CN110029070B

CN110029070B - 土著酿酒酵母菌株、筛选方法及应用

Info

Publication number: CN110029070B
Application number: CN201910445992.1A
Authority: CN
Inventors: 宋文军; 郝亚波; 张洁; 谭燕; 牛国焕; 韩冰; 吴敏
Original assignee: Liaoning Shichuang Technology Development Co ltd; Tianjin University of Commerce
Current assignee: Liaoning Shichuang Technology Development Co ltd; Tianjin University of Commerce
Priority date: 2019-05-27
Filing date: 2019-05-27
Publication date: 2021-09-21
Anticipated expiration: 2039-05-27
Also published as: CN110029070A

Abstract

一种土著酿酒酵母菌株、筛选方法及应用，是从鸭绿江流域的北冰红葡萄果皮及生长土壤中筛选出适合酿造北冰红冰葡萄酒的耐低温、耐高糖的菌株，其菌落表面光滑，边缘整齐，乳白色，突起，细胞多为较大圆形或卵圆形。经测序鉴定为酵母菌。本菌株耐糖性优于商业酵母LB 13%，在糖浓度500 g/L、pH 3.0～4.0、温度10℃～12℃时生长良好，受酒精、SO₂影响相对较小。在糖浓度360 g/L的冰葡萄汁中发酵结束后，酒精度含量为13.5%vol，残糖量含量为130 g/L，感官品评协调，符合冰酒生产工艺要求。本菌株丰富了我国本土特色的葡萄酒酵母菌群的丰度。

Description

土著酿酒酵母菌株、筛选方法及应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，更具体的说是涉及一种土著酿酒酵母菌株、筛选方法及在冰葡萄酒中的应用。

背景技术

冰酒是我国从国外引进的一种新型葡萄酒，冰酒被公认为是酒中的佳酿，不仅仅是因为其葡萄产区所处的地理环境有严格的规定，也是因为在冰酒的整个发酵过程中，发酵周期长、生产工艺复杂、生产上受环境条件影响较大等等。由于酿造冰酒所使用的原料具有高糖、高酸两大特性，以及需要在低温条件下完成整个发酵工艺过程，因此，在实际工业生产中所用的酿酒酵母需要能适应这些环境，才能酿造出高品质的葡萄酒体。

目前，我国冰酒的发酵工艺条件正处于初步探索时期，尚不成熟。酿酒酵母菌，别名为面包酵母或出芽酵母，是一种与实际生活联系较为紧密的真核生物。酵母菌是酿酒工业中应用最广泛的有益微生物种类之一，在冰酒酿制过程中扮演重要的角色。经过细胞自身进行的生理代谢活动，酵母细胞会将绝大部分糖类物质消耗掉并生成酒精和CO₂，同时生成甘油、高级醇类、酯、醛等多种代谢副产物，这些代谢产物在很大程度上决定了冰葡萄酒的整体品质，如酒体的色度、香气成分及口味感觉。

冰酒酒体的品质是通过细胞发酵作用将酿造原料中的各种潜在成分体现出来。酵母菌在相当大的比例上对葡萄酒的产量、整体品质及对发酵过程中的生产管理起到重要的作用，此外，酵母细胞对酒体的整体风味和特色物质的生成过程中扮演着十分重要的角色。

目前，国内有三种途径来获得品质优良的酵母菌种：一是依赖于国外进口引进的商业酵母；二是从当地土著酵母中进行分离筛选；三是对目前已有的优良酵母菌种作进一步的基因改良。若使用进口的商业酵母菌种作为生产菌种，由于国内与国外的葡萄品种、地理环境和生产工艺条件等的差异，并不能使当地酿造出的冰葡萄酒完全地表现出其独有的特色，失去了该葡萄品种所酿造出的冰葡萄酒中所应有的内涵。因此，其自身价值也无法与国际上某些高品质的冰酒相提并论。

发明内容

为了丰富我国本土特色的葡萄酒酵母菌群的丰度，为解决当前多数国产冰葡萄酒风格和口味单一问题，本发明通过葡萄种植园中的葡萄以及土壤中筛选出具有既耐低温又耐高糖的优良品质的葡萄酒酵母，通过对其进行各种基本性能的测定，对其进行详细的了解，来指导冰葡萄酒的酿造，有助于其在冰葡萄酒实际发酵过程工艺的调整与优化，本发明提供的土著酿酒酵母菌株是耐低温、耐高糖，适合酿造的鸭绿江流域北冰红冰葡萄酒菌株。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种土著酿酒酵母菌株，其特征在于：菌株拉丁名为：Saccharomyces cerevisiae，保藏在：CGMCC，保藏号为：16036。

一种土著酿酒酵母菌株的筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）、取北冰红葡萄的果皮及其生长土壤分别加入装有YPD培养基的250 mL三角瓶中，放入18 ℃恒温培养箱进行富集培养，培养48 h之后，待培养基变浑浊，长出菌种，取上层浑浊溶液进行酵母菌的复筛；

（2）、采用平板分离方法，取1mLYPD富集培养液加入到9mL无菌的生理盐水中进行梯度稀释，分别稀释成10^-1到10^-6不同的浓度，吸取浓度梯度为10^-4到10^-6的菌液各0.05mL涂布到虎红固体分离培养基中，利用三区划线法进行涂布，18℃培养48h；

（3）、挑选长势良好的酵母菌转移到蔗糖乳酸培养基中进行扩大培养。

所述蔗糖乳酸培养基：

乳酸 5.0mL

蔗糖 50.0g

酵母粉 10.0g

氯霉素 0.01 g·ml^-1

NaCL 5.0g

H₂O 1.0L

pH值5.4，高温高压灭菌，121 ℃，20 min。

所述的土著酿酒酵母菌株用于冰葡萄酒的发酵。

附图说明

图1是酵母菌菌落形态图，G①为酵母菌菌落，H②酵母菌菌落，B④酵母菌菌落，LB酵母菌菌落。

图2是酵母菌显微镜形态图，G①酵母菌显微镜形态，H②酵母菌显微镜形态，B④酵母菌显微镜形态，LB酵母菌菌落。

图3是菌株的耐渗透压性能分析图。

图4是菌株的温度性能分析图。

图5是菌株的耐酒精性能分析图。

图6是菌株的耐SO₂性能分析图。

图7是菌株的耐pH性能分析图。

本发明的优点和有益效果是：

1、土著酿酒酵母菌株其耐糖性优于商业酵母 LB 13%，其在糖浓度 500g/L、pH3.0～4.0、温度 10℃～12℃时生长良好，受酒精、SO₂影响相对较小。

2、在糖浓度 360g/L 的冰葡萄汁中发酵结束后，酒精度含量为 13.5 %vol，残糖量含量为 130g/L，感官品评协调，符合冰酒生产的工艺要求。

3、本菌株丰富了我国本土特色的葡萄酒酵母菌群的丰度，解决当前多数国产冰葡萄酒风格和口味单一问题。

具体实施方式：

本申请实施例所用YPD富集培养液：是指酵母浸出粉胨葡萄糖培养基配制成液体培养基，菌种在YPD培养基中富集培养之后的菌液。

虎红固体分离培养基指虎红琼脂培养基，也叫做孟加拉红培养基，用于菌种的分离。

实施例1：

一种土著酵母菌株，具有耐低温、耐高糖，菌株拉丁名为：Saccharomycescerevisiae，已于2019年3月28日保藏于：CGMCC，保藏号为：16036。

实施例2：

本实施例所用葡萄品种为“北冰红”，生长在鸭绿江流域，它是酿造冰葡萄酒的山葡萄品种。其果实含糖量高，总酸和单宁适中，克服了以往山葡萄品种糖度低、酸度高的缺点，为酿造优质的冰葡萄酒提供了原料基础。通过从北冰红葡萄的果皮及其生长土壤中筛选出耐低温、耐高糖的冰葡萄酒酿酒酵母菌株，并对其进行生理生化、遗传及发酵性能的研究，进一步为生产本土特色的冰葡萄酒提供依据。

（1）土著酵母菌株的筛选

取样本葡萄以及土壤分别加入装有YPD培养基的250mL三角瓶中分别编号,然后放入18 ℃恒温培养箱进行富集培养，培养48 h之后，待培养基变浑浊，长出菌种，然后取上层浑浊溶液进行酵母菌的复筛；

采用平板分离方法，取1 mLYPD富集的培养液加入到9 mL无菌的生理盐水中进行梯度稀释，分别稀释成10^-1到10^-6不同的浓度，吸取浓度梯度为10^-4到10^-6的菌液各0.05mL涂布到虎红固体分离培养基中，利用三区划线法进行涂布，18 ℃培养48 h；

挑选长势良好的酵母菌转移到蔗糖乳酸培养基中进行扩大培养；

蔗糖乳酸培养基配方如下：

注：pH值5.4,高温高压灭菌，121 ℃，20 min。

（2）酵母菌株的初步鉴定

将挑选出的三株菌株及商业酵母LB在麦芽汁培养基中进行涂布培养48 h后，其形态如图1、图2所示。

通过YPD培养基培养后观察，培养基表面均无菌醭生成，但三角瓶壁上面有菌环生成，且均有白色沉淀生成，质地紧密。表1所示，筛选出的菌株形态为圆形或近圆形，出芽繁殖，且不产生假菌丝，符合酿酒酵母的基本形态特征。

表1 酵母菌的形态特征鉴定结果

（3）酵母菌株的生理、生化鉴定

根据J.A巴尼特《酵母菌的特征与鉴定手册》对G①、H②、B④及LB菌株进行生理生化试验，包括糖类发酵试验、碳源同化试验、氮源同化试验。结果见表2。

表2 酵母菌生理、生化试验结果

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。

（4）酵母菌株的分子生物学鉴定

以菌株G①、H②、B④的总DNA为模板，ITS1/ITS4为引物进行基因扩增，以18S rDNA基因序列进行测序，结合《酵母菌的特征与鉴定手册》，G①、H②、B④均被鉴定为酵母菌。

（5）菌株的性能鉴定

采用不同葡萄糖浓度，300 g/L、400 g/L、500 g/L、600 g/L、700 g/L，温度8℃、10℃、12℃、14℃，酒精浓度3%、5%、7%、9%、11%，13%、15%，SO₂浓度60mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L、250mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L，pH值1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0的50ml的YPD液体培养基，按5%的接种量接种，16℃恒温培养48h，选用660nm波长进行培养液OD值的测定，结果见图3-7。

（6）菌株的性能分析

酿造冰酒要求葡萄汁含糖量为320～360g/L，在高糖情况下，容易导致细胞破裂，因此要求菌株能够耐渗透压。由图3可知，各菌株在葡萄糖为300g/L～400g/L时生长良好。当糖度增加至500g/L后，各菌株生长受到抑制。在此浓度下，B④菌株的耐高糖性比LB高13%。

温度是影响菌株生长发酵的重要因素。若培养温度过高，酵母出芽率会降低；若温度过低，则会导致发酵速度减慢甚至发酵终止。因此发酵温度控制在10℃～12℃，菌株需要有较好的耐低温能力。由图4可知，在8℃时各菌生长缓慢，在10℃～12℃时，H②生长速度最快。与LB相比，各菌株在10℃～12℃时均长势良好，适合冰酒的发酵。

酵母菌株在无氧的条件下产乙醇和二氧化碳，但酒精达到一定浓度时也会抑制酵母菌株的生长代谢。因此需要菌株有较好的耐酒精的能力。由图5可知，所有菌株随着乙醇浓度的升高生长受到抑制。乙醇浓度大于7%时，G①、H②急剧下降，说明菌株的生长开始受酒精的影响增大。与LB相比，B④菌株受酒精影响相对较小。

SO₂在葡萄酒生产过程中有抑菌、增色、增酸和改善口感质量等作用，我国规定葡萄酒中SO₂添加量不能超过300mg/L，因此菌株需要有较高的耐SO₂能力。由图6可知，当添加量浓度小于250mg/L，三支菌株均表现出较好的耐性，当添加量大于400 mg/L，菌株的生长受到抑制。与LB相比，B④菌株受SO₂影响相对较小。

pH值是葡萄酒生产的重要条件，pH越高，紫红色逐渐消失变成蓝色色调，色泽和透明度变差，所以要选择能够在pH3.0～3.6条件下生长较好并且代谢旺盛的菌株。如图7可知，与LB相比，各菌株均在pH3.0～4.0时生长良好。

（7）葡萄汁发酵实验

根据菌株发酵性能实验结果，选择H②、B④及LB进行葡萄汁发酵实验。表3所示，各菌株发酵启动时间相似，并均在2d达到高峰。与商用酵母LB相比，菌株B④启动速度快，但发酵周期长较长。由表4可以看出，各菌均能完成酒精发酵。由表3、表4可知，B④性能稳定，发酵力强，产酒精量高，与商业菌对照结果相近。

酒精发酵结束后，测定发酵液的残糖含量及酒精度，发酵力采用CO₂失重法；酒精采用酒精计法；残糖采用直接滴定法；并按照GB/T 15038-2006进行感官品尝。

表3 酵母菌发酵试验CO₂失重

表4 酵母菌发酵液酒精度与残糖

酵母编号	酒精度（%vol）	残糖（g/L）	品尝结果
				H②	10.5	118	口感一般
B④	13.5	130	口感协调
				LB	12.3	135	口味醇厚

结论：

从鸭绿江流域的北冰红葡萄果皮及生长土壤中筛选适合酿造北冰红冰葡萄酒的耐低温、耐高糖的菌株，其菌落表面光滑，边缘整齐，乳白色，突起，细胞多为较大圆形或圆形。经18S rDNA 基因序列测序，结合《酵母菌的特征与鉴定手册》，G①、H②、B④均被鉴定为酵母菌。结果表明，B④的耐糖性优于LB 13%，其在糖度500g/L、pH3.0～4.0、温度10℃～12℃时生长良好，受酒精、SO₂影响相对较小。在糖度360g/L的冰葡萄汁中发酵结束后，酒精为13.5 %vol，残糖为130g/L，感官品评协调，符合冰酒生产的工艺要求。

实施例3：

B④酵母在发酵温度为 11.91℃，pH3.13，酵母接种量 7.78%，感官品评最优值为77.81。考虑到实际可行性和操作便利性，将该工艺的参数调整为发酵温度为 12℃，pH3.1，酵母接种量 8%。按照上述修正条件进行验证，进行 3 次重复实验，平均品尝得分为76.45。

Claims

1.一种土著酿酒酵母菌株，其特征在于，菌株拉丁名为：Saccharomyces cerevisiae，保藏在：CGMCC，保藏号为：16036。

2.一种权利要求1所述的土著酿酒酵母菌株用于冰葡萄酒的发酵。