CN103173381A - 杏皮渣醋醋酸菌及其分离纯化方法和应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种杏皮渣醋醋酸菌及利用该菌种制备杏皮渣醋的方法，菌种的名称为：醋酸杆菌（AcetobacterpomorumstrainLMG18848），属于醋酸单胞菌属，命名为Ac11；已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.6938，并有存活证明；易在酸性且含酒精的环境中生长，菌落形态为边缘整齐、表面光滑、乳白色、凸起的圆形菌落，直径为0.5～1mm；个体形态为短杆状，呈单、对、堆或链状排列，为革兰氏阴性菌。本发明从杏皮渣自然发酵液中筛选出生长良好的醋酸菌株，是一种耐受性好、发酵性能优良的醋酸菌种。利用该菌株生产杏皮渣醋具有杏果典型的风味。

Description

杏皮渣醋醋酸菌及其分离纯化方法和应用方法

  

技术领域

本发明涉及一种杏皮渣醋醋酸菌及利用该菌种制备杏皮渣醋的方法，属于微生物及发酵工业领域。 

背景技术

杏皮渣是杏加工产品的副产品。 

新疆是我国杏的主要产区。据2010年统计，新疆杏产量达到13.23×10⁴吨，约占新疆水果总量的22.29%。随着一些深加工企业的诞生，新疆杏产业得到大力发展，已经成为较大的浓缩杏浆生产基地，产品几乎全部出口。浓缩杏浆已成为我国浓缩果汁（浆）类产品中产量和出口量排在浓缩苹果汁后居第二位的品种。生产1吨杏浓缩浆需2.7吨原料杏，同时产杏渣0.225吨。截止2011年新疆浓缩杏浆年产量达11万吨左右，杏皮渣年产量约为2.5万吨。 

随着杏皮渣的大量积累，大部分杏皮渣作为饲料或肥料应用，杏皮渣没有得到充分利用，附加值低，造成了严重的资源浪费。 

杏皮渣醋及其醋饮料的研发是利用杏皮渣的有效途径之一。优选适合于酿制杏皮渣醋的专用醋酸菌，研究和创新杏皮渣醋发酵工艺是目前急需解决的问题。杏皮渣醋的开发对于提高杏皮渣的附加值，促进杏产业的发展具有重要的意义。 

我国对杏皮渣综合利用的研究主要集中在新疆，新疆轮台国家果树资源圃的李文慧、徐麟研究了杏皮渣酿制杏果醋饮料的工艺，确定了酿制杏皮渣果醋的最佳工艺参数：果醋酿制过程中添加剂SO₂含量≤30 mg/L，醋酸发酵结束后，加入食盐的浓度为1.0‰～1.5‰，采用115 ℃/2 min 超高温瞬时杀菌。新疆大学的李雪娟研究了杏浓缩浆渣果醋饮料的工艺。 

当前果醋生产使用的菌种大都是食醋菌种AS1.41（A.rancens L）恶臭醋酸杆菌浑浊变种和沪酿1.01醋酸杆菌(A.lovaniense L)，不仅产酸能力和耐酒精能力都有待提高，而且发酵果醋形成的风味也不佳。适宜于杏皮渣醋酿造的醋酸菌尚属空白。 

因此急需选育优良的杏皮渣醋专用醋酸菌种。 

关于果醋专用菌种的研究不多。陈伟等在2003年从苹果醋酸发酵母液中选育果醋菌种，可以较好地适用于苹果醋的酿造。而其它有关醋酸菌菌种的研究多数是以食醋醪为菌源进行筛选，或直接将食醋菌AS1.41（A.rancens L）恶臭醋酸杆菌浑浊变种和沪酿1.01醋酸杆菌（A.lovaniense L.）进行高酸驯化、诱变选育。 

日本的正井博之用多层琼脂培养基保温培养，成功地分离出了能制造20%以上的高酸度醋的优良菌。国内的洪俊华等进行了生淀粉酿醋醋醅中耐高温且产酸率高的醋酸菌的分离筛选，施安辉等对洛口醋醅中优势醋酸菌株进行分离和鉴定，另外臧晋、黄仲华、郭丽萍、祖国仁、王电垒、候红漫、杨军、陈伟等科研工作者对醋酸菌分离进行了的大量试验研究，并取得了一定的效果，获得了一些优良醋酸菌。 

我国食醋生产工艺占主导地位的是传统的固态发酵法和液面静置发酵法，深层液体发酵法占我国食醋总产量的6%。利用固态发酵法和半固-液态发酵方法生产果醋的研究较少，大多数是利用液体发酵法生产果醋。栾丽杰、李莉、牟建楼、姚云游等利用液体深层发酵法分别对柿醋、苹果醋、枣醋、桑果醋进行了研究，牟建楼、朱正军、卢克、韩晓青等采用液体表面发酵法分别对枣醋、杨梅醋、黄金梨醋进行了研究。 

李湘利、冉旭采用分光光度计法分别研究了壳聚糖对金丝枣醋和葡萄醋的澄清作用。结果表明：壳聚糖可以提高金丝枣醋、葡萄醋的澄清度。周杨使用果胶酶、纤维素和半纤维素复合酶澄清木瓜果醋发酵液，效果较好。史经略研究了用明胶溶液来解决果醋的非生物返混。张善宝、赵欣宇采用硅藻土分别对红枣果醋和金红苹果果醋澄清进行了研究。李华兰采用超滤技术对桑果醋澄清进行了研究。马永昆对不同年份镇江香醋香气成分及其形成机理进行了研究，采取固相微萃取提取香气成分，共得到52种风味物质；解华东对岐山高粱醋陈化期香气成分进行研究，酸类物质为主要风味物质；鲁周民采用不同发酵方式对柿果醋香气成分进行研究，共分离挥发性成分63种；崔涛研究了砂梨及其果醋的香气成分，共获得15种果醋香气成分；王永苓对沙棘果醋香气成分进行了研究，共分离了82种香气成分，其中酯类占挥发物质的56.35%。 

目前还没有发酵性能优良、耐受性好的杏皮渣醋专用醋酸菌。 

发明内容

本发明需要解决的技术问题就在于克服现有技术的缺陷，提供一种杏皮渣醋醋酸菌及利用该菌种制备杏皮渣醋的方法，本发明从杏皮渣自然发酵液、食醋醋醅、枣醋中筛选出一批生长良好的醋酸菌株，进一步从中优选出一株编号为Ac11的产酸菌株，经鉴定为醋酸菌，利用该菌株确定的发酵工艺能生产杏皮渣醋。 

为解决上述问题，本发明采用如下技术方案： 

本发明提供了一种杏皮渣醋醋酸菌，菌种的名称为：醋酸杆菌（Acetobacter pomorum），属于醋酸单胞菌属，命名为Ac11；已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6938，保藏日期为2012年12月06日；保藏单位地址为：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，邮政编码为：100101；并有存活证明。

该菌种易在酸性且含酒精的环境中生长，菌落形态为边缘整齐、表面光滑、乳白色、凸起的圆形菌落，直径为0.5～1mm；个体形态为短杆状，呈单、对、堆或链状排列，为革兰氏阴性菌。 

本发明同时公开了一种所述的杏皮渣醋醋酸菌的分离纯化方法，包括下列步骤： 

1）醋酸菌的富集培养：

50g杏皮渣加入250mL水中，30℃下培养15d，得杏皮渣自然发酵液；取杏皮渣自然发酵液、枣醋和醋醅各10g，分别放入装有90ml富集培养基的三角瓶中，30℃、110r/min培养3d，得到醋酸菌的富集培养液；

富集培养基的重量组成为：酵母浸粉1%、葡萄糖1%、重量浓度为0.02%的结晶紫0.5%、制霉素（5×10⁵ u）5mg/ml、无水乙醇3%(v/v)、余量为水；

2）醋酸的定性试验：

取含有醋酸菌的富集培养液10ml以转速3000r/min，5min离心后，除去醋酸菌等菌体沉淀，吸取5ml无菌体的上清液，以2.5mol/l和0.1mol/l NaOH溶液中和至pH 7.0，煮沸，加入质量浓度为5%的氯化铁液5～7滴，如果形成红褐色沉淀确定有醋酸；

3）醋酸菌平板分离纯化：

取醋酸菌富集培养液25ml放入装有225ml生理盐水的三角瓶中，依次稀释至10^-7（ml/ml）分别取250μl10^-6(ml/ml)和10^-7(ml/ml)的稀释液涂布于3个碳酸钙平板和3个溴甲酚紫平板，在30℃培养至菌落产生透明圈，挑选钙溶解圈大的单个菌落采用涂布法进一步纯化，分离出单个菌落接种于碳酸钙分离培养基斜面上，30℃培养2d，得到醋酸菌Ac11, 4℃保藏；

碳酸钙分离培养基的重量组成为：葡萄糖1%、酵母浸粉1%、165℃干热灭菌30min的碳酸钙2%、无水乙醇3%(v/v)、琼脂1.8%、余量为水。

本发明还公开了一种所述的杏皮渣醋醋酸菌的应用方法，利用所述的杏皮渣醋醋酸菌制备杏皮渣醋，具体步骤为： 

（1）原料预处理：选择无霉变、黄色干杏皮渣，去除杂物，并用清水将杏皮渣上的泥土、微生物洗净待用；

（2）制备杏皮渣汁：将洗净的干杏皮渣放入50℃的温水中，重量份配比为杏皮渣：温水为1：5， 浸泡4h后，过滤取汁，调整可溶性固形物为18Brix，100℃水浴灭菌5min；

（3）酿酒酵母种子液和产酯酵母种子液的制备：

取斜面保藏的酿酒酵母CGMCC No.2927（已公开）1环接种至10ml 17Brix杏皮渣汁中，28℃培养24h，得到酿酒酵母种子液；

取斜面保藏的产酯酵母（已公开）2环接种至10ml 17Brix杏皮渣汁中28℃培养36h，得到产酯酵母种子液；

（4）酒精发酵：以3%（v/v）接种量将酿酒酵母种子液和以1.5%（v/v）接种量将产酯酵母种子液接入18Brix杏皮渣汁中，密闭发酵，28℃发酵5d，得杏皮渣酒精发酵液；

（5） 醋酸发酵：取斜面保藏的醋酸杆菌Ac11 1环接种至10ml 3%（v/v）杏皮渣酒精发酵液中，28℃培养24h，得到醋酸杆菌Ac11种子液；

按13%（v/v）的接种量将醋酸菌Ac11种子液接入杏皮渣酒精发酵液，30℃静止发酵24d；

（6）杏皮渣醋澄清：每100ml杏皮渣醋加入6ml、质量浓度为2%的皂土，澄清24h，4500r/min离心5min，收集澄清液，得杏皮渣醋；

（7）成品杀菌：将杏皮渣醋装瓶加塞，75℃保持3min杀菌。

本发明提供了一种耐受性好，发酵性能优良的醋酸菌种，命名为Ac11。根据《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》第八版对Ac11菌株进行形态学，生理生化特性进行了鉴定。该醋酸菌易在酸性且含酒精的环境中生长，分离株菌落形态多为边缘整齐、表面光滑，乳白色，凸起的圆形菌落，直径为0.5～1mm。个体形态为短杆状，呈单、对、堆或链状排列，为革兰氏阴性菌。 

在初始酒精度为6.75%（v/v）的杏皮渣酒精发酵液中接种13%（v/v）的醋酸菌Ac11种子液，30℃静止发酵24d，可使其产酸量达到7.49g/100ml, 并且杏皮渣醋的感官评价非常出色。在初始酒精度为10%（v/v）的杏皮渣汁中接种Ac11菌株发酵7d产酸量可以达到1.25g/100ml，因此耐酒精性能优良；当初始酒精度为6%（v/v）时，产酸量为5.92g/100ml，酒精转化率为75.66%，在20d发酵期内产酸随发酵时间的延长而上升，酸度达到7.49g/100ml，因此具有耐高酸性能； 通过均匀设计发现在pH3.4-4.4之间Ac11可以发酵杏皮渣酒精发酵液，因此适应pH范围大；在28℃-36℃之间可以发酵杏皮渣酒精发酵液，因此适应温度范围大。 

通过实施本发明具体的技术指标，实现本发明内容，可以达到以下有益效果： 

A：获得了一株发酵性能良好，耐受性好的醋酸菌Ac11。接种量在13%，30℃发酵时，可使杏皮渣汁酸度达到7.49g/100mL，具有耐高酸性能。在pH3.4-4.4之间Ac11可以发酵杏皮渣酒精发酵液，并且杏皮渣醋的感官评价非常出色；将该菌株接种在酒精度10%的杏皮渣汁中发酵7d酸度达到1.25g/100ml，耐酒精性能优良；在28℃-36℃之间可以发酵杏皮渣酒精发酵液，弥补了目前杏皮渣醋专用醋酸菌缺乏的现状。

B：获得了优良的杏皮渣醋产品，其色泽棕黄清亮、果香和酸味较浓、后甜味舒适、体态丰满。丰富了目前我国果醋产品市场。 

附图说明

图1为17株醋酸菌产酸量试验结果柱状图。 

图2 为8株醋酸菌产酸曲线。 

图3为产酸量较高的两株醋酸菌耐酒精试验曲线图。 

图4为七株醋酸菌16S rDNA琼脂糖凝胶电泳图。 

图5（a）为DNAstar邻接法绘制的醋酸菌Ac10和Ac11进化树。 

图5（b）为DNAman最大似然法绘制的醋酸菌Ac10和Ac11进化树。 

图6 为酒精发酵中酿酒酵母与产酯酵母用量比例结果曲线图。 

图7 为不同处理对杏皮渣原醋透光率的影响结果柱形图。 

图8 为不同2%皂土添加量处理7h和24h后对杏皮渣醋澄清的影响结果柱形图。 

具体实施方式

实施例1    醋酸菌种的分离纯化

（1）醋酸菌分离源的选择：

杏皮渣：来自新疆轮台县华隆农林开发有限公司；

枣醋：来自新疆农业大学食品科学与药学学院微生物实验室；

醋醅：来自新疆七一酱园酿造有限公司。

（2）醋酸菌的分离纯化： 

1）醋酸菌的富集培养：

50g杏皮渣加入250mL水中，30℃下培养15d, 得到杏皮渣自然发酵液, 取杏皮渣自然发酵液、枣醋和醋醅各10g，分别放入装有90ml富集培养基的三角瓶中，30℃、110r/min培养3d，得到醋酸菌的富集培养液；

富集培养基的重量组成为：酵母浸粉1%、葡萄糖1%、重量浓度为0.02%的结晶紫0.5%、制霉素（5×10⁵ u）5mg/ml、无水乙醇3%(v/v)、余量为水；

2）醋酸的定性试验：

取含有醋酸菌的富集培养液10ml以转速3000r/min，5min离心后，除去醋酸菌等菌体沉淀，吸取5ml无菌体的上清液，以2.5mol/l和0.1mol/l NaOH溶液中和至pH 7.0，煮沸，加入质量浓度为5%的氯化铁液5～7滴，如果形成红褐色沉淀确定有醋酸；

3）醋酸菌平板分离纯化：

取醋酸菌富集培养液25ml放入装有225ml生理盐水的三角瓶中，依次稀释至10^-7（ml/ml）分别取250μl10^-6(ml/ml)和10^-7(ml/ml)的稀释液涂布于3个碳酸钙平板和3个溴甲酚紫平板，在30℃培养至菌落产生透明圈，挑选钙溶解圈大的单个菌落采用涂布法进一步纯化，分离出单个菌落接种于碳酸钙分离培养基斜面上，30℃培养2d；共得到17株醋酸菌，分别命名为Ax1，Az1，Az2，Az3，Az4，Ac1，Ac2，Ac3，Ac4，Ac5，Ac6，Ac7，Ac8，Ac9，Ac10，Ac11，Ac12，包括Ac11菌种，4℃保藏；

碳酸钙分离培养基的重量组成为：葡萄糖1%、酵母浸粉1%、165℃干热灭菌30min的碳酸钙2%、无水乙醇3%(v/v)、琼脂1.8%、余量为水。

实施例2    醋酸菌Ac11基本酿醋性能试验

（1）醋酸菌Ac11产酸量试验：

500mL三角瓶中加入100mL液体培养基(葡萄糖1%、酵母浸粉1%、无水乙醇6%(v/v))，接入纯化菌株5环，在30℃下，110r/min振荡培养15d，测定产酸量。

15d后取上述液体培养液2mL，加50mL蒸馏水，再加2-3滴1%酚酞试剂，用0.1mol/L标准NaOH溶液滴定至浅粉色。由所耗的NaOH溶液的量来计算样品中的含酸量（以醋酸计）。 

产酸量（g/L）=（V-V₀）×C_NaOH×60/V_样

其中V：发酵液样品滴定耗用的NaOH量（ml）；

V₀：以空白培养基对照滴定耗用的NaOH量（ml）；

C_NaOH：标准NaOH溶液的浓度（mol/l）；

V_样：取培养液的体积，为1ml。

由图1可知，醋酸菌Ac11产酸量最高。 

（2）产酸曲线试验： 

500ml三角瓶中加入200ml 6% (v/v)无水乙醇的液体基础培养基。接入纯化菌株5环，110r/min，30℃振荡培养30d，每隔2d测定各菌株的产酸量，绘制产酸曲线。以观察不同菌种起酵时间。

由图2可知，醋酸菌Ac11产酸曲线最平稳。 

（3）耐酒精度试验 

将纯化菌株3环接入10mL含无水乙醇3% (v/v)的基础培养基中， 30℃培养36h后，转入乙醇含量分别为5%、6%、7%、8%、9%、10%(v/v) 200mL基础培养基中，置于500mL三角瓶中，培养7d，分别测产酸量，选出耐酒精性能好的菌株。

由图3可知，醋酸菌Ac11耐酒精性能良好。 

（4）结论：醋酸菌Ac11，其耐酒精度为10%(v/v)。当初始酒精度为6%(v/v)时，产酸量为5.92g/100mL，酒精转化率为75.66%。 

实施例3   醋酸菌Ac11的鉴定

（1） 生理生化鉴定：

根据《伯杰氏细菌鉴定手册》第八版和《常见细菌系统鉴定手册》选择接触酶试验、甘油生酮试验、形成5-酮葡萄糖酸盐试验、葡萄糖酸盐试验、乙醇氧化试验、产纤维素试验、水溶性色素试验、乙酸钙氧化试验、淀粉水解试验、乳酸钙氧化试验对醋酸菌Ac11进行试验。

（2）醋酸菌Ac11 16S rDNA 鉴定： 

 16S rDNA的提取：

采用细菌基因组DNA提取试剂盒（北京庄盟国际生物基因科技有限公司）提取。

 16S rDNA PCR扩增： 

选择细菌通用引物进行16S rDNA扩增试验：

引物1序列为5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，

引物2序列为5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

PCR扩增体系选择25μL体系：2.5μL含镁离子10×buffer， 2μL2.5mmol/L dNTP，1μLTemplate，0.5μL 10mmol/L引物27F，0.5μL 

10mmol/L引物1492R，1 μL5U/μL Taq DNA 聚合酶，17.5μL的重蒸水。

PCR扩增程序：预变性的条件为94℃5min；变性的条件为94℃30s，退火条件为55℃30s，延伸条件为72℃1min，从变性到延伸30个循环；72℃延伸7min；保温4min；降至16℃取出PCR产物，使用1%琼脂糖进行电泳，EB染色后由荧光-可见光凝胶成像分析系统检测。 

结果如图4所示Ac1116S rDNA大约在1600bp-1800bp。 

 扩增产物测序和序列分析： 

16S rDNA扩增产物经纯度检测后，委托北京华大基因研究中心进行测序。测得的序列与NCBI数据库中已知序列进行比对及相似性分析。

（3） 醋酸菌Ac11鉴定结果 

通过《伯杰氏细菌鉴定手册》第八版和《常见细菌系统鉴定手册》测定，Ac11序列与NCBI数据库中已报道的16S rDNA序列进行比对。由图5（a）和图5（b）可以看出醋酸菌Ac11和Acetobacter pomorum strain LMG 18848进化位置相同，所以菌株Ac11为Acetobacter pomorum strain LMG 18848。

16S rDAN是编码原核生物核糖体小亚基rRNA（16S rRNA）的基因。长度约为1500pb，是细菌分类学研究中最常用、最有用的分子钟，16S rRNA其大小在1500 bp左右，所代表的信息量适中，因此是进行分类研究的理想材料。利用16S rDNA两端的引物PCR扩增未知菌株的16S rRNA基因，并进行DNA测序，与已知序列进行同源性比较后，判定细菌种类，将细菌划分到属或种。   

实施例1制备的醋酸菌Ac11菌种的名称为：醋酸杆菌（Acetobacter pomorum ），属于醋酸单胞菌属，命名为Ac11；易在酸性且含酒精的环境中生长，株菌落形态为边缘整齐、表面光滑、乳白色、凸起的圆形菌落，直径为0.5～1mm；个体形态为短杆状，呈单、对、堆或链状排列，为革兰氏阴性菌。

实施例4    利用实施例1制备的醋酸菌Ac11制备杏皮渣醋

（1）原料预处理：选择无霉变、黄色杏皮渣，去除杂物，并用清水将杏皮渣上的泥土、微生物洗净待用；

（2）制备杏皮渣汁：将洗净的杏皮渣放入50℃的温水中，重量份配比为杏皮渣：温水为1：5，浸泡4h，过滤取汁，调整可溶性固形物为18Brix，100℃水浴灭菌5min；

（3）酿酒酵母种子液和产酯酵母种子液的制备:

取斜面保藏的酿酒酵母CGMCC No.2927（已公开）1环接种至10ml 17Brix杏皮渣汁中，28℃培养24h，得到酿酒酵母种子液。

取斜面保藏的产酯酵母（已公开）2环接种至10ml 17Brix杏皮渣汁中28℃培养36h，得到产酯酵母种子液。 

（4）酒精发酵：以3%（v/v）接种量将酿酒酵母种子液和以1.5%（v/v）接种量将产酯酵母种子液接入18Brix杏皮渣汁中，密闭发酵，28℃发酵5d，得酒精发酵液； 

（5） 醋酸发酵：取斜面保藏的醋酸杆菌Ac11 1环接种至10ml 3%（v/v）杏皮渣酒精发酵液中，28℃培养24h，得到醋酸杆菌Ac11种子液。按13%（v/v）的接种量将醋酸菌Ac11种子液接入酒精发酵液，30℃静止发酵24d；

（6）杏皮渣醋澄清：每100ml杏皮渣醋加入6ml、重量浓度为2%的皂土，澄清24h，4500r/min离心5min，收集澄清液，得杏皮渣醋；

（7）成品杀菌：将杏皮渣醋装瓶加塞，75℃保持3min杀菌。

得到的杏皮渣醋，具备优良品质： 

感官指标：

色泽：棕黄色或浅黄色、澄清透明；

气味：具有典型的杏果香气，有良好的醋味；

口感：酸味较浓、余味呈甜、具有杏果典型的风味。

理化指标： 

原醋产品酸度：7.49g/100ml；

澄清后酸度：5.58-5.94g/100ml；

可溶性固形物含量：4.47%；

Vc含量：1.6mg/100g；

氨基酸含量：0.13%（g/g），杏皮渣醋干基氨基酸含量是杏皮渣的3倍。

香气成分：酯类物质共16种，醇类物质共7种，酸类物质共7种，醛类物质共6种，烯烃类物质共6种，酮类物质共8种。 

卫生指标： 

铅含量： 0.027mg/l；

砷含量： 0.036mg/ l；

黄曲霉毒素B₁含量<5ug/Kg；

游离矿酸：未检出；

菌落总数：未检出；

大肠菌群：未检出；

致病菌：未检出。

实施例5    醋酸菌Ac11酿造杏皮渣醋工艺参数的确定

（1）杏皮渣汁取汁方式试验：

两种杏皮渣预处理方式：直接浸泡、粉碎后浸泡。粉碎浸泡是指杏皮渣先用粉碎机粗碎，再用万能粉碎机细碎浸泡。分别取10g杏皮渣和10g粉碎杏皮渣加水50g，50℃浸泡4h后，4000r/min离心5min。以杏皮渣出汁率和可溶性固形物含量为指标。

通过试验发现，直接浸泡和粉碎浸泡对杏皮渣出汁率和可溶性固形物含量的影响相差不大。因此选择直接浸泡方式。 

（2）杏皮渣汁灭菌条件试验： 

杏皮渣汁在处理过程中存在大量微生物，在酒精发酵前需进行灭菌。以营养琼脂、孟加拉红为培养基测定菌落总数和酵母菌。

表1 杏皮渣汁灭菌试验处理及结果 

50mg/LK₂S₂O₅作用5h、6h、7h、8h，60℃10min、20min、30min，90℃2min、4min、6min，酵母菌和细菌数多不可计，在100℃的条件下，随着时间的延长，酵母菌和细菌逐渐减少。所以选择100℃保持5min，此时孟加拉红平板上未生长酵母菌，营养琼脂平板菌落总数只有9cfu/mL。

（3） 酒精发酵菌种比例选择试验： 

选择酿酒酵母和产酯酵母，以产酯量和酒精度选择菌种比例。

酒精发酵中酿酒酵母与产酯酵母用量比例结果如图6所示，通过试验确定酿酒酵母与产酯酵母的比例为2:1。 

（4） 酒精发酵工艺参数优化试验： 

采用二次通用旋转组合设计对酒精发酵中初始含糖量、初始pH、接种量、发酵时间四因素进行研究。

表2 酒精发酵工艺参数优化结果 

初始可溶性固形物含量、初始pH、接种量和发酵时间四因素与杏皮渣汁发酵酒精度的相关系数R²=回归平方和/总平方和=0.9452，回归模型较好的拟合了杏皮渣汁发酵酒精度与各因素之间的关系，其他因素和误差占5.48%。因此可以用模型来分析和预测杏皮渣醋酒精发酵的工艺条件。酒精发酵的最佳参数为初始可溶性固形物含量为18%，初始pH为3.8，接种量为3%，发酵5d，杏皮渣汁发酵液的酒精度可达7.26%(v/v)。验证试验选pH自然，酒精度达到6.75%(v/v)，占预测值的92.36%。残糖1.34g/L。

（5） 醋酸发酵参数优化试验： 

采用均匀设计对醋酸发酵中初始酒精度、初始pH、装瓶量、接种量、发酵时间、发酵温度六因素进行研究。发酵方式为静止发酵法。

表3 醋酸发酵参数优化结果 

采用拟水平二次均匀设计进行30组试验考察6因素对杏皮渣醋醋酸发酵工艺的影响。通过二次多项式逐步回归分析得到最佳的工艺参数：初始pH为4.24，初始酒精度为6.53%(v/v)，装液量为30%，接种量为12.92%，发酵时间为25d，发酵温度为30.1℃，杏皮渣醋的产酸量可达到8.11%。通过逐步回归分析可知，初始pH和发酵温度对产酸量的影响最小，因此选择pH自然。在最优条件的基础上，选择接种量13%，装液量为30%的条件，采用静止发酵法和摇床发酵法30℃发酵24d产酸量可达到7.49g/100mL。占预测值的92.36%。

（6） 杏皮渣醋澄清试验： 

试验选择10种处理方式对杏皮渣醋进行处理：

 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%硅藻土处理24h，抽滤。

 1%壳聚糖处理24h，4000r/min离心5min。 

 0.5g/L硅胶处理24 h，抽滤。 

 95 ℃下加热2 min，冷却，抽滤。 

 PVP处理24h，4000r/min离心5min。 

 高岭土处理24h，4000r/min离心5min。 

 2%皂土处理24h，4000r/min离心5min。 

 1%蛋清处理24h，95℃加热使蛋清受热变性，4000r/min离心5min。 

 明胶-单宁法处理24h，4000r/min离心5min。 

 95 ℃下加热2 min，加入2%硅藻土处理，冷却，抽滤。 

采用上述各种澄清方法的杏皮渣醋用分光光度计测定透光率(T ₆₅₀ )。 

图7 为不同处理对杏皮渣原醋透光率的影响结果柱形图，图8 为不同2%皂土添加量处理7h和24h后对杏皮渣醋澄清的影响结果柱形图。 

由图7和图8，最终确定添加6mL/100mL2%皂土处理24h。透光率达到84.6%。 

（7）杏皮渣醋杀菌试验： 

以营养琼脂、伊红美蓝为培养基测定菌落总数和大肠杆菌。本试验设计十三种不同的杀菌方式，以杀菌后杏皮渣醋的色泽、微生物指标为试验指标，确定适宜的杀菌方式。采用营养琼脂、孟加拉红为培养基涂布平板，37℃培养48h，计数。

表4 杏皮渣醋杀菌条件结果 

通过实验结果确定杏皮渣醋在75℃保持3min。

最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。 

  

 醋酸菌Ac11 16S rDNA序列表

<110>    韩山师范学院 

<120>    杏皮渣醋醋酸菌及其分离纯化方法和应用方法

<140>    201210577182.X

<141>    2012-12-27

<160>    1

<210>    1   

<211>    1313

<212>    DNA

<213>    醋酸杆菌Ac11（Acetobacter pomorum ）

<220>

<223>    n =a或g或c或t

<400>    1

CCGACCGTGG   TCGGCTGCGT  CCTTGCGGTT   30 CGCTCACCGG   CTTAAGGTCA  AACCAACTCC   60 CATGGTGTGA   CGGGCGGTGT  GTACAAGGCC   90 CGGGAACGTA   TTCACCGCGG  CATGCTGATC   120 CGCGATTACT    AGCGATTCCA  CCTTCATGCA   150  CTCGAGTTGC   AGAGTGCAAT  CCGAACTGAG  180 ACGGCTTTTA   GAGATCAGCA   TGGTGTCACC   210   ACCTAGCTTC   CCACTGTCAC   CGCCATTGTA   240    GCACGTGTGT   AGCCCAGGAC   ATAAGGGCCA   270  TGAGGACTTG   ACGTCATCCC    CACCTTCCTC   300  CGGCTTGTCA   CCGGCAGTCT    CTCTAGAGTG   330  CCCAGCCCAA   CCTGATGGCA    ACTAAAGATA   360 GGGGTTGCGC   TCGTTGCGGG   ACTTAACCCA    390 ACATCTCACG   ACACGAGCTG   ACGACAGCCA   420 TGCAGCACCT   GTGTTAGAGG   TCCCTTGCGG   450 GAAACAAACA   TCTCTGCTTG   CAGCCTCTAC   480 ATTCAAGCCC    TGGTAAGGTT   CTGCGCGTTG   510  CTTCGAATTA    AACCACATGC   TCCACCGCTT  540 GTGCGGGCCC   CCGTCAATTC    CTTTGAGTTT   570  CAACCTTGCG    GCCGTACTCC   CCAGGCGGTG  600 TGCTTAACGC    GTTAACTGCG   ACACTGAATA  630   ACTAAGTTAC    CCAACATCTA   GCACACATCG   660  TTTACAGCGT   GGACTACCAG   GGTATCTAAT  690   CCTGTTTGCT   CCCCACGCTT    TCGCGCCTCG  720  CGTCAGTAAT   GAGCCAGGTT   GCCGCCTTCG  750  CCACCGGTGT   TCTTCCCAAT    ATCTACGAAT  780   TTCACCTCTA    CACTGGGAAT   TCCACAACCC  810  TCTCTCATAC    TCTAGTCTCA    CGTATCAAAT   840  GCAGCTCCCA   GGTTAAGCCC    GGGGATTTCA  870   CATCTGACTG   TACAAACCGC    CTACACGCCC   900   TTTACGCCCA   GTCATTCCGA     GCAACGCTAG  930         CCCCCTTCGT    ATTACCGCGG    CTGCTGGCAC  960   GAAGTTAGCC   GGGGCTTCTT   CTACGGGTAC  990 CGTCATCATC   GTCCCCGTCG    AAAGTGCTTT  1020 ACAATCCGAA   GACCTTCTTC    ACACACGCGG 1050 CATTGCTGGA   TCAGGGTTGC    CCCCATTGTC 1080 CAATATTCCC   CACTGCTGCC    TCCCGTAGGA 1110 GTCTGGGCCG   TGTCTCAGTC    CCAGTGTGGC 1140 TGATCATCCT   CTCAAACCAG   CTATTGATCA 1170 TCGCCTTGGT   AGGCCTTTAC   CCCACCAACT 1200 AGCTAATCAA   ACGCAGGCTC  CTCCACAGGC 1230 GACTTGCGCC   TTTGACCCTC   AGGTGTCATG 1260 CGGTATTAGC   ACCAGTTTCC  CAGTGTTATC 1290 CCCCACCCAT   GGATAGATAC    CTA            1313。

Claims (2)

1.一种杏皮渣醋醋酸菌，其特征在于，菌种的名称为：醋酸杆菌（Acetobacter pomorum strain LMG 18848），属于醋酸单胞菌属，命名为Ac11；已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6938，并有存活证明；

该菌种易在酸性且含酒精的环境中生长，菌落形态为边缘整齐、表面光滑、乳白色、凸起的圆形菌落，直径为0.5～1mm；个体形态为短杆状，呈单、对、堆或链状排列，为革兰氏阴性菌。

2.如权利要求1所述的杏皮渣醋醋酸菌的分离纯化方法，其特征在于，包括下列步骤：

1）醋酸菌的富集培养：

50g杏皮渣加入250ml水中，30℃下培养15d得杏皮渣自然发酵液，取杏皮渣自然发酵液、枣醋和醋醅各10g，分别放入装有90ml富集培养基的三角瓶中，30℃、110r/min培养3d，得到醋酸菌的富集培养液；

富集培养基的重量组成为：酵母浸粉1%、葡萄糖1%、重量浓度为0.02%的结晶紫0.5%、制霉素（5×10⁵ u）5mg/ml、无水乙醇3%(v/v)、余量为水；

2）醋酸的定性试验：

取含有醋酸菌的富集培养液10ml以转速3000r/min，5min离心后，除去醋酸菌等菌体沉淀，吸取5ml无菌体的上清液，以2.5mol/l和0.1mol/l NaOH溶液中和至pH 7.0，煮沸，加入质量浓度为5%的氯化铁液5～7滴，如果形成红褐色沉淀确定有醋酸；

3）醋酸菌平板分离纯化：

取醋酸菌富集培养液25ml放入装有225ml生理盐水的三角瓶中，依次稀释至10^-7（ml/ml）分别取250μl10^-6(ml/ml)和10^-7(ml/ml)的稀释液涂布于3个碳酸钙平板和3个溴甲酚紫平板，在30℃培养至菌落产生透明圈，挑选钙溶解圈大的单个菌落采用涂布法进一步纯化，分离出单个菌落接种于碳酸钙分离培养基斜面上，30℃培养2d，得到醋酸菌Ac11,4℃保藏；

碳酸钙分离培养基的重量组成为：葡萄糖1%、酵母浸粉1%、165℃干热灭菌30min的碳酸钙2%、无水乙醇3%(v/v)、琼脂1.8%、余量为水；

权利要求1所述的杏皮渣醋醋酸菌的应用方法，其特征在于，利用所述的杏皮渣醋醋酸菌制备杏皮渣醋，具体步骤为：

（1）原料预处理：选择无霉变、黄色干杏皮渣，去除杂物，并用清水将杏皮渣上的泥土、微生物洗净待用；

（2）制备杏皮渣汁：将洗净的干杏皮渣放入50℃的温水中，重量份配比为杏皮渣：温水为1：5， 浸泡4h，过滤取汁，调整可溶性固形物为18Brix，100℃水浴灭菌5min；

（3）酿酒酵母种子液和产酯酵母种子液的制备：

取斜面保藏的酿酒酵母CGMCC No.2927（已公开）1环接种至10ml 17Brix杏皮渣汁中，28℃培养24h，得到酿酒酵母种子液；

取斜面保藏的产酯酵母（已公开）2环接种至10ml 17Brix杏皮渣汁中28℃培养36h，得到产酯酵母种子液；

（4）酒精发酵：以3%（v/v）接种量将酿酒酵母种子液和以1.5%（v/v）接种量将产酯酵母种子液接入18Brix杏皮渣汁中，密闭发酵，28℃发酵5d，得杏皮渣酒精发酵液；

（5） 醋酸发酵：取斜面保藏的醋酸杆菌Ac11 1环接种至10ml 3%（v/v）杏皮渣酒精发酵液中，28℃培养24h，得到醋酸杆菌Ac11种子液；

按13%（v/v）的接种量将醋酸菌Ac11种子液接入杏皮渣酒精发酵液，30℃静止发酵24d；

（6）杏皮渣醋澄清：每100ml杏皮渣醋加入6ml质量浓度为2%的皂土，澄清24h，4500r/min离心5min，收集澄清液，得杏皮渣醋；

（7）成品杀菌：将杏皮渣醋装瓶加塞，75℃保持3min杀菌。

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