CN102577951B - 一种利用蛇足石杉原叶体生产石杉碱甲的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用蛇足石杉原叶体生产石杉碱甲的方法。该方法以离体蛇足杉原叶体为材料，经过人工大量培养以生产石杉碱甲。方法简单易行，为石杉碱甲的来源提供新的途径，同时保护了野生蛇足石杉的资源。
Description
技术领域
本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种利用蛇足石杉原叶体生产石杉碱甲的方法。
背景技术
蛇足石杉Huperzia serrata(Thunb.)Trev.，又名千层塔，山芝和蛇足草等，为石杉科Huperoaceae石杉属Huperzia Bernh.多年生草本蕨类植物，在中国民间主要将全草用于治疗跌打损伤、淤血肿痛和精神分裂等疾病。自1972年我国科技工作者首次报道从该植物中分离的石杉碱甲具有横纹肌松弛作用后，对其进行了大量的研究，发现石杉碱甲是一种高效、低毒、可逆和高选择性的乙酰胆碱酯酶抑制剂，对治疗老年痴呆症(AD)、重症肌无力和单纯记忆障碍等有明显疗效。
石杉碱甲化学名为(5R，9R，11E)5-氨基-11-乙叉基-5，6，9，10-四氢-7-甲基-5，9-甲撑环辛并(6)吡啶-2(1H)酮。我国学者刘嘉森等在1986年确定了其化学结构。临床试验表明它对老年痴呆病等多种病症有良好的治疗效果。在多种治疗老年痴呆病的单体化合物中，石杉碱甲是首选药物。已经被广泛用于治疗认知能力减退、行动迟钝、学习和记忆障碍等。还用于治疗重症肌无力、血管性痴呆、多梗性痴呆、小儿智力发育迟缓、慢性失眠、精神分裂症的阴性症状等。石杉碱甲显著的临床功效引发了人们对其药理的深入研究。
随着科研工作者队石杉碱甲药理作用得更深入研究，起新的药理作用将不断被发现。这也将促进对石杉碱甲的人工合成的进程。但是，由于石杉碱甲特殊的分子结构，人工合成费时费力，且价格高；而且很多合成药都是以野生植株中的基本化合物作为母体进行的。石杉碱甲的来源还是以其原药材蛇足石杉为主。但是，蛇足石杉中石杉碱甲的含量很低，仅为0.007％左右，而且现存的该类植物大多生长缓慢，野生状态下蛇足石杉的繁殖主要以孢子繁殖为主，孢子萌发周期长，萌发后属地下生配子体，需6～15年才能成熟。极大地限制了蛇足石杉野生资源的再生。
现由于蛇足石杉在主产国-中国的蕴藏量甚少，很本不够社会的需求。吴荭等对中国蛇足石杉野生蕴藏量进行了调查，初步确定我国蛇足石杉天然生物量为4656.6t。并以此为基础，在进一步考虑人的采集能力的前提下，判定我国蛇足石杉的理论可采量为1604t。我国蛇足石杉商业可采量大约不会超过200t。由于蛇足石杉资源分散，而且许多相对集中的产地均位于自然保护区和风景区范围内，不可能大规模开采，解决资源短缺的问题还有赖于寻求其他更加科学合理的途径。不然，这种宝贵的自然资源将处于灭绝的边缘。
发明内容
针对上述现有的用于生产石杉碱甲的原药材蛇足石杉资源短缺的问题，本发明的目的在于，提供一种利用蛇足石杉原叶体生产石杉碱甲的方法，该方法以离体培养获得的蛇足石杉原叶体为材料，进行提取获得石杉碱甲粗品，为石杉碱甲的来源提供新的途径，同时保护了野生蛇足石杉的资源。
为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：
一种蛇足石杉原叶体诱导和增殖方法，其特征在于，具体按以下步骤操作：
(1)原叶体的诱导
将蛇足石杉孢子囊在超净工作台中先浸在质量分数为70％的乙醇溶液中30s；接着置于浓度0.1％的HgCl2溶液中浸泡8min，再用无菌水冲洗3次，将孢子囊或者孢子囊破裂后从中散出的孢子作为原叶体诱导的外植体；将得到的外植体接种在常规MS培养基中，在培养温度为22±2℃、光照时间12h/d、光照强度为1000Lx条件下培养12周，从外植体上长出绿色的原叶体组织；
(2)原叶体的培养
步骤(1)中获得的原叶体组织切割成0.3cm2的小片，然后转入石杉碱甲生产培养基上继续培养，培养条件与步骤(1)中相同，培养7周后，原叶体可用于提取石杉碱甲；所述石杉碱甲生产培养基为：常规的MS培养基中加入三氯化铁1mg/L～10mg/L；
(3)原叶体中石杉碱甲的提取
步骤(2)中经过7周培养获得的原叶体在60℃烘干，采用2％酒石酸浸提24h，然后离心，得到上清液，即为石杉碱甲提取液；浓缩石杉碱甲提取液，获得石杉碱甲的粗品。
所述的孢子囊为石杉科(Huperziaceae)石杉属(Huperzia Bernh.)植物蛇足石杉(Huperzia serrata(Thunb.)Trevis)的孢子囊。
所述步骤(3)中石杉碱甲的提取方法或者采用2％的酒石酸进行超声提取，超声功率600W、超声时间30min，然后离心，得到上清液，即为石杉碱甲提取液；浓缩石杉碱甲提取液，获得石杉碱甲的粗品。
采用本发明的利用蛇足石杉原叶体生产石杉碱甲的方法，带来的技术效果体现在以下几方面：
1、选取蛇足石杉的原叶体作为提取石杉碱甲的材料的优点是：由于原叶体来源于组织培养体系，不依赖于野生蛇足石杉资源状况，可常年四季生产石杉碱甲，是石杉碱甲生产的新途径，同时保护了野生蛇足石杉的资源；
2、原叶体的培养是在人工控制的环境中进行的，因此每批次原叶体中石杉碱甲的含量差异性小，石杉碱甲产品质量比来源于野生蛇足石杉药材的稳定，有利于石杉碱甲的大规模生产。
具体实施方式
以下通过发明人给出的实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：
(1)原叶体的诱导
将蛇足石杉孢子囊在超净工作台中先浸在质量分数为70％的乙醇溶液中30s；接着置于浓度0.1％的HgCl2溶液中浸泡8min，再用无菌水冲洗3次，将孢子囊或者孢子囊破裂后从中散出的孢子作为原叶体诱导的外植体；将得到的外植体接种在常规MS培养基中，在培养温度为22±2℃、光照时间12h/d、光照强度为1000Lx条件下培养12周，从外植体上长出绿色的原叶体组织；
(2)原叶体的培养
将获得的原叶体组织切割成0.3cm2的小片，然后转入含有2mg/L三氯化铁石杉碱甲生产培养基上继续培养，培养条件与步骤(1)中相同，即培养温度为22±2℃、光照时间12h/d、光照强度为1000Lx，培养7周后，原叶体可用于提取石杉碱甲；
(3)原叶体中石杉碱甲的提取
将经过7周培养获得的原叶体在60℃烘干，采用2％的酒石酸进行超声提取，超声功率600W、超声时间30min，然后离心，得到上清液，即为石杉碱甲提取液；浓缩提取液获得石杉碱甲的粗品，经过HPLC检测石杉碱甲的含量为0.0096％。
实施例2：
(1)原叶体的诱导
将蛇足石杉孢子囊在超净工作台中先浸在质量分数为70％的乙醇溶液中30s；接着置于浓度0.1％的HgCl2溶液中浸泡8min，再用无菌水冲洗3次，将孢子囊或者孢子囊破裂后从中散出的孢子作为原叶体诱导的外植体；将得到的外植体接种在常规MS培养基中，在培养温度为22±2℃、光照时间12/d、光照强度为1000Lx条件下培养12周，从外植体上长出绿色的原叶体组织；
(2)原叶体的培养
将获得的原叶体组织切割成0.3cm2的小片，然后转入含有10mg/L三氯化铁石杉碱甲生产培养基上继续培养，培养条件与步骤(1)中相同，即培养温度为22±2℃、光照时间12h/d、光照强度为1000Lx，培养7周后，原叶体可用于提取石杉碱甲；
(3)原叶体中石杉碱甲的提取
将经过7周培养获得的原叶体在60℃烘干，2％酒石酸浸提24h，然后离心，得到上清液(即为石杉碱甲提取液)；将上清液浓缩获得石杉碱甲的粗品，经过HPLC检测石杉碱甲的含量为0.0035％。
Claims (2)
1.一种利用蛇足石杉原叶体生产石杉碱甲的方法，其特征在于，按以下步骤进行：
（1）原叶体的诱导
将蛇足石杉孢子囊在超净工作台中先浸在质量分数为70%的乙醇溶液中30s；接着置于浓度0.1%的HgCl2溶液中浸泡8min，再用无菌水冲洗3次，将孢子囊或者孢子囊破裂后从中散出的孢子作为原叶体诱导的外植体；将得到的外植体接种在常规MS培养基中，在培养温度为22±2℃、光照时间12h/d、光照强度为1000 Lx条件下培养12周，从外植体上长出绿色的原叶体组织；
（2）原叶体的培养
步骤（1）中获得的原叶体组织切割成0.3cm2的小片，然后转入石杉碱甲生产培养基上继续培养，培养条件与步骤（1）中相同，培养7周后，原叶体可用于提取石杉碱甲；所述石杉碱甲生产培养基为：常规的MS培养基中加入三氯化铁1mg/L~10mg/L；
（3）原叶体中石杉碱甲的提取
步骤（2）中经过7周培养获得的原叶体在60℃烘干，采用2%酒石酸浸提24h，然后离心，得到上清液，即为石杉碱甲提取液；浓缩石杉碱甲提取液，获得石杉碱甲的粗品。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中石杉碱甲的提取方法采用2%的酒石酸进行超声提取，超声功率600W、超声时间30min，然后离心，得到上清液，即为石杉碱甲提取液；浓缩石杉碱甲提取液，获得石杉碱甲的粗品。
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