甲酰腙类化合物对小鼠皮下移植瘤的抑制作用

本实施例在对广橙皮提取物进行体外细胞水平作用的观察和研究基础上，建立小鼠移植瘤模型，给药后观察不同浓度广橙皮素腙在体内对小鼠LLC移植瘤的抑制作用。

(1)制备小鼠肿瘤细胞LLC混悬液

将成瘤的小鼠在无菌条件下剥离肿块，称重，用玻璃匀浆器研磨瘤块，磨均后放入无菌大试管内，加生理盐水稀释成2×107个/ml的细胞悬液，将试管置于预备好的冰块上，充分混匀。

(2)接种皮下瘤

取健康昆明种小鼠50只，每只均于背部接种细胞悬液0.2ml，共需10ml。

(3)给药

接种24小时后，小鼠称重，随机分5组。即生理盐水组、阿霉素组，广橙皮素腙低、中、高剂量组，(低剂量组100mg/kg，中剂量组250mg/kg，高剂量组500mg/kg)每组10只小鼠。接种24小时后分别灌胃给药，灌胃体积为20ml/kg的量连续11天。阿霉素组腹腔注射，隔日1次。于第12天时处死小鼠后称重，并小心剥离瘤组织测其瘤重。

(4)检测

测量瘤体体积，剥取肿瘤组织并计算抑瘤率，如下：

抑瘤率(IR)＝(模型组均重–治疗组均重)/模型组均重×100％

结果如表5所示。

表5、广橙皮素对氯苯甲酰腙对小鼠肺癌LLC抑制性瘤的抑制作用(n＝10)

统计学分析：用SPSS13.0版统计软件包进行统计学处理，实验所得数据用均数±标准差表示，采用F检验，P＜0.05

体内实验表明，广橙皮素对氯苯甲酰腙在体内具有抗肿瘤作用。实验证实橙皮素对氯苯甲酰腙可以抑制LLC小鼠移植瘤模型肿瘤的生长，以高剂量组500mg/kg抑瘤效果最佳，对LLC小鼠移植瘤的抑瘤率达48％证明小鼠体内试验研究，对不同模型的肿瘤小鼠都有效果。

Claims (2)

1.一种来源于肇庆的橙皮素腙类化合物，其特征在于，是以肇庆地产柑桔皮为原材料，提取橙皮苷，制备橙皮素，以橙皮素为先导化合物，通过对氯苯肼缩合反应得到的广橙皮素对氯苯甲酰腙化合物。

2.根据权利要求1所述的来源于肇庆的橙皮素腙类化合物用于制备抗肿瘤的药物的用途。