CN101921711B - 一类交链孢菌生物碱及其制备方法和用途 - Google Patents
一类交链孢菌生物碱及其制备方法和用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于微生物工程及制药工程技术领域，具体涉及从密叶苔草内生真菌(Alternaria sp.)固体发酵物中提取的一类交链孢菌生物碱及其制备方法与抗肿瘤作用。这种交链孢菌生物碱(alternarlactam)，可采用固体发酵和化学合成两种方法制备。交链孢菌生物碱对人类宫颈癌细胞HeLa与人类肝癌细胞QSG-7701增殖有很强的抑制作用，因此交链孢菌生物碱可作为具有抗肿瘤作用的化合物，并在制备抗肿瘤药物中得到应用。
Description
技术领域
本发明属于微生物工程及制药工程技术领域，具体涉及从密叶苔草内生真菌(Alternaria sp.)固体发酵物中提取的一类交链孢菌生物碱及其制备方法与抗肿瘤作用。
背景技术
植物内生菌是指那些在其生活史的一定或全部阶段生活在健康植物的各种组织内部，且不引起宿主明显感染症状的真菌和细菌(包括放线菌)。植物内生菌和宿主之间存在着互惠共生的关系，它可促进宿主植物的生长，提高宿主抵抗逆境、病原体、以及动物危害等方面的能力，使宿主植物比一般未感染的植株更具生存竞争力。内生菌由于其独特的生境，能够产生丰富多样的次生代谢产物，它们常具有新颖的结构和多种生物活性，在农业和医药业都具有重要的应用前景，成为近年来一个研究的热点。
肿瘤是当前危害人类健康的严重疾病，其死亡率仅次于心血管疾病而列居第二。抗癌药物的研究和开发一直受到科学家们的重视。由于许多化学合成的抗癌药在杀死肿瘤细胞的同时对正常细胞的毒副作用非常强，而且治疗过程中肿瘤细胞易产生多药耐药性而常导致治疗失败。目前，从天然产物中寻找有效的抗肿瘤药物已成为国内外重要的研究课题。
发明内容
本发明需要解决的问题是：
提供一类具有抗肿瘤作用的交链孢菌生物碱(alternarlactam)；
提供一种发酵生产及提取分离交链孢菌生物碱(alternarlactam)的方法；
提供一种全合成交链孢菌生物碱(alternarlactam)的制备方法；
本发明的交链孢菌生物碱(alternarlactam)在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明通过下述技术方案予以实现。
1交链孢菌生物碱(alternarlactam)，它具有下述结构通式：
其中1，2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，9b，10为碳原子序数编号，4为氮原子序数编号。
2交链孢菌生物碱(alternarlactam)的分离方法，它包括下述步骤：
1)将新鲜的从密叶苔草(Carex maubertiana Boott.)叶片中分离、纯化得到的交链孢属菌菌丝体块接种到PD培养基(土豆200g，蔗糖20g，蒸馏水1000ml)上(每瓶300mL)，在旋转式摇床(28℃，150rpm)振荡培养6天，
2)然后将发酵液接种于400瓶小米固体培养基中，每瓶15mL菌液。接种后的固体培养基在28℃下静置培养30天，所得的固体培养物干燥、磨碎后称重为2000克，
3)将步骤2所得固体培养物用3L的氯仿/甲醇混合溶剂(1∶1，V/V)提取5次，将提取液浓缩，得粗浸膏F1，
4)将粗浸膏F1用适量的甲醇溶解，然后把溶液置于-4℃的冰箱过夜，过滤除去析出的蜡状固体，将滤液减压浓缩，得浸膏F2，
5)对浸膏F2进行硅胶柱层析，先用10倍体积的氯仿洗脱，得浸膏F3，
6)然后用氯仿/甲醇(体积比100/1)混合溶液继续对浸膏F2进行洗脱，合并白色部分洗脱液得白色浸膏F4，
7)对浸膏F4，用凝胶柱层析氯仿/甲醇(体积比1/1)得到左旋交链孢菌生物碱[(-)-alternarlactam]。
3交链孢菌生物碱(alternarlactam)的合成方法，它包括下述步骤：
1)以3，5-二甲氧基苯胺为原料，通过两步反应制得中间体A(2-氨基-4，6-二甲氧基苯甲酸)，
2)再以3-甲基环戊酮为原料，通过邻位氯代然后氧化两步反应生成中间体B(4-甲基-1，2-环戊二酮)，
3)将中间体A通过重氮化反应生成相应的重氮盐，再加入中间体B即可生成3环的内酯C，
4)在甲酰胺存在的情况下，通入氨气，将化合物C转化为3环内酰胺D，
5)再通过对化合物D进行选择性脱甲基，得外消旋交链孢菌生物碱[(±)-alternarlactam]，
6)对外消旋交链孢菌生物碱[(±)-alternarlactam]，用手性高压液相色谱法(手性柱：ChiralpakAD-H column；流动相：甲醇/二乙醇胺＝100/0.1(v/v)；流速：1.0ml/min)分离得到一对对应异构体左旋交链孢菌生物碱[(-)-alternarlactam]和右旋交链孢菌生物碱[(+)-alternarlactam]。
4本发明的交链孢菌生物碱(alternarlactam)对人类宫颈癌细胞HeLa与人类肝癌细胞QSG-7701增殖有很强的抑制作用，因此交链孢菌生物碱(alternarlactam)可作为具有抗肿瘤作用的化合物，在制备抗肿瘤药物中得到应用。
与现有技术相比，本发明有益效果是：
1.本发明的交链孢菌生物碱(alternarlactam)是新化合物，可以作为具有抗肿瘤作用的新药物或先导化合物，克服现有抗肿瘤药物的耐药性缺陷。
2.本发明的交链孢菌生物碱(alternarlactam)可以利用化学合成的方法生产，工艺简便，周期短，成本低，来源有保证。
3.本发明的化学合成交链孢菌生物碱(alternarlactam)对环境无污染。
具体实施方式
通过下面给出的具体实施例可以进一步了解本发明。但它们不是对本发明的限定。
1[天然交链孢菌生物碱(alternarlactam)的分离方法]
实施例1：苔草(Carex aridula V.Krecz.)叶片交链孢属(Alternaria sp.)真菌的分离与纯化。
剪下苔草叶片，用自来水洗净后，再将叶片裁成1cm×1cm的小块，然后用75％乙醇消毒1min，用2.5％次氯酸钠10min，接下来用75％乙醇消毒1min，再用无菌水冲洗2-3次，接入WA+双抗培养基的平板上，28℃培养3-15天。待菌体长出后，挑取菌落边缘菌丝纯化培养，得到苔草叶片真菌。菌落深绿色至黑色，菌丝淡色，生长迅速；分生孢子梗暗色，单枝，长短不一，顶生不分枝或偶尔分枝的孢子链；分生孢子暗色，有纵横隔膜，倒棍棒形、椭圆形或卵形，常形成链，顶端有喙状的附属丝。经宋勇春副教授鉴定为交链孢属(Alternaria sp.HG1)现保藏在中国典型培养物保藏中心(地址：武汉市武昌珞珈山武汉大学内)，专利菌种保藏编号为CCTCC NO.M2010064，保藏日期为2010年3月27日。
实施例2：苔草叶片交链孢属(Alternaria sp.)真菌的固体发酵
在PDA平板培养基中活化的苔草叶片交链孢属真菌(Alternaria sp.)的菌丝体接种于20瓶PD培养基中(每瓶300mL)，在旋转式摇床(28℃，150rpm)振荡培养6天，将发酵液接种于400瓶小米固体培养基中，每瓶15mL菌液。接种后的固体培养基在28℃下静置培养30天。
实施例3：交链孢菌生物碱(alternarlactam)的提取与分离
实施例2中所得的固体培养物干燥、磨碎后称重，得2000克固体。将固体培养物用3 L的氯仿/甲醇混合溶剂(1∶1，V/V)提取5次，将提取液浓缩，得粗浸膏F1。将粗浸膏F1用适量的甲醇溶解，然后把溶液置于-4℃的冰箱过夜，过滤除去析出的蜡状固体，将滤液减压浓缩，得浸膏F2。对浸膏F2进行硅胶柱层析，先用10倍体积的氯仿洗脱，得浸膏F3。然后用氯仿/甲醇(体积比100/1)混合溶液洗脱继续对浸膏F2进行洗脱，合并白色部分洗脱液得白色浸膏F4。对浸膏F4，用凝胶柱层析氯仿/甲醇(体积比1/1)得到左旋交链孢菌生物碱[(-)-alternarlactam]。
实施例4：交链孢菌生物碱(alternarlactam)的结构鉴定
交链孢菌生物碱(alternarlactam)的结构是基于它的质谱、核磁共振谱等分析而确定的。
光谱学数据如下：
交链孢菌生物碱(alternarlactam)，白色粉末，熔点234-236℃； 
(c＝0.04，MeOH)；UVλmax(MeOH)nm：255，358；IRυmax(cm-1)：3383，3157，3048，1706，1650(s)，1625，1559，1503，1466，1284，1207，969，841；CDλ(MeOH)(nm(Δε))：355(-0.84)，255(-1.67)；ESI-MS m/z 260.1021[M+H]+，282.0844[M+Na]+，298.0140[M+K]+，541.2416[2M+Na]+，800.3215[3M+Na]+；1H、13C NMR和HMBC data见表1。
表1.交链孢菌生物碱(alternarlactam)1H、13C NMR和HMBC的数据(溶剂：CDCl3)
S：单峰，d：双重峰，dd：四重峰，m：多重峰，br：宽单峰
2[交链孢菌生物碱(alternarlactam)的合成方法]
实施例6：中间体A(2-氨基-4，6-二甲氧基苯甲酸)与中间体B(4-甲基-1，2-环戊二酮)的合成。
12g的3，5-二甲氧基苯胺经过盐酸酸化后，与20ml草酰氯在165℃反应半小时，待反应混合物冷却后加入甲醇。混合物加热至甲醇沸腾，趁热过滤，固体用甲醇洗涤，并在空气中过夜晾干，得13g固体。将该固体用33％氢氧化钠溶解后，在100℃下加入20ml 30％的双氧水加热回流十分钟，反应放热并产生大量气泡。用浓盐酸将上述混合溶液pH值调至7～8，醋酸调pH值到5～6，过滤，水洗，即得中间体A(2-氨基-4，6-二甲氧基苯甲酸)。
在25℃下，将4.9g的3-甲基1，2-环戊酮溶于50ml的二氯甲烷，加入7.5g磺酰氯后，逐滴加入甲醇水的混合物(50mmol/50mmol)，滴加完毕后，溶液回流2小时，用饱和碳酸氢钠洗涤，无水硫酸钠干燥，得2-氯-4-甲基-环戊酮4.7g。将6.6g的2-氯-4-甲基-环戊酮加入50ml水中并将溶液加热至100℃，然后逐滴加入32g的FeCl3·6H2O(溶于8ml水)，滴加完毕后，将溶液冷却至40℃，加入48g的(NH4)2SO4，用二氯甲烷萃取反应液并用无水硫酸钠干燥，得中间体B(4-甲基-1，2-环戊二酮)4.6g。
实施例7：3环的内酯C的合成
将2.4g的中间体A(2-氨基-4，6-二甲氧基苯甲酸)溶于3.6ml水和3.6ml浓盐酸的混合溶液，在0℃下向溶液中缓慢滴加1.26g的亚硝酸钠水溶液(5ml)，继续搅拌20分钟至室温。将5g的中间体B(4-甲基-1，2-环戊二酮)加入反应体系，50℃搅拌12小时，冷却至室温，加水，用二氯甲烷萃取3次后，合并有机相浓缩，所得固体经过硅胶柱(CHCl3/MeOH，100∶1)纯化后，得到1.68g的3环的内酯C。
实施例8：交链孢菌生物碱(alternarlactam)的合成
将0.55g的3环的内酯C溶于10ml甲酰胺中，在90℃下持续通入氨气，2小时候，冷却至室温，反应液减压浓缩后用凝胶柱(CHCl3/MeOH，1∶1)纯化得230mg的3环内酰胺D。在氮气保护环境下，将30mg的3环内酰胺D溶于2ml的二氯甲烷，在0℃向溶液中缓慢滴加150mg的三溴化硼，搅拌1小时后，用5ml的2M的NaOH终止反应，加入1M的HCl至反应液变黄后，用乙酸乙酯萃取，减压浓缩，用凝胶柱(MeOH/H2O，1∶1)纯化得外消旋交链孢菌生物碱[(±)-alternarlactam]24mg。对外消旋交链孢菌生物碱[(±)-alternarlactam]，用手性高压液相色谱法(手性柱：ChiralpakAD-H column；流动相：甲醇/二乙醇胺＝100/0.1(v/v)；流速：1.0mL/min)分离得到一对对应异构体左旋交链孢菌生物碱[(-)-alternarlactam]和右旋交链孢菌生物碱[(+)-alternarlactam]。
3MTT法测定交链孢菌生物碱(alternarlactam)抗肿瘤活性
1)抗肿瘤活性
取人类宫颈癌细胞HeLa与人类肝癌细胞QSG-7701，置于盛有5mL、RPMI1640培养基的培养皿中，使细胞进入溶液并分散成单个细胞，收集指数生长期的测试细胞，计数，调成5×105cells/mL，细胞存活率大于99％。
取5×105cells/well置96孔培养板中，培养24小时后，加入不同浓度的供试化合物，同时设空白及阳性对照，置37℃，培养48小时。终止培养前4h加入5mg/mL 3-4，5-二甲基-2-噻唑-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)10μL，4小时后吸去上清，每孔加入150μL二甲亚砜，震荡，待完全溶解后在酶联免疫测定仪上于570nm测吸光度。所有实验均设三次重复。
2)细胞生长抑制率计算方法
抗肿瘤活性，采用下列公式计算细胞生长抑制率。
生长抑制率＝(1-用药组平均OD值/对照组平均OD值)×100％
然后根据不同药物浓度的生长抑制率计算出药物的半数抑制浓度(IC50)。
抗肿瘤活性测试结果(表2)表明：(-)-交链孢菌生物碱[(-)-alternarlactam]抗肿瘤活性的IC50均小于1.6μg/mL，可与阳性对照盐酸阿霉素相比较。
表2.交链孢菌生物碱(alternarlactam)的抗肿瘤作用
以上结果提示，交链孢菌生物碱(alternarlactam)具有很强的抗肿瘤活性，因此本发明的交链孢菌生物碱(alternarlactam)可制备成抗肿瘤药物。
Claims (5)
1.一种交链孢菌，由密叶苔草叶片分离纯化获得，菌落深绿色至黑色，菌丝淡色，生长迅速，分生孢子梗暗色，单枝，长短不一，顶生不分枝或偶尔分枝的孢子链，分生孢子暗色，有纵横隔膜，倒棍棒形、椭圆形或卵形，常形成链，顶端有喙状的附属丝，经鉴定为交链孢属(Alternaria sp.)，现保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址：武汉市武昌珞珈山武汉大学内，专利菌种保藏编号为CCTCC NO.M 2010064，保藏日期为2010年3月27日。
2.一类交链孢菌生物碱，其特征是具有下述结构通式(I)：
其中1，2，3，3a，5，5a，6，7，8，9，9a，9b，10为碳原子序数编号，4为氮原子序数编号。
3.根据权利要求2所述交链孢菌生物碱的制备方法，其特征是：在PDA平板培养基中活化的权利要求1所述苔草叶片交链孢属真菌的菌丝体接种于20瓶PD培养基中每瓶300mL，在28℃、150rpm旋转式摇床上振荡培养6天，将发酵液接种于400瓶小米固体培养基中，每瓶15mL菌液，接种后的固体培养基在28℃下静置培养30天；所得的固体培养物干燥、磨碎后称重，得2000克固体；将固体培养物用3L的氯仿/甲醇混合溶剂，体积为1∶1，提取5次，将提取液浓缩，得粗浸膏F1；将粗浸膏F1用适量的甲醇溶解，然后把溶液置于-4℃的冰箱过夜，过滤除去析出的蜡状固体，将滤液减压浓缩，得浸膏F2；对浸膏F2进行硅胶柱层析，先用10倍体积的氯仿洗脱，得浸膏F3；然后用体积比为100/1的氯仿/甲醇混合溶液洗脱继续对浸膏F2进行洗脱，合并白色部分洗脱液得白色浸膏F4；对浸膏F4，用体积比为1/1的氯仿/甲醇凝胶柱层析得到左旋交链孢菌生物碱。
4.根据权利要求2所述的交链孢菌生物碱的制备方法，其特征是由以下步骤构成：
步骤1.以3，5-二甲氧基苯胺为原料，通过两步反应制得中间体A，即2-氨基-4，6-二甲氧基苯甲酸，具体步骤为12g的3，5-二甲氧基苯胺经过盐酸酸化后，与20ml草酰氯在165℃反应半小时，待反应混合物冷却后加入甲醇，混合物加热至甲醇沸腾，趁热过滤，固体用甲醇洗涤，并在空气中过夜晾干，得13g固体，将该固体用33％氢氧化钠溶解后，在100℃下加入20ml 30％的双氧水加热回流十分钟，反应放热并产生大量气泡，用浓盐酸将上述混合溶液pH值调至7～8，醋酸调pH值到5～6，过滤，水洗，即得中间体A；
步骤2.再以3-甲基环戊酮为原料，通过邻位氯代然后氧化两步反应生成中间体B，4-甲基-1，2-环戊二酮，即在25℃下，将4.9g的3-甲基1，2-环戊酮溶于50ml的二氯甲烷，加入7.5g磺酰氯后，逐滴加入甲醇水的混合物(50mmol/50mmol)，滴加完毕后，溶液回流2小时，用饱和碳酸氢钠洗涤，无水硫酸钠干燥，得2-氯-4-甲基-环戊酮4.7g，将6.6g的2-氯-4-甲基-环戊酮加入50ml水中并将溶液加热至100℃，然后逐滴加入32g的FeCl3·6H2O的水溶液，滴加完毕后，将溶液冷却至40℃，加入48g的(NH4)2SO4，用二氯甲烷萃取反应液并用无水硫酸钠干燥，得中间体B4.6g；
步骤3.将2.4g的中间体A溶于3.6ml水和3.6ml浓盐酸的混合溶液，在0℃下向溶液中缓慢滴加1.26g的亚硝酸钠水溶液，继续搅拌20分钟至室温，将5g的中间体B加入反应体系，50℃搅拌12小时，冷却至室温，加水，用二氯甲烷萃取3次后，合并有机相浓缩，所得固体经过硅胶柱纯化后，得到1.68g的3环的内酯C；
步骤4.将0.55g的3环的内酯C溶于10ml甲酰胺中，在90℃下持续通入氨气，2小时候，冷却至室温，反应液减压浓缩后用凝胶柱纯化得230mg的3环内酰胺D；
步骤5.在氮气保护环境下，将30mg的3环内酰胺D溶于2ml的二氯甲烷，在0℃向溶液中缓慢滴加150mg的三溴化硼，搅拌1小时后，用5ml的2M的NaOH终止反应，加入1M的HCl至反应液变黄后，用乙酸乙酯萃取，减压浓缩，用凝胶柱纯化得外消旋交链孢菌生物碱[(±)-alternarlactam]24mg；
步骤6.对外消旋交链孢菌生物碱[(±)-alternarlactam]用手性高压液相色谱法，ChiralpakAD-H柱，体积为100/0.1的甲醇/二乙醇胺作为流动相，流速为1.0mL/min，分离得到一对对应异构体：左旋交链孢菌生物碱[(-)-alternarlactam]和右旋交链孢菌生物碱[(+)-alternarlactam]。
5.根据权利要求2所述的交链孢菌生物碱在制备抗肿瘤药物中的应用。
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