CN117126753B

CN117126753B - 产多糖酿酒酵母及其在龙眼葡萄酒酿造中的应用

Info

Publication number: CN117126753B
Application number: CN202311397047.1A
Authority: CN
Inventors: 丁子元; 陈佳威; 郑晓卫; 刘沛通; 李泽福; 傅晓方; 孙建平; 薛楚然; 赵晓宁; 郜成军; 凌翰; 陈晓园; 孙玉婷; 范佳硕
Original assignee: China Great Wall Wine Co ltd; Cofco Nutrition and Health Research Institute Co Ltd
Current assignee: China Great Wall Wine Co ltd; Cofco Nutrition and Health Research Institute Co Ltd
Priority date: 2023-10-26
Filing date: 2023-10-26
Publication date: 2024-04-09
Anticipated expiration: 2043-10-26
Also published as: CN117126753A

Abstract

本发明涉及微生物及酿酒技术领域，公开了一株产多糖酿酒酵母及其在龙眼葡萄酒酿造中的应用。本发明提供的酿酒酵母不仅具有较好的抗胁迫能力和发酵性能，还具有独特的产香性能，而且该酿酒酵母还能高产酵母多糖，使其酿造的葡萄酒的口感更好，风格更加突出。该酿酒酵母尤其适合用于以怀涿产区的龙眼葡萄为原料进行葡萄酒酿造，获得的葡萄酒具有更浓郁丰富的香气物质，具有品质高、风味好、产区风格突出等特点。

Description

产多糖酿酒酵母及其在龙眼葡萄酒酿造中的应用

技术领域

本发明涉及微生物以及酿酒技术领域，具体涉及一株产多糖酿酒酵母及其在龙眼葡萄酒酿造中的应用。

背景技术

酵母多糖酵母在发酵过程中产生的一种活性大分子物质，通常在葡萄酒发酵及陈酿过程中持续释放，其含量直接影响产品的风格和质量。有研究表明，酵母多糖可以抑制葡萄酒中的酒石和蛋白沉淀，增加葡萄酒的稳定性；还可以提高酒的颜色稳定性和香气品质，降低苦涩感，有效提升葡萄酒的感官质量。目前，国内外酒厂在葡萄酒酿造中常外源添加酵母多糖，以改善葡萄酒的结构、提高稳定性、提升产品品质。然而，外源添加酵母多糖一方面提高了葡萄酒酿造成本，另一方面对于葡萄酒的品质改善效果也很有限。

龙眼葡萄是中国本土葡萄品种之一，既可以作为鲜食葡萄食用，也可以用来酿造优质葡萄酒。龙眼葡萄果实香气柔和，葡萄酒风格可塑性强。近年来，已有一些研究使用低温发酵、产香酵母混合发酵等工艺提升龙眼葡萄酒的香气强度、复杂度和平衡感，以期提高本土葡萄酒品质，丰富葡萄酒产品。但是，对于如何提升龙眼葡萄酒口感及整体风格方面的内容鲜有报道。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺乏改善和提升葡萄酒，尤其是龙眼葡萄酒的整体风格的手段和产品等问题，提供一株产多糖酿酒酵母及其在龙眼葡萄酒酿造中的应用。本发明提供的酿酒酵母能够高产酵母多糖，用于酿造葡萄酒时，对于葡萄酒的口感和风格具有良好的改善作用，其该菌株具有较好的抗胁迫能力，发酵速度快，在较宽的发酵温度下均可完成葡萄酒发酵等特点，具有作为工业生产菌株的潜力。

为了实现上述目的，本发明第一方面提供一株酿酒酵母，所述酿酒酵母的保藏编号为CGMCC No.28280。

本发明第二方面提供第一方面所述的酿酒酵母在制备酵母多糖中的应用。

本发明第三方面提供第一方面所述的酿酒酵母，和/或，该酿酒酵母制备的酵母多糖在葡萄酒酿造中的应用。

本发明第四方面提供第一方面所述的酿酒酵母，和/或，该酿酒酵母制备的酵母多糖在改善葡萄酒口感和/或塑造葡萄酒风格中的应用。

本发明第五方面提供一种酿造葡萄酒的方法，所述方法包括：

（1）将第一方面所述的酿酒酵母接种至葡萄汁和/或葡萄果浆中，在酿酒条件下进行发酵，获得葡萄酒，其中，所述方法不包括添加外源酵母多糖的操作；或者

（2）在葡萄酒酿造过程中添加如上所述的酿酒酵母制备的酵母多糖。

本发明第六方面提供第五方面所述的方法制备获得的葡萄酒。

通过上述技术方案，本发明至少能够取得如下有益效果：

（1）本发明提供的酿酒酵母具有十分优异的产酵母多糖能力，使用该酿酒酵母进行葡萄酒酿造时，可以在完全不添加外源酵母多糖的情况下获得品质更优、风格更加突出的优质葡萄酒。另外，经研究还发现，该酿酒酵母所产的酵母多糖对于葡萄酒的品质和风格的提升效果也明显优于现有商业酵母多糖，采用本发明提供的酿酒酵母制备的酵母多糖作为葡萄酒酿造过程中的添加剂，可以更好地提高葡萄酒的品质和风格，丰富了提升葡萄酒整体风格的手段和产品。

（2）本发明提供的酿酒酵母具有较好的抗胁迫能力，具有发酵温度范围广、二氧化硫耐受能力和酸耐受能力强等特点，还能在较低的温度下启动发酵，降低了对葡萄酒酿造条件的控制和管理的要求。

（3）本发明提供的酿酒酵母具有独特的产香能力，尤其乙酸酯类和乙酯类香味物质产量较高，可提高葡萄酒果香、花香等风味特征。

（4）本发明提供的酿酒酵母特别适合怀涿盆地龙眼葡萄酿酒使用，利于丰富我国高品质特色葡萄酒产品种类，满足高品质葡萄酒市场消费需求。

附图说明

图1是实施例1中，酿酒酵母CGMCC No.28280在YPD培养平板上进行培养的菌落形态图。

图2A至图2C中分别为实施例2中绘制的酿酒酵母CGMCC No.28280的pH抑制率曲线、二氧化硫抑制率曲线和温度抑制率曲线。

图3为实施例5中酿酒酵母CGMCC No.28280和商业酵母D254发酵获得的龙眼干白葡萄酒的感官评价结果对比。

生物保藏

本发明提供的菌株BC60725，分类命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，已于2023年8月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.28280。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明中，未作特殊说明的情况下，“（本发明提供的）酿酒酵母”是指酿酒酵母CGMCC No.28280，BC60725（简称为60725）是发明人在研究过程中对该菌株的编号，其二者是同一菌株，其保藏编号和（研究过程中的）编号在后文中可以互换使用。

怀涿盆地位于北纬40°附近，是我国最理想的葡萄原料产地之一。由于其独特的地质地貌特性，造成了盆地内独特的气候特点，为葡萄的生长提供了绝佳的生存条件。盆地内热量丰富，昼夜温差大，太阳光辐射强，无霜期长，年降雨量偏低等气候特点及完美的土壤渗透性、排水性和土壤自然肥力都有利于葡萄生长，加之海拔较高，紫外线和蓝紫光丰富，与良好的通风条件相结合，对葡萄的光合作用十分有力，尤其是利于葡萄花青素的合成，所以怀涿盆地栽培的葡萄果实色泽艳丽，香气浓郁，是我国酿酒葡萄的优良产区之一。

龙眼葡萄是中国古老的葡萄栽培品种，广泛分布在西北、华北等地，其果实呈紫红色，含糖量含酸量较高，酸甜爽口，是鲜食葡萄中佳品的同时也是酿造高级白葡萄酒的主要原料。由于长期的栽培驯化，河北怀涿盆地已成为龙眼葡萄的最适栽培区之一。

本发明的发明人在研究的过程中，从怀涿盆地沙城产区自然发酵的酿酒葡萄醪中分离获得一株酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），并意外地发现该酿酒酵母不仅发酵性能良好，具有良好的抗胁迫能力和独特的产香能力，而且还具有很好的产酵母多糖能力。使用该菌株进行葡萄酒酿造时，可以在完全不添加外源酵母多糖的情况下获得品质和风格提升的葡萄酒。该酿酒酵母的推广应用不仅能够丰富葡萄酒酿造菌株市场，加快我国葡萄酒产业自主发展进程，还能避免我国不同产区葡萄酒同质化的问题，提高葡萄酒品质，凸显怀涿盆地产区葡萄酒的特色。经过进一步研究，发明人还发现，采用该酿酒酵母进行龙眼葡萄酒酿造时，具有能够在较低温度下启动发酵，且发酵速度快的特点。而且，酿造获得的龙眼葡萄酒口感好，花香和果香突出，极大突出了产区特色，提高了葡萄酒的品质。此外，该酿酒酵母的高产酵母多糖特性还使其可以用作酵母多糖生产的发酵株，提高企业效益，丰富产品种类。发明人在研究中发现，采用现有商购菌株进行葡萄酒酿造过程中，相比于添加商购酵母多糖，添加本发明的酿酒酵母生产的酵母多糖能够更好地提高葡萄酒的品质和风味，突出葡萄酒的风格。

基于上述发现，本发明一方面提供一株酿酒酵母，所述酿酒酵母的保藏编号为CGMCC No.28280。

本发明第三方面提供第一方面所述的酿酒酵母，和/或，该酿酒酵母制备的酵母多糖在葡萄酒酿造中的应用。尤其是在（怀涿产区）龙眼（干白）葡萄酒酿造中的应用。例如，可以采用本发明提供的酿酒酵母作为酿造菌株（之一）进行葡萄酒酿造，或者也可以采用本发明提供的酿酒酵母进行酵母多糖制备，再将获得的酵母多糖作为添加剂在葡萄酒酿造过程中加入以改善葡萄酒的口感和风味等。

本发明第四方面提供第一方面所述的酿酒酵母，和/或，该酿酒酵母制备的酵母多糖在改善葡萄酒口感和/或塑造葡萄酒风格中的应用。“塑造葡萄酒风格”是指从香气、口感、风味等方面赋予葡萄酒独特的风格特点。

本发明进一步提供一种改善葡萄酒口感和/或塑造葡萄酒风格的方法，该方法包括：

（1）在葡萄酒酿造过程中加入酿酒酵母CGMCC No.28280，或者在葡萄酒中掺入酿酒酵母CGMCC No.28280酿造的葡萄酒；或者，

（2）对酿酒酵母CGMCC No.28280进行发酵培养，然后从培养物中分离获得酵母多糖，并在葡萄酒酿造过程中或酿造完成后，加入所述酵母多糖。

本发明中，方式（1）即为将酿酒酵母CGMCC No.28280作为葡萄酒的发酵菌株（之一），利用其独特的产香性能和优越的产酵母多糖能力改善葡萄酒的口感或风格的方式。任意能够实现该目的的方法均可适用于本发明。例如，本领域技术人员可以采用任意本领域现有的葡萄酒酿造菌株（例如自行分离、筛选、改造获得的菌株，又例如商购获得的葡萄酒酿造菌株等）和酿酒酵母CGMCC No.28280共同发酵葡萄原料以获得葡萄酒，或者也可以用现有的葡萄酒酿造菌株和酿酒酵母CGMCC No.28280分别对葡萄原料进行发酵获得葡萄酒后，按照一定的比例将酿酒酵母CGMCC No.28280酿造的葡萄酒掺入现有菌株酿造的葡萄酒中。

本发明中，方式（2）即为获取酿酒酵母CGMCC No.28280生产的酵母多糖，并将其作为外源酵母多糖在采用现有的其他菌株酿造葡萄酒的过程或酿造好的葡萄酒中加入，从而改善葡萄酒口感、风味或塑造葡萄酒风格的方式。任意能够实现该目的的方式和原料均可适用于本发明。例如，可以采用任意本领域常用于酿酒酵母发酵培养的培养基，或者也可以根据需要采用葡萄酒酿造原料（如葡萄汁、葡萄果浆等）对本发明提供的酿酒酵母进行发酵培养，以获得酵母多糖。本领域技术人员也能够根据实际需要和葡萄酒本身的特点对于所述酵母多糖的添加时机和添加量等条件进行控制和选择，例如可以直接与原料一起加入、在葡萄酒发酵过程中加入，或者也可以在葡萄酒发酵完成后加入等。

本发明提供的方法中，“不包括添加外源酵母多糖”是指在葡萄酒酿造过程中或酿造完成后均不额外添加外源性的酵母多糖。

本发明提供的方法中，方式（1）即为直接采用本发明提供的酿酒酵母进行葡萄酒酿造的方法。该方式中，对于用于葡萄酒酿造的原料（酿酒葡萄）的来源没有特别限制，任意可以用于葡萄酒酿造的葡萄制成的果汁或葡萄果浆均可适用于本发明提供的方法。经过大量研究，发明人发现，本发明提供的酿酒酵母CGMCC No.28280特别适合以怀涿盆地产区的酿酒葡萄（尤其是龙眼葡萄）为原料进行葡萄酒酿造。根据该产区葡萄的特点，上述方法特别适合糖、酸含量较高的酿酒葡萄为原料进行葡萄酒酿造。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述葡萄汁和/或葡萄果浆中，还原糖含量（以葡萄糖计）为150-500g/L，总酸含量（以酒石酸计）为1-15g/L。

优选地，所述葡萄汁和/或葡萄果浆中，还原糖含量为150-350g/L，总酸含量为3-10g/L。

更优选地，所述葡萄汁和/或葡萄果浆中，还原糖含量为150-200g/L，总酸含量为4-9g/L。

本发明提供的方法可以采用任意品种的具有上述特征的酿酒葡萄为原料进行葡萄酒酿造。根据本发明的优选实施方式，其中，用于制备所述葡萄汁和/或葡萄果浆的葡萄品种选自龙眼、马瑟兰、赤霞珠、梅鹿辄、品丽珠、西拉、黑比诺、丹菲特、长相思、贵人香和霞多丽中的至少一种。

根据本发明一种特别优选的实施方式，其中，用于制备所述葡萄汁和/或葡萄果浆的葡萄为产自怀涿盆地的龙眼葡萄。

本发明提供的方法中采用的葡萄汁或葡萄果浆可以采用任意本领域现有方法制备获得，也可以直接从商购途径购买获得，只要其原料符合前述特征即可。

本发明提供的方法中，对于酿酒酵母的接种量没有特别限制，可以根据实际情况（例如原料来源和种类、发酵条件、产品要求等）进行调整。根据本发明的优选实施方式，其中，所述酿酒酵母的接种量为10⁵-10¹⁰CFU/mL。所述10⁵-10¹⁰CFU/mL是指接种后发酵体系中酿酒酵母的含量在10⁵-10¹⁰CFU/mL的数量级水平，例如10⁵CFU/mL的数量级水平代表的是大于等于1×10⁵CFU/mL至小于1×10⁶CFU/mL的范围，也即，如1×10⁵CFU/mL、5×10⁵CFU/mL、9.9×10⁵CFU/mL等均属于10⁵CFU/mL的数量级水平。因此，本发明提供的方法中，酿酒酵母的接种量在大于等于1×10⁵CFU/mL至小于1×10¹¹CFU/mL的范围内。

优选地，所述酿酒酵母的接种量为10⁵-10⁸CFU/mL。更优选为10⁵-10⁷CFU/mL。

本发明的发明人在研究过程中发现，本发明提供的酿酒酵母具有较好的温度耐受性，在较宽的温度范围内均可启动发酵，而且发酵效率较高，因此，本发明提供的方法中，酿酒的温度可以在一个相对较宽的范围内进行选择。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述酿酒条件包括：发酵温度10-40℃（优选为12-35℃，更优选为13-32℃，进一步优选为13-30℃）。

本发明提供的方法中，对于发酵时间没有特别限制，其通常由原料、发酵温度以及产品要求等多方面因素确定。一般来说，当发酵体系中的还原糖浓度低于4g/L时，即可结束发酵。当采用龙眼葡萄作为原料时，根据本发明的一些优选实施方式，其中，所述酿酒条件还可以包括：发酵时间5-25天（优选为5-20天，更优选为10-20天）。

本发明提供的方法中，出于提升葡萄酒品质的目的，在酿造葡萄酒的原料（即葡萄汁和/或葡萄果浆）中还可以添加辅料，例如，用于帮助酵母发酵的辅料，进一步改善和提升葡萄酒风格、香气和风味的辅料等。根据本发明的优选实施方式，其中，所述葡萄汁和/或葡萄果浆中还包括果胶酶、单宁、氮源和橡木制品中的至少一种。本发明提供的方法中对于所述辅料的用量没有特别限制，可以根据实际情况（例如原料特性、辅料特性、产品需要等）进行调整。氮源可以为本领域常见的氮源，例如蛋白胨、酵母提取物等。橡木制品用于进一步改善葡萄酒的香气和风味。

本发明提供的方法中，在发酵前还可以采用常规的方法对菌株进行活化。优选所述活化的条件可以包括：温度为25-35℃，时间可以为10-30h（优选15-25h）。

本发明提供的方法中，方式（2）即为以本发明提供的酿酒酵母作为酵母多糖生产菌株，并将其生产的酵母多糖作为葡萄酒发酵过程中添加的辅料使用的方式。该方式中，对于葡萄酒酿造的原料以及酿酒菌株的选择没有特别限制，任意本领域中常用的酿酒葡萄和菌株均可适用于该方法。例如，可以采用自行分离、筛选、改造的菌株或者商购菌株接种至任意来源的酿酒葡萄制备的葡萄汁或葡萄果浆中进行发酵以制备葡萄酒，并在发酵原料中加入一定量的由酿酒酵母CGMCC No.28280制备获得的酵母多糖。

本发明中，对于由酿酒酵母CGMCC No.28280制备获得的酵母多糖的用量没有特别限制，本领域技术人员能够根据酿酒原料和菌株本身的特点以及葡萄酒所需的品质、风味和风格特点等进行调整。根据本发明的一些优选实施方式，其中，所述酵母多糖的添加量可以为酿酒原料（即葡萄汁或葡萄果浆）总重的0.001-0.1重量%。例如可以为0.001重量%、0.005重量%、0.01重量%、0.03重量%、0.05重量%、0.08重量%、0.1重量%，或者也可以为上述任意两个值的任意中间值。

本发明第六方面提供根据第五方面所述的方法制备获得的葡萄酒。

任意根据本发明提供的上述方法制备获得的葡萄酒均属于本发明的内容，对于其中的具体成分没有特别限制。

由于葡萄酒的成分与酿酒原料和酿酒条件等均有关联，因此，采用不同来源和品种的酿酒葡萄，或采用不同的酿酒条件获得的葡萄酒中的成分均会有所差别。

根据本发明的一种特别优选的实施方式，其中，所述葡萄酒为采用还原糖含量为150-200g/L，总酸含量为5-10g/L的（去皮）龙眼葡萄汁为原料，采用如前所述的酿酒条件酿造获得的葡萄酒。优选所述葡萄酒中，乙酸酯（如乙酸乙酯、乙酸异戊酯、2-乙酸苯乙酯、乙酸己酯等）的含量不低于52mg/L，乙酯（如丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、十二酸乙酯、乳酸乙酯、苯乙酸乙酯等）的含量不低于15mg/L。乙酸酯是由乙醇或者高级醇与乙酰辅酶A在醇酰基转移酶催化作用下形成的，可以为葡萄酒提供花香和果香。乙酯是葡萄酒中另一类重要的酯类化合物，是由酵母脂肪酸代谢过程中产生的酯酰辅酶A醇解产生的，不同的脂肪酸乙酯具有不同的风味，例如，己酸乙酯可以为酒体增添苹果香和草莓香，乳酸乙酯则可以提供奶油香气，乙酯类物质种类和含量对于葡萄酒的香气复杂度具有较大影响。

由于本发明提供的酿酒酵母具有突出的合成酵母多糖的能力，因此，本发明提供的方法制备获得的葡萄酒中也含有一定量的酵母多糖。优选地，所述葡萄酒中，酵母多糖的含量不低于250mg/L。优选为250-500mg/L。

优选地，所述葡萄酒中还可以含有：乙醇5-20体积%，乙酸酯55-75mg/L，乙酯20-40mg/L。

根据本发明的一些优选实施方式，其中，所述葡萄酒中含有：乙醇5-15体积%，乙酸酯60-75mg/L，乙酯20-30mg/L，酵母多糖300-400mg/L。

本发明提供的葡萄酒中：乙醇含量可以为5体积%、6体积%、7体积%、8体积%、9体积%、10体积%、11体积%、12体积%、13体积%、14体积%、15体积%，或者也可以为任意两个上述值的任意中间值。

乙酸酯的含量可以为60mg/L、61mg/L、62mg/L、63mg/L、64mg/L、65mg/L、66mg/L、67mg/L、68mg/L、69mg/L、70mg/L、71mg/L、72mg/L、73mg/L、74mg/L、75mg/L，或者也可以为任意两个上述值的任意中间值。

乙酯的含量可以为20mg/L、21mg/L、22mg/L、23mg/L、24mg/L、25mg/L、26mg/L、27mg/L、28mg/L、29mg/L、30mg/L，或者也可以为任意两个上述值的任意中间值。

酵母多糖的含量可以为300mg/L、310mg/L、320mg/L、330mg/L、340mg/L、350mg/L、360mg/L、370mg/L、380mg/L、390mg/L、400mg/L，或者也可以为任意两个上述值的任意中间值。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。应当能够理解的是，以下实施例仅用于示例性地进一步解释和说明本发明的内容，而不用于限制本发明。

以下实施例中用作对比菌株的商业菌株D254购自法国Laffort公司。未进行说明的情况下，采用的试剂和材料均为购自正规化学或生物用品供应商，试剂纯度均为分析纯。

以下实施例中采用的培养基配制方法如下：

YPD培养基：

酵母提取物10g/1000mL，葡萄糖20g/1000mL，蛋白胨20g/1000mL。按照上述用量称取试剂，溶于去离子水中，无需调节pH，即得液体YPD培养基。按照1.5g/1000mL的比例在液体YPD培养基中加入琼脂，即得固体YPD培养基。将获得的培养基121℃高压灭菌15min，冷却后备用。

将灭菌后的固体YPD培养基冷却至不烫手（约45-50℃），倒入平板培养皿中，冷却凝固后即得YPD培养平板。

WL营养琼脂培养基：

酵母浸粉4g/1000mL，氯化铁0.0025g/1000mL，葡萄糖50g/1000mL，硫酸锰0.0025g/1000mL，氯化钾0.425g/1000mL，溴甲酚绿0.022g/1000mL，氯化钙0.125g/1000mL，硫酸镁0.125g/1000mL，酸水解酪蛋白5g/1000mL，磷酸二氢钾0.55g/1000mL。按照上述用量称取试剂，溶于去离子水中，调节pH至5.5±0.2，即得液体WL培养基。按照20g/1000mL的比例在液体WL培养基中加入琼脂，即得固体WL培养基。将获得的培养基121℃高压灭菌15min，冷却后备用。

将灭菌后的固体WL培养基冷却至不烫手（约45-50℃），倒入平板培养皿中，冷却凝固后即得WL培养平板。

以下实施例中采用的龙眼葡萄果浆和龙眼葡萄汁的制备方法如下：

龙眼葡萄果浆：

将未灭菌的龙眼葡萄破碎后，所得的包含葡萄皮、籽、汁的混合物即为龙眼葡萄果浆。

龙眼葡萄汁：将龙眼葡萄果浆中的葡萄籽和葡萄皮去除后即得龙眼葡萄汁。经检测，其中的还原糖含量（以葡萄糖计）为170.02±5.25g/L；总酸含量（以酒石酸计）为7.05±0.63g/L。

实施例1

本实施例用于说明酿酒酵母CGMCC No.28280的获得和保藏。

（一）菌株筛选和鉴定

使用怀涿盆地产区的龙眼葡萄汁进行实验室小试发酵，将未杀菌的龙眼葡萄果浆加入发酵容器中，18℃恒温发酵。在发酵过程中检测还原糖含量，根据还原糖的消耗量，在发酵不同阶段进行取样。对样品进行梯度稀释后涂布于WL培养基平板上，待葡萄酒酵母长出后，从中挑选出长势较好且具有明显特征的菌株，进行菌落形态以及分子生物学鉴定（5.8S-rDNA ITS方法），并使用酶标仪从14株酿酒酵母中快速筛选获得3株具有较好的产酵母多糖能力的酿酒酵母，进一步通过小试发酵试验从中筛选获得1株高产多糖的酿酒酵母，编号为BC60725（简称为60725）。

该菌株经过形态学观察、5.8S-ITS rDNA基因扩增测序，对所有鉴定结果综合分析。具体鉴定结果如下：

（1）形态学观察方法和结果：经过48h培养，菌株60725在YPD培养平板上生长的菌落为圆形、乳白色、有光泽，边缘整齐（具体可参考图1）。

（2）ITS鉴定：取菌株总DNA，采用真菌ITS rDNA通用引物，按照表1的PCR体系和扩增程序进行ITS rDNA扩增。

表1

将PCR产物送至生工生物工程（上海）有限公司完成测序。ITS rDNA测序结果与NCBI中数据比对，菌株60725与Saccharomyces cerevisiae具有100%的同源性，结合生理生化鉴定结果，综合认定为酿酒酵母。

（二）菌株保藏

于2023年8月29日，将上述筛选获得的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）BC60725保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.28280。

实施例2

本实施例用于说明酿酒酵母CGMCC No.28280的抗胁迫能力。

（1）菌株接种评价

将菌株60725单菌落接种于无菌YPD液体培养基的96孔板中，30℃，200 rpm进行过夜培养活化。然后采用如下方法对该菌株的抗胁迫能力进行检测。

pH抑制评价：将96孔板中活化的菌株以3%的接种量分别转接至pH 1.5、pH 2、pH2.5、pH 3、pH 3.5、pH 4、pH 4.5、pH 5的YPD培养基中进行pH抑制率实验，30℃、200rpm过夜培养后，酶标仪测OD_600nm值，绘制酿酒酵母的pH抑制率曲线。

二氧化硫耐受能力：将96孔板中活化的菌株以3%的接种量转接至分别含150mg/L、200mg/L、250mg/L、300mg/L、350mg/L二氧化硫浓度的YPD培养基中进行二氧化硫浓度抑制率实验，30℃、200rpm过夜培养后，酶标仪测OD_600nm值，绘制酿酒酵母的二氧化硫浓度抑制率曲线。

温度抑制评价：将96孔板中活化的菌株以3%的接种量转接至YPD培养基中进行温度抑制率实验，10℃、13℃、18℃、32℃、40℃、200rpm过夜培养后，酶标仪测OD_600nm值，绘制酿酒酵母的温度抑制率曲线。

（2）评价结果

图2A-2C中分别示出了菌株60725的pH抑制率曲线、二氧化硫抑制率曲线和温度抑制率曲线。

从图中可以看出，60725可在pH 1.5，350mg/L二氧化硫的条件下正常生长发酵。该菌株还可在温度较低的条件下（例如10℃）启动发酵，保证葡萄酒的正常酿造生产，使用该菌株进行葡萄酒酿造时，对于温度条件的要求较为宽泛，也更适合酿造不同风格的葡萄酒。

实施例3

本实施例用于说明酿酒酵母CGMCC No.28280的产多糖能力。

初筛：向无菌96孔板中加入灭菌后的YPD液体培养基，分别接种入实施例1中所述的14株候选菌株和1株商业酵母D254，30℃下培养48小时后离心，取30μL上清液至另一块96孔板中，并加入30μL的5%苯酚溶液和150μL浓硫酸震荡混合均匀，25℃下反应30 min后，于490 nm处检测吸光度。检测结果详见表2，吸光度越高表明该菌株多糖产量多高，由表中数据可以看出，候选菌株中有3株酿酒酵母的吸光值检测结果明显高于商业酵母，分别为60721、60725和60732。将筛选获得的多糖产量较高的三株酿酒酵母在-80℃冻存备用。

复筛：将保存于-80℃的60721、60725、60732菌株以及商业菌株D254分别在YPD固体和液体培养基上传代，从YPD平板上挑取菌株分别接入装有100mL已灭菌液体YPD培养基的三角瓶中，摇床（180rpm，30℃）培养24h，作为待接种的活化种子液。同时使用商业酿酒酵母D254作为对照。按10⁶CFU/mL接种于龙眼葡萄汁中（500 mL锥形瓶），以发酵栓液封，14℃条件下静置培养10-14 d，至最终糖含量＜4g/L或酵母停止生长时终止发酵。使用苯酚-硫酸法检测发酵结束后葡萄酒中的多糖含量（结果详见表3），筛选出可以高产多糖的酿酒酵母60725。进一步检测60725发酵液中的多糖成分，以甘露聚糖和葡聚糖为主。

表2 14株候选菌株的产多糖能力

表3 3株初筛候选菌株的产多糖能力

实施例4

本实施例用于说明酿酒酵母CGMCC No.28280的发酵效果和产香性能。

采用灭菌龙眼葡萄汁对实施例3筛选得到的高产酵母多糖的酿酒酵母60725进行小试发酵实验，对其发酵效果及产香性能进行验证，具体方法如下：

将酿酒酵母60725和商购菌株D254分别在YPD培养平板上传代，并从YPD培养平板上挑取单菌落分别接入装有100 mL已灭菌液体YPD液体培养基的三角瓶中，摇床（180 rpm，30℃）培养24h，作为种子液。

按照106CFU/mL的接种量，将种子液接种于300mL灭菌的龙眼葡萄汁中（500 mL锥形瓶），以发酵栓液封，18℃条件下静置培养10-14天（至最终糖含量＜4g/L终止发酵）。

按照下述方法检测葡萄酒的酿造特性：

多糖：苯酚-硫酸法；

乙醇、果糖、葡萄糖、甘油、乙酸、柠檬酸、苹果酸、琥珀酸：液相色谱法（GB/T15038-2006）；

酯类、高级醇、有机酸等挥发性香气物质含量：用Agilent 6890气相色谱（GC）和Agilent 5975质谱（MS）联用仪（Agilent，美国）检测上述获得的酿造葡萄酒中各种挥发性香气物质种类和含量。具体条件包括：毛细管柱HP-INNOWAX Polyethylene Glycol 60 m×0.25 mm×0.25 μm（J&W scientific，美国）载气为高纯氦气，流速1 mL/min；顶空固相微萃取手动进样，采用不分流模式，插入气相色谱的进样口，进样口温度250℃，热解析25 min。柱温箱的升温程序是：40℃保持5 min，然后以3℃/min的速度升温至200℃，保持2 min。质谱接口温度为280℃，离子源温度为230℃，电离方式EI，离子能量70 ev，质量扫描范围20-450 amu。

表4和表5中分别示出了60725和商业菌株D254采用龙眼葡萄汁酿造的葡萄酒样的理化指标和挥发性香气物质的检测结果。

表4 测试菌株发酵后葡萄酒样的理化指标

发酵结束时，60725获得的小试葡萄酒最终糖度为3.21g/L，可以完成发酵（<4g/L）。多糖含量356mg/L，显著高于商业酵母（238mg/L）。

表5 测试菌株发酵后葡萄酒样中挥发性香气物质检测结果

由60725所酿造得到的葡萄酒香气成分（表5）可知，该酵母的乙酸酯类物质和乙酯类物质产量显著高于商业酵母，其中乙酯类物质总量达到商业菌株的1.9倍。辛酸乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯等明显高于商业对照，可提升葡萄酒的果香、花香等风味特征，提高香气复杂性，改善葡萄酒的风味品质。

实施例5

本实施例用于说明酿酒酵母CGMCC No.28280的葡萄酒发酵效果和产香性能。

采用100L发酵罐，对菌株60725和商业酵母D254在中试水平采用龙眼葡萄汁发酵获得的葡萄酒的感官评价结果进行比较，同时使用D254加60725酵母多糖以及D254加商业酵母多糖（购自法国拉曼公司）进行发酵进行对比。

具体方法如下：将保存于-80℃的60725和商业酿酒酵母D254分别在YPD固体和液体培养基上传代，从YPD平板上挑取菌株分别接入装有100 mL已灭菌液体YPD培养基的三角瓶中，摇床（180 rpm，30℃）培养24 h，作为待接种的活化种子液。按106CFU/mL的接种量接种于10L龙眼葡萄汁中，静置24h，回温后得到活化好的种子液。将活化好的种子液加入100L发酵罐中进行发酵，60725酵母多糖组和商业酵母多糖组在发酵原料中分别另外添加0.02wt%的酵母多糖，发酵结束（还原糖浓度<4 g/L）后取样进行感官评价。

邀请十名均为来自企业的国家级葡萄酒品酒师针对以上方法获得的发酵酿造酒样进行了专业的专家感官品评，评价结果具有较高的权威性和合理性。各位品评人员对所试酒样给出的评分（取平均值）结果见表6及图3。

表6 100L发酵葡萄酒感官评定评分结果（专家盲评）

从感官评定评分结果看出，60725菌株所酿造的龙眼干白葡萄酒具有更高的浓郁度、优雅细腻度和酒体醇厚感，并显著提升了葡萄酒的香气复杂性，表现出了良好的酿酒潜力。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims

1. 一株酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），其特征在于，所述酿酒酵母的保藏编号为CGMCC No.28280。

2.权利要求1所述的酿酒酵母在制备酵母多糖中的应用，所述酵母多糖包括甘露聚糖和葡聚糖，制备酵母多糖采用的培养基包括YPD培养基和/或龙眼葡萄汁。

3.权利要求1所述的酿酒酵母在葡萄酒酿造中的应用。

4.权利要求1所述的酿酒酵母在改善葡萄酒口感中的应用，所述葡萄酒选自龙眼干白葡萄酒。

5.一种酿造葡萄酒的方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求1所述的酿酒酵母接种至葡萄汁和/或葡萄果浆中，在酿酒条件下进行发酵，获得葡萄酒，其中，所述方法不包括添加外源酵母多糖的操作。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述葡萄汁和/或葡萄果浆中，还原糖含量为100-500g/L，总酸含量为1-15g/L。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其中，用于制备所述葡萄汁和/或葡萄果浆的葡萄品种选自龙眼、马瑟兰、赤霞珠、梅鹿辄、品丽珠、西拉、黑比诺、丹菲特、长相思、贵人香和霞多丽中的至少一种；

所述酿酒酵母的接种量为10⁵-10¹⁰CFU/mL；

所述酿酒条件包括：发酵温度10-40℃。

8.根据权利要求5所述的方法，其中，所述葡萄汁和/或葡萄果浆中还包括果胶酶、单宁、氮源和橡木制品中的至少一种。