CN102168027A

CN102168027A - 一种果酒生物发酵新菌株j4及其应用

Info

Publication number: CN102168027A
Application number: CN 201010534961
Authority: CN
Inventors: 何志刚; 李维新; 任香芸; 林晓姿; 梁璋成; 魏巍; 陆东和
Original assignee: Institute of Agricultural Engineering Technology of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Fujian Spring and Autumn Agroforestry Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2010-11-08
Filing date: 2010-11-08
Publication date: 2011-08-31
Anticipated expiration: 2030-11-08
Also published as: CN102168027B

Abstract

本发明涉及一种果酒生物发酵新菌株J4及其应用，命名为酿酒酵母J4，该菌种已于2010年9月1日保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO：M2010215。本发明还涉及该菌株在果酒降酸中的应用。本发明的酿酒酵母J4除具有良好的酒精发酵能力外，还具有很强的酸代谢能力，能降解原果汁中的柠檬酸和苹果酸等酸感刺激的有机酸组分，提高果酒柔和度，对高品质果酒的酿造、提高果酒的市场占有率具有重要的推动作用。

Description

一种果酒生物发酵新菌株J4及其应用

技术领域

本发明涉及一种酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），特别涉及一种果酒生物发酵新菌株J4及其应用，命名为酿酒酵母J4，该菌种已于2010年9月1日保藏在位于武汉市武昌珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2010215。

背景技术

水果是人体膳食维生素、无机盐、纤维素、有机酸等营养物质的理想供源，蛋白质和脂类含量低，酿制的果酒营养丰富，风味独特，经常适量饮用具有一定的保健作用，市场前景广阔。但果酒往往因为有机酸含量较高，导致酒体酸涩、粗糙感较强，这已成为果酒产业进一步拓宽市场和规模化发展的瓶颈制约。酵母品种是酿造果酒的关键因素之一，其发酵性能的好坏直接影响到所酿果酒的口感和风味，决定果酒品质的优劣。因此，采用具有酸代谢能力且综合性能优良的酵母菌进行酒精发酵可以使果酒的总酸下降，酸涩感和粗糙感降低，口感柔和、圆润，对提高果酒品质、扩大果酒的市场占有率有重要的推动作用。

目前果酒降酸方法主要采用化学降酸及接入乳酸菌二次发酵MLF生物降酸。化学降酸虽有效果好、速度快的特点，但降酸的同时引入过多的Na⁺和Ca²⁺，使酒体风味及质地明显下降，且在贮放过程中产生不稳定的钙盐沉淀致使酒体稳定性下降。乳酸菌能利用苹果酸为底物进行苹果酸乳酸发酵，在苹果酸乳酸酶的催化下，转变成酸感柔和的乳酸，但乳酸菌降酸幅度有限，且对营养要求严苛，其在酒体里生长又易受到酒精、SO₂等综合抑制，尚难以推广应用。因此，采用具有酸代谢能力的酵母菌进行酒精发酵，用于果酸含量较高的果酒酿造，结合乳酸菌生物降酸技术的集成应用，可以有效改善酒体的刺激性酸感，酿造口感柔和、圆润的果酒，使果酒品质得到明显的提升，对扩大果酒的市场占有率具有重要的推动作用。

发明内容

针对上述果酒酿造中存在的问题和缺陷，本发明的目的是选育出一种具有酸代谢能力且综合性能优良的果酒生物发酵新菌株J4及其应用。

本发明的果酒生物发酵新菌株J4，是从自然发酵的刺葡萄酒中分离、筛选出的具有很强的酸代谢能力且综合发酵性能优良的一株酵母菌株，命名为Saccharomyces cerevisiae J4，简称J4，已于2010年9月1日送交位于武汉的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：M 2010215。

本发明的酿酒酵母J4（即果酒生物发酵新菌株J4）除具有酒精发酵能力外，还具有酸代谢能力，能有效降低果浆中的苹果酸、柠檬酸含量，从而使酿造的果酒口感柔和、协调，为提高果酒品质奠定基础。

本发明的酿酒酵母J4在果酒酿造中的应用方法，其特征在于：将酿酒酵母J4在种子发酵培养基中活化后，以1.11×10⁶~9.88×10⁷cfu/mL接种量接入总硫浓度39.68～122.76mg/L、pH值在3.01～6.15的果浆中，在20~25℃下发酵5~20天。

附图说明：

本发明果酒生物发酵新菌株J4，命名为Saccharomyces cerevisiae J4，简称J4，已于2010年9月1日送交位于武汉的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：M 2010215。

图1 18S rDNA序列系统发育进化树。

图2 平板菌落形态。

图3 液体培养显微形态

图4 细胞形状图（扫描电镜）。

图5 细胞纵切面结构图（透射电镜）。

具体实施方式

实施例1：

以下将结合附图，介绍本发明果酒生物发酵新菌株酿酒酵母J4的微生物学特征，诸如形态学、生理生化、18S rDNA序列测定与同源性分析。

酿酒酵母J4的分离选育

1、酵母菌株的分离

以新鲜刺葡萄为原料，经挑选、清洗、破碎等工艺，制成刺葡萄果浆，调节果浆总SO₂浓度为80mg/L，分装在5L发酵罐中，在20-25℃下自然发酵，作为酵母菌选育菌源。

待样品在发酵罐中有大量气泡时，取发酵液10%接入酵母富集培养基中，28℃培养1d。在无菌条件下将发酵液进行10倍梯度稀释，选取3个适宜的稀释度10^-1、10^-2和10^-3，使得平板菌落能够彼此分开，各吸取0.1mL，涂布于公知的麦芽汁培养基平板上，每个稀释度做2个平行，置于28℃培养箱中恒温培养2d。挑取具有典型酵母菌落形态的单菌落，在麦芽汁培养基平板上进行4～5次划线传代，经显微镜镜检，从采集的样品中共分离得到68株酵母菌株。首先对68株菌株进行TTC试验，挑选出具有典型酵母菌菌落特征的初筛菌株28株。初筛菌经杜氏小管产气试验，得到14株带有酒香的菌株，其中有6株在12h内产生大量气泡、酒香浓郁，将其编号为J1、J2、J3、J4、J5、J6并分别转移至麦芽汁琼脂斜面培养基上，于4℃条件下保藏、备用。

2、酿酒酵母J4的选育

将分离得到的J1、J2、J3、J4、J5、J6酵母菌分别以1×10⁷~9×10⁷cfu/mL菌量接种于含总SO₂60mg/L、可滴定酸8.7g/L（苹果酸计）的刺葡萄果浆中，于20~25℃自然发酵10天，以降酸能力、发酵速率、产酒能力、产香水平、感官评价等进行模糊综合评判，筛选出适于果酒发酵、具有酸代谢能力且综合性能优良的酵母菌株。结果如表1，酿酒酵母J4产酒率最高，且降酸能力强，酿造的果酒总酸下降了1g/L；从果酒的色泽、澄清度、香气、滋味和典型性进行综合感官评价，也以 J4酿制的果酒分值最高，为93分，且果酒风味纯正、协调，口感柔和、圆润，说明酿酒酵母J4是1株具有酸代谢能力的优良酵母菌株。酿酒酵母J4已保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO：M 2010215。CCTCC NO：M 2010215 J4适宜的种子发酵培养基的组分为：麦芽汁琼脂培养: 10°波林麦芽汁1L，加18～20g琼脂，25～30℃培养3d。

表1不同菌种发酵对比试验结果

注：酿造前总酸为8.7g/L（苹果酸计）。

、酿酒酵母J4的鉴定

（1） J4的形态学与生理学特征

（2）J4的糖发酵能力

注：“—”为阴性反应；“+”为阳性反应，“W”表示阳性弱反应

（3）J4的碳源同化能力

（4）J4的氮源同化能力

（5）18S rDNA序列测定与同源性分析

采用TIANGEN公司的酵母菌基因组DNA提取试剂盒提取纯培养的目标菌株的基因组DNA。以引物Au2-F和Au4-R扩增其18S rDNA基因保守区。以50μL PCR反应体系进行扩增，反应体系为：10*buffer 5.0μL、dNTP 4.0μL、Au2-F 2μL、Au4-R 2μL、DNA 4μL、rTaq 1.0μL、dd H₂O 32μL。94℃预变性5min，然后94℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存。PCR产物检测：取5μL的PCR产物，2μL的上样缓冲液，在1.0%的琼脂糖中凝胶电泳分离，在EB染料上染色10min,用凝胶成像系统进行分析，将含有目标片段的产物进行测序。将J4的18S rDNA序列输入Genebank以Blast软件进行序列同源性比较，利用MEGA 4.0软件构建系统发育进化树，进行亲缘关系和系统发育分析，其18S rDNA序列系统发育进化树，如图1。结果显示，与J4菌株基因序列相似性较高的序列主要为酿酒酵母属，与其相似性最高的是该属中的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）种，与多株已知酿酒酵母的同源性达99％以上，说明该菌在分子系统发育分类学上属于酿酒酵母属中的一个种。经18S rDNA序列同源性分析，依据同源性在系统发育中的分类原则并结合形态、生理生化特征，参考《酵母菌的特征与鉴定手册》，最终确定J4菌株为酿酒酵母，命名为Saccharomyces cerevisiae J4。

为了充分公开本发明的一种果酒生物发酵新菌株J4及其应用，现结合附图和发明人给出酿酒酵母J4在果酒酿造中的应用，来进一步说明本发明的有益效果。

实施例2：酿酒酵母J4在“解放钟”枇杷酒酿造中的应用

将酿酒酵母J4在种子发酵培养基中活化后，以4.3×10⁷接种量接入80mg/L、pH值在3.05、起始总酸为7.6g/L的“解放钟”枇杷果浆中，在23±1℃下发酵10天，发酵结束后对酿酒酵母J4的发酵能力进行考察，结果见表2、3。酿酒酵母J4可以降解酸感较刺激的苹果酸和柠檬酸，产生酸感较柔和的乳酸；使用酿酒酵母J4酿造的“解放钟”枇杷酒酒精度为13.5%，总酸比枇杷原浆降低了0.8g/L，酒体风味纯正、口感柔和、酒香醇厚。可见酿酒酵母J4是1株具有酸代谢能力且综合性能优良的酵母菌株，适用于“解放钟”枇杷酒的生产。

表2 发酵前后“解放钟”枇杷酒主要理化指标的变化

表3 发酵前后“解放钟”枇杷酒主要有机酸指标的变化

实施例3：酿酒酵母J4在“巨峰”葡萄酒中的应用

将酿酒酵母J4在种子发酵培养基中活化后，按表4正交试验方案调节葡萄果浆的总硫浓度和pH值并接种，在25±1℃下发酵5~20天，发酵结束后对酿酒酵母J4的发酵能力进行考察，结果见表5。结果表明，使用酿酒酵母J4酿造的“巨峰”葡萄果酒酒精度平均为13.2%，总酸比葡萄原浆降低了0.7~1.0g/L，残糖含量均低于0.4%，酒体风味纯正、口感柔和、酒香醇厚。可见酿酒酵母J4是1株具有酸代谢能力且综合性能优良的酵母菌株，适用于“巨峰”葡萄酒的生产。

表4 正交试验L₉（3⁴）因素水平表

表5 不同发酵条件对“巨峰”葡萄酒发酵前后主要理化指标变化的影响

实施例4：酿酒酵母J4在“安海变”杨梅酒酿造中的应用

将酿酒酵母J4在种子发酵培养基中活化后，以1.07×10⁷~9.86×10⁷cfu/mL接种量接入40.38~122.76mg/L、pH值在3.03~6.03的“安海变”杨梅果浆中，在20±1℃下发酵18天，发酵结束后对酿酒酵母J4的发酵能力进行考察。由表6可知，使用酿酒酵母J4酿造的“安海变”杨梅酒酒精度平均为12.8%，总酸比葡萄原浆降低了0.6~1.0g/L，酒体风味纯正、口感柔和、酒香醇厚。可见酿酒酵母J4是1株具有酸代谢能力且综合性能优良的酵母菌株，适用于“安海变”杨梅酒的生产。

表6 “安海变”杨梅酒主要理化指标的变化

以上试验所涉及到的试验方法如下：

1、总酸：指示计法(GB/T15038-2006)，以苹果酸计。

2、总硫、游离硫：直接碘量法（GB/T15038-2006）。

3、酒精度：酒精计法（GB/T15038-2006）。

4、总糖的测定：菲林试剂法（GB/T15038-2006）。

5、挥发酸的测定：按GB/T15038-2006进行。

6、葡萄酒色度的测定：葡萄酒经过0.4μm孔径膜过滤，测其pH值，用相同pH的磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液稀释10倍后，于1 cm比色皿中在波长420，520，620 nm下分别测定其吸光值，葡萄酒的色度为三者之和与稀释倍数的乘积。

7、感官评价：参照GB/T15038-2006，并略作修改：分别从色泽、澄清度、香气、滋味和典型性四个角度来考察，分别赋予5分，5分，30分，40分，20分的权重，最后以各项的总和来计算。

8、苹果酸、柠檬酸、乳酸的测定：采用高效液相色谱法，参照国标GB/T 5009.157-2003 进行。

Claims

1.一种果酒生物发酵新菌株J4，该菌为酿酒酵母属的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae J4），命名为酿酒酵母J4，该菌种已保藏在位于武汉市武昌珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO：M 2010215。

2.根据权利要求1所述的果酒生物发酵新菌株J4，其特征在于：酸代谢能力，能降解原果汁中苹果酸和柠檬酸等刺激性强的有机酸组分。

3.根据权利要求1所述的果酒生物发酵新菌株J4的应用，其特征在于：酿酒酵母J4用于果酒的酿造，具有很强的酒精发酵能力，果酒残糖含量低于0.4%。

4.根据权利要求1所述的果酒生物发酵新菌株J4的应用，其特征在于：酿酒酵母J4用于含有苹果酸、柠檬酸的果酒酿造，除具有很强的酒精发酵能力外，还能进行生物降酸。

5.根据权利要求1所述的一种果酒生物发酵新菌株J4在果酒酿造中的应用方法，其特征在于：将酿酒酵母J4在种子发酵培养基中活化后，以1.11×10⁶~9.88×10⁷cfu/mL接种量接入总硫浓度39.68～122.76mg/L、pH值在3.01～6.15的果浆中，在20~25℃下发酵5~20天。