CN105886414B - 一株产有机酸酿酒酵母菌的筛选与利用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株高产有机酸酿酒酵母菌及在葡萄酒生产中的应用，属于微生物和发酵酿造工程领域。该菌株是从中国新疆阜康地区葡萄表面分离得到的，其筛选方法是酿酒葡萄原料，使用培养基的方法对酵母菌进行分离和纯化，然后经过初筛、复筛和发酵试验，发酵液采用离子交换色谱检测有机酸成分及含量，挑选总酸含量高的酿酒酵母菌株。使用该菌株能有效的提高葡萄酒的酸度，解决低酸高糖产区生产优质葡萄酒的难题，生产的葡萄酒口感清爽、柔和，酸甜平衡，极具特色，挥发性香气成分平衡，葡萄酒特征香气更加明显。

Description

一株产有机酸酿酒酵母菌的筛选与利用

技术领域

本发明涉及一种产有机酸酵母及其筛选方法，该产有机酸酵母已经保存到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.11977，属于微生物技术领域。还涉及该葡萄酒酵母在葡萄酒酿造中的应用，属于发酵食品领域。

背景技术

葡萄酒是国际公认的健康饮品，是国民经济发展中最具活力的产业之一。自2000年以来，我国葡萄酒产量年平均增幅达到15％～20％，成为饮料酒类中增幅最快的酒种，它在提高城乡居民生活水平、推动相关产业发展、扩大就业、带动农民增收等方面做出了重要贡献。然而自2013年以来，我国葡萄酒产量却严重下滑，国家统计局根据国有及年销售收入2000万元以上的企业统计数据显示：2013年我国葡萄酒产量为117.38万千升，同比减少14.59％；销售收入408.17亿元，同比减少8.52％；利润43.81亿元，同比减少20.06％，截止到2014年上半年(6月)，葡萄酒产量为50.85万千升，同比减少3.92％；销售收入191.70亿元，同比减少0.37％；利润19.91亿元，同比减少5.16％，形势不容乐观。

盛名之下，我国葡萄酒产业出现这种情况的原因在于在市场需求并不紧缺的情况下，不仅有国内的激烈竞争，还存在着进口葡萄酒的冲击。就目前来讲，国产葡萄酒与进口葡萄酒在各方面都存在着差距，其中最明显的就是葡萄酒的口味及风格。进口葡萄酒品种多样，口味独特且风格各异，而中国的葡萄酒则风味基本一致，出现产品同质化的现象。由于酿酒葡萄的种植期较长(3-7年)，从原料上改变同质化现象耗费时间且成本较大，借鉴传统葡萄酒强国的经验，采用具有典型性、个性化的酿酒微生物对葡萄酒的风味进行改善是一种快速且有效的方法。

新疆自治区具有种植优质酿酒葡萄得天独厚的地理资源优势，自古以来是中国主要的酿酒葡萄及葡萄酒产地，近两年由于葡萄产业化及龙头企业的发展，新疆葡萄酒产量逐年提高，工业水平有了明显的发展。新疆占全国葡萄酒产量的比重分别从2005年1.38％提升到2013年的3.16％。新疆由于其地理位置的优越，加上1.47万公顷全国最大的酿酒葡萄基地，葡萄酒已成为自治区经济发展的支柱型产业。但是由于新疆地区日温差大、降雨量少等气候特点，造成了新疆酿酒葡萄原料糖高酸低的特点，进而严重影响到新疆地区葡萄酒的质量，因此筛选具有新疆产区的葡萄酒酵母，提高葡萄酒的质量，生产具有产区特点的葡萄酒产品是未来新疆葡萄酒工业发展的重点。

本专利通过以下筛选方法，分离筛选出一株产有机酸能力高的葡萄酒酿酒酵母菌株，对于开发适用于新疆产区的酿酒葡萄原料并显著改善葡萄酒品质的葡萄酒酵母菌具有重要意义。

发明内容

1.本发明的目的，旨在解决新疆葡萄酒酸度低的现状，提供一株产有机酸的酿酒酵母及其在葡萄酒生产中的应用。

2.本发明所提供的产有机酸的酿酒酵母菌，经过48h固体PDA培养基上生长的菌落特征为乳白色，圆形，菌落球形突出，表面光滑湿润、不透明，其边缘整齐，菌体粘稠易挑起；在WL营养琼脂培养基上菌落特征为奶油色带绿色，圆形，菌落球形突出，表面光滑湿润、不透明，菌体易挑起；在溴甲酚绿培养基上菌落特征为奶黄色，圆形，菌落球形突出，表面光滑、不透明，菌落周围出现黄色圈；在含有牛津杯的溴甲酚绿培养基上牛津杯周围出现边缘整齐的黄色圈。

3.本发明从我国新疆阜康产区酿酒葡萄表面筛选得到的酿酒酵母菌，主要筛选步骤包括：

①在葡萄园中选取成熟的赤霞珠葡萄原料，以无菌操作的方式在不同位置处摘取整串葡萄，从每串葡萄的上部、下部、内部、外部摘取葡萄50粒，放入100mL生理盐水中，以120r/min在25℃下震荡24h，然后梯度稀释涂布于分离培养基中，于25℃培养箱中静置培养3d，随机选取具有典型酵母菌菌落特征的单菌落，划线分离纯化2-3次，斜面保存备用。

②将分离的酵母菌株进行初筛、复筛、产气试验、酒精耐受性试验、SO₂耐受性试验、pH耐受性试验和发酵试验，获得产有机酸含量高于2.0g/L的一株酵母。

4.权利要求2所述的筛选方法①所使用的分离培养基为PDA培养基，所含组分为：

马铃薯浸粉3g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉15g/L。

5.权利要求2所述的筛选方法①所使用的斜面保存培养基为YPD培养基，所含组分为：

葡萄糖2％，蛋白胨2％，酵母浸膏1％，琼脂2％。

6.权利要求2所述筛选方法②中的初筛、复筛培养基为溴甲酚绿培养基，所含组分为：

PDA基础培养基，0.01％溴甲酚绿，pH6.0。

7.权利要求2所述筛选方法②为初筛，具体过程是：挑取一环酵母菌接种于溴甲酚绿培养基上，在25℃培养箱中静置培养24h，观察黄色圈，选择菌落周围出现黄色圈的酿酒酵母菌株；

8.权利要求2所述筛选方法②为复筛，具体过程是：将初筛的酵母菌株和工业化普遍应用的商业酿酒酵母71B分别配置为相同浓度的菌悬液，先在培养皿中倒入一层刚好覆盖培养皿底部的溴甲酚绿培养基，待其凝固后放入牛津杯，再倒入一层溴甲酚绿培养基，凝固后取出牛津杯，接种0.1mL菌悬液于牛津杯处，在25℃培养箱中静置培养24h，观察黄色圈，通过其大小来判断产酸能力的大小，黄色圈越大表示产酸能力越强，反之则越弱，选择黄色圈大于商业酿酒酵母71B的酵母菌株。

9.权利要求2所述筛选方法②是酵母菌的产气性能测试，具体过程为：采用杜氏管发酵法，将10mL的12°Brix麦芽汁加入试管中，灭菌冷却后加入酵母菌，在25℃下发酵48h，选择产气量等于杜氏小管体积的菌株。

10.权利要求2所述筛选方法②是酵母菌的产酒精能力测试，具体过程为：采用新疆阜康地区成熟的赤霞珠葡萄，捏碎成汁，葡萄汁总糖含量为260g/L。在25℃条件下培养6d后，选择酒精度12％(V/V)以上、香气平衡的菌株。

11.权利要求2所述筛选方法②是酒精耐受性、SO₂耐受性和pH耐受性试验，具体过程是：采用杜氏管发酵法，将10mL的12°Brix麦芽汁加入试管中，灭菌后分别添加无水乙醇(8％、10％、12％、14％、16％、18％)、SO₂(50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L)和pH(2.5、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0)，接种酿酒酵母菌株，25℃条件下静止培养48小时，选择杜氏小管产气达到满体积且耐酒精度在12％以上、耐SO₂在150mg/L以上、耐pH在2.5以上的菌株。

12.权利要求2所述筛选方法②中的发酵试验，具体过程是：将葡萄汁糖含量调到260g/L，将权利要求11中筛选得到的酵母菌株活化后接到装有200mL葡萄汁的三角瓶中，使终浓度达到1×10⁸cfu/mL，在20℃下发酵7天，每天称重绘制生长曲线，发酵结束后采用国标方法滴定总酸，并用离子交换色谱分析有机酸组成及含量，选择产酸能力高于2.0g/L的酵母菌株。

13.利用本发明的酿酒酵母生产出的葡萄酒优点在于：发酵前葡萄汁有机酸含量为5.25g/L，发酵后，本发明的酿酒酵母菌有机酸含量为7.65g/L，商业酿酒酵母71B有机酸含量为5.81g/L；可以看出，本发明的酿酒酵母菌产有机酸量为2.4g/L，商业酿酒酵母71B产有机酸量为0.56g/L，本发明的酿酒酵母菌产酸能力远大于比对照菌株商业酿酒酵母71B。该菌株在工业生产葡萄汁发酵中，显示能很好利用果糖、葡萄糖，菌体生长和酒精生成速率高等优良酿造特性，并能保持原酒的香气成分。本发明应用价值高，具有极高的社会和经济效益。

具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的葡萄汁为：新疆阜康冰湖酒庄的赤霞珠葡萄汁，调节糖含量到260g/L。

下述实施例中的WL培养基配方如下：

酵母浸粉4.0g/L，胰蛋白胨5.0g/L，葡萄糖50.0g/L，磷酸二氢钾0.55g/L，氯化钾0.425g/L，氯化钙0.125g/L，硫酸镁0.125g/L，氯化铁0.0025g/L，硫酸锰0.0025g/L，琼脂20.0g/L，溴甲酚绿22.0mg/L。

下述实施例中的添加溴甲酚绿选择培养基配方如下：

PDA基础培养基，0.01％溴甲酚绿，pH6.0。

下述实施例中的YPD培养基配方如下：

葡萄糖2％，蛋白胨2％，酵母浸膏1％，琼脂2％。

实施例1：高产有机酸酵母菌的分离、纯化及鉴定

对新疆阜康、玛纳斯和昌吉地区的赤霞珠表面所分离的39株野生酵母菌株进行分离、纯化和鉴定。其分离方法采用平板稀释涂布法挑取单菌落，并采用平板划线法进行连续纯化，鉴定方法采用传统形态学并结合26S rDNA D1/D2区域序列分析法。

该菌株经形态学并结合26S rDNA D1/D2区域序列分析，鉴定为酿酒酵母，具体鉴定结果如下：

1.形态学观察方法和结果：经过48h固体PDA培养基上生长的菌落特征为乳白色，圆形，菌落球形突出，表面光滑湿润、不透明，其边缘整齐，菌体粘稠易挑起；在WL营养琼脂培养基上菌落特征为奶油色带绿色，圆形，菌落球形突出，表面光滑湿润、不透明，菌体易挑起；在溴甲酚绿培养基上菌落特征为奶黄色，圆形，菌落球形突出，表面光滑、不透明，菌落周围出现黄色圈；在含有牛津杯的溴甲酚绿培养基上牛津杯周围出现边缘整齐的黄色圈。

2.26S rDNA D1/D2区域序列分析方法和结果：

⑴酵母菌基因组DNA的提取采用酵母菌基因组DNA提取试剂盒，具体方法如下所述

①取酵母细胞(最多不超过5×10⁷cells)，12000rpm离心1min，尽量吸除上清；

②酵母细胞壁的破除：向菌体中加入600μL山梨醇buffer，加入大约50ULyticase，充分混匀。30℃水浴30min。4000rpm离心10min，弃上清，收集沉淀；

③向沉淀中加入200μL缓冲液GA重悬沉淀，充分混匀。振荡15sec，室温放置5min

④加入20μL Proteinase K溶液，混匀；

⑤加入220μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心，去除管盖内壁的水珠；

⑥加220μL无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心，去除管盖内壁的水珠；

⑦将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

⑧向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

⑨向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

⑩重复操作步骤⑨；

将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μL洗脱缓冲液TE，室温放置5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中；

将所离心得到的溶液再加入吸附柱中，室温放置5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，-20℃保存备用。

⑵酵母26S rDNA D1/D2区域特异性片段的扩增采用通用引物NL1/NL4由上海生物工程技术服务有限公司合成；PCR扩增条件为95℃预变性5min；95℃变性1min，52℃退火45s，72℃延伸40s，反应40个循环；72℃延伸5min；PCR扩增体系(50uL)的组成为：模板DNA1uL，10×BufferPCR反应缓冲液5.0uL，25mmoL/L dNTPS4uL，上下游引物NL1、NL4各1uL，5U/uLTaq DNA聚合酶0.25uL，双蒸水补充体系至50uL，混匀。随后对PCR扩增产物进行检测：取5uLPCR扩增产物点样于2％琼脂糖凝胶上。电泳缓冲液为1×TAE，100V电压下，电泳30min，GoldView I染色后，由凝胶成像系统对电泳图谱拍照并进行分析，采用DL2000DNAMarker判断PCR扩增产物的大小，结果显示酵母的特异性片段长度约为700bp。

⑶酵母26S rDNA D1/D2序列分析：26S rDNA PCR扩增产物由上海生物工程技术服务有限公司进行测序，根据测序结果，利用BLAST软件从Genbank核酸序列数据库中进行同源序列搜索，比较试验菌株与已知酵母菌株相应序列的相似程度。

根据目前酵母菌分子系统学研究领域的观点：具有相同或相似ITS序列(序列同源性≥99％)的菌株属于同一物种。该菌株序列分析结果与基因库参考菌株的序列同源性≥99％，因此确定该菌株为酿酒酵母。

实施例2：高产有机酸酵母的筛选

对经鉴定为酿酒酵母的菌株再经过初筛、复筛、产酒精能力测试、耐受性能力测试、发酵力测试，得到数株具有优良酿造特性的酿酒酵母菌株，然后在葡萄汁中以1×10⁸cfu/mL的接种量接种，在20℃下发酵7天，发酵结束后采用国标方法滴定总酸，并用离子交换色谱分析有机酸组成及含量，用GS-MS分析风味物质，并进行专家感官品评。

经过反复筛选、验证和酿造研究，从新疆阜康产区赤霞珠表面分离得到了一株产有机酸高且发酵性能良好的葡萄酒酵母，用该菌株酿造的葡萄酒具有良好的香气结构和组成。

具体筛选过程如下：

1.高产有机酸酿酒酵母的初筛：挑取一环酿酒酵母菌接种于溴甲酚绿培养基上，在25℃培养箱中静置培养24h，观察黄色圈，选择菌落周围出现黄色圈的酿酒酵母菌株。

2.高产有机酸酿酒酵母的复筛：将初筛的酿酒酵母菌和商业酿酒酵母71B分别配置为相同浓度的菌悬液，先在培养皿中倒入一层刚好覆盖培养皿底部的溴甲酚绿培养基，待其凝固后放入牛津杯，再倒入一层溴甲酚绿培养基，凝固后取出牛津杯，接种0.1mL菌悬液于牛津杯处，在25℃培养箱中静置培养24h，观察黄色圈，选择黄色圈大于商业酿酒酵母71B的酿酒酵母。

3.酿酒酵母的产气性能测试：采用杜氏管发酵法，将10mL的12°Brix麦芽汁加入试管中，灭菌冷却后加入供试酵母菌，在25℃下发酵48小时，选择产气量等于杜氏小管体积的菌株。

4.酿酒酵母的产酒精能力测试：采用12°Brix麦汁为原料，总糖含量为260g/L。在25℃条件下培养7天后，选择发酵后葡萄酒酒精度12％(V/V)以上、香气平衡的菌株。

5.酿酒酵母的酒精耐受性、SO₂耐受性和pH耐受性试验：采用杜氏管发酵法，将10mL的12°Brix麦芽汁加入试管中，灭菌后分别添加无水乙醇(8％、10％、12％、14％、16％、18％)、SO₂(50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L)和pH(2.5、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0)，接种供试酵母菌株，25℃条件下静止培养48小时，选择杜氏小管产气达到满体积且耐酒精度在12％以上、耐SO₂在150mg/L以上、耐pH在2.5以上的菌株。

6.发酵试验：将供试酵母活化后分别接到装有200mL葡萄汁的三角瓶中，使终浓度达到1×10⁸cfu/mL，在20℃下发酵7d，发酵结束后采用国标方法滴定总酸，并用离子交换色谱分析有机酸组成及含量，选择产酸能力大于2g/L的酿酒酵母。

实施例2：高产有机酸酵母和商业菌株在赤霞珠葡萄汁中的小型酿酒比较试验

在2个2.5L广口瓶里分别装2L赤霞珠葡萄汁(理化指标为：还原糖263.1g/L，总酸5.25g/L,pH 4.80，添加总SO₂约60mg/L)，加入高产有机酸酵母和工业化普遍应用的商业酿酒酵母71B，使终浓度达到1×10⁸cfu/mL，按照干红葡萄酒的标准工艺进行生产。发酵结束后取澄清的干红葡萄酒，取样测定有机酸含量和香气成分及含量。

表1两种酵母菌株生产葡萄酒的理化指标

表2两种酵母菌株生产葡萄酒主要有机酸的组成

表3两种酵母菌株生产葡萄酒中各种风味成分的检测结果(单位：ug/L)

结果如下：所筛菌株与商业酿酒酵母71B相比，发酵结束后残糖均小于4g/L，酒精度无显著差异，因此筛选的菌株符合工业发酵的要求；两种酵母所发酵的葡萄酒香气成分及含量基本吻合，同时筛选菌株的有机酸含量明显高于普遍应用的商业酿酒酵母71B，是所需的高产有机酸目标菌株。

Claims (2)

1.一株产有机酸的葡萄酒酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），保藏号为CGMCCNO. 11977，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

2.权利要求1所述酿酒酵母在葡萄酒生产中的 应用。