CN110468055B - 一种千层塔内胶孢炭疽菌及其应用 - Google Patents

一种千层塔内胶孢炭疽菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种千层塔内生炭疽菌及其应用，该炭疽菌的分类命名为胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2018年11月19日，保藏编号：CGMCC16786，将该胶孢炭疽菌发酵获得菌丝，将菌丝进行提取获得石杉碱甲。本专利为石杉碱甲的获取提供了一条新途径。

Description

一种千层塔内胶孢炭疽菌及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种千层塔内生胶孢炭疽菌及其应用。
背景技术
石杉碱甲分子式为C15H18N2O，相对分子质量242，是我国科学家刘嘉森首次从蛇足石杉中分离提取到了石杉碱甲。陆续的研究结果表明石杉碱甲是一种高效的、高选择性的乙酰胆碱酯酶可逆性抑制剂，石杉碱甲对乙酰胆碱酯酶的抑制作用为毒扁豆碱的3倍、加兰他敏的30倍，临床用于老年性记忆功能减退，对改善记忆功能有良好的作用，可用于治疗阿尔茨海默病等神经性疾病。此后对石杉碱甲的多项研究成果也纷纷被国际同行广泛引用。
石杉碱甲的获得有两种常规途径，化学合成和植物提取。人工合成石杉碱甲技术不成熟，植物资源匮乏，所以其产量受到了极大的限制，而且植物提取存在植物资源匮乏、植株生长缓慢生产周期长、提取含量极其低微的弊端；而且化学合成存在副产物多、反应专一性差、纯度低、构型不易控制等弊端而难以满足临床用药需求。目前，主要通过植物提取的方式获得石杉碱甲。通过植物提取的方式获得石杉碱甲主要依赖于野生资源，加上提取率仅为0.006％-0.1％，久而久之，资源必将枯竭。因此，研究石杉碱甲的新来源非常重要。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种内生胶孢炭疽菌，该炭疽菌的分类命名为内生胶孢炭疽菌，Colletotrichum gloeosporioides，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2018年11月19日，保藏编号：CGMCC16786，并利用CGMCC16786发酵培养可生物合成石杉碱甲，为石杉碱甲的获得提供新途径。
本发明采取的技术方案包括：
一种千层塔内生胶孢炭疽菌，该炭疽菌的名称为胶孢炭疽菌，Colletotrichumgloeosporioides，该炭疽菌的保藏编号为CGMCC16786。
本发明千层塔内生胶孢炭疽菌用于制备石杉碱甲的应用。
可选的，所述的制备石杉碱甲包括：将所述的千层塔内生胶孢炭疽菌在PDA液体培养基中发酵培养，收集发酵培养产生的菌丝提取获得石杉碱甲。
可选的，所述的制备石杉碱甲包括：将所述的千层塔内生胶孢炭疽菌在改良的PDA液体培养基中发酵培养，收集发酵培养产生的菌丝提取获得石杉碱甲；
改良的PDA液体培养基为在PDA液体培养基中添加千层塔植株水提物。
可选的，按占PDA液体培养基的体积百分数计，千层塔植株水提物的添加比例为10％～40％。
可选的，按占PDA液体培养基的体积百分数计，千层塔植株水提物的添加比例为20％～30％。
可选的，所述的千层塔植株水提物的制备包括：以千层塔植株为原料，按照每克原料10mL水的比例稀释，煮沸提取后的液体即为千层塔植株水提物。
可选的，所述的发酵培养的温度为28℃，发酵培养的转速为120转/分钟。
可选的，所述的菌丝提取获得石杉碱甲包括：液氮研磨菌丝至粉末状，按照1：5(g/v)的比例加入体积百分数为0.5％的盐酸溶液，收集上清液调pH至9.0，等体积的三氯甲烷对上清液抽提3次，合并有机相并浓缩有机相至粘稠状即得。
可选的，所述的菌丝提取获得石杉碱甲包括：液氮研磨菌丝至粉末状，按照1：5(g/v)的比例加入体积百分数为0.5％的盐酸溶液，超声处理后过夜，收集上清液，上清液用浓氨水调pH至9.0，静置2～3h，等体积三氯甲烷抽提3次，合并有机相，40℃旋转蒸发浓缩有机相至粘稠状即得。
本发明的优点为：
(1)本发明在千层塔植株的叶中分离出炭疽菌及其应用，该炭疽菌的分类命名为胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)，保藏编号为CGMCC16786，通过发酵培养可合成石杉碱甲，从而为为石杉碱甲的获取提供了一条新途径；
(2)通过在对普通的PDA培养基中加入千层塔植株提取液，可使得CGMCC16786合成石杉碱甲的效率提高45％。千层塔植株提取液在PDA中的最佳加入量为20％。
附图说明
图1为石杉碱甲标准品的HPLC图谱；
图2为实施例1中胶孢炭疽菌菌丝中石杉碱甲的HPLC图谱。
具体实施方式
以下如无特殊说明，出现的加入液体或试剂中的％指的是体积百分浓度。
本发明提到的千层塔植株采集自野外，千层塔采自陕西省汉中市南郑区碑坝镇，经纬度：107°09′/32°30′。
内生真菌和宿主在长期的生存过程中形成了稳定的相互作用，很多内生真菌能够合成宿主所特有的代谢产物。从而利用内生真菌的发酵可取代消耗宿主原谅而生产宿主特有的代谢产物。本发明从千层塔植株的叶片分离出炭疽菌及其应用，该炭疽菌的分类命名为胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2018年11月19日，保藏编号：CGMCC16786，将该胶孢炭疽菌发酵获得菌丝，将菌丝进行提取获得石杉碱甲。本专利为石杉碱甲的获取提供了一条新的途径。
胶孢炭疽菌CGMCC16786的分离方法：
取野生千层塔的新鲜叶片，用0.1％氯化汞溶液进行表面灭菌，接到MS固体培养基上培养，培养温度25℃±2℃，光照强度为2000Lux、光周期16小时；一周后，再用5％次氯酸钠溶液进行表面灭菌；然后放置到PDA固体培养基(马铃薯200g、葡萄糖20g)上培养；培养30天后，获得内生菌菌丝体。再通过纯培养(培养基为PDA固体培养基，方法为平板平板划线法)获得内生菌的纯培养物，即本发明的胶孢炭疽菌CGMCC16786。
胶孢炭疽菌CGMCC16786的鉴定：
将胶孢炭疽菌CGMCC16786通过分子生物学方法进行鉴别，rDNA的ITS片段的扩增产物与GENBANK中的炭疽菌属(Colletotrichum)序列比对，近缘性≥99％。该菌的ITS序列如下(从5’—3’端)：SEQ ID NO：1。
以下结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：
胶孢炭疽菌发酵培养获取石杉碱甲：
将胶孢炭疽菌的纯培养物(用灭过菌的玻璃棒蘸取接入适量即可)采用PDA培养基进行摇瓶液体培养，28℃、摇床转速120转/分钟，培养6天，获得菌丝体。
石杉碱甲提取及检测方法是：液氮研磨菌丝至粉末状，按照1：5(g/v)的比例加入0.5％的盐酸溶液，超声处理1h后，过夜，离心酸液，收集上清液，用浓氨水调pH至9.0，静置2～3h，用等体积三氯甲烷抽提3次，合并有机相，使用旋转蒸发仪，40℃浓缩有机相至粘稠状，用甲醇溶解至1.5mL，然后再用高效液相色谱法检测石杉碱甲的含量，换算成每克干重菌丝的产量为0.93μg石杉碱甲，HPLC图谱见图2。
实施例2：
本实施例与实施例1不同的是，在进行胶孢炭疽菌的发酵培养获取石杉碱甲时对PDA培养基进行了改良，在其中添加了10％的千层塔植株提取液。发酵后获得石杉碱甲的含量为每克干重菌丝1.06μg。
植物提取液的制备方法是：以新鲜千层塔全株为材料，清洗干净，再用破壁机打磨，按照每克10mL水的比例稀释，然后煮沸，降温后过滤获得滤液，再抽滤除菌即得千层塔植株的提取液。
实施例3：
本实施例与实施例2不同的是，PDA培养基中添加了20％的千层塔植株提取液。发酵后获得石杉碱甲的含量为每克干重菌丝1.35μg。
实施例4：
本实施例与实施例2不同的是，PDA培养基中添加了30％的千层塔植株提取液。发酵后获得石杉碱甲的含量为每克干重菌丝1.33μg。
实施例5：
本实施例与实施例2不同的是，PDA培养基中添加了40％的千层塔植株提取液。发酵后获得石杉碱甲的含量为每克干重菌丝1.02μg。
核苷酸和/或氨基酸序列表
<110>西北大学
<120>一种千层塔内生炭疽菌及其应用
<160>1
<210>1
<211>547
<212>DNA
<213>胶孢炭疽菌CGMCC16786
<220>胶孢炭疽菌CGMCC16786的rDNA的ITS片段
<400>1
CCTGCGGAGGGATCATTACTGAGTTTACGCTCTATAACCCTTTGTGAACATACCTATAACTGTTGCTTCGGCGGGTAGGGTCTCCGCGACCCTCCCGGCCTCCCGCCTCCGGGCGGGTCGGCGCCCGCCGGAGGATAACCAAACTCTGATTTAACGACGTTTCTTCTGAGTGGTACAAGCAAATAATCAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCTCTGCTTGGTGTTGGGGCCCTACAGCTGATGTAGGCCCTCAAAGGTAGTGGCGGACCCTCCCGGAGCCTCCTTTGCGTAGTAACTTTACGTCTCGCACTGGGATCCGGAGGGACTCTTGCCGTAAAACCCCCCAATTTTCCAAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCAT。

Claims (7)

1.千层塔内生胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）用于制备石杉碱甲的应用，所述的千层塔内生胶孢炭疽菌的保藏编号为CGMCC No.16786；
其特征在于，所述的制备石杉碱甲包括：将所述的千层塔内生胶孢炭疽菌在改良的PDA液体培养基中发酵培养，收集发酵培养产生的菌丝提取获得石杉碱甲；
改良的PDA液体培养基为在PDA液体培养基中添加千层塔植株水提物。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，按占PDA液体培养基的体积百分数计，千层塔植株水提物的添加比例为10%～40%。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，按占PDA液体培养基的体积百分数计，千层塔植株水提物的添加比例为20%～30%。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的千层塔植株水提物的制备包括：以千层塔植株为原料，按照每克原料10mL水的比例稀释，煮沸提取后的液体即为千层塔植株水提物。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养的温度为28℃，发酵培养的转速为120转/分钟。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的菌丝提取获得石杉碱甲包括：液氮研磨菌丝至粉末状，按照1：5（g/v）的比例加入体积百分数为0.5%的盐酸溶液，收集上清液调pH至9.0，等体积的三氯甲烷对上清液抽提3次，合并有机相并浓缩有机相至粘稠状即得。
7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的菌丝提取获得石杉碱甲包括：液氮研磨菌丝至粉末状，按照1：5（g/v）的比例加入体积百分数为0.5%的盐酸溶液，超声处理后过夜，收集上清液，上清液用浓氨水调pH至9.0，静置2～3h，等体积三氯甲烷抽提3次，合并有机相，40℃旋转蒸发浓缩有机相至粘稠状即得。
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