CN103865841B - 一种醋酸杆菌及其利用杏皮渣固态发酵制备的果醋 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种醋酸杆菌及其利用杏皮渣固态发酵制备的果醋，本发明将醋酸菌株经过亚硝基胍和紫外线复合诱变获得的醋酸菌突变株，获得一种遗传性稳定、发酵性能优良的醋酸杆菌突变株Acetobacter？pomorum？AcF1？CCTCC？No：M2013554，在初始酒精度6％，醋酸接种量14％，发酵时间25d，发酵温度31℃，醋醋酸含量可达8.16g/100ml，耐酒精性能优良和耐高酸性能；采用固态混合菌种发酵工艺能生产杏皮渣醋在感官、理化和卫生指标方面都具备优良品质，其色泽棕黄清亮、果香和酸味较浓、后甜味舒适、体态丰满，丰富了果醋产品品种，具有广泛的实用性和产品典型性。

Description

一种醋酸杆菌及其利用杏皮渣固态发酵制备的果醋

发明领域

本发明涉及微生物及发酵工业领域。具体的说，本发明涉及一种利用突变菌种采用固态发酵酿造杏皮渣醋技术领域。

背景技术

目前，在果醋酿造过程中我国主要用到的有两种醋酸菌。一种是果醋液态发酵中使用的菌种是Asl.41(A.rancensL.)恶臭醋酸杆菌浑浊变种，另一种是沪酿1.01醋酸杆菌(A.lovanienseL.)罗旺醋酸杆菌，是上海酿造科学研究所和上海醋厂从丹东速酿醋中分离的菌种。这两种醋酸菌最初是用于食醋发酵工业，不仅产酸能力和耐酒精能力都有待提高，而且发酵果醋形成的风味也不佳，在果醋发酵过程中出现产酸能力、耐酒精能力和产香能力不理想的问题。

经检索现有技术可知，李湘利、冉旭采用分光光度计法分别研究了壳聚糖对金丝枣醋和葡萄醋的澄清作用。结果表明：壳聚糖可以提高金丝枣醋、葡萄醋的澄清度。周杨使用果胶酶、纤维素和半纤维素复合酶澄清木瓜果醋发酵液，效果较好。史经略研究了用明胶溶液来解决果醋的非生物返混。张善宝、赵欣宇采用硅藻土分别对红枣果醋和金红苹果果醋澄清进行了研究。李华兰采用超滤技术对桑果醋澄清进行了研究。马永昆对不同年份镇江香醋香气成分及其形成机理进行了研究，采取固相微萃取提取香气成分，共得到52种风味物质；解华东对岐山高粱醋陈化期香气成分进行研究，酸类物质为主要风味物质；鲁周民采用不同发酵方式对柿果醋香气成分进行研究，共分离挥发性成分63种；崔涛研究了砂梨及其果醋的香气成分，共获得15种果醋香气成分；王永苓对沙棘果醋香气成分进行了研究，共分离了82种香气成分。

杏皮渣是加工成杏果浆、杏果汁和饮料后产生的副产品。根据资料记载，每生产1吨杏浓缩浆约需2.7吨原料杏，同时产杏皮渣0.225吨。随着杏皮渣的大量积累，大部分杏皮渣作为饲料或肥料应用，杏皮渣没有得到充分利用，附加值低，造成了严重的资源浪费。我国对杏皮渣综合利用的研究主要集中在新疆，何伟研究了以杏皮渣为原料的酿造杏皮渣白兰地酒精发酵阶段的主要工艺条件。潘杨、王桓等研究了从杏渣里提取色素的工艺。郭金喜研究了从杏渣中提取不溶性膳食纤维；窦芹、李芳等以乙酸乙酯为浸提溶剂，从杏渣中提取到类胡萝卜素。李文慧、徐麟等研究了以杏皮渣为原料生产果醋饮料的工艺。

我国食醋生产工艺占主导地位的是传统的固态发酵法和液面静置发酵法，深层液体发酵法占我国食醋总产量的6％。利用固态发酵法和半固-液态发酵方法生产果醋的研究较少。适宜于固态发酵酿造杏皮渣醋的醋酸菌尚属空白。杏皮渣醋及其醋饮料的研发是利用杏皮渣的有效途径之一。优选适合于酿制杏皮渣醋的专用醋酸菌，研究和创新杏皮渣醋发酵工艺是目前急需解决的问题。杏皮渣醋的开发对于提高杏皮渣的附加值，促进杏产业的发展具有重要的意义。

发明内容

针对现有技术中利用固态发酵法和半固-液态发酵方法生产果醋的研究较少，适宜于固态发酵酿造杏皮渣醋的醋酸菌尚属空白。本发明需要解决的技术问题就在于克服现有技术的缺陷，提供一种固态发酵酿造杏皮渣醋醋酸菌突变株的育种及利用该突变菌种固态发酵制备杏皮渣醋的方法，本发明将醋酸菌株经过亚硝基胍和紫外线复合诱变获得的醋酸菌突变株，是一种遗传性稳定、发酵性能优良的醋酸菌种，利用该菌株确定的固态发酵工艺能生产杏皮渣醋。

本发明具体提供一种固态发酵酿造杏皮渣醋的突变株醋酸杆菌，菌种的编号为AcF1，菌种经鉴定名称为：AcetobacterpomorumAcF1，属于醋酸单胞菌属。

本发明从中国新疆巴音郭楞蒙古自治州轮台县杏果园中取土样，从中优选出一批优良的醋酸杆菌，以亚硝基胍和紫外线二者交替处理醋酸菌原生质体进行诱变，获得其中一株菌种编号为AcF1，经鉴定为醋酸单胞菌属，将该菌种AcetobacterpomorumAcF1应用于固态发酵酿造杏皮渣醋，制备获得典型性杏皮渣醋。

本发明提供的菌种AcetobacterpomorumAcF1于申请日前已保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏日期是2013年11月7日，保藏号是CCTCCNo：M2013554。该菌种易在酸性且含酒精的环境中生长，菌落形态为边缘整齐、表面光滑、浅黄白色、凸起的圆形菌落，直径为0.5～1mm；个体形态为短杆状，呈单、对、堆或链状排列，为革兰氏阴性菌。菌种AcetobacterpomorumAcF1的生理生化特性经触酶试验、甘油生酮试验、形成5-酮葡萄糖酸盐试验、葡萄糖酸盐试验、乙醇氧化试验、水溶性色素试验和乳酸钙氧化试验结果呈阳性，而乙酸钙氧化试验、淀粉水解试验和产纤维素试验结果呈阴性；通过上述结果及经过16SrDNA同源分析、系统发育分析结果，依照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》第九版对编号AcF1菌株进行形态学，生理生化特性进行了鉴定，将AcF1菌株鉴定为AcetobacterpomorumAcF1。

同时，本发明提供了杏皮渣醋醋酸菌AcetobacterpomorumAcF1CCTCCNo：M2013554的选育方法，包括下列步骤：

(1)醋酸菌原生质体的制备：将筛选常见的醋酸菌活化培养液以2％(v/v)的接种量接入到100ml液体基础培养基，30℃，120r/min震荡培养至对数生长期后，取5ml培养液，3500r/min离心15min，弃上清液留菌体沉淀，分别取5mlHM缓冲液洗涤菌体2次，3500r/min离心15min离心弃上清液，用0.2mg/ml溶菌酶液悬浮菌体沉淀，30℃缓慢震荡，每隔15min取酶解液涂片，革兰氏染色后镜检，镜检原生质体生成约80％后，3500r/min离心15min离心弃酶液，用HM缓冲液洗涤终止酶解备用；HM缓冲液的重量组成为：O.4％NH₄Cl、1.2％Tris、0.0035％KCl、0.0058％NaCl、0.03％Na₂SO₄·10H₂O、0.426％MgCl₂·5H₂O、6.846％蔗糖、pH7.5、余量为水；

(2)原生质体复合诱变：以亚硝基胍和紫外线二者交替处理醋酸菌原生质体进行诱变。先用8mg/ml亚硝基胍处理原生质体20min后，再用照射距离30cm的紫外线处理60s，获得醋酸菌突变株，所得的复合诱变原生质体溶液在暗环境下，用双层法复生培养，30℃条件下培养3-5d；

(3)醋酸菌原生质体的再生：采用双层平板法，取O.1ml制备好的原生质体溶液，涂布在固体再生培养基下层，迅速加入4ml固体再生培养基上层温度40℃，30℃静置培养3-5d；

(4)醋酸菌突变株平板分离纯化：取再生出的醋酸菌突变株划线涂布于3个碳酸钙平板和3个溴甲酚紫平板，在30℃培养至菌落产生透明圈，挑选钙溶解圈大的单个菌落采用涂布法进一步纯化，分离出单个菌落接种于碳酸钙分离培养基斜面上，30℃培养2d，得到醋酸菌AcetobacterpomorumAcF1CCTCCNo：M2013554，在4℃保藏。

本发明中，固体再生培养基上层的重量组成为：0.5％牛肉膏、1％蛋白胨、0.5％葡萄糖、0.5％酵母膏、0.5％NaCl、pH7.2、0.8％琼脂、余量为HM缓冲液。

本发明中，固体再生培养基下层的重量组成为：0.5％牛肉膏、1％蛋白胨、0.5％葡萄糖、0.5％酵母膏、0.5％NaCl、pH7.2、2％琼脂、余量为HM缓冲液。

本发明中，碳酸钙分离培养基的重量组成为：葡萄糖1％、酵母浸粉1％、165℃干热灭菌30min的碳酸钙2％、无水乙醇3％(v/v)、琼脂1.8％、余量为水。

进一步，本发明提供了利用突变株醋酸杆菌AcetobacterpomorumAcF1CCTCCNo：M2013554固态发酵酿造杏皮渣醋的制备工艺，具体步骤如下：

(1)原料预处理：选择无霉变、黄色干杏皮渣，去除杂物，并用清水将杏皮渣上的泥土、杂物洗净待用；大米用万能粉碎机打碎，过40目筛，制成大米粉；稻壳121℃，15min灭菌；

(2)制备杏皮渣汁：将洗净的干杏皮渣放入50℃的温水中，按重量份配比为杏皮渣：温水为1∶5，经浸泡、过滤取汁，调整可溶性固形物为18％，100℃水浴灭菌5min；

(3)制备杏皮渣浆：采用高压蒸煮和酶解结合法，将杏皮渣和水按重量比为1∶6浸泡2h后破碎打浆，在121℃高压10min，冷却到室温后加入杏皮渣重量200U/g的果胶酶和150U/g的纤维素酶，在50℃下酶解4h；

(4)制备大米糖化醪：取重量份配比为大米粉：温水为1∶3配制成醪液，将醪液先用12U/g中温α-淀粉酶，在65℃条件下液化45min，再加入180U/g糖化酶，在70℃条件下糖化180min；

(5)将步骤(3)制备的杏皮渣浆和步骤(4)制备的大米糖化醪以重量份配比1∶1混合获得混合浆，将获得混合浆经杀菌条件下100℃处理5min；

(6)酿酒酵母种子液和产酯酵母种子液的制备：将常见的酿酒酵母接种至10ml17％杏皮渣汁中，28℃培养24h，得到酿酒酵母种子液；取常见的产酯酵母接种至10ml17％杏皮渣汁中28℃培养36h，得到产酯酵母种子液；

(7)固态酒精发酵：以4.5％(v/v)接种量将酿酒酵母种子液和以2.25％(v/v)接种量将产酯酵母种子液接入步骤(5)中制备的18％混合浆中，按重量份配比，加入为混合浆：稻壳按照3∶1配比的稻壳，密闭发酵，28℃发酵6d，得杏皮渣酒精发酵液；

(8)固态醋酸发酵：取斜面保藏的醋酸杆菌突变株AcetobacterpomorumAcF1CCTCCNo：M2013554，1环接种至10ml3％(v/v)步骤(7)制备的杏皮渣酒精发酵液中，30℃培养24h，得到醋酸杆菌突变株AcetobacterpomorumAcF1CCTCCNo：M2013554种子液；按14％(v/v)的接种量将醋酸杆菌突变株AcetobacterpomorumAcF1CCTCCNo：M2013554种子液接入步骤(7)制备的杏皮渣酒精发酵液中，31℃静止发酵25d；

(9)杏皮渣醋澄清：按照每100ml杏皮渣醋加入6ml质量浓度为4％的皂土，澄清24h，4500r/min离心5min，收集澄清液，得杏皮渣醋；

(10)成品杀菌：将杏皮渣醋按照常规75℃保持3min杀菌。

在初始酒精度为6％(v/v)的混合浆酒精发酵醅中接种14％(v/v)的醋酸菌F1种子液，31℃静止发酵25d，可使其产酸量达到8.16g/100ml，并且杏皮渣醋的感官评价非常出色。在初始酒精度为10％(v/v)的杏皮渣汁中接种F1菌株发酵7d产酸量可以达到1.03g/100ml，因此耐酒精性能优良，具有耐高酸性能；在28℃-36℃之间可以发酵杏皮渣酒精发酵液，因此适应温度范围大。

本发明提供一种通过上述利用突变株醋酸杆菌AcetobacterpomorumAcF1CCTCCNo：M2013554固态发酵制备工艺酿造的杏皮渣醋，得到的杏皮渣醋具备优良品质：

(1)感官指标：色泽：棕黄色或浅黄色、澄清透明；气味：具有典型的杏果香气，有良好的醋味；口感：酸味较浓、余味呈甜、具有杏果典型的风味。

(2)理化指标：原醋产品酸度：8.16g/100ml；澄清后酸度：6.18-6.56g/100ml；可溶性固形物含量：4.67％；氨基酸总量：0.54％；香气成分：酯类物质鉴定出32种，醇类物质21种，醛类物质9种，酸类物质12种，烯类物质5种。

(3)卫生指标：菌落总数：未检出；大肠菌群：未检出；致病菌：未检出。

本发明提供杏皮渣醋上述理化指标测试可采用的方法：总糖的测定：GB/T15038-2006直接滴定法；酒精度的测定：GB/T15038-2006酒精计法；总酸：GB/T15038-2006电位滴定法；还原糖：GB/T15038-2006直接滴定法。香气成分的测定：同时蒸馏萃取法，量取杏皮渣原醋200ml置于同时蒸馏萃取装置一端的500ml圆底烧瓶中，用电热套加热；另取50ml二氯甲烷放人装置另一端的250ml圆底烧瓶中，置于45℃恒温水浴锅中加热，同时蒸馏提取2h后，合并接收液和二氯甲烷，置于分液漏斗中分离并收集二氯甲烷相于旋转蒸发瓶中，45℃浓缩至3ml，用无水硫酸钠脱水，待GC-MS分析。GC-MS色谱条件：色谱柱为HP-5MS毛细管柱(30.0m×250μm×0.25μm)；程序升温：初始温度40℃，保持0.5min，以2℃/min的速度升至80℃，保持0min，以4℃/min的速度升至110℃，再以10℃/min的速度升至190℃后以6℃/min的速度升至225℃，最后以5℃/min的速度升至240℃，保持5min；进样口温度250℃；载气为He气，流量1ml/min；进样方式：分流比1∶30，延迟2min，进样量5μL。质谱条件；离子源温度为220℃；电子能量为70eV；电离方式为EI；质量扫描范围为33-500amu。氨基酸成分的测定：GB/T5009.124-2003食品中氨基酸的测定；菌落总数的测定：GB/T4789.2-2003菌落总数测定；大肠菌群的测定：GB/T4789.3-2003大肠菌群测定；致病菌的测定：GB/T4789.22-2003食品卫生微生物学检验调味品检验，这些方法都是本领域常见的方法。

通过实施本发明具体的发明内容可以达到以下有益效果：

(1)本发明提供一株酿造杏皮渣醋发酵性能良好的突变株醋酸杆菌AcetobacterpomorumAcF1CCTCCNo：M2013554。接种量在14％(V/V)，31℃发酵时，可使酸度达到8.16g/100mL，具有耐高酸性能。将该菌株接种在酒精度10％的杏皮渣汁中发酵7d酸度达到1.03g/100ml，耐酒精性能优良；在28℃-36℃之间可以发酵混合浆酒精发酵醅，弥补了目前固态发酵杏皮渣醋专用醋酸菌缺乏的现状。

(2)本发明提供一种通过利用提供的突变株醋酸杆菌AcetobacterpomorumAcF1CCTCCNo：M2013554固态发酵制备工艺酿造的杏皮渣醋，得到的杏皮渣醋在感官指标、理化指标和卫生指标方面都具备优良品质，获得了优良的杏皮渣醋产品，其色泽棕黄清亮、果香和酸味较浓、后甜味舒适、体态丰满，丰富了目前果醋产品市场。

附图说明

图1显示为固态发酵制备杏皮渣醋的工艺流程图。

图2突变株醋酸杆菌AcetobacterpomorumAcF1CCTCCNo：M2013554的产酸量图。

图3杏皮渣浆与大米糖化醪混合浆的比例对酒精度的影响。

图4杏皮渣醋挥发性香气成分GC-MS总离子流图。

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。

主要仪器与设备：PL202电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；HPX-9272数显电热培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；LDZX-40BI高压灭菌器，上海申安医疗器械厂；GZX-9420电热恒温鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司；SW-CJ-2F超净工作台，上海博迅实业有限公司；HHW.21.600电热恒温水浴箱，北京永光明医疗仪器厂；fcycler96孔PCR反应仪，Bio-Rad公司；DYY-6C型电泳仪，北京六一仪器厂；GELDoc2000凝胶成像分析仪，Bio-Rad公司；LHS-250SC恒温恒湿培养箱，常州中捷实验仪器制造有限公司；游标卡尺，上海工量具有限公司；WHB96微孔板，上海市蔚宏生物科技有限公司；移液枪，上海艾本德生物技术国际贸易有限公司；G4B20C5E1C6B71旋蒸蒸发仪，日本Eyela公司。BL3100电子天平，德国Sartorius公司；SCW-CA-650桌上型垂直流洁净工作台，苏州宏瑞净化科技有限公司。手持糖度计，上海天垒仪器仪表有限公司；酒精计，上海医联控温仪器厂。PHS-3B型pH计，上海红益仪器仪表有限公司；HH-2数显恒温水浴锅，金坛市杰瑞尔电器有限公司。

本发明中选用的所有酿酒酵母的菌种和原辅材料，以及选用的菌种培养条件和方法都为本领域熟知选用的，本发明中涉及到的％一般为重量之比，个别不同之处另作说明。

实施例一：醋酸菌原生质体的制备与再生

(1)醋酸菌来源：中国新疆巴州轮台县杏果园土壤从中筛选获得。

(2)醋酸菌原生质体的制备。

将醋酸菌活化培养液以2％(v/v)的接种量接入到100ml液体基础培养基，30℃，120r/min震荡培养至对数生长期后，取5ml培养液，3500r/min离心15min，弃上清液留菌体沉淀，分别取5mlHM缓冲液洗涤菌体2次，3500r/min离心15min离心弃上清液，用0.2mg/ml溶菌酶液悬浮菌体沉淀，30℃缓慢震荡，每隔15min取酶解液涂片，革兰氏染色后镜检，镜检原生质体生成约80％后，3500r/min离心15min离心弃酶液，用HM缓冲液洗涤终止酶解备用。

HM缓冲液的重量组成为：0.4％NH₄Cl、1.2％Tris、0.0035％KCl、0.0058％NaCl、0.03％Na₂SO₄·10H₂O、0.426％MgCl₂·5H₂O、6.846％蔗糖、pH7.5、余量为水。

(3)醋酸菌原生质体的再生：

采用双层平板法，取0.1ml制备好的原生质体溶液，涂布在固体再生培养基下层，迅速加入4ml固体再生培养基上层(温度40℃)，30℃静置培养3-5d。

固体再生培养基上层的重量组成为：0.5％牛肉膏、1％蛋白胨、0.5％葡萄糖、0.5％酵母膏、0.5％NaCl、pH7.2、0.8％琼脂、余量为HM缓冲液。

固体再生培养基下层的重量组成为：0.5％牛肉膏、1％蛋白胨、0.5％葡萄糖、0.5％酵母膏、0.5％NaCl、pH7.2、2％琼脂、余量为HM缓冲液。

实施例二：醋酸菌诱变育种试验

(1)原生质体紫外线诱变最佳时间的确定

将实施例一中制备好的醋酸菌原生质体用HM缓冲溶液稀释107个/ml，取4ml注入无菌平皿中，并用功率20W紫外线照射，处理时间分别为15s、30s、45s、60s、75s、90s，照射的距离为30cm，照射后用HM溶液进行适当稀释后，用双层法进行原生质体再生，同时，未经照射的原生质体以同样的倍数稀释后用双层法进行原生质体再生，作为对照。30℃条件下避光培养3-5d，待长出菌落后，计算原生质体致死率及确定最佳诱变时间。

(2)原生质体亚硝基胍诱变最佳条件的确定

①亚硝基胍处理时间对致死率的影响

亚硝基胍溶液配制：取10mg亚硝基胍溶于1ml丙酮中，制成浓度10mg/ml的亚硝基胍原液。再用HM缓冲液配制成浓度分别为0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml、8mg/ml、10mg/ml亚硝基胍溶液备用。

调节原生质体悬液浓度：用HM缓冲液调节制备好的原生质体溶液浓度为10⁸个/ml，吸取1ml，3500r/min离心15min，收集原生质体。

亚硝基胍诱变原生质体：将浓度1mg/ml的亚硝基胍溶液注入原生质体，分别反应5min、10min、15min、20min、25min，离心弃诱变剂，将处理过的原生质体稀释100倍终止诱变反应，用HM缓冲液10倍稀释至10^-6，取10^-6、10^-5，10^-4三个稀释度各0.1ml，用双层法再生原生质体。30℃条件下培养3-5d，待长出菌落后，计算原生质体致死率及确定最佳诱变时间。

②亚硝基胍浓度对致死率的影响

配制浓度分别0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml、8mg/ml、10mg/ml的亚硝基胍溶液，分别注入处理好的原生质体，处理时间为20min，离心弃清液，将处理过的原生质体稀释100倍终止诱变反应，用HM缓冲液10倍稀释到10^-6，取10^-6、10^-5，10^-4三个稀释度各0.1ml，用双层法再生原生质体。30℃条件下培养3-5d，待长出菌落后，计算原生质体致死率及确定亚硝基胍诱变的最佳浓度。

(3)原生质体复合诱变

以紫外线和亚硝基胍二者的最佳诱变剂量进行诱变。先用8mg/ml亚硝基胍处理原生质体20min后，再用照射距离30cm的紫外线处理60s，获得醋酸菌突变株，所得的复合诱变原生质体溶液在暗环境下，用双层法复生培养，30℃条件下培养3-5d；将经亚硝基胍诱变处理的原生质体悬浮液转入培养皿，进行紫外线照射诱变。所得的复合诱变原生质体溶液在暗环境下，用双层法复生培养，30℃条件下培养3-5d，待长出菌落后，再接种到钙平板分离培养基，选择水解透明圈大的菌落进行初筛。再把初筛得到的菌落接入液体基础培养基，110r/min，30℃振荡培养7d后测醋酸含量，复筛出醋酸产量提升大的菌落，参见附图2。

(4)突变菌株遗传稳定性实验

将复筛后的菌株在液体基础培养基中连续转接20代，30℃、120r/min震荡培养5d，重复发酵3次，测定其发酵液醋酸含量，计算其平均值，确定诱变菌株产酸性能是否稳定。

结论：参见附图2，突变株醋酸杆菌AcetobacterpomorumAcF1产酸量为3.336g/100ml，且遗传稳定性较好，将突变株醋酸杆菌AcetobacterpomorumAcF1可作为一种优良的固态发酵试验的试验菌种。

实施例三：菌种的筛选、分离、纯化和鉴定

1、菌种筛选分离与纯化：

本发明从新疆杏树产地中取样，筛选出一批优良的醋酸杆菌，以亚硝基胍和紫外线二者交替处理醋酸菌原生质体进行诱变，获得其中一株菌种编号为AcF1，经鉴定为醋酸单胞菌属，将该菌种AcetobacterpomorumAcF1应用于固态发酵酿造杏皮渣醋，制备获得典型性杏皮渣醋。

同时，本发明提供了杏皮渣醋醋酸菌AcetobacterpomorumAcF1CCTCCNo：M2013554的选育方法，包括下列步骤：

(1)醋酸菌原生质体的制备：将醋酸菌活化培养液以2％(v/v)的接种量接入到100ml液体基础培养基，30℃，120r/min震荡培养至对数生长期后，取5ml培养液，3500r/min离心15min，弃上清液留菌体沉淀，分别取5mlHM缓冲液洗涤菌体2次，3500r/min离心15min离心弃上清液，用0.2mg/ml溶菌酶液悬浮菌体沉淀，30℃缓慢震荡，每隔15min取酶解液涂片，革兰氏染色后镜检，镜检原生质体生成约80％后，3500r/min离心15min离心弃酶液，用HM缓冲液洗涤终止酶解备用；HM缓冲液的重量组成为：0.4％NH₄Cl、1.2％Tris、0.0035％KCl、0.0058％NaCl、0.03％Na₂SO₄·10H₂O、0.426％MgCl₂·5H₂O、6.846％蔗糖、pH7.5、余量为水。

(2)原生质体复合诱变：以亚硝基胍和紫外线二者交替处理醋酸菌原生质体进行诱变。先用8mg/ml亚硝基胍处理原生质体20min后，再用照射距离30cm的紫外线处理60s，获得醋酸菌突变株，所得的复合诱变原生质体溶液在暗环境下，用双层法复生培养，30℃条件下培养3-5d。

(3)醋酸菌原生质体的再生：采用双层平板法，取0.1ml制备好的原生质体溶液，涂布在固体再生培养基下层，迅速加入4ml固体再生培养基上层(温度40℃)，30℃静置培养3-5d。

(4)醋酸菌突变株平板分离纯化：取再生出的醋酸菌突变株划线涂布于3个碳酸钙平板和3个溴甲酚紫平板，在30℃培养至菌落产生透明圈，挑选钙溶解圈大的单个菌落采用涂布法进一步纯化，分离出单个菌落接种于碳酸钙分离培养基斜面上，30℃培养2d，得到醋酸菌AcetobacterpomorumAcF1CCTCCNo：M2013554，在4℃保藏。

本发明中，固体再生培养基上层的重量组成为：0.5％牛肉膏、1％蛋白胨、0.5％葡萄糖、0.5％酵母膏、0.5％NaCl、pH7.2、0.8％琼脂、余量为HM缓冲液。

本发明中，固体再生培养基下层的重量组成为：0.5％牛肉膏、1％蛋白胨、0.5％葡萄糖、0.5％酵母膏、0.5％NaCl、pH7.2、2％琼脂、余量为HM缓冲液。

本发明中，碳酸钙分离培养基的重量组成为：葡萄糖1％、酵母浸粉1％、165℃干热灭菌30min的碳酸钙2％、无水乙醇3％(v/v)、琼脂1.8％、余量为水。

2、菌种的形态学鉴定：

菌落形态观察：将AcetobacterpomorumAcF1CCTCCNo：M2013554在碳酸钙分离培养基上划线，30℃培养1d，观察其菌落形态。

个体形态观察：将AcetobacterpomorumAcF1CCTCCNo：M2013554在碳酸钙分离培养基上划线，30℃培养1d，挑取单个菌落，革兰氏染色，显微镜观察个体形态。

3、生理生化鉴定：

依据菌种醋酸菌AcetobacterpomorumAcF1CCTCCNo：M2013554的特性进行生理生化鉴定。

选择接触酶试验：将AcetobacterpomorumAcF1CCTCCNo：M2013554在碳酸钙分离培养基上划线，30℃培养1d，向平板上滴加3％的H₂O₂，观察有无气泡产生。

甘油生酮试验：将AcetobacterpomorumAcF1CCTCCNo：M2013554在培养基成分为3％酵母膏、2％琼脂、3％甘油的固体培养基上划线，30℃培养24h，将费林液注满平板，观察菌落周围有无红色沉淀产生。

形成5-酮葡萄糖酸盐试验：将AcetobacterpomorumAcF1CCTCCNo：M2013554在培养基成分为3％葡萄糖、1％酵母膏、2％无水乙醇、2％琼脂的固体培养基上划线，32℃培养24h，观察菌落周围有无白色不透明圈。

葡萄糖酸盐试验：将AcetobacterpomorumAcF1CCTCCNo：M2013554接种于葡萄糖酸盐培养基中(1ml)，30℃培养48h，加入班式试剂，于水浴中煮沸10min并迅速冷却，观察有无黄到砖红色沉淀。

乙醇氧化试验：将AcetobacterpomorumAcF1CCTCCNo：M2013554在培养基成分为1％葡萄糖、3％无水乙醇、2％琼脂的固体培养基上划线，30℃培养24h，观察其是否可以生长。

产纤维素试验：将AcetobacterpomorumAcF1CCTCCNo：M2013554在培养基成分为30％葡萄糖、1％酵母膏、2％琼脂、2％碳酸钙的固体培养基上划线，30℃培养24h，向平板中加入Lugol碘液和60％硫酸，观察菌落周围有无变化。

水溶性色素试验：将AcetobacterpomorumAcF1CCTCCNo：M2013554在培养基成分为10％葡萄糖、5％酵母膏、2％琼脂、2.5％碳酸钙的固体培养基上划线，30℃培养24h，观察是否产生棕色水溶性色素。

乙酸钙氧化试验：将AcetobacterpomorumAcF1CCTCCNo：M2013554在培养基成分为1％葡萄糖、1％酵母膏、2％琼脂、1％乙酸钙的固体培养基上划线，30℃培养48h，观察菌落周围是否产生乳白色的晕圈。

淀粉水解试验：将AcetobacterpomorumAcF1CCTCCNo：M2013554接种于淀粉琼脂平板，30℃培养48h，加入革兰碘液数滴，观察有无蓝色产生。

乳酸钙氧化试验：将AcetobacterpomorumAcF1CCTCCNo：M2013554在培养基成分为1％葡萄糖、1％酵母膏、2％琼脂、2％乳酸钙的固体培养基上划线，30℃培养48h，观察菌落周围是否产生乳白色的晕圈。

鉴定结果：经触酶试验、甘油生酮试验、形成5-酮葡萄糖酸盐试验、葡萄糖酸盐试验、乙醇氧化试验、水溶性色素试验和乳酸钙氧化试验结果呈阳性，而乙酸钙氧化试验、淀粉水解试验和产纤维素试验结果呈阴性。

本发明提供的菌种AcetobacterpomorumAcF1于申请日前已保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏日期是2013年11月7日，保藏号是CCTCCNo：M2013554。该菌种易在酸性且含酒精的环境中生长，菌落形态为边缘整齐、表面光滑、浅黄白色、凸起的圆形菌落，直径为0.5～1mm；个体形态为短杆状，呈单、对、堆或链状排列，为革兰氏阴性菌。菌种AcetobacterpomorumAcF1的生理生化特性经触酶试验、甘油生酮试验、形成5-酮葡萄糖酸盐试验、葡萄糖酸盐试验、乙醇氧化试验、水溶性色素试验和乳酸钙氧化试验结果呈阳性，而乙酸钙氧化试验、淀粉水解试验和产纤维素试验结果呈阴性；通过上述结果及经过16SrDNA同源分析、系统发育分析结果，依照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》第九版对AcF1菌株进行形态学，生理生化特性进行了鉴定，将菌种编号为AcF1菌株鉴定为AcetobacterpomorumAcF1。

4、16SrDNA序列分析鉴定：

(1)16SrDNA的提取：

采用细菌基因组DNA提取试剂盒(北京庄盟国际生物基因科技有限公司)提取。

(2)16SrDNAPCR扩增：

选择细菌通用引物进行16SrDNA扩增试验：

引物1序列为5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，

引物2序列为5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

PCR扩增体系选择25μL体系：2.5μL含镁离子10×buffer，2μL2.5mmol/LdNTP，1μLTemplate，0.5μL10mmol/L引物27F，0.5μL

10mmol/L引物1492R，1μL5U/μLTaqDNA聚合酶，17.5μL的重蒸水。

PCR扩增程序：预变性的条件为94℃5min；变性的条件为94℃30s，退火条件为55℃30s，延伸条件为72℃1min，从变性到延伸30个循环；72℃延伸7min；保温4min；降至16℃取出PCR产物，使用1％琼脂糖进行电泳，EB染色后由荧光-可见光凝胶成像分析系统检测。

(3)扩增产物测序和序列分析：

16SrDNA扩增产物经纯度检测后，委托北京华大基因研究中心进行测序。测得的序列与NCBI数据库中已知序列进行比对及相似性分析。

(4)醋酸菌AcF1鉴定结果

通过《伯杰氏细菌鉴定手册》第八版和《常见细菌系统鉴定手册》测定，Ac11序列与NCBI数据库中已报道的16SrDNA序列进行比对得出：醋酸菌AcF1和AcetobacterpomorumstrainLMG18848进化位置相同，所以菌株AcF1为Acetobacterpomorumstrain。

16SrDAN是编码原核生物核糖体小亚基rRNA(16SrRNA)的基因。长度约为1500pb，是细菌分类学研究中最常用、最有用的分子钟，16SrRNA其大小在1500bp左右，所代表的信息量适中，因此是进行分类研究的理想材料。利用16SrDNA两端的引物PCR扩增未知菌株的16SrRNA基因，并进行DNA测序，与已知序列进行同源性比较后，判定细菌种类，将细菌划分到属或种，结合醋酸菌AcetobacterpomorumAcF1CCTCCNo：M2013554菌落形态、生理生化特性及上述分子水平鉴定，确定本发明提供的醋酸菌AcF1CCTCCNo：M2013554为Acetobacterpomorum。本发明醋酸菌AcF1CCTCCNo：M2013554的序列1012pb，具体参见附后的序列表SEQUENCELISTING。

实施例四：利用突变株醋酸杆菌AcetobacterpomorumAcF1CCTCCNo：M2013554固态发酵酿造工艺制备杏皮渣醋

参见附图1，利用突变株醋酸杆菌AcetobacterpomorumAcF1CCTCCNo：M2013554固态发酵制备杏皮渣醋的详细酿造工艺步骤如下：

(1)原料预处理：选择无霉变、黄色干杏皮渣，去除杂物，并用清水将杏皮渣上的泥土、杂物洗净待用；大米用万能粉碎机打碎，过40目筛，制成大米粉；稻壳121℃，15min灭菌。

(2)制备杏皮渣汁：将洗净的干杏皮渣放入50℃的温水中，按重量份配比为杏皮渣：温水为1∶5，浸泡4h，过滤取汁，调整可溶性固形物为18％，100℃水浴灭菌5min。

(3)制备杏皮渣浆：采用高压蒸煮和酶解结合法，将杏皮渣和水按重量比为1∶6浸泡2h后破碎打浆，在121℃高压10min，冷却到室温后加入杏皮渣重量200U/g的果胶酶和150U/g的纤维素酶，在50℃下酶解4h。

(4)制备大米糖化醪：取重量份配比为大米粉：温水为1∶3配制成醪液，将25％的醪液先用12U/g中温α-淀粉酶，在65℃条件下液化45min，再加入180U/g糖化酶，在70℃条件下糖化180min。

(5)将步骤(3)制备的杏皮渣浆和步骤(4)制备的大米糖化醪以重量份配比1∶1混合获得混合浆，将获得混合浆经杀菌条件下100℃处理5min。

(6)酿酒酵母种子液和产酯酵母种子液的制备：将常见的酿酒酵母接种至10ml17Brix杏皮渣汁中，28℃培养24h，得到酿酒酵母种子液；取常见的产酯酵母接种至10ml17Brix杏皮渣汁中28℃培养36h，得到产酯酵母种子液。

(7)固态酒精发酵：以4.5％(v/v)接种量将酿酒酵母种子液和以2.25％(v/v)接种量将产酯酵母种子液接入步骤(5)中制备的18％混合浆中，按重量份配比，加入为混合浆：稻壳按照3∶1配比的稻壳，密闭发酵，28℃发酵6d，得杏皮渣酒精发酵液。

(8)固态醋酸发酵：取斜面保藏的醋酸杆菌突变株AcetobacterpomorumAcF1CCTCCNo：M2013554，1环接种至10ml3％(v/v)步骤(7)制备的杏皮渣酒精发酵液中，30℃培养24h，得到醋酸杆菌突变株AcetobacterpomorumAcF1CCTCCNo：M2013554种子液；按14％(v/v)的接种量将醋酸杆菌突变株AcetobacterpomorumAcF1CCTCCNo：M2013554种子液接入杏皮渣酒精发酵液步骤(7)制备的杏皮渣酒精发酵液中，31℃静止发酵25d。

(9)杏皮渣醋澄清：按照每100ml杏皮渣醋加入6ml质量浓度为4％的皂土，澄清24h，4500r/min离心5min，收集澄清液，得杏皮渣醋。

(10)成品杀菌：将杏皮渣醋采用常见的75℃保持3min杀菌。

在初始酒精度为6％(v/v)的混合浆酒精发酵醅中接种14％(v/v)的醋酸菌F1种子液，31℃静止发酵25d，可使其产酸量达到8.16g/100ml，并且杏皮渣醋的感官评价非常出色。在初始酒精度为10％(v/v)的杏皮渣汁中接种F1菌株发酵7d产酸量可以达到1.03g/100ml，因此耐酒精性能优良，具有耐高酸性能；在28℃-36℃之间可以发酵杏皮渣酒精发酵液，因此适应温度范围大。

本发明提供一种通过上述利用突变株醋酸杆菌AcetobacterpomorumAcF1CCTCCNo：M2013554固态发酵制备工艺酿造的杏皮渣醋，得到的杏皮渣醋具备优良品质：

(1)感官指标：色泽：棕黄色或浅黄色、澄清透明；气味：具有典型的杏果香气，有良好的醋味；口感：酸味较浓、余味呈甜、具有杏果典型的风味。

(2)理化指标：原醋产品酸度：8.16g/100ml；澄清后酸度：6.18-6.56g/100ml；可溶性固形物含量：4.67％；氨基酸总量：0.54％；香气成分：酯类物质鉴定出32种，醇类物质21种，醛类物质9种，酸类物质12种，烯类物质5种。

(3)卫生指标：菌落总数：未检出；大肠菌群：未检出；致病菌：未检出。

实施例五：利用突变株醋酸杆菌AcetobacterpomorumAcF1CCTCCNo：M2013554固态酿造杏皮渣醋工艺参数的确定

(1)大米糖化醪制备试验：

大米醪液化的最佳工艺参数为：中温α-淀粉酶的酶用量为12U/g，大米浆底物浓度为25％，液化时间为45min，液化温度为65℃。

大米醪糖化的最佳工艺参数为：糖化酶的酶用量为180U/g，糖化时间为180min，糖化温度为70℃。

(2)混合浆灭菌条件试验：

混合浆在处理过程中存在大量微生物，在酒精发酵前需进行灭菌。以营养琼脂、孟加拉红为培养基测定菌落总数和酵母菌，见表1。

表1：混合浆灭菌试验处理及结果

处理	酵母菌	菌落总数
			60℃10min	多不可计，菌落有褶皱	多不可计，菌株有荚膜或芽孢
60℃20min	多不可计，菌落有褶皱	325cfu/ml
			60℃30min	多不可计，菌落有褶皱	259cfu/ml
90℃2min	300cfu/ml	212cfu/ml
			90℃4min	264cfu/ml	167cfu/ml
90℃6min	236cfu/ml	101cfu/ml
			100℃1min	133cfu/ml菌落有褶皱	56cfu/ml菌落有芽孢
100℃2min	59cfu/ml菌落有褶皱	49cfu/ml菌株有芽孢
			100℃3min	49cfu/ml菌落有褶皱	24cfu/ml菌株有荚膜
100℃4min	17cfu/ml	11cfu/ml菌株有荚膜
			100℃5min	未检出	10cfu/ml
100℃6min	未检出	3cfu/ml

在100℃的条件下，随着时间的延长，酵母菌和细菌逐渐减少。所以选择100℃保持5min，此时孟加拉红平板上未生长酵母菌，营养琼脂平板菌落总数只有10cfu/mL。

(3)混合浆比例试验：

选择杏皮渣浆与大米糖化醪质量比1∶1制成混合浆，参见附图3。

(4)酒精发酵工艺参数优化试验：

采用响应面法对酒精发酵中初始含糖量、接种量、发酵时间三因素进行研究，具体见表2。

表2：酒精发酵工艺参数优化结果

编号	糖度(％)	接种量(％)	时间(d)	酒精度(％)
					1	17	3	6	6.7

2	16	3	5	6.2
					3	18	4	4	6.2
4	17	5	6	6.9
					5	18	3	5	5.6
6	18	5	5	6.7
					7	17	3	4	5.9
8	17	4	5	7.1
					9	17	5	4	6.3
10	16	4	4	5.9
					11	17	4	5	7
12	16	5	5	6.3
					13	17	4	5	7.1
14	17	4	5	7.2
					15	16	4	6	6.6
16	18	4	6	6.1
					17	17	4	5	6.9

初始可溶性固形物含量、接种量和发酵时间三因素与混合浆发酵酒精度的P值＝0.0007(小于0.05)回归模型较好的拟合了杏皮渣汁发酵酒精度与各因素之间的关系，其他因素和误差占5.20％。因此可以用模型来分析和预测杏皮渣醋酒精发酵的工艺条件。得到的最佳工艺参数为：初始可溶性固形物17％，酿酒酵母接种量4.5％(v/v)和产酯酵母接种量2.25％(v/v)，发酵时间6d，酒精度理论值为7.15％(v/v)。经验证最佳条件下得到的酒精度为7.05％(v/v)，占预测值的98.6％。

(5)醋酸发酵参数优化试验：

采用均匀设计对醋酸发酵中初始酒精度、接种量、发酵时间、发酵温度四因素进行研究。发酵方式为静止发酵法。

表3：醋酸发酵参数优化结果

因子	X1	X2	X3	X4	醋酸含量(g/100ml)
						N1	5	5	4	5	4.05
N2	1	1	2	3	1.66
						N3	1	5	5	2	7.16
N4	1	4	3	5	3.13
						N5	3	4	5	4	7.87
N6	3	2	1	5	1.54
						N7	5	3	2	4	3.12
N8	3	5	2	1	2.74
						N9	5	1	1	2	0.96
N10	2	1	5	5	3.52
						N11	4	4	3	2	5.67
N12	5	3	5	1	5.23
						N13	4	2	4	3	3.74
N14	3	1	4	1	3.08
						N15	4	2	3	4	2.97
N16	4	4	2	3	4.42
						N17	2	5	1	4	0.94
N18	2	2	3	2	4.64
						N19	2	3	4	3	6.54
N20	1	3	1	1	0.59

由表3可见，采用拟水平二次均匀设计进行20组试验考察4因素对杏皮渣醋醋酸发酵工艺的影响。通过二次多项式逐步回归分析得到最佳的工艺参数：初始酒精度6％(v/v)，醋酸接种量14％(v/v)，发酵时间25d，发酵温度31℃，杏皮渣醋的酸度可达到8.60g/100ml。经验证，在最佳工艺参数下发酵的杏皮渣醋醋酸含量为8.16g/100ml，占预测值的94.91％。

(6)杏皮渣醋澄清试验：

试验选择1％壳聚糖处理、PVP处理、2％皂土处理、高岭土处理、1％蛋清处理、用孔径0.45μm的滤膜过滤杏皮渣醋不同处理方式对杏皮渣醋进行处理24h，4000r/min离心5min后，采用分光光度计测定透光率(T650)，最终确定添加6mL/100mL4％皂土处理24h，透光率达到82.2％。

实施例六：利用突变株醋酸杆菌AcetobacterpomorumAcF1CCTCCNo：M2013554固态酿造杏皮渣醋香气成分及氨基酸的测定

(1)香气成分的提取：采用同时蒸馏萃取法，量取杏皮渣原醋200ml置于同时蒸馏萃取装置一端的500ml圆底烧瓶中，用电热套加热；另取50ml二氯甲烷放人装置另一端的250ml圆底烧瓶中，置于45℃恒温水浴锅中加热，同时蒸馏提取2h后，合并接收液和二氯甲烷，置于分液漏斗中分离并收集二氯甲烷相于旋转蒸发瓶中，45℃浓缩至3ml，用无水硫酸钠脱水，待GC-MS分析。

(2)GC-MS分析条件：

色谱条件：色谱柱为HP-5MS毛细管柱(30.0m×250μm×0.25μm)；程序升温：初始温度40℃，保持0.5min，以2℃/min的速度升至80℃，保持0min，以4℃/min的速度升至110℃，再以10℃/min的速度升至190℃后以6℃/min的速度升至225℃，最后以5℃/min的速度升至240℃，保持5min；进样口温度250℃；载气为He气，流量1ml/min；进样方式：分流比1∶30，延迟2min，进样量5μL。质谱条件；离子源温度为220℃；电子能量为70eV；电离方式为EI；质量扫描范围为33-500amu。

(3)氨基酸的测定采用GB/T5009.124-2003。

利用突变株醋酸杆菌AcetobacterpomorumAcF1CCTCCNo：M2013554固态酿造杏皮渣醋挥发性香气成分中，酯类物质的种类及相对含量最高，共鉴定出32种，其相对含量达63.80％；醇类物质21种，占总挥发性成分的3.47％；醛类物质9种，占总挥发性成分的4.14％；酸类物质12种，其相对含量达11.81％；烯类物质的相对含量仅为0.04％；其他物质共鉴定出17种，相对含量为1.99％，参见附图4。经鉴定共检测到17种氨基酸，天门冬氨酸含量最高，氨基酸总量为0.54％。

上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

Claims (3)

1.一种用于杏皮渣醋固态发酵的醋酸杆菌突变株AcetobacterpomorumAcF1，其特征在于，醋酸杆菌突变株AcetobacterpomorumAcF1的保藏号为CCTCCNo：M2013554。

2.一种利用权利要求1中所述菌株进行固态发酵酿造杏皮渣醋的制备工艺，其特征在于，所述的固态发酵酿造具体步骤如下：

(1)原料预处理：选择无霉变、黄色干杏皮渣，去除杂物，并用清水将杏皮渣上的泥土、杂物洗净待用；大米用万能粉碎机打碎，过40目筛，制成大米粉；稻壳121℃，15min灭菌；

(2)制备杏皮渣汁：将洗净的干杏皮渣放入50℃的温水中，按重量份配比为杏皮渣∶温水为1∶5，浸泡4h，过滤取汁，调整可溶性固形物为18％，100℃水浴灭菌5min；

(3)制备杏皮渣浆：采用高压蒸煮和酶解结合法，将杏皮渣和水按重量比为1∶6浸泡2h后破碎打浆，在121℃高压10min，冷却到室温后按照每克杏皮渣加入200U果胶酶和150U纤维素酶，在50℃下酶解4h；

(4)制备大米糖化醪：取重量份配比为大米粉∶温水为1∶3配制成醪液，将醪液先用12U/g中温α-淀粉酶，在65℃条件下液化45min，再加入180U/g糖化酶，在70℃条件下处理180min；

(5)将步骤(3)制备的杏皮渣浆和步骤(4)制备的大米糖化醪以重量份配比1∶1混合获得混合浆，将获得的混合浆在100℃的杀菌条件下处理5min；

(6)酿酒酵母种子液和产酯酵母种子液的制备：将常见的酿酒酵母接种至10ml18％杏皮渣汁中，28℃培养24h，得到酿酒酵母种子液；取常见的产酯酵母接种至10ml18％杏皮渣汁中28℃培养36h，得到产酯酵母种子液；

(7)固态酒精发酵：以4.5％(v/v)接种量将酿酒酵母种子液和以2.25％(v/v)接种量将产酯酵母种子液接入步骤(5)中制备的混合浆中，混合浆的可溶性固形物含量为17％，按混合浆∶稻壳为3∶1的重量份配比加入稻壳，密闭发酵，28℃发酵6d，得杏皮渣酒精发酵液；

(8)固态醋酸发酵：取斜面保藏的保藏号为CCTCCNo：M2013554的醋酸杆菌突变株AcetobacterpomorumAcF1，1环接种至10ml步骤(7)制备的杏皮渣酒精发酵液中，杏皮渣酒精发酵液的初始酒精度为6％(v/v)，30℃培养24h，得到保藏号为CCTCCNo：M2013554的醋酸杆菌突变株AcetobacterpomorumAcF1种子液；按14％(v/v)的接种量将保藏号为CCTCCNo：M2013554的醋酸杆菌突变株AcetobacterpomorumAcF1种子液接入步骤(7)制备的杏皮渣酒精发酵液中，31℃静止发酵25d；

(9)杏皮渣醋澄清：按照每100ml杏皮渣醋加入6ml质量浓度为4％的皂土，澄清24h，4500r/min离心5min，收集澄清液，得杏皮渣醋；

(10)成品杀菌：将杏皮渣醋按照75℃保持3min杀菌。

3.一种利用权利要求1中所述的菌株和权利要求2所述的固态发酵制备工艺酿造制备的杏皮渣醋。