CN113667611B - 耐热克鲁维酵母菌株及其应用 - Google Patents

耐热克鲁维酵母菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及耐热克鲁维酵母菌株及其应用。该酿酒菌株的保藏编号为CGMCC No.21713或CGMCC No.21714，分类命名为耐热克鲁维酵母(Lachancea thermotolerans)。实验结果表明，该菌株具有在不同发酵基质下稳定高产乳酸且能够提升葡萄酒挥发性香气的能力。在酿造干红葡萄酒及桃红葡萄酒种中，将该酵母菌株与酿酒酵母混合发酵可增加葡萄酒酸度、降低酒样的pH、提高葡萄酒甘油含量并提高乳酸乙酯、丁酸乙酯及苯乙醇的含量，赋予葡萄酒更多的花香，增加葡萄酒香气的复杂度。本发明提供的酵母菌株发酵能力强、发酵性能优良，在提升葡萄酒酸度及品质应用中具有重要价值。

Description

耐热克鲁维酵母菌株及其应用
本申请要求于2021年07月13日提交中国专利局、申请号为202110812227.6、发明名称为“耐热克鲁维酵母菌株及其应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及耐热克鲁维酵母菌株及其应用。
背景技术
葡萄酒的酿造是一个复杂的、动态的、多种微生物综合作用的过程。其中，起主导作用的微生物是酿酒酵母(Saccharomyces cevevisiae)，它们具有较强的发酵及定殖能力，在发酵过程中能将糖转化成为酒精。而非酿酒酵母是一类发酵能力相对较弱的酵母，主要在酒精发酵的前期起作用。近年来不少研究显示，一些非酿酒酵母在将一部分糖转化为酒精的同时，也能通过其他一些复杂的生化反应生成甘油、高级醇、醛及酯等物质，增加葡萄酒的风味。因此，将酿酒酵母与非酿酒酵母混合接种发酵以增加葡萄酒独特风味，生产高品质葡萄酒，满足消费者对复杂风味的需求而受到越来越多的关注。
近年来，受众多因素的影响，我国西部葡萄酒产区葡萄原料糖分过高酸度过低的现象愈发突出，这不仅使得葡萄酒在口感上失去平衡，而且也容易导致微生物的污染。为了解决这一问题，目前较为普遍的增酸方法包括物理增酸、化学增酸及生物增酸三类。化学方法主要通过添加酒石酸调节葡萄酒的酸度，但可能会引起酒石沉淀，进而对葡萄酒产生复杂影响，而且添加量受到法律的严格限制。物理增酸的方法是采用离子交换法，但其价格较为昂贵。而利用产酸非酿酒酵母发酵产生的乳酸口感柔和，性质稳定，不易被微生物利用，这样的优点也使得生物增酸成为研究的热点。
在众多非酿酒酵母的相关研究中，我们发现耐热克鲁维酵母在提高葡萄酒的酸度、降低pH的同时，也能够增加葡萄酒的香气。在酿酒特性方面，它有着较强的发酵能力且对酒精、SO2耐受性较高，在生物酸化葡萄酒的应用中具有极大潜力。但同样可以发现，由于耐热克鲁维酵母受地理起源影响较大，菌株的基因型及表型存在特异性，在目前的研究中，即使同一菌株使用不同的发酵策略和发酵条件，其最终酿造结果可能也会出现较大的差异。因此如何进行本土非酿酒酵母资源的开发利用及本土优良耐热克鲁维酵母的筛选和选育非常重要。这对于解决我国西部地区葡萄酒酸度不足的问题和提高我国葡萄酒的风土特征具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供能够在不同发酵基质下稳定高产乳酸、发酵能力强、产甘油含量高、产挥发酸含量低、且能够提升葡萄酒挥发性香气的酵母菌株。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了酵母菌株，其保藏编号为CGMCC No.21713或CGMCC No.21714。
基于上述研究，本发明还提供了混合菌株，包括所述酵母菌株和酿酒酵母。
本发明还提供了活性干酵母，由所述的酵母菌株制得。
此外，本发明还提供了用于果酒发酵的组合物，包括所述酵母菌株、所述的混合菌株或所述的活性干酵母。
更重要的是，本发明还提供了所述酵母菌株、所述的混合菌株、所述的活性干酵母或所述的组合物在果酒发酵中的应用；作为优选，所述果酒包括葡萄酒；更优选的，所述葡萄酒包括干红葡萄酒、干白葡萄酒或桃红葡萄酒中的一种或多种。
本发明还提供了所述酵母菌株、所述的混合菌株、所述的活性干酵母或所述的组合物增强果酒的香气、增加果酒的酸度、降低果酒的pH或提高果酒中甘油的含量中的一种或多种的用途。
在本发明的一些具体实施方案中，所述增强果酒的香气包括提高香气的复杂性和/或提高香气的浓郁度。
在本发明的一些具体实施方案中，所述增强果酒的香气包括提高果酒中酯类香气，具体包括：提高乳酸乙酯、丁酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、壬酸乙酯、癸酸乙酯、己酸乙酯、丁二酸二乙酯、乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯、乙酸庚酯、辛酸异戊酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸异丁酯、乙酸香叶酯、乙酸己酯、棕榈酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、乳酸异戊酯的含量；提高果酒中部分高级醇类香气，具体包括：苯乙醇、1-壬醇、α-松油醇、香叶醇、里那醇、2,3-丁二醇及其他物质含量，包括：提高辛酸、壬酮、壬醛、正辛醛的含量，或提高果酒中花色苷的含量中的一种或多种。
本发明还提供了果酒的发酵方法，取所述酵母菌株、所述的混合菌株、所述的活性干酵母或所述的组合物与原料混合发酵；作为优选，所述果酒包括葡萄酒；更优选的，所述葡萄酒包括干红葡萄酒、干白葡萄酒或桃红葡萄酒中的一种或多种。
在本发明的一些具体实施方案中，所述原料包括赤霞珠葡萄醪、赤霞珠葡萄汁、北冰红葡萄汁、小芒森葡萄汁或霞多丽葡萄汁中的一种或多种。
本发明还提供了所述的发酵方法制得的果酒。
本发明提供的酿酒菌株的保藏编号为CGMCC No.21713或CGMCC No.21714，分类命名为耐热克鲁维酵母(Lachancea thermotolerans)。实验结果表明，该菌株具有在不同发酵基质下稳定高产乳酸且能够提升葡萄酒挥发性香气的能力。在酿造干红葡萄酒及桃红葡萄酒种中，将该酵母菌株与酿酒酵母混合发酵可增加葡萄酒酸度、降低酒样中的pH、提高葡萄酒甘油含量并提高乳酸乙酯及苯乙醇的含量，赋予葡萄酒更多的花香，增加葡萄酒香气的复杂度。本发明提供的酵母菌株发酵能力强、发酵性能优良，在提升葡萄酒酸度及品质应用中具有重要价值。
生物保藏说明
菌株CEC NA38，简称A38；保藏日期为2021年01月25日，保藏编号为CGMCCNo.21713，分类命名为耐热克鲁维酵母(Lachancea thermotolerans)，保藏单位名称为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏中心地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；
菌株CEC NR52，简称R52；保藏日期为2021年01月25日，保藏编号为CGMCCNo.21714，分类命名为耐热克鲁维酵母(Lachancea thermotolerans)，保藏单位名称为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1(A)为菌株A38的生长形态图；图1(B)为菌株R的生长形态图；
图2为菌株A38、R52发酵干红葡萄酒过程中菌落数变化图；
图3为菌株A38、R52发酵干红葡萄酒样中香气分类数据图；
图4为菌株A38在模拟汁及赤霞珠葡萄汁发酵过程中OD变化图；
图5为菌株A38在模拟汁及赤霞珠葡萄汁发酵过程中乳酸变化图；
图6为菌株A38与酿酒酵母不同接种时间发酵桃红葡萄酒过程中A38菌落数变化图；其中，实线表示的是非酿酒酵母，虚线表示的是酿酒酵母；
图7为菌株A38与酿酒酵母不同接种时间发酵桃红葡萄酒过程中pH变化图；
图8为菌株A38与酿酒酵母不同接种时间发酵桃红葡萄酒过程中可滴定酸变化图；
图9为菌株A38与酿酒酵母不同接种时间发酵桃红葡萄酒过程中乳酸变化图；
图10为菌株A38与酿酒酵母不同接种时间发酵桃红葡萄酒样的香气雷达图；
图11为菌株A38、R52与酿酒酵母混合发酵桃红葡萄酒过程中菌落数变化图；
图12为菌株A38、R52与酿酒酵母混合发酵桃红葡萄酒过程中可滴定酸变化图；
图13为菌株A38、R52与酿酒酵母混合发酵桃红葡萄酒过程中pH变化图；
图14为菌株A38、R52与酿酒酵母混合发酵桃红葡萄酒过程中乳酸变化图；
图15为菌株A38、R52与酿酒酵母混合发酵桃红葡萄酒样的香气雷达图；
图16为菌株R52发酵石榴酒的主要香气类型雷达图。
具体实施方式
本发明公开了耐热克鲁维酵母菌株及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明从贵人香葡萄汁自然发酵过程中筛选得到了非酿酒酵母。酵母菌株A38，其保藏编号为CGMCC No.21713；酵母菌株R52，其保藏编号为CGMCC No.21714；两个菌株的分类命名为耐热克鲁维酵母(Lachancea thermotolerans)。保藏日期为2021年01月25日，保藏单位名称为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
本发明还提供一种上述菌株在降低葡萄酒pH的应用，上述菌株与酿酒酵母混合发酵葡萄原料。具体地，所述葡萄酒为干红葡萄酒、干白葡萄酒或桃红葡萄酒。
本发明还提供一种在不同葡萄汁中稳定增加乳酸产量的方法，将上述菌株与酿酒酵母混合发酵葡萄原料。具体地，原料为赤霞珠葡萄汁、北冰红葡萄汁、小芒森葡萄汁及霞多丽葡萄汁。
本发明还提供一种增强葡萄酒香气的方法，取上述酵母菌株与其他酵母菌株混合发酵葡萄原料。具体地，发酵原料为赤霞珠葡萄醪、赤霞珠葡萄汁或石榴汁。
本发明还提供一种提高葡萄酒甘油产量的方法，取上述的菌株与其他酵母菌株混合发酵葡萄原料。具体地，发酵原料为赤霞珠葡萄醪、赤霞珠葡萄汁或石榴汁。
本发明提供的Lachancea thermotolerans A38在生理特性研究中显示，菌株A38可以在14％(v/v)的酒精度、SO2含量为300mg/L、含糖量为250g/L的环境中生长。
本发明提供的菌株A38在混合发酵干红葡萄酒的研究中显示，在L.thermotolerans与S.cerevisiae顺序间隔48h接种的发酵中，可以发现在发酵前期，L.thermotolerans能够维持一定的生物量，但在接入S.cerevisiae之后，L.thermotolerans的生物量迅速降低，直到最终发酵结束依然达104cfu/mL之上。发酵结束后，各发酵组酒样的乙醇、甘油、可滴定酸、挥发酸及部分有机酸含量存在显著差异。其中LT组的可滴定酸显著高于SC对照组3.84％-4.92％，说明L.thermotolerans能够增加最终葡萄酒中的酸度。在乳酸方面，不同处理组的乳酸含量在0.22g/L-0.5g/L，其中LT A38及LTR52发酵组的乳酸产量高于SC组。香气方面，L.thermotolerans能够降低高级醇及脂肪酸的含量，同时能够增加酒样中的乙酯及烯萜类化合物，增加2-苯乙醇、正辛醛、β-大马士酮及β-紫罗兰酮等香气物质，提高香气的复杂性和浓郁度。
本发明提供的菌株A38在发酵过程中乳酸积累规律的探究中显示，L.thermotolerans主要在发酵前期(约2-4天)生成乳酸，发酵后期乳酸含量保持稳定。乳酸、酯类香气、正辛醛等物质不受发酵基质的影响，而主要与不同的酵母菌株有关，这表明L.thermotolerans A38在生成乳酸及酯类香气方面的能力更为显著。因此，认为本土L.thermotolerans A38具有酿造增酸葡萄酒的应用潜力。
本发明提供的菌株A38发酵干白葡萄酒的研究显示，菌株A38发酵的酒样中最终的总酸及乳酸含量最高，是酿酒酵母对照组的9.1倍，能够有效提高酒样中的酸度，改善低酸葡萄酒的口感。
本发明提供的菌株A38在不同发酵基质中发酵实验的研究显示，在不同培养基条件下，酵母A38产生的乳酸显著高于商业耐热克鲁维酵母及酿酒酵母对照，即使在仅消耗了80g/L糖的MS300培养基中，依然能产生0.59g/L的乳酸。而在北冰红葡萄汁中，A38发酵产生的乳酸能达到2.34g/L，这表明酵母A38产乳酸的能力在不同培养基条件下依旧是稳定的，能够适应多种不同环境的发酵基质，具有较高的生产意义。而在可滴定酸方面，除了在MS300培养基中，A38在葡萄汁中发酵的酒样中可滴定酸与对照组有显著差异，表明酵母A38在生物增酸方面具有较高潜力，在不同发酵基质中均能够提高酒样中的酸度。本发明提供的菌株A38在不同发酵基质中的乳酸产量探究的研究显示，菌株A38在不同培养基条件下拥有稳定的产乳酸能力，能够适应不同的环境，对在葡萄酒中的实际应用具有积极意义。
本发明提供的菌株A38在不同接种时间酿造桃红葡萄酒实验的研究显示，在实际生产中，接种酿酒酵母时间越晚，乳酸产量越高。且酵母A38产生的乳酸显著高于其他各发酵组，其中A38 72h的乳酸浓度最终达到4.13g/L。且72h接种的酒样中的甘油最高，同时能有效降低葡萄酒中的pH，增加酸度。72h接种的酒样的外观、香气及总分数是实验组中最高的，感官特征主要带有以樱桃、草莓、醋栗为主的红色水果香气，还含有一定的杏、玫瑰香气。这一现象表明，推迟酿酒酵母接种的时间对于耐热克鲁维酵母生成乳酸、增加葡萄酒酸度和香气复杂程度具有积极意义。
本发明提供的菌株A38在酿造桃红葡萄酒实验的研究显示，菌株A38能显著增加发酵后的甘油产量，同时有效降低了酒样中的pH及增加了酸度，同时其口感质量分数也同样高于对照组，尤其是在口感的得分上，口感细腻优雅，柔和饱满，协调纯正，带给品鉴人极为愉悦的感受。通过有关香气特征的MF值雷达图，可以直观感受到A38酒样在樱桃、草莓、玫瑰、香草、蜂蜜等香气上都是4个酒样中最纯正浓郁的。
综上所述，本发明提供的菌株A38能够在不同发酵基质下稳定高产乳酸且能够提升葡萄酒挥发性香气的酵母菌株。在酿造干白葡萄酒及桃红葡萄酒种中，将该酵母菌株与酿酒酵母混合发酵可增加葡萄酒酸度、降低酒样中的pH、提高葡萄酒甘油含量并提高乳酸乙酯及苯乙醇的含量，赋予葡萄酒更多的花香，增加葡萄酒香气的复杂度。本发明提供的酵母菌株发酵能力强、发酵性能优良，在提升葡萄酒酸度及品质应用中具有重要价值。
本发明提供的Lachancea thermotolerans R52在生理特性研究中显示，菌株R52可以在14％(v/v)的酒精度、SO2含量为300mg/L、含糖量为250g/L的环境中生长。菌株R52的乳酸产量比酿酒酵母高2.57倍，能够有效提高酒样中的酸度及口感。
本发明提供的菌株R52在混合发酵干红葡萄酒的研究中显示，在L.thermotolerans与S.cerevisiae顺序间隔48h接种的发酵中，酵母R52具备一定的定殖能力，发酵结束后依然保持104cfu/mL。发酵结束后，LT R52的可滴定酸显著高于SC对照组，琥珀酸和挥发酸含量分别显著低于SC组，说明R52能够增加最终葡萄酒中的酸度并降低琥珀酸和挥发酸的含量。在乳酸方面，LT R52发酵组的乳酸产量高于SC组，且花色苷含量最高。香气方面，LT R52能够降低高级醇及脂肪酸的含量，同时能够增加酒样中的乙酯及烯萜类化合物，增加2-苯乙醇、正辛醛、β-大马士酮及β-紫罗兰酮等香气物质，提高香气的复杂性和浓郁度。
本发明提供的菌株R52发酵干白葡萄酒的研究显示，菌株R52具有较好的发酵能力，能发酵产生接近9％的乙醇，与酿酒酵母对照没有显著差异，但其残糖量显著高于酿酒酵母对照。菌株R52甘油产量在实验组中为最高，能显著提高甘油产量。同时，R52菌株发酵的酒样中最终的总酸及乳酸含量显著高于酿酒酵母对照组，能够有效提高酒样中的酸度及口感。
本发明提供的菌株R52在酿造桃红葡萄酒实验的研究显示，R52在发酵后期定殖能力比CT10更好。尤其是R52实验组，当其余两株菌种的生物量已经降至1×103cfu/mL以下时，R52仍能保持1×104cfu/mL左右的生物量，具有较高的活力，能能够为葡萄酒带来更多风味。同时R52实验组的可滴定酸最高时达到了8.75g/L，各发酵组中最高的。同样,该组的pH值也远低于对照组。同时R52实验组的产乳酸速率和产量都是4组实验中最高的，能达到3.25g/L。菌株R52能显著增加发酵后的甘油产量，同时有效降低了酒样中的pH及增加了酸度，R52酒样无论从外观、香气还是口感上都高于其他3个酒样，整体质量最好。通过计算香气特征的MF值，能明显看出R52酒样的香气主要是以樱桃、草莓、李子为主的红色水果香气和洋槐、玫瑰花、蜂蜜香气，除这些外，它还有浓郁的以杏为主的核果香气，这与其他三组酒样极为不同，香气复杂浓郁的同时，其整体质量还能保持在最好，极为难得。
本发明提供的菌株R52在在不同发酵基质中的乳酸产量探究的研究显示，菌株R52在不同培养基条件下拥有稳定的产乳酸能力，能够适应不同的环境，对在葡萄酒中的实际应用具有积极意义。
综上所述，本发明提供的菌株R52能够在不同发酵基质下稳定高产乳酸且能够提升葡萄酒挥发性香气的酵母菌株。在酿造干红葡萄酒及桃红葡萄酒种中，将该酵母菌株与酿酒酵母混合发酵可增加葡萄酒酸度、降低酒样中的pH、提高葡萄酒甘油含量并提高乳酸乙酯及苯乙醇的含量，赋予葡萄酒更多的花香，增加葡萄酒香气的复杂度。本发明提供的酵母菌株发酵能力强、发酵性能优良，在提升葡萄酒酸度及品质应用中具有重要价值。
本发明提供的耐热克鲁维酵母菌株及其应用中，所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1耐热克鲁维酵母(Lachancea thermotolerans)生理特性
1.1菌株来源
耐热克鲁维酵母菌株A38和R52均分离自甘肃祁连酒厂葡萄酒自然发酵过程中，属于我国本土酵母，其在WLN培养基上的生长形态图如图1所示，其中，图1(A)为菌株A38的生长形态图，图1(B)为菌株R52的生长形态图。
1.2实验内容与方法
1.2.1乙醇耐受性
在试管中加入5mL YPD培养基，灭菌后分别加入无水乙醇调整乙醇浓度为6％、8％、10％、12％和14％(v/v)，按2％接种量接入活化菌株，28℃，150rpm培养，设3组重复，48h后测定OD600。
1.2.2正交试验测定糖、SO2和pH耐受性
如表1所示确定3个因素的水平，在试管中加入5mL YPD培养基，参照表2，用葡萄糖调整初始糖浓度，用亚硫酸调整SO2浓度，用磷酸-柠檬酸缓冲液调整pH，按2％接种量接入活化菌株，28℃，150rpm培养，设3组重复，48h后测定OD600。
表1试验自变量因素水平表
表2正交试验设计表
1.3结果与分析
1.3.1乙醇耐受性
由表3可以看出，菌株A38和R52随着乙醇含量的增加，OD600不断下降。当乙醇浓度大于10％(v/v)时，L.thermotolerans的生长受到严重抑制，其中菌株A38在8％(v/v)-12％(v/v)的乙醇浓度下耐受性比R52略高。
表3 R52与A38的乙醇耐受性
乙醇浓度 R52 A38
6％ 1.25 1.23
8％ 0.74 0.89
10％ 0.21 0.28
12％ 0.18 0.19
14％ 0.17 0.18
1.3.2糖、SO2和pH耐受性
根据极差数R的大小(表4)，判断各因素对实验结果的影响大小。对于A38及R52来说，3个因素对生长影响大小顺序依次为pH＞SO2＞糖含量。
对于菌株A38，pH对其生长的影响远远大于糖含量和SO2浓度，糖含量的变化对其生长几乎无影响，而当培养基的pH小于3.4和SO2达到200mg/L后，其生长受到了极大的抑制。所以当糖含量在250g/L，pH为3.8，SO2浓度为100mg/L时，其生长最旺盛。
对于菌株R52，SO2和pH对其生长的影响显著，糖含量对其生长影响较小，但随着糖含量的上升，其生长状况整体呈上升趋势，而当pH小于3.4，SO2达到200mg/L后，对其生长造成了极大的影响，几乎停止生长。当糖含量在250g/L，pH为3.8，SO2浓度为100mg/L时，其生长最旺盛。
表4正交试验极差(R)分析
实施例2 L.thermotolerans发酵特性研究及其在增酸发酵中的应用
2.1试验方法
对上述耐热克鲁维酵母A38及R52采用Triple M模拟汁进行发酵特性研究，TripleM模拟汁的配方为：ergo stock：12.5mL Tween80，37.5mL 95％乙醇，0.125g麦角固醇，溶液A：375mL去离子水中加125g葡萄糖，125g果糖，4mL ergo stock，溶解后加入去离子水补充到500mL；溶液B：250mL去离子水中加6g L(+)酒石酸，3g L(-)苹果酸，0.5g柠檬酸；溶液C：250mL去离子水中加入1.7g YNB，2g酸水解酪蛋白，6mg肌醇，0.2g无水氯化钙，L-精氨酸0.8g，L-脯氨酸1g/L，DL-色氨酸0.1g/L，磷酸铵1g。A、B、C混合后，用4mol/L氢氧化钾调pH至3.25，0.22μm滤膜过滤除菌，现配现用。
活化好的菌株以106cells/mL的接种量接种到20mL除菌过滤后的模拟汁中，模拟汁初始含糖量为250g/L，pH3.5。在28℃，150rpm的条件下进行发酵，每个菌设置三组平行。每天称重以测定其CO2失重量，当连续三天失重量均在0.1g以下，则发酵结束。对发酵结束的样品进行取样，离心、取上清液，测定残糖、pH、总酸，高效液相色谱测定有机酸、甘油及乙醇含量。
2.2实验结果
2.2.1基本理化指标
表5为发酵结束后检测的主要理化指标。从该表中可以看出，A38在残糖含量上与R52有显著差异。发酵结束后菌株A38及R52能明显增加发酵液中的总酸，并降低其挥发酸。其中A38总酸略高，二者挥发酸无显著差异。两株酵母菌在发酵产生酒度上没有显著差异，均能达到7％以上。此外，菌株A38同样有效降低了pH，使得发酵液中的酸度有明显提升。在甘油方面，酵母A38能够产生高达7.02g/L的甘油，比酿酒酵母高出1.65倍。
表5模拟汁发酵主要理化指标
对发酵液中有机酸进行检测，发现A38和R52在柠檬酸、酒石酸、苹果酸、丙酮酸及琥珀酸的产量上没有显著差异。但在乳酸的产量上存在显著差异，其中A38乳酸产量最高，达到0.64g/L，是酿酒酵母的9.14倍。R52乳酸产量较A38略低，但其产量依旧比酿酒酵母高2.57倍。
表6模拟汁发酵有机酸指标
实施例3 L.thermotolerans和S.cerevisiae混合发酵对干红葡萄酒质量的影响
3.1实验内容与方法
将L.thermotolerans A38与S.cerevisiae NX11424进行混合发酵葡萄汁，其中酿酒酵母NX11424保存于西北农林科技大学微生物菌株保藏室，葡萄品种：宁夏银川赤霞珠葡萄，初始含糖量239g/L，可滴定酸含量6.56g/L(以酒石酸计)，pH 3.55。
按照干红葡萄酒生产工艺，将采收的赤霞珠葡萄果实除梗破碎后装入1L发酵罐中，仅加入60mg/L SO2进行杀菌处理。将扩培的L.thermotolerans菌液以1x106CFU/mL的接种量分别接种于葡萄醪中(分别命名为LT CT10、LT A38及LT R52)，48h后将S.cerevisiae菌液分别接种到上述4个实验组中进行混合菌种发酵(接种后S.cerevisiae初始菌体数量为106CFU/mL)；实验以S.cerevisiae单一发酵作为对照(初始菌体数量为106CFU/mL)。接种后于25℃控温发酵，每组处理重复3次。发酵过程中每8h进行压帽，每24h取样测定还原糖含量以监控发酵过程，同时滴定总酸的变化，待还原糖含量≤4g/L且不再降低时加入50mg/LSO2终止发酵。
理化指标检测：发酵结束后参照GB/T15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》测定残糖、乙醇体积分数、总酸、pH和挥发酸等葡萄酒基本理化指标。色度、单宁、总酚等指标参照文献(李运奎等,2017；苏鹏飞,2016；吴澎等,2018)进行检测。
有机酸及甘油检测：高效液相色谱法，色谱条件：色谱柱：Bio Rad 87H+(300mm×7.8mm，9μm)；检测器：二极管阵列检测器；流动相：0.005mol/L硫酸水溶液；流速0.6mL/min；柱温：55℃；进样量：5μL；检测波长：210nm。
花色苷测定：pH示差法进行检测。
挥发性成分的检测：采用SPME-GC/MS法。质谱结果利用计算机谱库(NIST14)并结合文献进行各挥发性物质的定性，采用外标法定量。
3.2实验结果与分析
3.2.1发酵过程中活菌数变化
发酵过程中五个阶段的L.thermotolerans与S.cerevisiae活菌数变化如图2所示，可以看出，整个发酵过程中，所有菌株的菌落数都是呈现先上升后下降的趋势，在ST2阶段增殖数达到最大，后缓慢下降，这可能是由于在发酵48h后(约至ST2阶段)在葡萄醪中加入S.cerevisiae。其中，混合发酵组中菌株R52及A38的最大增值量约为106cfu/mL。结果表明，L.thermotolerans在葡萄酒酿造过程中始终具有一定的定殖能力，与S.cerevisiae混合能够完成发酵。
3.2.2发酵结束后酒样理化指标及有机酸含量
由表7可以看出，顺序接种后，混合发酵组的乙醇体积分数比SC组略高，有显著差异，这说明L.thermotolerans与S.cerevisiae混合发酵时，其乙醇发酵能力高于S.cerevisiae单独接种发酵。其中LT R52发酵组的酒度高于LT A38组。甘油是酵母在酒精发酵过程中最主要的副产物之一，能够显著改善葡萄酒的酒体与丰满度，实验结果表明，LTA38发酵产生的甘油产量较SC对照组有显著增加，为1.03g/L；LT R52发酵产生的甘油产量较SC对照组有显著增加，为0.41g/L，这表明L.thermotolerans能在一定程度上增加发酵体系中的甘油，对葡萄酒的品质有积极影响。而在可滴定酸及pH方面，LT A38的可滴定酸含量最高，显著高于SC发酵组0.41g/L，pH也最显著低于其他各实验组，为3.42；LT R52发酵组的pH显著低于SC组0.09。
表7发酵结束后酒样的基本理化指标
在有机酸方面，可以发现LT A38组的乳酸质量浓度显著高于其他各组，LT R52组的乳酸质量浓度有一定的提高，乳酸能在增加葡萄酒酸度的同时使葡萄酒的口感更润滑，从而提高葡萄酒的质量。挥发酸含量是判断葡萄酒健康状态或腐败情况的重要指标，GB/T15037—2006要求挥发酸不能高于1.2g/L，可以看出，LT R52及LT A38发酵组与对照组相比挥发酸质量浓度显分别低了0.25及0.29g/L。
3.2.3酒样颜色分析
颜色是评价葡萄酒质量的重要指标之一，而葡萄酒的颜色主要取决于酒中花色苷的含量和构成。表8展示了发酵结束后酒样的总花色苷含量及CIELAB参数，可以看出，各组酒样的总花色苷含量具有显著差异，其中LT A38组的总花色苷含量显著高于商业对照LTCT10。LT R52组的总花色苷含量最高，为246.62mg/L，显著高于商业对照LT CT10及SC对照组。整体来看，LT R52酒样总花色苷含量最高，能够提高酒样花色苷含量。
表8发酵结束后酒样CIELAB参数分析
3.2.4香气分析
对发酵结束后的酒样进行挥发性香气成分分析，共检测到88种物质，包括37种酯类化合物、18种高级醇、25种醛酮萜烯类物质，8种脂肪酸类物质。图3为这四类物质的总含量图，与SC对照组相比，各处理组间香气物质组成种类没有显著差异，但物质含量存在显著差异。
为进一步探究不同混合发方式对葡萄酒具体香气组分的影响，本研究对提取出的挥发性香气化合物进行了定性和定量分析，将发酵样品中OAV>1的呈香化合物其及含量整理成表9。
表9酒精发酵结束酒样中挥发性香气物质的含量(μg/L)
酯类物质通过酵母代谢及酒中的酯化反应产生，为葡萄酒的果香和花香做出贡献。可以发现，LT A38及LT R52实验组中的酯类物质总量显著高于SC对照组。其中LT R52实验组中的酯类物质总量比SC对照组酒样高出58.35％，乳酸乙酯的产量显著高于其他实验组，能赋予葡萄酒特殊的乳香及奶油香气。
高级醇主要来自于发酵过程中的糖代谢和氨基酸转化，但当高级醇超过400mg/L时，则会给葡萄酒带来刺鼻味。本实验中与SC组相比，其他处理组的高级醇含量均显著降低，LT A38组的高级醇降低了67.88％，说明L.thermotolerans能降低葡萄酒发酵过程中的高级醇含量。苯乙醇是一种令人愉悦的具有玫瑰、紫罗兰香气的挥发性物质，能为葡萄酒带来愉悦香气。相比SC对照组，LT R52实验组产生的的苯乙醇含量显著上升16％，对葡萄酒品质的提升有积极作用。
脂肪酸类化合物属于酵母发酵过程中的代谢副产物，脂肪酸含量较低时为葡萄酒增加奶酪、奶油及脂肪风味，同时也能抑制对应芳香酯的水解，但含量过高时会导致葡萄酒出现刺激、腐败等不良风味。本实验中各LT实验组的总脂肪酸含量显著低于SC对照组7.55％-30.59％，说明L.thermotolerans能够在一定程度上减少葡萄酒出现酸腐等不良风味的风险。
萜烯类化合物感官阈值低，能够赋予葡萄酒浓郁的品种香气特征，是麝香型葡萄及其葡萄酒的典型香气成分本实验中LT实验组的总醛酮萜烯类物质的含量平均高出SC对照组11.16％。正辛醛、β-大马士酮及β-紫罗兰酮三种物质对葡萄酒奶油、蜂蜜及花香类香气贡献较大。
实施例4 L.thermotolerans A38发酵过程中乳酸积累规律
4.1材料与方法
实验材料：陕西省合阳县赤霞珠葡萄汁，还原糖182.04g/L，可滴定酸6.01g/L，YAN为204.4mg/L。MS300模拟汁：还原糖设置为180g/L(赤霞珠葡萄汁含糖量)，有机酸5.5g/L(酒石酸3g/L，苹果酸2g/L，柠檬酸0.5g/L)，其他微量元素及氨基酸按照正常量设置。试剂盒：LDH活性检测试剂盒及蛋白试剂盒均购于Solarbio试剂公司。
实验组设计：将准备好的菌株A38及CT10母液分别接入MS300模拟汁及赤霞珠葡萄汁中，每实验组设置三个平行，25℃静置发酵，每24h取样，对发酵过程中酵母细胞数进行计算，并检测发酵体系中酵母的OD值。同时监测过程中的糖、有机酸产量及LDH酶活。
表10发酵实验组
理化指标和香气检测：同实施例3
4.2结果与分析
4.2.1发酵曲线
图4所示发酵过程中各组酵母的OD变化规律。可以看出在第6天时，所有发酵组的酵母细胞数量均达到最大值，之后逐渐下降，与OD变化基本一致。同时，在赤霞珠葡萄汁中，两组发酵的OD及细胞数量均远远高于其在MS300模拟汁中的表现，这表明酵母A38及CT10在葡萄汁中的生长情况更好，生长速率也更快。
4.2.2发酵过程中乳酸变化规律
图5展示了发酵过程中乳酸的变化。可以发现，即使在不同的发酵基质中，酵母A38的乳酸产量依然远高于商业菌株CT10的乳酸产量，其中A38的乳酸产量在1.0-1.2g/L，CT10的产量仅为0.15-0.30g/L。这表明不同L.thermotolerans的不同菌株生成乳酸的能力是稳定的，基本不受发酵基质的影响。在MS300培养基中，两株酵母的乳酸产量在第2天已经达到最大值，后期基本保持不变。而在赤霞珠葡萄汁中，菌株的乳酸在第2-4天仍有增加，这与其对糖的消耗速率是一致的，这说明在发酵前期是L.thermotolerans产生乳酸的时期，且在发酵后期乳酸基本不会被消耗。
4.2.3发酵结束后各项理化指标
由表11可以看出，发酵结束后，除乙醇外，不同酒样的理化指标均有显著差异。其中酵母CT10及A38发酵后样品中残糖、乙酸及柠檬酸这三种物质的产量在赤霞珠葡萄汁中显著低于在MS300培养基，而甘油、丙酮酸、苹果酸、酒石酸及琥珀酸这几种物质在赤霞珠葡萄汁中的产量显著高于MS300培养基，这表明不同发酵基质是影响上述几种物质生成的主要因素。而对于乳酸而言，酵母A38在两种发酵基质下比酵母CT10的产量高约6倍，这说明L.thermotolerans菌株的表型多样性是影响酒样中乳酸产生的主要因素。
表11发酵结束后酒样的基本理化指标
4.2.4香气分析
对发酵结束后的酒样进行挥发性香气成分分析，如表12所示。各处理组间香气物质组成种类没有显著差异，但物质含量存在显著差异。A38发酵产生的乙酯类香气较为突出，其酒样中的酯类物质总量显著高于CT10发酵组1.5-2.6倍。其中A38发酵组的乳酸乙酯产量显著高于CT10实验组，能赋予葡萄酒特殊的乳香及奶油香气。同时可以看到，影响高级醇的主要因素是不同的发酵基质，MS300发酵组酒样的高级醇显著低于赤霞珠葡萄汁发酵酒样33.45％-102％。本试验中所有实验组的高级醇含量均低于400mg/L，其中酵母A38发酵的酒样中高级醇略高于CT10，能为葡萄酒带来更加复杂的香气。本实验中CT10 CS组中的脂肪酸含量最高，其中己酸和辛酸较为显著，能为酒样带来柑橘玫瑰及奶酪的香气。
其他物质主要包括萜烯类化合物及羰基化合物。这类物质感官阈值低，能够赋予葡萄酒浓郁的品种香气特征。总体来看，这些物质在赤霞珠葡萄汁发酵组的总含量比MS300培养基高。但正辛醛在MS300培养基发酵组的含量高于其在赤霞珠葡萄汁发酵组约1.69-2.84倍，可能是由于MS300培养基的环境更适合酵母生成正辛醛。
表12发酵后酒样中的香气物质
实施例5 L.thermotolerans A38、R52发酵干白葡萄酒
5.1实验材料与方法
将霞多丽干白葡萄汁115℃灭菌5min。将活化好的菌株A38、R52以1×107cells/mL的接种量接种到30mL灭菌后的葡萄汁中，葡萄汁初始含糖量为191g/L，酸为7.75g/L，pH为3.47，YAN含量451mg/L。25℃静置发酵，每个菌设置三组平行。每天称重测定其CO2失重量以监控发酵进程。对发酵结束的样品进行取样，离心、取上清液，测定残糖、pH、总酸，高效液相色谱测定各有机酸及甘油产量。
5.2实验结果
5.2.1理化指标及有机酸
发酵结束后的酒样检测其有机酸、糖、pH等理化指标如表13所示。可以看到，菌株A38和R52具有较好的发酵能力，能发酵产生接近9％的乙醇，与酿酒酵母对照没有显著差异，但其残糖量显著高于酿酒酵母对照。
菌株A38能显著提高甘油产量。同时，菌株A38发酵的酒样中最终的总酸及乳酸含量最高，是酿酒酵母对照组的9.1倍，能够有效提高酒样中的酸度及口感。
菌株R52甘油产量在实验组中为最高，能显著提高甘油产量。同时，R52菌株发酵的酒样中最终的总酸及乳酸含量显著高于酿酒酵母对照组，能够有效提高酒样中的酸度及口感。
表13发酵结束后酒样理化指标
实施例6 A38在不同基质中的发酵实验
6.1实验材料与方法
将MS300模拟汁过滤除菌，小芒森葡萄汁、赤霞珠葡萄汁及北冰红葡萄汁在115℃灭菌5min。将活化好的菌株A38、CT10和NX11424以1×107cells/mL的接种量分别接种到30mL灭菌后的葡萄汁中，25℃静置发酵，每个菌设置三组平行，以NX11424为对照。每天称重测定其CO2失重量以监控发酵进程，每隔7天涂wln板。对发酵结束的样品进行取样，离心、取上清液，测定残糖、pH、总酸，高效液相色谱测定各有机酸及甘油产量。
6.2实验结果
对发酵结束后的酒样检测其有机酸、残糖、pH等理化指标，如表14。可以发现，在不同培养基条件下，酵母A38产生的乳酸显著高于商业耐热克鲁维酵母及酿酒酵母对照，即使在仅消耗了80g/L糖的MS300培养基中，依然能产生0.59g/L的乳酸。而在北冰红葡萄汁中，A38发酵产生的乳酸能达到2.34g/L，这表明酵母A38产乳酸的能力在不同培养基条件下依旧是稳定的，能够适应多种不同环境的发酵基质，具有较高的生产意义。
表14发酵后各培养基理化指标
实施例7 A38在不同接种时间酿造桃红葡萄酒实验
7.1实验材料与方法
实验设计如表15所示，研究不同接种时间对酒样酸度及香气的影响。
表15不同时间间隔接种试验设计
原料：赤霞珠葡萄汁，初始糖：247.2g/L，可滴定酸：5.42g/L，YAN：257.5mg/L，pH：3.7。
理化指标测定：发酵过程中，在1、2、3、4、5、6、7、9、12、15天取样100ml冻存，留样检测糖、pH、可滴定酸、有机酸、乙醇及甘油的含量。
7.2结果与分析
7.2.1发酵过程酵母菌落数的变化
图6所示酵母A38在发酵过程中菌落数的变化。可以看到，耐热克鲁维酵母的生物量在接种后旺盛期略有上升，但是在加入酿酒酵母后开始下降，且与酿酒酵母接种的时间间隔越长，耐热克鲁维酵母的生物量越高。在最终发酵末期仍有一定量的耐热克鲁维酵母能够存活。
7.2.2发酵过程中pH、可滴定酸及乳酸的变化
图7-8所示酵母在发酵过程中pH及可滴定酸的变化。可以发现，在发酵过程中，各组酒样的pH先降低后逐渐增加，与可滴定酸的变化呈现相反的趋势。由图可知，在发酵前3天，菌株A38发酵组的pH高于CT10发酵组，可滴定酸也低于CT10发酵组，但从发酵第三天起，菌株A38发酵组的pH开始低于CT10发酵组，且可滴定酸也开始高于CT10发酵组，这一趋势一直持续到发酵结束，最终酵母A38发酵组的酒样比酵母CT10发酵组的酒样pH低0.1-0.2，比初始葡萄汁降低约0.3，可滴定酸比CT10发酵酒样高约2g/L，比初始葡萄汁高3-4g/L。
发酵过程中乳酸变化如图9所示，可以看到，在整个发酵过程中乳酸整体呈现增长的趋势，各发酵组乳酸在前4天增长迅速，而A38 72h组在此之后仍在增加，最终达到4.13g/L。A38乳酸的整体产量高于CT10，其中接种酿酒酵母时间越晚，乳酸产量越高。而CT10组的乳酸产量最高也仅为1.5g/L左右。
7.2.3发酵结束后理化指标
发酵结束后理化指标如表16所示，可以发现，在两组发酵实验中，随着酿酒酵母接种时间的延长，最终酒样pH值越低。其中A38 72h酒样pH最低，为3.41，能够有效降低葡萄酒中的pH。而在可滴定酸方面，可以发现A38发酵组的可滴定酸高于CT10发酵组，在A38发酵组中，酿酒酵母接种时间越晚，其可滴定酸越高，在A38-72 h的酒样中可滴定酸能达到9.42g/L。而在CT10发酵组中其最终的可滴定酸差异较小。
在乳酸方面，可以发现，随着接种时间的延迟，发酵组的乳酸产量逐渐增加，其中A3872h的乳酸的产量最高，能够到达4.13g/L，显著高于其他各实验组。这一现象表明，推迟酿酒酵母接种的时间对于耐热克鲁维酵母生成乳酸、增加葡萄酒酸度具有积极意义。
表16发酵后理化指标
7.2.4感官品尝
表17展示了感官品尝的得分，图10展示出感官特征香气。可以发现6个酒样的香气主要是以红色水果香气为主，A38 72h的酒样外观和香气分数是实验组中最高的，总分也是整个实验中最高的，其观感特征主要带有以樱桃、草莓、醋栗为主的红色水果香气，还含有一定的杏、玫瑰香气。A38 48h的酒样中则含有较明显的蜂蜜、玫瑰、草莓、醋栗及香草香气。
表17感官品尝分数
实施例8 A38、R52发酵桃红葡萄酒
8.1实验材料与方法
实验设计如表18所示，设计菌株A38、R52与酿酒酵母在48h时顺序接种，探究不同酵母对酒样酸度及香气的影响。
表18不同时间间隔接种试验设计
原料：赤霞珠葡萄汁，初始糖：247.2g/L，可滴定酸：5.42g/L，YAN：257.5mg/L，pH：3.7。
理化指标测定：发酵过程中，在1、2、3、4、5、6、7、9、12、15天取样100ml冻存，留样检测糖、pH、可滴定酸、有机酸、乙醇及甘油。
8.2结果与分析
8.2.1发酵过程酵母菌落数的变化
对发酵过程中酵母活细胞数进行监测，结果如图11所示，可以看到，在起酵初期，4组实验组的酵母活细胞数量都在105-107cfu/mL之间，且都能保持增长状态直至发酵旺盛期，此时因为加入了酿酒酵母，3组耐热克鲁维酵母实验组的酵母活菌数不再增加。菌株R52的生长效果在三组中最好，最高峰时超过了1x107cfu/mL。随着发酵进行至中后期，3株耐热克鲁维的数量都有较快的下降，其中CT10下降速度最快，R52和A38在发酵后期定殖能力比CT10更好，尤其是R52实验组，当其余两株菌种的生物量已经降至1x103cfu/mL以下时，R52仍能保持1x104cfu/mL以上的生物量，具有较高的活力，能够为葡萄酒带来更多风味。
8.2.2发酵过程中pH、可滴定酸及乳酸的变化
在发酵进程中监控可滴定酸和pH的变化，结果如图12-13所示，在发酵的前5天，4组实验组可滴定酸的含量整体呈上升的趋势，并在第5天达到最大值，其中前4天酸的增长速度最快。随着发酵进行，可滴定酸含量有一定程度的下降并在发酵的第9、10天逐渐趋于平稳。
从发酵的第2天起至发酵结束，R52及A38实验组可滴定酸的含量都显著高于酿酒酵母实验组，其增酸能力明显高于商业酵母CT10，CT10实验组中发酵汁的可滴定酸含量最高时只达到7.25g/L，而R52和A38实验组最高时达到了8.75g/L，在可滴定酸含量趋于平稳后，R52实验组是含量最高的，A38实验组次之。同样，该两组的pH值也远低于CT10和NX11424实验组。
发酵过程中乳酸含量的变化如图14所示，整体乳酸含量随着发酵进行呈现上升趋势，NX11424实验组从第4天起才产生乳酸，而R52等3组实验组在发酵的前4天产乳酸速率最快，且之后仍能缓慢增长，而R52和A38实验组的产乳酸速率和产量都是本实验中相对较高的，最高的R52实验组的乳酸能达到3.25g/L，而CT10实验组乳酸产量最高仅有1.51g/L。
8.2.3发酵结束后理化指标
发酵结束后理化指标如表19所示，在4组发酵实验中，可以发现由于菌种的不同，其最终酒样的有机酸含量，尤其是乳酸也有很大的差异，其中R52实验组乳酸含量最高可以达到3.39g/L，显著高于其它各组，同样其pH也比其它各组低，说明其能够有效降低葡萄酒中的pH。在可滴定酸方面，R52与A38实验组的最终酒样可滴定酸含量明显高于CT10实验组。
表19发酵结束后酒样理化指标
8.2.4香气分析
对发酵结束后的酒样进行挥发性香气成分分析，与NX11424对照组相比，各处理组间香气物质组成种类没有显著差异，但物质含量存在显著差异。为进一步探究不同混合发方式对葡萄酒具体香气组分的影响，本研究对提取出的挥发性香气化合物进行了定性和定量分析，将发酵样品中OAV>0.1的呈香化合物其及含量见表20。
表20酒精发酵结束酒样中挥发性香气物质(OAV>0.1)的含量(μg/L)
可以发现，R52实验组中的丁酸乙酯、乳酸乙酯及乙酸异戊酯含量均高于其他实验组，且能够显著增加酒样中的2,3-丁二醇含量，为葡萄酒带来黄油香气。本实验中耐热克鲁维酵母R52在降低异戊酸的同时也能增加辛酸的产量，在降低酸腐风险的同时也能够增加葡萄酒中柑橘、玫瑰的香气。
8.2.5感官品尝
表21展示了4组酒样的感官品尝数据，A38酒样的外观和口感质量分数也同样高于同组的NX11424酒样和CT10酒样，尤其是在口感的得分上，口感细腻优雅，柔和饱满，协调纯正，带给品鉴人极为愉悦的感受。图15为酒样的感官特征香气雷达图，可见A38酒样在樱桃、草莓、玫瑰、香草、蜂蜜等香气上都是4个酒样中最纯正浓郁的。R52酒样无论从外观、香气还是口感上都高于其他3个酒样，整体质量最好。通过计算香气特征的MF值，能明显看出R52酒样的香气主要是以樱桃、草莓、李子为主的红色水果香气和洋槐、玫瑰花、蜂蜜香气，除这些外，它还有浓郁的以杏为主的核果香气，这与其他三组酒样极为不同，香气复杂浓郁的同时，其整体质量还能保持在最好，极为难得。
总体来看，4个酒样的香气主要是以樱桃、草莓的为主红色水果香气，A38酒样的口感得分也是最高的，相比较于对照酒样有着明显的优势。CT10酒样的口感和外观分数较低，NX11424酒样则是整体的感官质量分数在小组中最低。
表21酒样感官品尝得分
R52 NX114214 A38 CT10
外观 18.67±0.17 18.6±0.03 18.6±0.1 18.53±0.1
香气 32.96±0.1 32.53±0.53 32.38±0.61 32.83±0.04
口感 31.75±0.31 30.44±0.67 30.51±0.47 30.43±0.7
实施例9 A38、R52在不同培养基中的乳酸产量
9.1实验材料与方法
实验设计如表22所示，设计菌株A38、R52在不同pH及糖浓度下的发酵，探究在YPD及模拟汁中不同pH及糖浓度对酒样产乳酸的影响。
表22实验设计方案
试验条件：在28℃下，150rpm发酵20ml的模拟汁及YPD，每组设置3组平行。在第3，5，7，10天取样，每次取1ml用于测有机酸。结束后样品测总酸、pH、残糖。
9.2实验结果与分析
9.2.1不同培养基条件下有机酸产量
A38和R52有机酸产量如表23-24所示。可以发现对菌株A38来说，在模拟汁糖浓度为100g/L的培养基中，pH为3.5的时候乳酸产量最低。其他各培养基条件下的乳酸产量没有显著差异，且基本均高于1g/L。这表明菌株A38在不同培养基条件下拥有稳定的产乳酸能力，能够适应不同的环境，对在葡萄酒中的实际应用具有积极意义。对菌株R52来说，在YPD糖浓度为100g/L的培养基中，pH为5.6的时候乳酸产量最高，显著高于其他各培养基。当糖浓度为250g/L时，各培养基条件下的乳酸产量没有显著差异。这表明菌株R52在不同培养基条件下拥有稳定的产乳酸能力，能够适应不同的环境，对在葡萄酒中的实际应用具有积极意义。
表23不同培养基条件下菌株A38有机酸产量
表24不同培养基条件下菌株R52有机酸产量
实施例10 R52在发酵石榴果酒中的应用
10.1实验材料与方法
实验材料菌株及发酵条件如表25所示。
表25石榴酒酵母接种试验
原料：石榴汁，总糖138.35g/L，pH 4.53。
发酵条件：1L玻璃发酵罐置于20℃恒温箱内；添加S02数量均为60mg/L，果胶酶含量为30mg/L
发酵过程监控：每24h取样测定还原糖(DNS法)
发酵结束测定指标：酸度—中和滴定法、总糖—DNS法、还原糖测定—直接滴定法、pH值—pH计法、挥发酸—蒸馏滴定法、酒精度—密度瓶法
总花色苷含量：总单体花色苷的含量计算公式为C＝(A×MW×DF×1000)/(ε×1)。
多聚体花色苷含量占比：100μL 20％硫代硫酸钠溶液加入到1.4mL稀释的样品中。另一份样品用蒸馏水代替硫代硫酸钠溶液加入。15min平衡后，测量A420nm，A520nm和A700nm然后按公式计算：颜色深度color density(空白样品)＝[(A420nm-A700nm)+(A520nm-A700nm)]×DF
多聚体颜色polymeric color(漂白样品)＝[(A420nm-A700nm)+(A520nm-A700nm)]×DF
多聚体颜色占比polymeric color(％)＝(多聚体颜色/颜色深度)×100％
总酚含量：石榴酒中多酚类化合物与福林-肖卡试剂(福林酚)发生氧化还原反应，反应得到的蓝色混合物在750nm处有最大的吸光值，采用分光光度计进行吸光度值的测定，计算后得到福林-肖卡指数。
酒石酸酯及黄酮醇含量：样品酒石酸酯的测定参照Cliff(2007)的方法，略有修改。
黄烷醇含量：样品总黄烷醇的测定参照Li等(1996)的方法(p-DMACA-盐酸法)，稍作修改。
样品总黄烷醇的测定：石榴酒样品稀释4倍后，均取0.1mL加入至试管中。然后分别加3mL p-DMACA溶液，充分混匀并静置反应10min。在640nm波长下测定其吸光值，用蒸馏水替代样品做对照调零。均重复3次。结果以儿茶素当量值表示。
石榴酒感官质量的评定：前期，本课题组组建由10名葡萄酒专业的老师和学生组成的经过葡萄酒标准香气物质训练的品尝小组进行感官评定，品尝小组一次分析3款酒样，随机取组设计，共两轮，酒样于黑色郁金香杯盛放，室温20℃下进行，60min内完成。某一香气特征的最终量化强度值是综合品尝组对这一香气特征词汇的使用频率和强度平均值的信息，量化强度值按下列公式计算：
式中：M为量化强度值/％；I为强度平均值/％；F为使用频率/％。
10.2结果与分析
10.2.1石榴酒基本理化指标测定
选用的三株酵母按照工艺酿造出的石榴酒，对其进行基本理化分析，结果见表26。由表26知，发酵结束，R52与LFP524混合发酵组的pH降低值最多，约为1.04，,说明耐热克鲁维酵母R52具有增加石榴酒酸度的能力。
表26石榴果酒的基础理化指标
10.2.2风味理化指标分析
表27展示了石榴酒的风味理化指标。颜色是石榴酒质量的一项重要评价指标，而石榴酒的颜色主要取决于酒中花色苷的含量与构成。本研究利用pH示差法，对待测酒样在520nm、700nm处的吸收光谱进行测定。由表27可知，石榴酒总花色苷含量偏低，在49.57～76.52mg/L之间，且接种不同酵母所酿石榴酒的总花色苷含量具有显著性差异，LFP524纯种发酵组总花色苷含量最低，为49.57mg/L，单一添加非酿酒酵母与添加非酿酒酵母和酿酒酵母混菌发酵所得到的样品总花色苷含量相比于自然发酵所得酒样总花色苷含量明显较高，可见非酿酒酵母具有在发酵中保护果汁中花色苷的作用。随着石榴汁发酵过程的进行，石榴酒中的单体花色苷会与丙酮酸、苯乙烯、乙醛等发生聚合反应，生产颜色更加稳定的多聚体花色苷和吡喃花色苷等。由表27可见，不同接种方式所酿石榴酒的多聚体花色苷含量差异显著，其中R52与LFP524混菌发酵所得石榴酒多聚体花色苷比例最高，接种单一酿酒酵母LFP524的酒样多聚体花色苷比例最低。
R52纯种发酵组的总酚、酒石酸酯、黄酮醇及黄烷醇含量最高，表明耐热克鲁维酵母R52能够对石榴酒的各项风味起到积极作用。
表27石榴酒的风味理化指标
注：同列不同小写字母表示Ducan多重比较在P＜0.05差异显著。
10.2.3香气成分分析
对发酵结束后的酒样进行挥发性香气成分分析，与LFP524对照组相比，各处理组间香气物质组成种类没有显著差异，但物质含量存在显著差异。为进一步探究不同混合发方式对葡萄酒具体香气组分的影响，本研究对提取出的挥发性香气化合物进行了定性和定量分析，呈香化合物其及含量见表28。
表28酒精发酵结束酒样中挥发性香气物质的含量(单位：μg/L)
感官评定香气指标的雷达图分析
本试验感官品鉴小组根据不同处理方式所得3款酒样的感官进行评价，经过品鉴小组讨论共筛选出嗅觉感知明显、具有代表性的五种香气特征，分别为香蕉味、苦杏仁味、玫瑰花味、植物味、红樱桃味。计算各类香气特征的MF值，将各香气类型MF值以雷达图的形式进行呈现，如图16所示。从图中可以看出，LFP524纯种发酵的酒样中玫瑰花香气较为突出。这表明耐热克鲁维酵母R52对于石榴酒的香气具有积极影响。
表29展示了石榴酒的感官品尝各项得分，可以看到，其中R52纯种发酵组在香气的的各类指标中均为最高分，在口感的平衡性、协调性及整体感官中也均为最高分。这表明菌株R52能够明显提升石榴酒的品尝感官特征。
表29石榴酒感官品尝各项得分
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.酵母菌株，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No.21713或CGMCC No.21714。
2.混合菌株，其特征在于，包括如权利要求1所述酵母菌株和酿酒酵母。
3.活性干酵母，其特征在于，由如权利要求1所述的酵母菌株制得。
4.用于果酒发酵的组合物，其特征在于，包括如权利要求1所述酵母菌株、如权利要求2所述的混合菌株或如权利要求3所述的活性干酵母。
5.如权利要求1所述酵母菌株、如权利要求2所述的混合菌株、如权利要求3所述的活性干酵母或如权利要求4所述的组合物在果酒发酵中的应用。
6.如权利要求1所述酵母菌株、如权利要求2所述的混合菌株、如权利要求3所述的活性干酵母或如权利要求4所述的组合物在增强果酒的香气、增加果酒的酸度、降低果酒的pH或提高果酒中甘油的含量中的一种或多种的用途；
所述增强果酒的香气包括提高香气的复杂性和/或提高香气的浓郁度。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述增强果酒的香气包括提高果酒中乳酸乙酯的含量、提高果酒中己酸乙酯的含量、提高果酒中乙酸异戊酯的含量、提高果酒中2-甲基丁酸乙酯的含量、提高果酒中乙酸异丁酯的含量、提高果酒中乙酸己酯的含量或提高果酒中花色苷的含量中的一种或多种。
8.果酒的发酵方法，其特征在于，取如权利要求1所述酵母菌株、如权利要求2所述的混合菌株、如权利要求3所述的活性干酵母或如权利要求4所述的组合物与原料混合发酵。
9.如权利要求8所述的发酵方法制得的果酒。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101792719A (zh) * 2009-11-16 2010-08-04 中国农业大学 一株酿酒酵母及其在酿造葡萄酒中的应用
CN108624518A (zh) * 2018-05-15 2018-10-09 西北农林科技大学 酵母菌株及其应用
CN109929766A (zh) * 2019-03-27 2019-06-25 中国农业大学 一种克鲁维乳酸酵母cve-lt1及其在葡萄酒酿造中的应用
JP2019526228A (ja) * 2017-05-25 2019-09-19 チアンナン ユニヴァーシティ β−フェネチルアルコールを多収量に生成する酒醸造用酵母菌株及びその使用
CN112940952A (zh) * 2021-03-18 2021-06-11 北京工商大学 一株高产己酸乙酯酵母菌及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101792719A (zh) * 2009-11-16 2010-08-04 中国农业大学 一株酿酒酵母及其在酿造葡萄酒中的应用
JP2019526228A (ja) * 2017-05-25 2019-09-19 チアンナン ユニヴァーシティ β−フェネチルアルコールを多収量に生成する酒醸造用酵母菌株及びその使用
CN108624518A (zh) * 2018-05-15 2018-10-09 西北农林科技大学 酵母菌株及其应用
CN109929766A (zh) * 2019-03-27 2019-06-25 中国农业大学 一种克鲁维乳酸酵母cve-lt1及其在葡萄酒酿造中的应用
CN112940952A (zh) * 2021-03-18 2021-06-11 北京工商大学 一株高产己酸乙酯酵母菌及其应用

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