CN103667072A

CN103667072A - 一种蛇足石杉内生真菌及其在制备8α,15α-环氧化石杉碱甲的应用

Info

Publication number: CN103667072A
Application number: CN201310445192.2A
Authority: CN
Inventors: 单伟光; 应优敏; 占扎君
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2013-09-27
Filing date: 2013-09-27
Publication date: 2014-03-26
Anticipated expiration: 2033-09-27
Also published as: CN103667072B

Abstract

本发明公开了一种蛇足石杉内生真菌，是从蕨类植物蛇足石杉植株活体中采用分离纯化技术获得，其分类命名为撕裂蜡孔菌(Ceriporia lacerate)HS-ZJUT-C13A，该菌株已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年10月28日，保藏编号为CCTCC M 2012433。本发明提供的菌株，可用于制备具有神经保护疗效的化合物8α，15α-环氧化石杉碱甲，转化方法具有发酵条件简单、菌种易培养、底物转化率高等优势，具有工业化规模生产的潜力，是一种获得该化合物的新途径，既保护了珍稀药用石杉科植物资源免遭破坏，又能给缓解石杉碱甲临床用药需求短缺的局面开拓新思路。

Description

一种蛇足石杉内生真菌及其在制备8α,15α-环氧化石杉碱甲的应用

技术领域

本发明涉及生物化学技术领域，具体涉及一种蛇足石杉内生真菌及其在制备8α，15α-环氧化石杉碱甲的应用，该应用主要是指采用微生物转化的方法制备8α，15α-环氧化石杉碱甲。

背景技术

石杉碱甲(huperzine A)是来源于石松科石松属植物蛇足石杉(Huperzia serrata)的一个生物碱类化合物。大量科学研究已经表明，石杉碱甲对中枢乙酰胆碱酯酶(acetylcholine esterase，ACHE)具有高效、可逆、高选择性的抑制作用，可用于治疗阿尔茨海默症(AD)，同时对重症肌无力、记忆障碍、血管性痴呆具有显著的疗效。因此，石杉碱甲受到了研究人员的广泛关注，研究的热点主要集中于该化合物及其类似物的化学合成、结构修饰、活性评价、构效关系等方面。

目前，石杉碱甲及其类似物来源主要有三条途径：

途径一：从蛇足石杉植株中提取。该方法的缺陷在于：①蛇足石杉属于高等蕨类植物，生长缓慢(自然生长周期长达10～15年)，孢子萌发率低，使得野生资源匮乏(Ma XQ，etαl.The Lycopodium alkaloids.Nat.Prod.Rep.，2004，21，752-772.)；②人工栽培技术落后，使得蛇足石杉植株的成活率极低；③蛇足石杉植株体内的石杉碱甲含量相对较低，王峻等学者采集6种石杉科植物分别对其根、茎、叶、孢子囊等部位测定石杉碱甲含量，发现蛇足石杉植株全草的石杉碱甲含量仅为0.0332％，根部最少为0.0045％，孢子囊最多为0.0601％(王峻，潘胜利.湖南省石杉属植物中石杉碱甲含量的研究[J].中国药学杂志，2005，21，1616-1618.)。

途径二：通过蛇足石杉近缘植物的组织培养技术获得。该方法的缺陷在于：由于蛇足石杉近缘植物中含有丰富的微生物，使得其组织培养材料的灭菌困难，因此只有极少数获得了初步成功。Wojciech Szypula等研究报道，以伏贴石杉进行组织培养，其幼嫩新梢中石杉碱甲含量为3.33mg/kg，但未见其大田培养成功，也难以大规模获得石杉碱甲。

途经三：化学合成。如意大利科学家Kozikowski AP等(1989年)进行了石杉碱甲类似物的合成、英国的Lucey C等(2007年)进行了石杉碱甲的全合成，该方法的缺陷在于：①由于石杉碱甲分子结构存在较强的刚性，对其进行结构修饰的难度很大，目前已经报道的修饰也主要集中于其结构中的吡啶酮环和游离氨基，结构修饰的位点较单一；②合成出来的石杉碱甲类似物只有极少数具有明显的治疗效果，可筛选的化合物较少；③所有的化学合成路线均存在反应条件苛刻、目标产物收率低、无法实现工业化生产等技术障碍。

微生物生物合成及转化是一种新兴的获得天然产物及其类似物的手段，其本质是利用微生物或其产生的酶(系)对外源添加物进行合成与结构修饰的过程，具有操作简便、条件温和、选择性高、立体专一性强等优势，可以完成非活化饱和碳链的氧化、醚键的断裂等化学方法较难进行的反应。

有关石杉碱甲的微生物转化研究，近年来才刚兴起，但主要集中在通过微生物发酵的手段来获取石杉碱甲及其类似物。如CN101195804B的中国发明专利(发明名称：蛇足石杉内生真菌及其应用，申请号：200610119149.7)中公开的一种蛇足石杉内生真菌，是从蕨类植物蛇足石杉植物活体中采用内生真菌分离纯化技术分离获得的，经微生物分类学鉴定为内生枝顶孢霉(Acremonium endophytium)。该菌株保藏号为CCTCC M206118。该发明通过蛇足石杉内生真菌菌株液体发酵，产生了石杉碱甲类似化合物。又如CN102168017B的中国发明专利(发明名称：一种石杉碱甲高产菌及用其发酵生产石杉碱甲的方法，申请号：201010296985.9)中公开的一种石杉碱甲高产菌，该菌株为胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)isolate YLJ-13，保藏号为CCTCC M2010181。该菌株在改良马铃薯液体培养基进行发酵，从发酵液中得到石杉碱甲。上述两个技术方案的不足之处均在于：通过发酵方法获得的目标化合物产率低，无法满足工业化生产的需求。

2010年，中国医学科学院药物研究所戴均贵研究员通过研究Streptomyces griseus CACC200300(来源未报道)对石杉碱甲的微生物转化，首次获得了包括8α，15α-环氧化石杉碱甲在内的5个新化合物(Zhang XY，Zou JH and Dai JG.Tetrahedron Lett，2010，51，3840-3842.)，这是截至目前唯一的一例有关石杉碱甲微生物转化的报道；其后的药理学研究表明仅8α，15α-环氧化石杉碱甲对硝普钠诱导的PCI2细胞凋亡具有保护作用(Ning N，Hu JF，Yuan YH，Zhang XY，Dai JG and Chen NH.Acta.Pharmacol.Sin.，2012，33，34-40)，显示出了该化合物具有被开发成为神经保护类药物的潜质。8α，15α-环氧化石杉碱甲的分子式为C₁₅H₁₈N₂O₂，结构式如下所示：

但该技术方案的不足之处在于：8α，15α-环氧化石杉碱甲的转化率极低，仅为1％，不具有规模开发的成熟性。

综上，由于微生物转化过程中，酶(系)功能的新颖性、多样性和高效性制约着转化反应的类型，转化产物结构的新颖性、多样性，以及转化的效率；因此，如何寻找到一种新的微生物，利用其高效获取具有药效功能的化合物8α，15α-环氧化石杉碱甲，是本领域技术人员急需攻克的技术难题。

发明内容

本发明另辟蹊径，以真菌(尤其是蛇足石杉内生真菌)为筛选对象，经过大量的创造性实验智力劳动，从中筛选得到了一株撕裂蜡孔菌，通过该菌株的发酵与转化，以石杉碱甲为底物制得8α，15α-环氧化石杉碱甲，解决了现有技术中8α，15α-环氧化石杉碱甲转化率低、无法满足工业化生产需求、临床用药短缺等的技术缺陷。

为实现上述发明目的，本发明的技术方案提供了一种蛇足石杉内生真菌，是从蕨类植物蛇足石杉植株活体中采用分离纯化技术获得，其分类命名为撕裂蜡孔菌(Ceriporia lacerate)HS-ZJUT-C13A，该菌株已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年10月28日，保藏编号为CCTCC M2012433，保藏单位地址为中国，武汉，武汉大学。

本发明所述的蛇足石杉内生真菌，菌株的ITS碱基序列为：

CTGCGGAAGGATCATTATCGAGTTTTGAACGGGTTGTAGCTGGCCTTTAAC

GAGGTATGTGCACGCCTGGCTCATCCACTCTCAACCTCTGTGCACTTTATGT

AAGAAACGGTGTAAGCCAGCTATTTATTAGTTGGTAATAAGCCTTTCTTATG

TTTACTACAAACGCTTCAGTTATAGAATGTTTACTGTGTATAACACAATTATA

TACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAG

CGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCT

TTGAACGCACCTTGCACTCCTTGGTATTCCGAGGAGTATGCCTGTTTGAGT

CTCATGGAATTCTCAACCCCTAAATTTTGTAATGAAGTTTAGTGGGCTTGGA

CTTGGAGGTTGTGTCGGCTTCTAGTCGACTCCTCTGAAATGCATTAGCGTG

AATCTTACGGATCGCCTTCAGTGTGATAATTATCTGCGCTGTGGTGTTGAAG

TATTTATTAGTTCGTGCTTATAATCGTCTCTTACCGAGACAATTTATGACAAT

CTGAGCTCA。

本发明所述的蛇足石杉内生真菌，菌株的固体培养特征为：

在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上，于28℃下培养，菌丝呈白色绒毛状，生长蓬松、呈放射形生长，且多为气生菌丝，与培养基结合紧密；培养4～7天，菌落即铺满整皿，菌落干燥、不透明、边缘不平整，背面呈浅黄色。

上述PDA培养基，通过如下方法制得：取200g马铃薯去皮、切块后，加1L水煮沸约30分钟，双层纱布过滤，取滤液加20g葡萄糖、18g琼脂溶解后，加水补足1L。

本发明还提供了一种蛇足石杉内生真菌(CCTCC M2012433)的应用，即用如前所述的蛇足石杉内生真菌，经发酵与转化可制得8α，15α-环氧化石杉碱甲化合物，制备步骤如下：

(1)挑取菌丝体接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基，28℃培养，使菌株活化；

(2)将活化好的菌株接种于马铃薯葡萄糖液体培养基，投入底物石杉碱甲，28℃发酵培养，得转化产物；

(3)发酵结束，除去菌丝，调节发酵液的PH至9～11，用萃取剂萃取，减压蒸馏回收溶剂，得转化产物的提取物；

(4)将转化产物的提取物用MCI大孔树脂进行柱层析、洗脱，再经凝胶柱层析、纯化、洗脱，即得8α，15α-环氧化石杉碱甲。

优选的，步骤(2)中发酵条件为：温度28±2℃、转速为160～200转/分钟，培养时间6～14天，底物石杉碱甲的终浓度为0.01～0.1mg/mL。

优选的，步骤(3)中的萃取剂为氯仿，发酵液的PH调节剂为浓氨水和无水碳酸钠的混合。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供的保藏编号为CCTCC M2012433的蛇足石杉内生真菌，是发明人经多年创造性实验劳动发现的一种菌株，是迄今为止世界上首例具有能将石杉碱甲转化为8α，15α-环氧化石杉碱甲的真菌，原创性极强；本发明还提供了一种该菌株在制备8α，15α-环氧化石杉碱甲的应用，采用该方法制得的终产物8α，15α-环氧化石杉碱甲具有神经保护疗效，且该方法具有发酵条件简单、菌种易培养、转化率高(文献报道的产物转化率仅为1％，本发明可达29.5％)等优势，具有工业化规模生产的潜力。

此外，发明人经大量创造性实验发现：利用植物内生真菌转化宿主来源天然产物，其转化率远高于其他微生物，优势明显；植物内生真菌代表了一种尚未开发的微生物资源，可用于天然产物(尤其是宿主来源天然产物)的微生物转化。可见，本发明的研究思路迥异于现有文献报道，为石杉碱甲及其类似物的获取提供了一种新途径，既保护了珍稀药用石杉科植物资源免遭破坏，又能给缓解石杉碱甲临床用药需求短缺的局面开拓新思路。

附图说明

图1为本发明蛇足石杉内生真菌(Ceriporia lacerate)HS-ZJUT-C13A的菌落形态。

图2为采用本发明方法制得的化合物8α，15α-环氧化石杉碱甲的氢谱谱图。

图3为采用本发明方法制得的化合物8α，15α-环氧化石杉碱甲的碳谱谱图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但不限定本发明。下列实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到。

实施例1蛇足石杉内生真菌(Ceriporia lacerate)HS-ZJUT-C13A的分离

(1)样品的采集

样品为2010年8月自浙江省金华市磐安县高二乡采集的蛇足石杉(Huperzia serrata)植株。

(2)菌株的分离

用自来水将采集的植株表皮、根部都洗净，将洗净的样品浸入装有75％乙醇的容器中，2分钟后取出，并以无菌水冲洗3～5次，再浸入装有0.1％升汞溶液的容器中，维持1分钟后取出，用大量无菌水冲洗除去残留的升汞溶液。在无菌操作条件下，用灭菌的镊子和刀片将蛇足石杉茎的外表皮剥去，再切成0.3cm×0.3cm大小的组织片种植于PDA培养基上，于28℃暗培养3～7天。同时将表面消毒过的蛇足石杉茎不做剥皮及切割，在PDA培养基上反复滚动数次后，同条件培养作为对照观察。

培养5天后，见组织片断面边缘有菌丝生长后，立即挑取前端菌丝转入PDA培养基上平板培养，待菌落出现后，根据菌落的形态、颜色的差异及菌落长出时间的不同，分别挑取培养基边缘的菌丝接种于新的PDA平板上进行分离培养，直至筛选出单一的菌落，接入PDA培养基斜面，28℃暗培养4～7天后，转至4℃冰箱内保存备用。

如图1所示，培养起初，菌丝呈白色绒毛状，生长蓬松、呈放射形生长，且多为气生菌丝，与培养基结合紧密；当培养4～7天，菌落即铺满整皿，菌落干燥、不透明、边缘不平整，背面呈浅黄色。

实施例2蛇足石杉内生真菌(Ceriporia lacerate)HS-ZJUT-C13A的分子生物学鉴定

(1)DNA的提取

取培养6天的发酵液，离心收集菌丝体，将菌丝用液氮冷冻研磨后，用SK1375基因组DNA提取试剂盒(厂家：生工生物工程(上海)有限公司)提取基因组DNA，进行琼脂糖凝胶电泳。

(2)ITS区序列的PCR扩增

引物序列为：ITS1：5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG3’；ITS4：5’TCCTCCGCTTATTGATATGC3’。

PCR体系(50μL)构成为：Template(基因组)10pmol，Primer 1(10μM)1μL，Primer2(10μM)1μL，dNTP mix(10Mm each)1μL，10×Taq reaction Buffer 5μL，Taq(5U/μL)0.25μL，加水至50μL。

PCR程序设定为：98℃预变性5分钟，95℃变性35秒，55℃复性35秒，72℃延伸40秒，35个循环，最后72℃延伸8分钟。由PCR产物电泳结果切割所需DNA目的条带，经UNIO-10柱式DNA凝胶回收试剂盒(厂家：生工生物工程(上海)有限公司)纯化。

纯化产物由生工生物工程(上海)有限公司测序，测得ITS碱基序列为：

CTGCGGAAGGATCATTATCGAGTTTTGAACGGGTTGTAGCTGGCCTTTAAC

GAGGTATGTGCACGCCTGGCTCATCCACTCTCAACCTCTGTGCACTTTATGT

AAGAAACGGTGTAAGCCAGCTATTTATTAGTTGGTAATAAGCCTTTCTTATG

TTTACTACAAACGCTTCAGTTATAGAATGTTTACTGTGTATAACACAATTATA

TACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAG

CGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCT

TTGAACGCACCTTGCACTCCTTGGTATTCCGAGGAGTATGCCTGTTTGAGT

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CTTGGAGGTTGTGTCGGCTTCTAGTCGACTCCTCTGAAATGCATTAGCGTG

AATCTTACGGATCGCCTTCAGTGTGATAATTATCTGCGCTGTGGTGTTGAAG

TATTTATTAGTTCGTGCTTATAATCGTCTCTTACCGAGACAATTTATGACAAT

CTGAGCTCA

(3)数据处理

序列数据在美国国立生物信息中心(National Center for Biotechnology Information USA，NCBI)的Genbank中进行同源序列搜索比对，分析其同源性。将上述序列与GenBank中的序列比较，鉴定该菌株为撕裂蜡孔菌(Ceriporia lacerate)。

实施例3利用蛇足石杉内生真菌(Ceriporia lacerate)HS-ZJUT-C13A转化制备8α，15α-环氧化石杉碱甲的方法

(1)菌株活化

马铃薯葡萄糖琼脂培养基：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，水1000mL，制成试管斜面，挑取菌丝体接种于试管斜面上，28℃培养7天；

(2)发酵与转化

马铃薯葡萄糖液体培养基：去皮马铃薯200g切成约2cm²的小块，放入烧杯中煮沸30分钟，然后用双层纱布过滤，取滤液加入20g葡萄糖，加水定容至1000mL。

将活化好的蛇足石杉内生真菌(Ceriporia lacerate)HS-ZJUT-C13A菌株接种于350个250mL三角瓶(瓶中装有100mL马铃薯葡萄糖液体培养基，已于121C灭菌)中，于28℃、180转/分钟振荡培养。培养6天后，在无菌操作条件下，将0.3mL石杉碱甲无水乙醇溶液(10mg/mL)加入各三角瓶中，摇匀，于28℃静置培养14天，得到转化产物。

(3)转化产物的提取

发酵结束，先后以纱布过滤、离心操作的方式除去菌丝；用浓氨水、无水碳酸钠混合调节发酵液pH至9～11，用等体积氯仿萃取，取萃取液；反复萃取5次，合并萃取液，减压蒸馏回收溶剂，得转化产物的提取物。

(4)转化产物提取物的分离纯化

转化产物提取物先以MCI大孔树脂进行柱层析(4.0×60cm)，以甲醇∶水＝1∶1→1∶0洗脱，按份收集，通过薄层色谱检测，合并相同的流分，得S1-S7七个组分。S1再经凝胶柱层析(Toyopearl HW-40C)纯化，以甲醇洗脱，即得8α，15α-环氧化石杉碱甲(310mg)，终产物的转化率计算可得：

310mg/(0.3mL*10mg/mL*350)*100％≈29.5％。

终产物呈白色粉末状，溶于甲醇，丙酮及氯仿。有紫外，硫酸乙醇显色剂显灰色。

薄层色谱中，以氯仿∶甲醇∶二乙胺＝15∶1∶0.01为展开剂，展开R_f值约为0.4。

(5)8α，15α-环氧化石杉碱甲的结构鉴定

通过应用质谱、核磁共振波谱等技术，并与文献数据(Zhang XY，Zou JH and Dai JG.Tetrahedron Lett，2010，51，3840-3842.)比对，确定化合物为8α，15α-环氧化石杉碱甲。

如图2所示，本发明制得的8α，15α-环氧化石杉碱甲，氢谱数据如下：δ_H1.08 (3H，s，H-16)，1.64(3H，d，J＝6.8Hz，H-10)，1.79(1H，d，J＝14.4Hz，H_a-14)，1.94(1H，d，J＝14.4Hz，H_b-14)，2.87(1H，brd，J＝16.7Hz，H_a-6)，2.93(1H，brd，J＝1.8Hz，H-8)，2.97(1H，dd，J＝17.6，5.5Hz，H_b-6)，3.60(1H，dd，J＝4.0，1.9Hz，H-7)，5.58(1H，q，J＝6.7Hz，H-11)，6.43(1H，d，J＝9.5Hz，H-2)，7.90(1H，d，J＝9.4Hz，H-3)。

如图3所示，本发明制得的8α，15α-环氧化石杉碱甲，碳谱数据如下：δ_C12.2(C-10)，24.1(C-16)，31.0(C-6)，32.6(C-7)，47.4(C-14)，52.5(C-13)，56.6(C-15)，63.7(C-8)，116.8(C-11)，117.7(C-2)，121.7(C-4)，138.9(C-12)，140.5(C-3)，141.9(C-5)，165.2(C-1)。

此外，质谱显示其准分子离子峰为ESI-MSm/z：259[M+H]⁺，综合分析可知：本发明制得的8α，15α-环氧化石杉碱甲的分子式为C₁₅H₁₈N₂O₂，与文献一致。

序列表

Claims

1.一种蛇足石杉内生真菌，是从蕨类植物蛇足石杉植株活体中采用分离纯化技术获得，其分类命名为撕裂蜡孔菌(Ceriporia lacerate)HS-ZJUT-C13A，该菌株已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年10月28日，保藏编号为CCTCC M2012433，保藏单位地址为中国，武汉，武汉大学。

2.根据权利要求1所述的蛇足石杉内生真菌，其特征在于，菌株的ITS碱基序列为：

CTGCGGAAGGATCATTATCGAGTTTTGAACGGGTTGTAGCTGGCCTTTAAC

GAGGTATGTGCACGCCTGGCTCATCCACTCTCAACCTCTGTGCACTTTATGT

AAGAAACGGTGTAAGCCAGCTATTTATTAGTTGGTAATAAGCCTTTCTTATG

TTTACTACAAACGCTTCAGTTATAGAATGTTTACTGTGTATAACACAATTATA

TACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAG

CGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCT

TTGAACGCACCTTGCACTCCTTGGTATTCCGAGGAGTATGCCTGTTTGAGT

CTCATGGAATTCTCAACCCCTAAATTTTGTAATGAAGTTTAGTGGGCTTGGA

CTTGGAGGTTGTGTCGGCTTCTAGTCGACTCCTCTGAAATGCATTAGCGTG

AATCTTACGGATCGCCTTCAGTGTGATAATTATCTGCGCTGTGGTGTTGAAG

TATTTATTAGTTCGTGCTTATAATCGTCTCTTACCGAGACAATTTATGACAAT

CTGAGCTCA。

3.根据权利要求1所述的蛇足石杉内生真菌，其特征在于，菌株的固体培养为：在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上28℃培养，菌丝呈白色绒毛状，生长蓬松、呈放射形生长，且多为气生菌丝，与培养基结合紧密；培养4～7天，菌落即铺满整皿，菌落干燥、不透明、边缘不平整，背面呈浅黄色。

4.根据权利要求3所述的蛇足石杉内生真菌，其特征在于，所述的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，通过如下方法制得：取200g马铃薯去皮、切块后，加1L水煮沸约30分钟，双层纱布过滤，取滤液加20g葡萄糖、18g琼脂溶解后，加水补足1L。

5.一种用如权利要求1～4所述的蛇足石杉内生真菌在制备8α，15α-环氧化石杉碱甲的应用，其制备步骤如下：

6.根据权利要求5所述的蛇足石杉内生真菌在制备8α，15α-环氧化石杉碱甲的应用，其特征在于，步骤(2)中的发酵条件为：温度28±2℃、转速为160～200转/分钟，培养时间6～14天，底物石杉碱甲的终浓度为0.01～0.1mg/mL。

7.根据权利要求5所述的蛇足石杉内生真菌在制备8α，15α-环氧化石杉碱甲的应用，其特征在于，步骤(3)中的萃取剂为氯仿，发酵液的PH调节剂为浓氨水和无水碳酸钠的混合。