CN111621430B

CN111621430B - 一株适于酿造黄桃果酒的酿酒酵母及其应用

Info

Publication number: CN111621430B
Application number: CN202010533055.4A
Authority: CN
Inventors: 李崎; 李明瑕; 刘宜嵩; 刘春凤; 王金晶; 钮成拓; 郑飞云
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-06-12
Filing date: 2020-06-12
Publication date: 2022-03-15
Anticipated expiration: 2040-06-12
Also published as: CN111621430A

Abstract

本发明公开了一株适于酿造黄桃果酒的酿酒酵母及其应用，属于生物工程发酵技术领域。本发明中的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YP‑01已于2020年05月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19781；该菌株能够适应黄桃果汁的发酵环境、起酵速度快，发酵彻底，且在保障产酒精能力较强的基础上所产的黄桃果酒口感协调且黄桃典型性明显。在工业化制备果酒中具备广阔的应用前景。

Description

一株适于酿造黄桃果酒的酿酒酵母及其应用

技术领域

本发明涉及一株适于酿造黄桃果酒的酿酒酵母及其应用，属于生物工程发酵技术领域。

背景技术

桃属于蔷薇科，李属，其发源于我国的西北高原，后广泛分布于亚、非、欧、美、澳五个大洲。桃品种按照果肉的颜色可以分为白肉桃、红肉桃、黄肉桃和绿肉桃。其中黄肉桃因颜色鲜艳、香气浓郁，在国内外市场上有很强的竞争力。黄桃果肉含有大量的维生素、膳食纤维、番茄红素、胡萝卜素以及锌、硒等多种微量元素，营养价值十分丰富。随着黄桃良种和良育的不断普及扩增，黄桃的产量也在不断上升。然而，目前黄桃的可用性受到季节和有限的货架期的限制，严重影响了我国黄桃果业的发展。黄桃的深加工可以满足无桃季节市场的需求，现阶段我国黄桃的加工产品主要是黄桃罐头、桃汁，速冻桃片，黄桃酸奶等低值产品。因此，为了避免黄桃上市时大量的资源浪费，同时提升黄桃果农开展农业生产的积极性，有必要开展黄桃深加工技术的研发，提升黄桃产品的附加值和市场竞争力。

酿酒酵母菌在分类学上属于真核生物原界、真菌界、子囊菌门、酵母亚门、半子囊菌纲、酵母目、酵母科、酵母属。酿酒酵母菌落呈圆形，有光泽，平坦，边缘整齐，在麦芽汁中培养细胞呈小圆形或卵圆形。适宜生长温度为28-30℃，最适pH值为4-5。酿酒酵母在果酒发酵中起到至关重要的最用，不同酵母发酵后产生的风味物质存在很大差异。目前我国各种果酒的生产缺乏专用的酿酒酵母大多使用葡萄酒酿造的商业活性干酵母，大量使用商业活性干酵母进行发酵会导致发酵迟缓、果酒特征风味丧失，因此筛选出一株适用于黄桃果酒发酵的专用酵母就显得非常重要。

发明内容

为解决目前果酒酿造中的问题，本发明提供了一株适于酿造黄桃果酒的酿酒酵母及其应用，所述技术方案如下：

本发明的第一个目的是提供一株适于酿造黄桃果酒的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)YP-01，所述酿酒酵母已于2020年5月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.19781，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明的第二个目的是提供一种酿酒酵母的培养方法，所述方法是将酿酒酵母YP-01接种至YPD液体培养基中培养。

在本发明的一种实施方式中，在20～30℃、100～200rpm下培养。

本发明的第三个目的是提供一种制备黄桃果酒的方法，所述方法是利用酿酒酵母YP-01制备黄桃果酒。

在本发明的一种实施方式中，将所述酿酒酵母YP-01接种至灭菌后的含黄桃或黄桃汁的发酵原料中，在20～30℃发酵，至恒重。

在本发明的一种实施方式中，所述酿酒酵母YP-01在发酵体系中的终浓度为终浓度不低于10⁷cfu/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵时间为6～9天。

本发明的第四个目的是提供含有所述酿酒酵母YP-01的微生物菌剂。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂为固体菌剂或液体菌剂。

在本发明的一种实施方式中，所述固体菌剂的制备方法为：取200～600μL的酿酒酵母YP-01接种于10～30mL YPD液体培养基中，28℃下活化2至3代，待酿酒酵母YP-01达到10⁸cfu/mL以上活菌数时，5000～10000rpm下离心10～20min，去除上清液后，在无菌环境下依次加入缓冲液和冷冻保护剂，待细胞浓度不低于10⁶cfu/mL时，真空冷冻干燥处理得到固体菌剂。

在本发明的一种实施方式中，待细胞浓度不低于10⁷cfu/mL时，真空冷冻干燥处理得到固体菌剂。

在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为生理盐水或pH值为5～8的0.1～1M磷酸盐缓冲液，所述保护剂为浓度为10～25％(w/v)的蔗糖溶液。

在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为双蒸水和/或生理盐水或pH值为7的0.2M磷酸盐缓冲液，所述冷冻保护剂为15％～20％(w/v)的蔗糖溶液。

在本发明的一种实施方式中，所述液体菌剂的制备方法为：取200～600μL的酿酒酵母YP-01接种于10～30mLYPD液体培养基中，20～30℃下活化2至3代，待酿酒酵母YP-01达到10⁸cfu/mL以上活菌数时，5000～10000rpm下离心10～20min，去除上清液后，接种于黄桃汁培养基中，20～30℃、150～200rpm活化20～30h得到液体菌剂。

本发明第五个目的是提供一种提高黄桃果酒发酵效率的方法，在含黄桃或黄桃汁的发酵原料中加入所述酿酒酵母，或所述微生物菌剂。

在本发明的一种实施方法中，所述液体菌剂中酵母细胞浓度不低于10⁸cfu/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述黄桃汁中含糖量为150～200g/L，可滴定酸5.00～6.00g/L，100～110℃灭菌5～15min。

本发明第六个目的是提供一种提高黄桃果酒风味的方法，所述方法是在含黄桃或黄桃汁的发酵原料中加入所述酿酒酵母，或所述微生物菌剂，发酵5～8天，制备得到果酒。

本发明还保护所述酿酒酵母YP-01或微生物菌剂，或所述制备黄桃果酒的方法，或所述加速黄桃果酒起酵的方法，或所述提高黄桃果酒风味的方法在制备果汁或酒精饮品中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述果汁包括黄桃果汁、白桃果汁、蜜桃果汁。

在本发明的一种实施方式中，所述酒精饮品包括黄桃果酒、蜜桃果酒、白桃果酒、橙酒、菠萝酒。

本发明有益效果是：

本发明提供的酿酒酵母CGMCC NO.19781用于黄桃果酒的酿造，能够适应黄桃果汁高亚硫酸盐和高乙醇的发酵环境、起酵速度快、发酵彻底，发酵后果酒口感柔和，香气浓郁，并有典型黄桃香气。制备得到的果酒中与香味有关的物质总量较商用菌株D254发酵果酒含量提高了20.7％，其中，苯乙醇的含量提高了1.45倍，乙酸苯乙酯提高了66.44％，(R)-(+)-β-香茅醇提高了42.01％，乙酸乙酯提高了36.95％。在工业化生产中具备良好的应用前景。

生物材料保藏

本发明所提供的酿酒酵母YP-01，分类学命名为酿酒酵母Saccharomycescerevisiae，已于2020年05月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.19781，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

附图说明

图1是菌株产气情况分类图。

图2是BIGGY琼脂平板筛选。

图3是碳酸钙琼脂平板筛选。

图4是感官品评雷达图。

图5是酵母18S rDNA PCR产物凝胶糖电泳图。

图6是基于18S rDNA测序构建酵母菌株系统发育树。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

本发明实施例中菌株筛选和性能测定中所用的培养基：

YPD培养基(g/L)：葡萄糖20.0，蛋白胨20.0，酵母粉10.0

YPD培养基平板、斜面(g/L)：葡萄糖20.0，蛋白胨20.0，酵母粉10.0，琼脂粉20.0.

商业BIGGY琼脂培养基：青岛海博生物技术有限公司。

碳酸钙琼脂培养基：0.3％酵母粉，18％葡萄糖，0.3％碳酸钙，1.5％琼脂。

发酵培养基：调整浓缩黄桃汁含糖量为180g/L，可滴定酸5.68g/L，于高压蒸汽灭菌锅105℃灭菌10min。

实施例1：酿酒酵母的筛选及鉴定

本实例中菌株筛选，具体步骤如下：

1、菌种分离

黄桃果汁中菌株的筛选：购买来自湖北，武台，蒙阴，砀山四个不同产地的新鲜黄桃，运输到实验室后，分别取3-5个黄桃榨汁，调整糖度至22°Brix，倒入无菌三角瓶中，置于28℃恒温培养箱中自然发酵。自然发酵后期，取2mL菌液用0.85％生理盐水连续稀释7个浓度梯度，将稀释的菌液均匀涂布在含有25mg/L氨苄青霉素和100mg/L硫酸链霉素的抗菌YPD平板上，28℃培养2d，并观察菌落生长情况。每组三个平行。将培养后的平板中具有典型的酵母菌的特征的单菌落挑出，在YPD平板中进行二次划线分离。将分离到的酵母菌单菌落培养后接入甘油管在-80℃下保存，并编号(WT开头的菌株)。

同时，还使用304株分离自其他水果，保存在实验室的潜在酿酒酵母菌株(为以下实施例中编号为A开头的菌株)。

2、菌株一级筛选

将甘油管保藏的菌株接种于YPD液体试管中，28℃、180rpm活化18-24h后，以5％接种量分别接种于含杜氏小管的黄桃汁液体培养基中，使得菌株在培养基中的终浓度为10⁷cfu/mL，20℃培养48h，根据培养基中气泡产生情况，保留起酵速度快(即气泡产生速度快)的菌株进行下一级筛选。如图1所示，图1为培养48h后的含杜氏小管的黄桃汁培养基，从左到右试管中的气泡依次增加。

3、菌株的二级筛选

将上一级筛选出的起酵速度快的菌株活化后，在碳酸钙琼脂平板和BIGGY琼脂平板上点样5μL活化18h的培养物，28℃静置培养2d。根据菌落颜色和透明圈大小选择低产硫化氢和乙酸的菌株进行下一级筛选，结果如表1所示。

表1菌株筛选结果

4、菌株的三级筛选

将二级筛选得到的86株潜在的酿酒酵母菌株在含YPD培养基的96孔深孔板活化24h，以5％接种量接种于不同二氧化硫浓度(150mg/L、200mg/L)、不同乙醇浓度(8％、12％)的YPD培养基中，以YPD培养基为对照，在28℃、180rpm下培养。每隔2h取样，测定菌株OD₆₀₀。通过比较对照组与实验组到达稳定期的时间、存活率和比生长速率，筛选出能够耐受高浓度亚硫酸盐和乙醇的菌株，表2显示了能够耐受以上条件的菌株。

表2菌株三级筛选结果

5、菌株的四级筛选

在含有黄桃汁的发酵培养基中接种以上10株能够耐受高浓度亚硫酸盐和乙醇的潜在酿酒酵母菌株，以商业酿酒酵母D254为对照，发酵结束测定果酒基本理化指标，测定方法参照GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》，结果如表3所示。

表3基础理化指标

由表3可知，WT-7，WT-14，WT-21与商业酿酒酵母D254有相当的发酵速度，均在7天内完成发酵，而其余菌株在第8天完成发酵，WT系列菌株筛选自黄桃鲜果自然发酵，表明原生环境中的酿酒酵母菌株可能更适合黄桃的发酵。大多数菌株的乙醇产量与对照菌株D254相当，仅有A-33菌株产生的乙醇含量最低，发酵相对缓慢。黄桃果酒中的残糖也表现出明显差异，菌株A-5，A-34，WT-7，WT-14，WT-21发酵的果酒残糖相对较少，发酵更为完全，发酵效率更高。

6、感官品评

对菌株A-5，A-34，WT-7，WT-14，WT-21，以及商品菌发酵的黄桃果酒进行感官品评，以评估这些酵母菌株生产优质黄桃酒的能力。该分析由11名老师和同学进行，他们具有果酒感官描述性分析方面的经验。在22±1℃的室温下，将黄桃酒样品装到品评杯中给小组成员。小组成员讨论选择了10个感官术语，包括果香(香气)、甜香(香气)、花香(香气)、愉悦程度(香气)、酸(口感)、甜(口感)、异味(口感)、平衡(口感)、丰满度(口感)、嗜好程度，以描述和区分样品，并使用0-10分对每个属性的强度进行评分，其中0表示没有感知到描述词，此后强度逐渐增强，结果如表4所示。

表4感官品评

由表4可知，WT-21菌株在果香上有最高得分，在愉悦程度(香气)、丰满度(口感)、嗜好程均有较高得分，综合发酵后果酒的理化指标及感官品评结果，WT-21菌株最适于黄桃果酒的酿造。

6、菌种鉴定

挑取斜面保藏的菌株WT-21于10mL YPD培养基中，28℃，150rpm培养24h。取适量培养液离心1min，弃上清，采用酵母DNA提取试剂盒提取菌体DNA，用酵母18s通用引物ITS1和ITS4，扩增基因组DNA，PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，并进行测序。

ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG，

ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。

采用BLAST方式将测定的18srDNA序列与GenBank中酵母菌的序列进行比对，结果如图6所示，WT-21鉴定为酿酒酵母菌株并重新命名为酿酒酵母YP-01。

实施例2：酿酒酵母YP-01在黄桃果酒发酵中的应用

以浓缩黄桃汁为原料，调整含糖量至180g/L，可滴定酸5.68g/L，发酵规模为500mL，装液量为60％，于高压蒸汽灭菌锅中105℃灭菌10min，接种5％的酿酒酵母YP-01，使得酿酒酵母YP-01在发酵体系中的终浓度为10⁷cfu/mL，25℃发酵7d，发酵结束使用GC-MS分析果酒中的风味物质，结果如表5所示(仅显示相对含量较高的挥发性化合物)。

GC-MS分析具体步骤如下：

样品前处理萃取条件：在20mL顶空瓶中，加入8mL黄桃果酒样品，3.0g NaCl，在45℃预热5min，萃取60min。萃取完成后，将萃取头插入进样口，解吸附5min，进行GC-MS分析，实验以2-辛醇为内标作半定量分析。

分析条件为：GC条件：PEG.20m弹性石英毛细管柱，30ITI X0.25in x0.25Ixm；载气为高纯氦气，恒定流量为0.8mL·min-1；升温程序：从180℃开始，保持2min，以3℃·min^-1升温到230℃，保持10min；进样口温度250℃，出样口温度200℃；检测电压350V。MS条件：EI离子源，发射电流200μA，电子能量70eV，扫描范围20～550U。

表5 GC-MS半定量分析黄桃果酒中的挥发性风味物质

由表可知，YP-01发酵的黄桃果酒中各类具有香味的物质总含量较商品菌D254发酵果酒含量提高了20.7％。其中，苯乙醇、乙酸苯乙酯、(+)-α-松油醇、(R)-(+)-β-香茅醇等被描述为花香的挥发性化合物以及乙酸乙酯、丙位癸内酯等被描述为果香的挥发性化合物均得到提高：其中，苯乙醇的含量提高了1.45倍，乙酸苯乙酯提高了66.44％，(+)-α-松油醇提高了20.15％，(R)-(+)-β-香茅醇提高了42.01％，乙酸乙酯提高了36.95％。

实施例3：酿酒酵母YP-01的微生物菌剂的制备

取200～600μL的酿酒酵母YP-01接种于10～30mL YPD液体培养基中，28℃下活化2至3代，待酿酒酵母YP-01达到10⁸cfu/mL以上活菌数时，5000～10000rpm下离心10～20min，去除上清液后，在无菌环境下依次加入缓冲液(生理盐水或pH值为7的0.2M磷酸盐缓冲液)和冷冻保护剂(15％～20％(w/v)的蔗糖溶液)，待细胞浓度不低于10⁷cfu/mL时，真空冷冻干燥处理得到固体菌剂。

实施例4：微生物菌剂在制备果汁中的应用

具体实施方式参见实施例2，将微生物菌剂加水稀释后加入发酵体系中，在25℃发酵7天，即得到黄桃果酒。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一株酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），已于2020年05月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 19781。

2.一种制备黄桃果酒的方法，其特征在于，所述方法是用含黄桃或黄桃汁的发酵原料，利用权利要求1所述的酿酒酵母发酵，制备黄桃果酒。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将所述酿酒酵母加入含黄桃或黄桃汁的发酵原料中，在20~30℃发酵。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述酿酒酵母在发酵体系中的终浓度不低于10⁶cfu/mL。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，发酵5~8天。

6.一种微生物菌剂，其特征在于，所述菌剂中含有权利要求1所述酿酒酵母。

7.根据权利要求6所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂为固体菌剂或液体菌剂。

8.权利要求1所述酿酒酵母，或权利要求6或7所述微生物菌剂在制备果酒中的应用。