CN103820331B - 闽浙马尾杉内生真菌及其产石杉碱甲的方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及闽浙马尾杉内生真菌及其产石杉碱甲的方法和应用。本发明提供一种闽浙马尾杉内生真菌，命名为撕裂蜡孔菌MY183,其保藏单位和保藏号为:中国典型培养物保藏中心，CCTCC M2013644。本发明的另一技术方案为提供一种闽浙马尾杉内生真菌，命名为披覆炭团菌MY311，其保藏单位和保藏号为:中国典型培养物保藏中心，CCTCC M2013645。本发明从闽浙马尾杉中分离到产石杉碱甲内生真菌，首次发现撕裂蜡孔菌、披覆炭团菌能产石杉碱甲，是寻找石杉碱甲新药源的一种重要的微生物，有较大的应用价值。

Description

闽浙马尾杉内生真菌及其产石杉碱甲的方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及闽浙马尾杉内生真菌及其产石杉碱甲的方法和应用。

背景技术

老年痴呆症是一种严重的、退行性脑疾患，由于其发病率高，致残率高，给社会和家庭造成了严重的危害和巨大的经济负担，随着社会老龄化，老年痴呆症发病率相对上升，据统计，世界有5000多万老年人患有不同程度的老年性痴呆症，因此治疗老年痴呆症是摆在当前社会的一大难题。

石杉碱甲[(-)Huperzine A，Hup A]是我国科学家刘嘉森于1986年从蛇足石杉中分离得到的一种新型石松类生物碱有效单体。药理实验表明，它能抑制乙酰胆碱酯酶活性，有效地改善老年人记忆功能，对治疗老年痴呆症有特殊疗效。石杉碱甲不但来源于蛇足石杉全草，而且来源于其他石杉科植物。石杉科植物分为马尾杉属和石杉属。2005年马小强采用HPLC的方法测量Hup A的含量，发现在粗糙马尾杉（Phlegmariurus carinatus）含量最高，由此可知从马尾杉属植物中可以分离到石杉碱甲。而该植物对环境要求苛刻，生长缓慢，分布零散，资源更新周期长，而且石杉碱甲的含量甚微，仅为万分之几，造成国际市场上石杉碱甲的价格不断攀升，一度达到每千克50万美元，成为制约石杉碱甲开发的瓶颈。由于石杉碱甲的结构特殊，骨架中的桥环结构难以人工合成，目前所有化学合成方法步骤复杂、合成条件苛刻、产率很低，难以实现工业化生产；植物组织培养无法消除内在的微生物污染，同时由于植物生长条件十分苛刻，因此至今未能走出实验室。

植物内生真菌由于生活在植物体中，长期与植物相互作用，能够产生与宿主相同或相似化学成分。自从1993年Strobel等从短叶红豆杉中分离出能够合成抗癌成分的紫杉醇，人们希望采用内生真菌发酵合成药用成分。微生物具有易进行工业化生产，易诱变提高有效产物的含量，发酵产物较植物成分单一， 有效成分容易分离等优势。因此从内生真菌中提取活性成分代替从植物中提取活性成分，不但可解决许多药用植物资源的枯竭危机，而且也降低了活性成分的生产成本。

目前已有不少关于从蛇足石杉植物中分离到产石杉碱甲内生真菌的报道，如专利CN101195804A（黎万奎等，专利申请号：200610119149.7，内生枝顶孢霉）、CN101240304A(吴东才等，专利申请号：200710003519.5，枝孢霉菌)、CN101942393A(朱笃等，专利申请号：20091010186852.3，竹黄菌)、专利CN103103134A(吴水生等，专利申请号：201110355882.X，炭疽菌)等；杨晓军（《内生真菌YD-01次生代谢产物的研究Ⅰ》2006，37（5）：479-480，中国药科大学学报）均报道了产石杉碱甲及其类似物的菌株。以上均表明利用内生真菌发酵生产石杉碱甲成为一种可能，采用内生真菌发酵生产石杉碱甲是解决石杉碱甲原料来源的经济有效的新途径。但目前报道的菌种石杉碱甲产量低，无法应用于工业化生产。因此，通过进一步的分离纯化新的、高产石杉碱甲内生真菌成为必要，为发现适合于工业化发酵生产石杉碱甲创造一种可能。

发明内容

本发明的目的是提供发酵生产石杉碱甲药物的闽浙马尾杉内生真菌及其产石杉碱甲的方法和应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案为提供一种闽浙马尾杉内生真菌，命名为撕裂蜡孔菌（Ceriporia lacerata）MY183,其保藏单位和保藏号为:中国典型培养物保藏中心，CCTCC M2013644。

上述的闽浙马尾杉内生真菌—撕裂蜡孔菌MY183，其显微形态为：菌丝无隔，分枝，平滑，呈管状，间距不等，孢子椭圆形，单孢。

上述的闽浙马尾杉内生真菌—撕裂蜡孔菌MY183，其基因组ITS特征碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

上述的闽浙马尾杉内生真菌—撕裂蜡孔菌MY183，其液体培养菌落特征为PDA培养基28℃培养，转速为140rpm，培养第三天出现少量菌丝球，第五天菌丝球直径增大，量变多，第八天发酵液呈淡黄色，第十天颜色加深；其菌落特 征为：四天布满整个平板，菌丝发达，呈乳白色，颗粒状突起，背面黄白色。

本发明的另一技术方案为提供一种闽浙马尾杉内生真菌，命名为披覆炭团菌（Hypoxylon investiens）MY311，其保藏单位和保藏号为:中国典型培养物保藏中心，CCTCCM2013645。

上述的闽浙马尾杉内生真菌—披覆炭团菌MY311，其显微形态为：菌丝分枝，有隔，孢子椭圆形，单胞。

上述的闽浙马尾杉内生真菌—披覆炭团菌MY311，其基因组ITS特征碱基序列如SEQ ID NO：2所示。

上述的闽浙马尾杉内生真菌—披覆炭团菌MY311，其液体培养菌落特征为PDA培养基28℃培养，转速为140rpm，生长迅速，第三天未见明显生长，第五天菌丝球出现，发酵液呈白色，第六天发酵液呈灰色，第九天发酵液呈灰黑色，菌丝球直径增大。其菌落特征为：菌丝发达，中央呈黄灰色，呈点状，外源浅黄灰色，颗粒状，凸起处呈灰白色，布满整个平板，背面黑色。

本发明的又一技术方案为提供一种闽浙马尾杉内生真菌提取石杉碱甲的方法，包括下列步骤：

（1）取闽浙马尾杉内生真菌菌种即撕裂蜡孔菌MY183或披覆炭团菌MY311，在无菌条件下，用接种针挑取菌丝，接入灭菌的固体PDA培养基，于28℃活化48小时；

（2）取活化后的菌种，在无菌条件下，转接入已灭菌的液体PDA培养基，于28℃在140rpm摇床培养72小时，得种子液；

（3）将制备好的种子液按10：1的质量比接入液体PDA培养基中，于28℃下140rpm摇床培养10天；

（4）发酵完后，加入30ml的2%酒石酸，静置过夜，超声两次，每次各40min，抽滤收集上清液，用氨水调节至PH值为9.0，加入三倍量的二氯甲烷萃取3次，收集萃取液，60℃回收二氯甲烷，用10ml的甲醇溶解残留物得到石杉碱甲初提物。

本发明的又一技术方案为提供一种上述闽浙马尾杉内生真菌菌种即撕裂蜡孔菌MY183或披覆炭团菌MY311制备石杉碱甲的应用。

本发明的有益效果：本发明从闽浙马尾杉中分离到产石杉碱甲内生真菌，首次发现撕裂蜡孔菌、披覆炭团菌能产石杉碱甲。经HPLC、LC/MS检测实验证明该菌发酵产物中含有化合物石杉碱甲，是寻找石杉碱甲新药源的一种重要的微生物，有较大的应用价值。利用本发明闽浙马尾杉内生真菌的特点以及现代发酵技术，可以达到工业化生产石杉碱甲，以解决石杉碱甲开发的瓶颈问题，同时可以挽救濒临灭绝的石杉碱甲自然资源。

附图说明

图1为本发明撕裂蜡孔菌MY183的显微形态图；

图2为本发明披覆炭团菌MY311的显微形态图；

图3为撕裂蜡孔菌MY183的菌落形态图；

图4为披覆炭团菌MY311的菌落形态图；

图5为Hup A标准品HPLC色谱图；

图6为撕裂蜡孔菌MY183发酵提取物色谱图；

图7为披覆炭团菌MY311发酵提取物色谱图；

图8为Hup A标准品质谱图；

图9为撕裂蜡孔菌MY183发酵提取物质谱图；

图10为披覆炭团菌MY311发酵提取物质谱图。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。

本发明所述的产石杉碱甲的闽浙马尾杉内生真菌是从闽浙马尾杉活体植物中采用内生真菌分离纯化技术分离获得。经分子生物学及形态学鉴定命名为撕裂蜡孔菌（Ceriporia lacerata）MY183、披覆炭团菌（Hypoxylon investiens）MY311，都已保藏于中国典型培养物保藏中心，中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2013年12月10号；其中撕裂蜡孔菌（Ceriporia lacerata）MY183保藏号：CCTCC M2013644，披覆炭团菌（Hypoxyloninvestiens）MY311保藏号CCTCC M2013645。

实施例1

1、菌株显微形态观察：将本发明两种产石杉碱甲的内生真菌点接种于平板中央，再将灭完菌的盖玻片45°斜插人接完菌的平板中（2片/平板），于28℃真菌培养箱中培养，待菌株长到一定程度（6d）后，取插片（超净台中进行）于显微镜下观察。

请参阅图1为本发明撕裂蜡孔菌MY183的显微形态图，所述撕裂蜡孔菌MY183的显微形态为：菌丝无隔，分枝，平滑，呈管状，间距不等，孢子椭圆形，单孢。

请参阅图2为本发明披覆炭团菌MY311的显微形态图，所述披覆炭团菌MY311显微形态为：菌丝分枝，有隔，孢子椭圆形，单胞。

2、菌株平板形态观察：将本发明产石杉碱甲的内生真菌点接到3个平板中央。于28℃真菌培养箱中培养，每天定时观察记录菌体的生长情况，包括菌落直径、菌落颜色、菌丝变化等菌株形态变化。

闽浙马尾杉内生真菌—撕裂蜡孔菌MY183，其液体培养菌落特征为PDA培养基28℃培养，转速为140rpm，培养第三天出现少量菌丝球，第五天菌丝球直径增大，量变多，第八天发酵液呈淡黄色，第十天颜色加深；其菌落特征为：四天布满整个平板，菌丝发达，呈乳白色，颗粒状突起，背面黄白色。

闽浙马尾杉内生真菌—披覆炭团菌MY311，其液体培养菌落特征为PDA培养基28℃培养，转速为140rpm，生长迅速，第三天未见明显生长，第五天菌丝球出现，发酵液呈白色，第六天发酵液呈灰色，第九天发酵液呈灰黑色，菌丝球直径增大。其菌落特征为：菌丝发达，中央呈黄灰色，呈点状，外源浅黄灰色，颗粒状，凸起处呈灰白色，布满整个平板，背面黑色。

3、本发明闽浙马尾杉内生真菌分子生物学特征

菌体收集：将本发明产石杉碱甲内生真菌接自PDA液体培养基，28℃，140r/min,摇瓶培养，待菌体长到一定量后，8000rpm离心5min，弃上清，将沉淀的菌体转至EP管内，于-80℃冰柜中预冻一晚待用。

DNA提取：采用CTAB法提取基因组DNA，取适量冻干后的菌体，于研钵中充分研磨，加入预热至65℃的CTAB溶液1ml，取500ul转入2ml离心管， 加入20μl巯基乙醇，混合，65℃温浴1h；温浴结束后加入等体积的1：1的苯酚：氯仿，缓慢震荡，12000rpm，20℃离心10min，取上清液至新的离心管，重复以上步骤，至上清液澄清，将上清液转入1.5ml离心管（共提2～4次）。加入7/10体积异丙醇，4℃下沉淀，30min后10000rpm离心10min，弃上清；用75%冷乙醇（500ul）洗涤沉淀，然后10000rpm，4℃离心10min，弃上清（重复一次），自然风干；最后加入20ul超纯水充分溶解，最后放置-20℃冰箱保存备用。

PCR扩增：采用ITS1和ITS4作为上下游引物，构建20μl反应体系（含ddH2O12.2μl、10×buffer2μl、dNTP1.6μl、Primer ITS1和Primer ITS4各1μl、模板1μl、Taq酶0.2μl。），以94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min，32个循环；72℃延伸10min，4℃保温的条件进行反应扩增。结束后，以该轮的PCR产物作为模板，再次扩增100μl。

凝胶电泳：采用TBE做缓冲液，取1ul6×loading buffer和2ul样品（基因组和扩增产物）混匀上样，经1.0%的琼脂糖凝胶电泳，并在凝胶成像系统下观察记录结果。

产物纯化：采用离心柱式PCR产物纯化试剂盒（EZ-10Spin Column PCR ProductPurification Kit）纯化PCR产物。纯化后的PCR产物送交生工生物工程上海股份有限公司完成测序。

本发明所述的两种产石杉碱甲闽浙马尾杉内生真菌genebank登入号分别为：撕裂蜡孔菌（Ceriporia lacerata）MY183登入号KF973226，披覆炭团菌（Hypoxyloninvestiens）MY311登入号KF973227，ITS碱基序列为：

撕裂蜡孔菌（Ceriporia lacerata）MY183（SEQ ID NO：1）:

CCTTTACGAGGTATGTGCACGCCTGGCTCATCCACTCTCAACCTCTGTGCACTTTATGTAAGAAACGGTGTAAGCCAGCTATTTATTAGTTGGTAATAAGCCTTTCTTATGTTCACTACAAACGCTTCAGTTATAGAATGTTTACTGTGTATAACACAATTATATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCACTCCTTGGTATTCCGAGGAGTATGCCTGTTTGAGTCTCATGGAATTCTCAACCCCTAAATTTTGTAATGAAGTTTAGTGGGCTTGGACTTGGAGGTTGTGTCGGCTTCTAGTCGACTCCTCTGAAATGCATTAGCGTGAATCTTACGGATCGCCTTCAGTGTGATAATTATCTGCGCTGTGGTGTTGAAGTATTTATTAGTTCGTGCTTATAATCGTCTCTTACCGAGACAATTTATGACAATCTGAGCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAACGGAGGAA

披覆炭团菌（Hypoxylon investiens）MY311（SEQ ID NO：2）:

GGCCTATAGGCGGTGGTAGTCCTCCCCTTTGTGACCTTACCGTCGTTGCCTCGGCGTGAGCTACGGCTACCCGGGAGCTACCCTGGAAGTACCCTAGAGTTACCCTATAGCTACCCTGCAGCTACCCTATACTTACCCTATAGCTACCCTGCAGCTACCCTATAGTTAGTTACCCTGGAGTTACCCTGGAGCTACCCTGTAGCCGGCTTATGGCCCGCCGAAGGACAGCTAAACTCTTGTTTTTACCACTGTTTCTCTGAATTACAAACTGAAATAAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCATTAGTATTCTAGTGGGCATGCCTATTCGAGCGTCATTTCGACCCCTAAGCCCCTGTTGCTTAGCGTTGGGAATCTACAGCGTAGTTCCTCAAAATTAGTGGCGGAGTTAGGGTACACTCTCAGCGTAGTAATTTCTCTCGCTCGTGTGGTGGCCTTGGCTGCTAGCCGTTAAAACCCCTATAATTTCTAGTGGTTGACCTCGGATTAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAGCCCGGAGGAAG

序列比对及进化树构建：本发明闽浙马尾杉内生真菌18S rDNA序列测序结果全部转换为FASTA格式，在线BLAST检索，与GenBank中其他真菌的18SrDNA序列进行比对，分别与撕裂蜡孔菌（Ceriporia lacerata）、披覆炭团菌（Hypoxylon investiens）同源性为100%，同时通过菌株形态特征比较，确定菌株分类的正确。

实施例2

一、本发明闽浙马尾杉内生真菌的采集

1、从福建省龙岩市连城县冠豸山采回的闽浙马尾杉依照石纬等的分离方法分离闽浙马尾杉内生真菌。对采来的新鲜闽浙马尾杉活体植物用自来水冲洗干 净，浸入75%乙醇(5min)，用无菌水冲洗5次；用无菌滤纸吸干后再将其浸入0.1%升汞（约1min），再次用无菌水冲洗，无菌滤纸吸干，最后用75%乙醇浸泡30s，无菌滤纸吸干。用灭菌后的剪刀将不同植物组织材料(即根，茎，叶)分割成约5mm长的大小。然后每种样品分别转入含有3%链霉素的PDA平板上，用于内生真菌的分离。于28℃恒温培养箱中培养数天。定期观察内生真菌菌落形成情况，3-5天后观察到样品边缘部分有菌丝长出，挑取尖端菌丝转接于新鲜PDA平板，纯化2-3次，将纯化到的菌株进行菌种保藏。

2、将纯化后的菌株用PDB液体培养基进行发酵培养。

3、PDB液体培养基的制作方法：将洗净后去皮的马铃薯200g切碎，加水至1000ml煮沸半小时，用八层纱布滤去马铃薯，然后加入20g葡萄糖，加水补足至1000ml，搅拌溶解后分装灭菌（121℃高压蒸汽灭菌20min）。

二、本发明闽浙马尾杉内生真菌菌株发酵液的制备

1、取本发明的闽浙马尾杉内生真菌，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌过的固体PDA培养基试管，于28℃活化48小时。

2、取活化后的菌种，在无菌条件下，转接入已灭菌的液体PDA培养基，于28℃在140rpm摇床培养72小时，得种子液。

3、将制备好的种子液按10%的量转接入盛有100ml/250ml液体PDA培养基中，于28℃下140rpm摇床培养10天。

4、发酵完后，先取1ml的菌株发酵液，17000rpm离心15min取上清，用于ELISA初筛产石杉碱甲的菌株。剩余发酵液加入30ml的2%酒石酸，静置过夜，超声两次，每次各40min，抽滤收集上清液，用氨水调节至PH值为9.0，加入三倍量的二氯甲烷萃取3次，收集萃取液，60℃回收二氯甲烷，合并有机相，减压浓缩至干，用10ml无水甲醇分三次加入回收瓶中，溶解，取出吹干，加0.2%甲酸200μl，加入活化好的C-18固相小柱，收集40%甲醇洗脱的样品3ml，吹干，加0.2%甲酸200μl，17000r/min离心10min，取上清液备用。

三、本发明的闽浙马尾杉内生真菌产石杉碱甲特性的确定

1）ELISA初筛

根据抗原的性质和实验要求，用pH9.6的碳酸盐缓冲液将包被抗原 HupA-OVA稀释成1：200浓度，以100μl/孔，4℃孵育16h。弃去孔内液体，用PBST洗板3次，每次3min，于吸水纸上拍干。洗完板加入封闭液，200μl/孔,37℃孵育2h。弃去孔内液体，用PBST洗板3次，每次3min，于吸水纸上拍干。在已经封闭好的96孔板内分别加入PBS处理好样品和稀释度为1:8000的石杉碱甲的单克隆抗体（Hup A-McAb）各50μl，振荡混匀后，置于37℃孵育1h。弃去孔内液体，用PBST洗板3次，每次3min，于吸水纸上拍干。每孔加入新鲜稀释的酶标二抗（HRP-IgG）（稀释度为1：5000）100μl/孔，37℃孵育40min，倒空液体，用PBST洗板3次，每次3min，于吸水纸上拍干。加入新鲜配制的显色液100μl/孔，振荡混匀后，室温孵育10min，密切观察，显色10min后，每孔加入50μl2M H₂SO₄溶液终止反应，振荡混匀，静置5min，使终止彻底，颜色均一。在酶标测定仪上，于波长450nm测定吸光值。

2）HPLC和LC-MS分析

（1）HPLC(高效液相色谱)条件

色谱条件：色谱柱：XTerraMS C-18(2.1×50mm，5μm)流动相：甲醇︰0.2%甲酸（15:85）；流速：1.00/min；柱温：30℃；进样量：20μl；

（2）LC-MS(质谱条件)条件：离子源：ESI；检测方式：正离子检测；采集方式：MSscan；检测对象：石杉碱甲，m/z（243.2→211.5）；毛细管电压：3.0KV，锥孔电压：35V，离子源温度：110℃，脱溶剂温度：350℃，脱溶剂气流量：654L/hr。

（3）结果分析

在酶标测定仪上，于波长450nm测定吸光值，根据公式抑制率=(B0-B)/B0，计算抑制率，撕裂蜡孔菌（Ceriporia lacerata）MY183抑制率为85.4%，披覆炭团菌（Hypoxyloninvestiens）MY311抑制率为99.4%。

经HPLC分析，本发明所述的闽浙马尾杉内生真菌发酵提取物HPLC色谱图如图6、图7所示，色谱图中的31.127min、31.303min分别是撕裂蜡孔菌（Ceriporia lacerata）MY183、披覆炭团菌（Hypoxylon investiens）MY311发酵提取物目标峰保留时间，与石杉碱甲标准品保留时间（图5）（31.599min）一致。

经LC-MS分析，本发明所述的闽浙马尾杉内生真菌发酵提取物LC-MS色 谱图如图9、图10所示，其分子离子峰分别为m/z243.51/211.55，如图8所示石杉碱甲标准品分子离子峰为m/z243.51/211.55。本发明诉述的两株闽浙马尾杉内生真菌发酵提取物与石杉碱甲标准品化合物有一致的分子离子峰。

本发明所述的产石杉碱甲的闽浙马尾杉内生真菌—撕裂蜡孔菌MY183、披覆炭团菌MY311是从闽浙马尾杉内中分离纯化到的丝状真菌，经液体发酵后，ELISA、HPLC、LC-MS检测证明该菌株能够产生与寄生植物的化合物石杉碱甲，是寻找石杉碱甲新药源的重要微生物，有较大的应用价值。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (3)

1.一种闽浙马尾杉内生真菌，命名为撕裂蜡孔菌(Ceriporia lacerata)MY183,其保藏单位和保藏号为:中国典型培养物保藏中心，CCTCC M 2013644。

2.一种闽浙马尾杉内生真菌提取石杉碱甲的方法，其特征在于，包括下列步骤：

(1)取如权利要求1所述的闽浙马尾杉内生真菌菌种，在无菌条件下，用接种针挑取菌丝，接入灭菌的固体PDA培养基，于28℃活化48小时；

(2)取活化后的菌种，在无菌条件下，转接入已灭菌的液体PDA培养基，于28℃在140rpm摇床培养72小时，得种子液；

(3)将制备好的种子液按10：1的质量比接入液体PDA培养基中，于28℃下140rpm摇床培养10天；

(4)发酵完后，加入30ml的2％酒石酸，静置过夜，超声两次，每次各40min，抽滤收集上清液，用氨水调节至PH值为9.0，加入三倍量的二氯甲烷萃取3次，收集萃取液，60℃回收二氯甲烷，用10ml的甲醇溶解残留物得到石杉碱甲初提物。

3.根据权利要求1所述的闽浙马尾杉内生真菌制备石杉碱甲的应用。