CN108410745B - 一株酿酒酵母及其在葡萄酒酿造中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及工业微生物技术领域，具体公开一株酿酒酵母及其在葡萄酒酿造中的应用。所述酿酒酵母为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)HLP4‑1 CGMCC No.15420。本发明提供的酿酒酵母抗逆性强，生长性能良好，不但具有优异的耐酸性和耐二氧化硫性能，还具有耐高糖，耐高温，耐高酒精，产酒精度高的优点，可广泛应用于中国产区各个特色葡萄品种的优质干白葡萄酒的酿制，且在干白葡萄酒的典型性方面，都显著优于商业菌株，说明筛选的菌株能体现产地葡萄酒的典型性，具备现实的应用价值。

Description

一株酿酒酵母及其在葡萄酒酿造中的应用
技术领域
本发明涉及工业微生物技术领域，尤其涉及一株酿酒酵母及其在葡萄酒酿造中的应用。
背景技术
酿酒酵母是葡萄酒工业发酵最主要的酵母菌。优质葡萄酒的生产迫切需要具有产区特征、能体现葡萄酒特色和风格的优良酵母菌种。葡萄酒的酿造主要是在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的作用下，采用自然发酵或者纯种发酵，将葡萄原料中的各种潜在品质和优势在酒中充分表现出来。酿造过程中，酿酒酵母性能的优劣对葡萄酒的形成至关重要，因为酵母的发酵特性不仅直接影响着葡萄酒的酒精积累和感官品质，同时也决定着发酵工艺流程和运转周期及费用。葡萄酒是极具个性的饮品，不同产区的酒风格特征各不相同，这种差异性也正是葡萄酒的魅力所在。而目前我国的葡萄酒产品同质化严重，很少有能够代表产地特色的优质产品，其中最突出的就是香气质量差、缺乏产区特征，这也成为制约我国葡萄和葡萄酒产业发展的主要因素之一。
在葡萄酒酿造过程中，为了保持原果汁风味，通常不进行杀菌，只通过向果汁中添加二氧化硫来抑制野生酵母菌及有害微生物的生长繁殖，以保证发酵作用的正常进行。二氧化硫可通过简单扩散进入酿酒酵母细胞内，在其细胞内转变为SO3 2-和HSO3 -的形式，降低酿酒酵母细胞内的pH，虽然酿酒酵母(S.cerevisiae)比多数野生酵母和细菌更耐二氧化硫，但二氧化硫浓度过高也会影响酿酒酵母的繁殖，引起发酵停滞或终止。发酵过程中的其他因素，如酒精度、糖度等因素也会影响酵母菌的繁殖，从而影响葡萄酒的品质。因此，选育出耐受性能优良的本土葡萄酒酿酒酵母对葡萄酒生产意义重大。
发明内容
针对现有酿酒酵母耐受性能较差以及葡萄酒产品的产区风格特征不明显，失去了应有的复杂香气和风味的问题，本发明提供一株酿酒酵母及其在干白葡萄酒酿造中的应用。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：
一株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)HLP4-1，其保藏编号为CGMCCNo.15420。
所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)HLP4-1，分类命名为Saccharomyces，已于2018年3月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，菌种保藏号为CGMCC No.15420，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
优选的，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)HLP4-1是由河北省张家口市怀来县葡萄产区的龙眼葡萄中筛选出来的。
从河北省张家口市怀来县葡萄产区的龙眼葡萄中筛选出来的酿酒酵母HLP4-1具有优异的耐酸性、耐二氧化硫性，还具有耐高糖，耐高温，耐高酒精，产酒精度高的优点。
本发明还提供了上述酿酒酵母在酿造葡萄酒中的应用，尤其是在酿造干白葡萄酒中的应用。
本发明提供的酿酒酵母可广泛应用于中国产区各葡萄品种的葡萄酒的酿制。在干白葡萄酒的典型性方面，都显著优于商业菌株，说明筛选的菌株能体现产地葡萄酒典型性，具备现实的应用价值。
本发明还提供了一种生产葡萄酒的方法，具体步骤如下：以破碎除梗压榨后的葡萄汁为原料，向所述原料中通入SO2至游离硫含量达到50～70mg/L，然后调节葡萄汁的糖浓度，得初始物料，将所述初始物料加入发酵罐中，然后加入所述酿酒酵母HLP4-1，混合均匀，在10～15℃进行发酵，发酵时间为2～3周，当残糖量≤4g/L时发酵结束。
优选的，将所述葡萄汁初始糖浓度调至180～220g/L。
糖度的高低直接影响到酵母菌的繁殖与转化功能，并最终影响到葡萄酒的品质。糖度过高会抑制酿酒酵母的生长繁殖，使发酵不彻底，残糖含量高，甚至会使发酵失败。糖度过低，则酒精度不够，严重影响酒的品质，并且在有氧的情况下，低酒精度不能抑制酵母菌的生长，则酵母菌大量的繁殖，最终导致酒质败坏。
优选的，所述酿酒酵母HLP4-1的接种量为0.8×106～1.2×106CFU/ml。
通过酿酒酵母的发酵产生一系列的代谢产物，可赋予葡萄酒令人愉悦的独特的风味，代谢产物中高级醇和高级酯类直接受酿酒酵母细胞的繁殖密度影响，优选的接种量可使葡萄酒中的风味物质高级醇和高级酯含量适当，且可以使葡萄酒具有适当的酒精度和发酵度，使得葡萄酒的口感更好。
附图说明
图1为HLP4-1在YPD营养琼脂上的菌落形态；
图2为26S rDNAD1/D2扩增片段电泳图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例所用培养基：
YPD培养基(1L)：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母浸粉10g，琼脂15g，水1000ml，自然pH值，121℃灭菌20min后待用。
WL培养基(1L)：酵母粉0.5％，胰蛋白胨0.5％，葡萄糖5％,琼脂2％，磷酸二氢钾0.055％，氯化钾0.0425％，氯化钙0.0125％，氯化铁0.00025％，硫酸镁0.0125％，硫酸锰0.00025％，溴甲酚绿0.0022％，pH值为6.5，121℃、高压灭菌20min后待用。
麦芽汁培养基：麦芽汁70mL，pH约6.4，115℃，高压灭菌20min后待用。
基本培养基：葡萄糖21％，酵母粉0.5％，pH值6.5，121℃灭菌20min后待用。
MSM培养基：购自山东拓普生物工程有限公司，货号：M4241D。
实施例1
1.出发菌株的选育
1.1果表酵母的分离
无菌称量10克张家口市怀来县成熟的龙眼葡萄，放入盛有90ml无菌水三角瓶，振荡培30分钟，制成菌悬液，吸取50μl放入YPD固体培养基，以无菌刮铲刮匀，25℃培养24～48h。
1.2自然发酵酵母的分离
无菌称量100g张家口市怀来县新鲜成熟度好的龙眼葡萄，放入无菌的500ml三角瓶，以无菌的研锤破碎，置于28℃培养，每隔24h取发酵液1ml，加入9ml无菌水中进行梯度稀释至10-7，取50μl稀释后菌液放入YPD固体培养基，以无菌刮铲刮匀，25℃培养24～48h。
2.酵母菌株的初筛
2.1酵母菌的无性繁殖与筛选
对1.1和1.2中YPD培养48h的酵母菌株，挑取培养基中长出的肉眼可见的真菌菌落，分别移入YPD固体平板培养基上，恒温培养、纯化直至得到单菌落后，以16×40倍显微镜镜检，筛选出以多端出芽繁殖的菌株89株。
2.2WL琼脂培养基筛选酿酒酵母
将2.1分离出来的酵母菌株，接种YPD液体培养基活化24h后接种到WL琼脂培养基，28℃培养5天后观察，筛选出菌落颜色为奶油色或浅黄色至绿色，表面为球形突起，光滑，不透明，奶油状的菌株65株。
2.3菌株发酵能力筛选
将WL培养基筛选出的菌株，接种到倒扣杜氏小管的麦芽汁培养基中，置于28℃恒温培养箱中进行液体静置培养，检测4h、6h、8h、10h的产气情况(以产气至杜氏小管体积计发酵力)筛选出10h内产气满管的菌株，得到30株菌。
2.4TTC显色实验
将上述得到的30株酿酒酵母菌体划线接种在TTC下层培养基上，菌落培养成型后，倒入灭菌的TTC上层培养基，于28℃培养箱中遮光孵育2～3h，进行显色反应。菌体的酒精产率越强，该菌落的红色色调越深，根据显色反应筛选出产酒精能力强的菌株，得到13株酿酒酵母。
3模拟酒精发酵复筛
3.1将上述得到的13株菌株接种到含糖20％的100ml YPD液体摇瓶培养基中，28℃培养96h，检测模拟酒精发酵后的CO2失重量(g)、酒精度(％vol)及产香情况，筛选出发酵后CO2失重量在10g以上，酒精度在9％以上，产香较好或浓郁的菌株，得到6株菌。
4复筛得到酵母菌株耐高糖、耐酒精、耐酸、耐SO2等抗逆性评价及最高产酒精度试验
4.1酵母菌株耐高糖评价
将模拟酒精发酵得到的6株菌同时接到含有700g/L葡萄糖的YPD液体试管培养基和固体平板培养基上，28℃培养，观察液体试管培养48h的产气情况及固体平板培养96h的菌株存活情况和菌落生长情况，筛选出上述条件下存活并产气、菌落生长良好且菌落较大的菌株。
4.2酵母菌株耐酒精评价
将模拟酒精发酵得到的6株菌同时接到YPD含有20％乙醇的液体试管培养基和20％乙醇的固体平板培养基上，28℃培养，观察液体试管培养48h的产气和存活情况及固体平板培养96h的菌落生长情况，筛选出上述条件下存活并产气、菌落生长良好且菌落较大的菌株。
4.3酵母菌株耐酸性评价
将模拟酒精发酵得到的6株菌同时接到pH值为2.0的YPD液体试管培养基中，28℃培养，观察液体试管培养48h的产气情况，筛选出上述条件下存活并产气高的菌株。
4.4耐SO2评价
将模拟酒精发酵得到的6株菌同时接到SO2添加量320mg/ml的基本培养基中。发酵用玻璃瓶以纱布封口，置于28℃恒温箱，静止培养3天。3天后测定发酵液残糖。筛选出上述条件下存活并残糖量少的菌株。
4.5耐KCl评价
将模拟酒精发酵得到的6株菌同时接到YPD含有3.0mol/L KCl的液体试管培养基和3.0mol/L KCl的固体平板培养基上，28℃培养，观察液体试管培养48h的产气和存活情况及固体平板培养96h的菌落生长情况，筛选出上述条件下存活并产气、菌落生长良好且菌落较大的菌株。
4.6菌株最高产酒精度试验
将模拟酒精发酵得到的6株菌接到120ml含20g/L糖度的含30％蔗糖西瓜汁发酵液中，28℃培养，检测发酵96h后的CO2失重量(g)、酒精度(％vol)及产香情况，筛选出发酵后产酒精度较高(13％以上)，产香较好或浓郁的菌株。
综合4.1，4.2，4.3，4.4，4.5,4.6优筛，得到3株菌。
5优筛菌株模拟葡萄汁培养基发酵筛选
把3株优筛菌株分别以1×106CFU/ml接种量接种于400ml模拟葡萄汁(Modelsysthetic medium，MSM)，25℃模拟发酵静置培养25d左右，检测发酵酒样的CO2失重量(g)、酒精度(％vol)、总酸(以酒石酸计，g/L)、挥发酸(以乙酸计，g/L)、总糖(g/L)、等基本理化指标，并作产香香气分析和简单感官评价，筛选出整体表现突出的菌株，得到酵母菌株HLP4-1。
实施例2
1.酵母菌株Saccharomyces cerevisiae HLP4-1的鉴定
(1)形态学鉴定
根据《常见细菌系统鉴定手册》中记载的实验内容和实验方法，对筛得的菌株进行鉴定，将菌株划线接种后，于28℃恒温培养24小时观察菌落形态。HLP4-1菌株在YPD培养基上的菌落呈圆形，奶油色，边缘整齐，乳状突起，表面光滑，不透明，如图1所示。在WL营养琼脂培养基上，菌落特征为奶油色带绿色、菌落球形突起、表面光滑、不透明、奶油状。
(2)赖氨酸培养基鉴定
酿酒酵母不能采用赖氨酸作为氮源，因而在该培养基上不能生长。将酵母菌株HLP4-1接种YPD液体培养基活化24h后，按照1％接种量接种到5ml无菌水中进行饥饿处理，7d后接种到赖氨酸培养基，28℃培养5d后观察没有酵母生长，继续培养和观察，直到15d后仍无菌落生长，说明该菌株是酿酒酵母。
(3)分子鉴定
将筛得的菌株进行26S rDNAD1/D2区PCR扩增鉴定。PCR扩增的引物对为NL-1(5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3')和NL-4(5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3')。PCR反应体系为：Taq DNA Polymerse Buffer(1×)，MgCl2 2.0mmol/L，dNTPs 40μmol/L，Taq酶1U，模板DNA60ng，引物各0.6μmol/L，加超纯水至50μl。反应程序为95℃5min；94℃1min；52℃1min；72℃1min20s，循环36次；72℃延伸8min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，将PCR条带大小约为580bp的PCR产物送上海生工生物技术有限公司测序后，将获得的序列输入GenBank，用Blast程序与数据库中的所有序列进行比较分析。酵母菌株HLP4-1 26SrDNAD1/D2区序列同源比对分析结果如下：
表1酵母菌株HLP4-1 26S rDNAD1/D2区序列同源比对分析结果
Figure BDA0001674166630000081
鉴定结果表明，酵母菌株HLP4-1为酿酒酵母。
以上鉴定结果表明，菌株HLP4-1为来自于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的一株新菌，将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.15420。
实施例3
酿酒酵母HLP4-1用于干白葡萄酒酿造
以张家口市怀来县多年生优质葡萄园为采样地点，进行葡萄果实、果浆样本的采集，以破碎除梗压榨后的龙眼葡萄汁为原料，同时按葡萄汁重量的50-60ppm加入SO2至游离硫含量达到60mg/L，将葡萄汁初始糖浓度调整至200g/L(含糖量较低时用蔗糖补充)，将已经处理好的葡萄汁加入发酵罐中，加入量占发酵罐80％。采用酿酒酵母HLP4-1为发酵剂，接种量是1×106CFU/ml，商业活性干酵母LAFASEX16作为对照，当酵母混合液添加进发酵容器后，要尽量使酵母液在发酵罐中混合均匀。在14℃进行发酵，发酵时间大约为2-3周，当残糖量≤4g/L时发酵结束。
(1)各菌株酿造葡萄酒的酒精度、挥发酸、总酸和甲醇浓度的比较
测定葡萄酒的总酸和甲醇的浓度，对葡萄酒的感官品质进行评定。总酸反映葡萄酒的酒体平衡，酸度越高则酒的品质越好。甲醇含量的高低显示发酵葡萄酒的安全性，表2显示，用菌株HLP4-1酿造的葡萄酒总酸含量高于对照商业酵母LAFASEX16，甲醇含量和对照无明显差异，菌株HLP4-1具有良好的发酵性能。
表2葡萄酒酒精度、挥发酸、总酸和甲醇含量测定
Figure BDA0001674166630000091
(2)各菌株酿造葡萄酒的酯类和高级醇含量的比较
酿酒酵母作为葡萄酒发酵过程中的主导菌株，对葡萄酒品质，特别是在其产地香气特征的表现上起着决定性作用。其中由酿酒酵母代谢产生的酯类化合物是葡萄酒果香的主要来源，且不同的酯类物质在香气感知时相互之间具有累加效应，故在一定阈值范围内酯类化合物浓度的增加可以增强人们对葡萄酒果香的感知，进而提高葡萄酒的特征香气。酯类物质和高级醇都对葡萄酒整体香气都有影响，对于葡萄酒来说过高的总醇会带来不好的口感，而高级酯类物质则使葡萄酒香气优雅悦人，回味美好。乳酸乙酯可以增强葡萄酒的浓厚感，乙酸乙酯具有果香味，辛酸乙酯有似白兰地的香气，己酸乙酯是具有曲香、菠萝香型的香气，苯乙醇具有柔和、愉快持久的玫瑰香气，这对提高葡萄酒的香气起到重要作用。
参照国标GB/T10345-200710，GB/T394.2-20089、10利用GC-MS检测技术对葡萄酒中主要香气成分进行了定量分析，如表3所示，菌株HLP4-1和对照菌株LAFASE X16乙酸乙酯含量无显著差异，菌株HLP4-1乳酸乙酯、辛酸乙酯、己酸乙酯和苯乙醇的含量均明显高于对照菌株LAFASE X16，而菌株HLP4-1总醇含量则显著低于对照菌株LAFASE X16，说明菌株HLP4-1能赋予葡萄酒更复杂的口感和味感，从而赋予葡萄酒更多的个性和特质。
表3葡萄酒主要香气成分的定量分析(mg/L)
Figure BDA0001674166630000101
(3)不同菌株酿造葡萄酒的感官评价
按照具体实施例3方法发酵结束后，参照GB15037-2006《葡萄酒》中对葡萄酒感官指标的规定，召集10名从事葡萄酒研究多年的专家组成，其中5名来自(具备二级以上(含二级)品酒师资格人员)张家口怀来县贵族庄园葡萄酒业有限公司，对发酵得到的葡萄酒进行感官品评，评审专家组给出的评分结果见表4所示,菌株HLP4-1和LAFASE X16感官评定分数分别为90.1和86.6，综合香气成分分析结果，本发明的酿酒酵母HLP4-1菌株比商业菌株LAFASE X16能更好的挖掘本土葡萄的特色，发挥其酿造潜力，使其酿造特性得到更好的展现，提高发酵酒的感官品质。
专家一致认为，酿酒酵母菌株HLP4-1酿造的干白葡萄酒新酒澄清度更好，口感柔和细腻，果香、酒香浓郁，酸甜感适中，挂壁感更好，风格独特，更能挖掘本土龙眼葡萄的的特色，符合优质干白葡萄酒的典型风格。
表4酵母菌HLP4-1和LAFASE X16发酵葡萄酒的感官评定
项目 HLP4-1 LAFASE X16
色泽 4.2a 4.3a
澄清度、起泡度 4.0a 4.3a
香气 25.1a 23.9b
滋味 38.8a 37.6b
典型性 18.0a 16.5b
总分 90.1 86.6
注：小写字母表示在0.05水平上具有差异显著性。
由上述结果可以看出，本发明筛选出的保藏号为CGMCC No.15420的菌株具有良好的耐酸、耐二氧化硫性能，用其酿造的葡萄酒具有本土地域生化特性，能产生更突出丰富的地域香气成分，对于酿造特色优质干白葡萄酒具有重要意义。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure BDA0001674166630000121
Figure BDA0001674166630000131
SEQUENCE LISTING
<110> 河北省科学院生物研究所
<120> 一株酿酒酵母及其在葡萄酒酿造中的应用
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 590
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gcggaggaaa agaaaccaac cgggattgcc ttagtaacgg cgagtgaagc ggcaaaagct 60
caaatttgaa atctggtacc ttcggtgccc gagttgtaat ttggagaggg caactttggg 120
gccgttcctt gtctatgttc cttggaacag gacgtcatag agggtgagaa tcccgtgtgg 180
cgaggagtgc ggttctttgt aaagtgcctt cgaagagtcg agttgtttgg gaatgcagct 240
ctaagtgggt ggtaaattcc atctaaagct aaatattggc gagagaccga tagcgaacaa 300
gtacagtgat ggaaagatga aaagaacttt gaaaagagag tgaaaaagta cgtgaaattg 360
ttgaaaggga agggcatttg atcagacatg gtgttttgtg ccctctgctc cttgtgggta 420
ggggaatctc gcatttcact gggccagcat cagttttggt ggcaggataa atccatagga 480
atgtagcttg cctcggtaag tattatagcc tgtgggaata ctgccagctg ggactgagga 540
ctgcgacgta agtcaaggat gctggcataa tggttatatg ccgcccgtct 590

Claims (6)

1.一株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)HLP4-1，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No.15420。
2.如权利要求1所述的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)HLP4-1在酿造葡萄酒中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述葡萄酒为干白葡萄酒。
4.一种生产葡萄酒的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)HLP4-1发酵葡萄原料得到葡萄酒，具体步骤如下：以破碎除梗压榨后的葡萄汁为原料，向所述原料中通入SO2至游离硫含量达到50～70mg/L，然后调节葡萄汁的糖浓度，得初始物料，将所述初始物料加入发酵罐中，然后加入所述酿酒酵母HLP4-1，混合均匀，在10～15℃进行发酵，发酵时间为2～3周，当残糖量≤4g/L时发酵结束。
5.如权利要求4所述的生产葡萄酒的方法，其特征在于，将所述葡萄汁的糖浓度调至180～220g/L。
6.如权利要求4所述的生产葡萄酒的方法，其特征在于，所述酿酒酵母HLP4-1的接种量为0.8×106～1.2×106CFU/ml。
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