CN111139193A - 一种低产高级醇和强降解苹果酸的葡萄汁酵母菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株低产高级醇和强降解苹果酸的葡萄汁酵母菌株，该葡萄汁酵母菌株在其它发酵性能不受影响的情况下，葡萄酒发酵5天后，异丁醇、异戊醇和苯乙醇含量分别为28.18mg/L、171.76mg/L和13.60，与出发菌株相比分别降低了20.28％、14.77％和11.26％，主要高级醇(正丙醇、异丁醇、异戊醇和苯乙醇)总含量降低了12.97％，且发酵后苹果酸含量降为1.13g/L，大大缩短了发酵周期，克服了普通发酵过程中乳酸菌发酵的影响，和高级醇含量较高导致的风味不协调，对降低酿酒工业消耗，提高我国葡萄酒工业的生产技术水平具有重要意义。

Description

一种低产高级醇和强降解苹果酸的葡萄汁酵母菌株及其应用

技术领域：

本发明属于生物工程和基因工程技术领域，涉及工业微生物的育种及其应用，具体是涉及一种低产高级醇和强降解苹果酸的葡萄汁酵母菌株及其在制备葡萄酒中的应用。

背景技术：

葡萄酒是以新鲜的葡萄或葡萄汁为原料经全部发酵或部分发酵酿造的一种低度果酒，是人与自然和谐相处的产物，每一种优质的葡萄酒都是人们在合适的自然条件下长期栽培相适应的葡萄品种，结合独特的工艺技术，酿造出具有不同风味特色的葡萄酒。葡萄酒风味是由各种风味物质共同作用的一种相辅相成的平衡的综合体现，是衡量葡萄酒品质的重要指标。高级醇是葡萄酒发酵的主要副产物，是酒呈味的主要成分，适量高级醇与其他它风味物质互相配合、补充、衬托和制约给予葡萄酒特殊的香气和风味，给人以圆润、丰满、协调的感觉。然而较高含量的高级醇不但会使酒产生令人不愉快的异杂味，还会由于高级醇在人体内的氧化速度慢，停留时间长，对人体产生毒害作用。故在葡萄酒酿造过程中有效控制葡萄酒中高级醇的含量十分必要。

在葡萄酒酿造过程中高级醇主要由葡萄酒酵母酒精发酵产生。目前已有相应研究通过微生物诱变育种选育调控高级醇的酵母菌株，ZHAI HENG等通过在培养酵母的平板中添加一定量的氯乙酸异戊酯从而准确、方便、快速的筛选低产高级醇的酵母菌种，可使葡萄酒中的高级醇降低10％-15％(中国专利CN103627646B，2015.05.13)。XUYAN等通过一种葡萄酒酿造技术工艺酿造出红葡萄酒，该红葡萄酒在酒精度数达到要求的同时，大幅度减少了葡萄酒中高级醇的含量，改善了红葡萄酒的口感(中国专利，CN108060039A，2018.05.22)。但是大多数红葡萄酒和部分白葡萄酒发酵是由酵母主导的酒精发酵和乳酸菌主导的苹果酸-乳酸(简称苹乳发酵)发酵形成。苹乳发酵一般是在酒精发酵结束后于发酵液中接入乳酸菌进行，其可以将酒精发酵后酒中尖锐L-苹果酸脱羧降解为较弱的L-乳酸，使酒体变的圆润、柔和。但是在酒精发酵结束后，酒体较高的酒精度、较低的pH值与残糖量会抑制乳酸菌的正常代谢，使发酵受到阻碍，且酒体中存在的噬菌体也会造成苹乳发酵的推迟或被抑制，腐败菌发酵产生异香和异味，导致葡萄酒病害的发生，降低葡萄酒的风味质量。故在葡萄酒酿造过程中，应用工业微生物育种构建同时调控高级醇和强降解苹果酸的酵母菌株，是解决高级醇含量较高和由于乳酸菌发酵导致葡萄酒发酵周期延长等问题的根本方法。

葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)是一种具有潜在的酿酒特性的非酿酒酵母，其比酿酒酵母产生更多的芳香物质。利用分子育种技术构建同时调控苹果酸和高级醇葡萄汁酵母工业菌株，对缩短葡萄酒发酵周期，提高葡萄酒的风味质量具有重要意义。

发明内容：

本申请的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种低产高级醇和强降解苹果酸的葡萄汁酵母菌株及其应用，本发明通过在葡萄汁酵母中同时表达粟酒裂殖酵母的苹果酸通透酶基因mae1和乳酸乳球菌的苹果酸乳酸酶基因mleS，选育低产高级醇和强降解苹果酸的工业酵母菌株，在有效提高葡萄酒风味质量的同时也大大缩短了葡萄酒的发酵周期，为葡萄酒行业带来显著的经济效益。

本发明实现目的的技术方案如下：

本发明提供一种低产高级醇和强降解苹果酸的葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)菌株，所述菌株同时异源表达粟酒裂殖酵母的苹果酸通透酶基因mae1和乳酸乳球菌的苹果酸乳酸酶基因mleS。

所述mae1基因的Gene ID为：2543334，核苷酸序列如表中SEQ NO:1所示；所述mleS基因其Gene ID为：1114530，核苷酸序列如表中SEQ NO:2所示。

所述Gal80基因其Gene ID为：854954，核苷酸序列如表中SEQ NO:3所示。所述启动子PGK1其Gene ID为：850370，核苷酸序列如表中SEQ NO:4所示。

所述出发酵母菌株为葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)CICC1465。

本发明提供了低产高级醇和强降解苹果酸的葡萄汁酵母菌株的构建方法，包括如下步骤：

⑴表达mae1和mleS的重组片段的构建

①以质粒pPGK1为模板，PCR扩增PGK1基因片段，回收PCR产物强启动子PGK1，将质粒Yep352和片段PGK1同时进行BamHI和SalI双酶切后进行连接，构建质粒Yep-P。

②以出发酵母菌株基因组为模板，分别PCR扩增mae1和mleS基因，用限制性内切酶XhoI对质粒Yep-P进行酶切，将基因片段mae1和mleS分别与质粒Yep-P连接，构建质粒Yep-Pm1和Yep-PS。

③以质粒Yep-PS为模板，PCR扩增PGK1p-mleS-PGK1t片段。用限制性内切酶SmaI对质粒Yep-Pm1进行酶切，将片段PGK1p-mleS-PGK1t与质粒Yep-Pm1连接，构建质粒Yep-Pm1S。

④以质粒pUG6为模板，PCR扩增KanMX基因，用限制性内切酶ApaI对质粒Yep-Pm1S进行酶切后，与KanMX基因片段进行连接，构建质粒Yep-KPm1S。

⑵表达mae1和mleS的重组菌株的构建

①以质粒Yep-KPm1S为模板PCR扩增Bal80上游同源臂-PGKp-mae1-PGKt-PGKp-mleS-PGKt-KanMX-Bal80下游同源臂基因。

②导入出发菌株CICC1465中，得到同时过表达mae1和mleS基因的重组菌株WY-m1S。

本发明还提供一种上述菌株在制备葡萄酒中的应用。

优选的，所述葡萄酒为低含量高级醇和苹果酸的葡萄酒。

本发明的有益效果如下：

1、本发明提供的低产高级醇和强降解苹果酸葡萄汁酵母在保持良好发酵性能的前提下，同时表达粟酒裂殖酵母苹果酸通透酶基因mae1和乳酸乳球菌苹果酸乳酸酶基因mleS，达到了同时调控高级醇和苹果酸的目的，为酿造出风味优良且发酵周期短的葡萄酒奠定了理论基础。

2、本发明所述的葡萄汁酵母重组菌株，在其它发酵性能不受影响的情况下，葡萄酒发酵5天后，异丁醇、异戊醇和苯乙醇含量分别为28.18mg/L、171.76mg/L和13.60mg/L，与出发菌株相比分别降低了20.28％、14.77％和11.26％，主要高级醇(正丙醇、异丁醇、异戊醇和苯乙醇)总含量降低了12.97％，且发酵后苹果酸含量降为1.13g/L，消除了乳酸菌发酵的影响，大大缩短了发酵周期。

3、本发明的葡萄汁酵母重组菌株克服了普通酵母由于高级醇含量较高导致的风味不协调且由于乳酸菌发酵导致的发酵周期延长的问题，提高了葡萄酒的风味质量同时缩短了发酵周期，具有广阔的市场前景。

附图说明：

图1为Yep-KPm1S质粒构建过程；

图2为质粒Yep-Pm1、Yep-PS、Yep-Pm1S和Yep-KPm1S和重组菌株WY-m1S的验证图：

其中：M为marker；泳道1为以Yep352为模板，YP-F/YP-R为引物PCR扩增结果；泳道2为以Yep-P为模板，YP-F/YP-R为引物PCR扩增的PGK1基因片段；泳道3为以Yep-P为模板，Ymae1-F/Ymae1-R为引物PCR扩增结果；泳道4为以Yep-Pm1为模板，Ymae1-F/Ymae1-R为引物PCR扩增的mae1基因片段；5为以Yep-P为模板，YmleS-F/YmleS-R为引物PCR扩增结果；泳道6为以Yep-PS为模板，YmleS-F/YmleS-R为引物PCR扩增的mleS基因片段；泳道7为以Yep-Pm1为模板，SmaI-F/SmaI-R为引物PCR扩增结果；泳道8为以Yep-Pm1S为模板，SmaI-F/SmaI-R为引物PCR扩增的PGK1p-mleS-PGK1t片段；泳道9为以Yep-Pm1S为模板，YK-F/YK-R为引物PCR扩增结果；泳道10为以Yep-KPm1S为模板为模板，YK-F/YK-R为引物PCR扩增的KanMX基因片段。

图3a为质粒Yep-Pm1、Yep-PS、Yep-Pm1S和Yep-KPm1S和重组菌株WY-m1S的验证图：其中，M为marker；1和2分别为以出发菌株CICC1465和重组菌株WYm1S的DNA为模板，YA-F/YA-R为引物PCR扩增的验证片段；

图3b为质粒Yep-Pm1、Yep-PS、Yep-Pm1S和Yep-KPm1S和重组菌株WY-m1S的验证图：其中，M为marker；1和2分别为以出发菌株CICC1465和重组菌株WYm1S的DNA为模板，YB-F/YB-R为引物PCR扩增的验证片段。

具体实施方式：

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

所述低产高级醇和强降解苹果酸葡萄汁酵母菌株是将粟酒裂殖酵母苹果酸通透酶基因mae1和乳酸乳球菌苹果酸乳酸酶基因mleS分别在启动子PGK1的调控下并以KanMX基因作为筛选标记同时整合至出发葡萄汁酵母菌株的Gal80基因位点上所得。

本实例所用的出发菌株CICC1465。所述大肠杆菌DH5a购自Takara公司，粟酒裂殖酵母CICC1757和乳酸乳球菌NZ9000均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

所述YPD培养基为通用的完全培养基，固体培养基含2％进口琼脂粉。

所述mae1基因其Gene ID为：2543334，核苷酸序列如表中SEQ NO:1所示；所述mleS基因其Gene ID为：1114530，核苷酸序列如表中SEQ NO:2所示；所述Gal80基因其Gene ID为：854954，核苷酸序列如表中SEQ NO:3所示；所述启动子PGK1其Gene ID为：850370，核苷酸序列如表中SEQ ID NO:4所示；KanMX基因的核苷酸序列如表中SEQ ID NO:5所示。

根据Genebank中的酵母基因组数据和整合质粒序列，设计了下述引物。

表1本实施例中所用到的引物

注：下划线部分为酶切位点。

表2本实施例中所用的PCR扩增体系

实施例1

过表达苹果酸通透酶和苹果酸乳酸酶的葡萄汁酵母的构建

(1)重组质粒Yep-KPm1S的构建

重组质粒Yep-Pm1的构建流程如图1所示；

以质粒pPGK1为模板，PGK-F(SEQ ID NO:5)和PGK-R(SEQ ID NO:6)为引物，PCR扩增PGK1基因片段(SEQ ID NO:4)，PCR反应条件：95℃5min；94℃40s，56℃1min，72℃108s，30个循环；72℃10min。用限制性内切酶BamHI和SalI对质粒Yep532和PGK1基因片段进行酶切，将两者连接构建质粒Yep-P；以粟酒裂殖酵母CICC1757菌株基因组为模板，使用mae1-F(SEQID NO:7)和mae1-R(SEQ ID NO:8)为引物，PCR扩增得到片段mae1(SEQ ID NO:1)，PCR反应条件：95℃5min；94℃40s，56℃1min，72℃108s，30个循环；72℃10min。将该片段与经XhoI酶切后的Yep-P质粒通过同源重组而连接，构建质粒Yep-Pm1；以乳酸乳球菌NZ9000菌株基因组为模板，使用mleS-F(SEQ ID NO:9)和mleS-R(SEQ ID NO:10)为引物，PCR扩增得到片段mleS(SEQ ID NO:2)，PCR反应条件：95℃5min；94℃40s，56℃1min，72℃108s，30个循环；72℃10min。将该片段与经XhoI酶切后的Yep-P质粒通过同源重组而连接，构建质粒Yep-PS；以质粒Yep-PS为模板，使用PGK_(SmaI)-F(SEQ ID NO:11)和PGK_(SmaI)-R(SEQ ID NO:12)为引物，PCR扩增得到片段PGK1p-mleS-PGK1t片段，PCR反应条件：95℃5min；94℃40s，56℃1min，72℃108s，30个循环；72℃10min。将该片段与经SmaI酶切后的Yep-Pm1质粒通过同源重组而连接，构建质粒Yep-Pm1S；以质粒pUG6为模板，K-F(SEQ ID NO:13)和K-R(SEQ ID NO:14)为引物，PCR扩增筛选标记KanMX基因片段，PCR反应条件：95℃5min；94℃40s，57℃1min，72℃100s，30个循环；72℃10min。用限制性内切酶ApaI对质粒Yep-Pm1S进行酶切后与KanMX基因片段通过同源重组连接，构建质粒Yep-KPm1S。

PCR验证结果如图2所示，其中M为marker；泳道1为以Yep352为模板，YP-F(SEQ IDNO:21)和YP-R(SEQ ID NO:22)为引物PCR扩增结果，泳道2为以Yep-P为模板，YP-F(SEQ IDNO:21)和YP-R(SEQ ID NO:22)为引物PCR扩增的PGK1基因片段，质粒Yep-P可PCR扩增出PGK1基因片段而Yep352不能，说明基因PGK1成功连接于质粒Yep352上，质粒Yep-P构建成功；泳道3为以Yep-P为模板，Ymae1-F(SEQ ID NO:23)和Ymae1-R(SEQ ID NO:24)为引物PCR扩增结果，泳道4为Yep-Pm1为模板，Ymae1-F(SEQ ID NO:23)和Ymae1-R(SEQ ID NO:24)为引物PCR扩增的mae1基因片段，质粒Yep-Pm1可PCR扩增出mae1基因片段而Yep-P不能，说明基因mae1成功连接于质粒Yep-P上，质粒Yep-Pm1构建成功；泳道5为以Yep-P为模板，YmleS-F(SEQ ID NO:25)和YmleS-R(SEQ ID NO:26)为引物PCR扩增的结果，泳道6为以Yep-PS为模板，YmleS-F(SEQ ID NO:25)和YmleS-R(SEQ ID NO:26)为引物PCR扩增的mleS基因片段，质粒Yep-PS可PCR扩增出mleS基因片段而Yep-P不能，说明基因mleS成功连接于质粒Yep-P上，质粒Yep-PS构建成功；泳道7为以Yep-Pm1为模板，SmaI-F(SEQ ID NO:27)和SmaI-R(SEQ IDNO:28)为引物PCR扩增的结果，泳道8为以Yep-Pm1S为模板，SmaI-F(SEQ ID NO:27)和SmaI-R(SEQ ID NO:28)为引物PCR扩增的片段，质粒Yep-Pm1S可PCR扩增出PGKp-mleS-PGKt基因片段而Yep-Pm1不能，说明基因片段PGKp-mleS-PGKt成功连接于质粒Yep-Pm1上，质粒Yep-Pm1S构建成功；泳道9为以Yep-Pm1S为模板，YK-F(SEQ ID NO:29)和YK-R(SEQ ID NO:30)为引物PCR扩增结果，泳道10为以Yep-Pm1SK为模板，YK-F(SEQ ID NO:29)和YK-R(SEQ ID NO:30)为引物PCR扩增的KanMX基因片段，质粒Yep-Pm1SK可PCR扩增出KanMX基因片段而Yep-Pm1S不能，说明基因片段KanMX成功连接于质粒Yep-Pm1S上，质粒Yep-Pm1SK构建成功。

(2)重组菌株WYm1S的构建

以质粒Yep-KPm1S为模板，mS-F(SEQ ID NO:19)和mS-R(SEQ ID NO:20)为引物，PCR扩增含有基因Gal80上下游同源臂的基因片段A-PGKp-mae1-PGKt-PGKp-mleS-PGKt-KanMX-B，PCR反应条件：95℃5min；94℃40s，56℃1min，72℃108s，30个循环；72℃10min。

用醋酸锂转化法将PCR产物转入出发菌株CICC1465中，通过G418抗性筛选重组菌株WYm1S，提取该重组菌株和出发菌株CICC1465的基因组，分别在Gal80基因上游外部和下游外部设计引物YA-F(SEQ ID NO:31)和YB-R(SEQ ID NO:34)，在基因片段PGKp-mae1-PGKt-PGKp-mleS-PGKt-KanMX中设计引物YA-R(SEQ ID NO:32)和YB-F(SEQ ID NO:33)。分别以各基因组为模板，以YA-F(SEQ ID NO:31)/YA-R(SEQ ID NO:32)为引物进行PCR，其中重组菌株WYm1S基因组可扩增出大小约为860bp片段，且与预期的目的产物大小一致，而出发菌株则不能扩增得到相应片段，PCR验证结果如图3(a)所示，其中M为marker，泳道1为以出发菌株CICC1465为模板，YA-F(SEQ ID NO:31)和YA-R(SEQ ID NO:32)为引物PCR扩增结果，泳道2为以WYm1S为模板，YA-F(SEQ ID NO:31)和YA-R(SEQ ID NO:32)为引物PCR扩增的基因片段；以YB-F(SEQ ID NO:33)/YB-R(SEQ ID NO:34)进行PCR，重组菌株WYm1S基因组可扩增出大小约1400bp片段，且与预期的目的产物大小一致，而出发菌株则不能扩增得到相应片段，PCR验证结果如图3(b)所示，其中M为marker，泳道1为以出发菌株CICC1465为模板，YB-F(SEQ ID NO:33)/YB-R(SEQ ID NO:34)为引物PCR扩增结果，泳道2为以WYm1S为模板，YB-F(SEQ ID NO:33)/YB-R(SEQ ID NO:34)为引物PCR扩增的基因片段，说明基因片段PGKp-mae1-PGKt-PGKp-mleS-PGKt-KanMX已成功整合到基因Gal80的位置，菌株WYm1S构建成功。

实施例2

低产高级醇葡萄汁酵母菌株发酵实验

(1)重组菌株与出发菌株的葡萄酒发酵实验

①发酵工艺路线图：

葡萄原料；筛选、清洗、晾干、除梗；破碎；调糖、调酸；加亚硫酸、灭菌；接菌；前发酵；皮渣分离；测定指标。

②工艺条件：糖度：20.45Brix；酸度：pH 3.5；SO₂添加量：80mg/L，4℃静置12h；装液量：250mL的三角瓶装190mL葡萄汁；接菌量：1×10⁸CFU/mL；发酵温度和时间：25℃，5d；蒸酒条件：100mL发酵液，加100mL水，蒸出100mL酒样。

按上述发酵工艺对葡萄汁酵母出发菌株CICC1465和选育实施例的菌株WY-m1S进行葡萄酒发酵实验；发酵期间每隔12h振荡并称重，记录失重；发酵结束后，停止培养并称重；用温度计和酒度计测定馏出液的温度和酒精度，并将该温度下的酒精度换算成20℃下对应的酒精度，应用斐林试剂法测定葡萄酒中的还原糖含量，结果如表3。表3表明：在葡萄酒发酵实验中，本发明所获得的葡萄汁酵母重组菌株WY-m1S与出发菌株CICC 1465相比，基本发酵性能没有太大变化。

表3亲本菌株和重组菌株的发酵性能测定

注：所示数据为三个平行试验结果的平均值。

(2)苹果酸和高级醇含量测定

发酵后葡萄酒中苹果酸和高级醇含量分别以高效液相色谱(HPLC)和气相色谱(GC)方法进行测定，HPLC分析：葡萄酒发酵液经0.22μm的纤维滤膜过滤后进行高效液相色谱分析。色谱条件为：色谱柱为Bio-Rad HPX-87H，300×7.8mm；检测器为示差折光检测器(RID)；流动相为5mmol/L硫酸，流速为0.6mL/min；检测器温度为45℃，柱温为65℃，进样量为20μl；GC分析：发酵液经蒸馏后，酒样进行高效气相色谱分析，色谱条件为：气相色谱仪为Agilent 7890C，并且配置有Agilent G4512A自动进样器，色谱柱Agilent 1909N-213，30m×0.32mm×0.5μm毛细血管柱，检测器为FID。进样口的温度设置为200℃，检测器的温度为200℃。进样量条件：1μL的进样量，并设置为5:1的分流比。载气为高纯度的氮气，流速设置为2.0mL/min。升温程序：起始柱温设置为50℃，保持8min，再以5℃/min的升温速度上升至120℃，保持5min。测定结果见表4。

表4表明：重组菌株WY-m1S发酵后葡萄酒异丁醇为、异戊醇和苯乙醇含量分别为28.184mg/L、171.756mg/L和13.604mg/L，相比于出发菌株分别降低了20.28％、14.77％和11.26％，高级醇(异丁醇、异戊醇、苯乙醇)总含量为213.54mg/L，相比于出发菌株降低了15.33％。且本发明得到重组菌株WYm1S的苹果酸生成量达到了1.130mg/L，几乎与含有乳酸菌发酵的葡萄酒中苹果酸含量相一致。这说明本发明得到的菌株可以在很大程度上降低葡萄酒中高级醇含量，且在酒精发酵期间即可强有效的降解苹果酸含量，进而消除乳酸菌发酵的影响，大大缩短了葡萄酒发酵周期，同时为丰富葡萄酒口感，提高葡萄酒的风味质量，提供了理论基础。

表4亲本菌株和重组菌株的苹果酸和高级醇含量(单位mg/L)

注：所示数据为三个平行试验结果的平均值。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种低产高级醇和强降解苹果酸的葡萄汁酵母菌株及其应用

<160> 35

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1946

<212> DNA

<213> 粟酒裂殖酵母苹果酸通透酶基因mae1(Unknown)

<400> 1

ttcattttct ctcttggcca ctattttttt ttttaattcc cctttatctc tcgattcgac 60

atgggtgaac tcaaggaaat cttgaaacag aggtatcatg agttgcttga ctggaatgtc 120

aaagcccctc atgtccctct cagtcaacga ctgaagcatt ttacatggtc ttggtttgca 180

tgtactatgg caactggtgg tgttggtttg attattggtt ctttcccctt tcgattttat 240

ggtcttaata caattggcaa aattgtttat attcttcaaa tctttttgtt ttctctcttt 300

ggatcatgca tgctttttcg ctttattaaa tatccttcaa ctatcaagga ttcctggaac 360

catcatttgg aaaagctttt cattgctact tgtcttcttt caatatccac gttcatcgac 420

atgcttgcca tatacgccta tcctgatacc ggcgagtgga tggtgtgggt cattcgaatc 480

ctttattaca tttacgttgc agtatccttt atatactgcg taatggcttt ttttacaatt 540

ttcaacaacc atgtatatac cattgaaacc gcatctcctg cttggattct tcctattttc 600

cctcctatga tttgtggtgt cattgctggc gccgtcaatt ctacacaacc cgctcatcaa 660

ttaaaaaata tggttatctt tggtatcctc tttcaaggac ttggtttttg ggtttatctt 720

ttactgtttg ccgtcaatgt cttacggttt tttactgtag gcctggcaaa accccaagat 780

cgacctggta tgtttatgtt tgtcggtcca ccagctttct caggtttggc cttaattaat 840

attgcgcgtg gtgctatggg cagtcgccct tatatttttg ttggcgccaa ctcatccgag 900

tatcttggtt ttgtttctac ctttatggct atttttattt ggggtcttgc tgcttggtgt 960

tactgtctcg ccatggttag ctttttagcg ggctttttca ctcgagcccc tctcaagttt 1020

gcttgtggat ggtttgcatt cattttcccc aacgtgggtt ttgttaattg taccattgag 1080

ataggtaaaa tgatagattc caaagctttc caaatgtttg gacatatcat tggggtcatt 1140

ctttgtattc agtggatcct cctaatgtat ttaatggtcc gtgcgtttct cgtcaatgat 1200

ctttgctatc ctggcaaaga cgaagatgcc catcctccac caaaaccaaa tacaggtgtc 1260

cttaacccta ccttcccacc tgaaaaagca cctgcatctt tggaaaaagt cgatacacat 1320

gtcacatcta ctggtggtga atcggatcct cctagtagtg aacatgaaag cgtttaagct 1380

tgtatgcttt tccttaattt ttctataaat ctgtgtgccc tgctcttaat accattatag 1440

attaatcatt ttgaatcatt ctgtatcttt attgtactac tggtactaat tttgcttaga 1500

catttttgct ccttcttctt ctttttgttt aaattataca taccaaaatt ttggactttg 1560

aataatggta atttttggtt gtcgtagtgt taaatatgta tgcgtcttgc atatgaatca 1620

cgacgaagga atcaattaaa aaatcaatcc tgtacataat aaaattaagt ttatttattt 1680

cattttatcg gatttaatcg tctaaaattt atatcttggt catccaagct tatatctctt 1740

tctactctta tcagcagcac actttagtta tggttatttg aaaacttgtg tataaattcc 1800

tggttataga gaaaatgagt ataagacaac aaaaaaaagc ctagtcggca tgcgacatgt 1860

ctcaaacata tctttggcgt attgatgagc atcttacaca ctcactatac gtaacaataa 1920

aattaagagg gatttcatga caaaag 1946

<210> 2

<211> 1623

<212> DNA

<213> 乳酸乳球菌苹果酸乳酸酶基因mleS(Unknown)

<400> 2

atgcgtgcac atgaaatttt aaacaatcct tttttaaata aaggaacagc ttttactatg 60

aaagaacgtc aagaattggg gttgattggt cttcttccac caactgttca aacaattgag 120

gaacaagctg aacaaactta cgaacaatat ttgacaaaac catctgattt agaaaaacgt 180

catttcttga tggaaatttt taatacaaac cgtactttgt tttactactt attcaacaaa 240

catattgtag aatttaatcc agttgtttat gatccaacaa ttgctgatac aattgaaaac 300

tacagtcatt tgttcgtaga tccacaatat gctgcttatc ttgatattaa ccaccctgaa 360

aacattactg aaacattgaa aaatgcagca ggtgacagag aaattcgtct tattgttgta 420

actgatgctg aaggaatcct tggtattgga gactggggaa ctcaaggtgt tgatatctca 480

gttggtaaat taatgattta tacagccgca gcaggtattg atccagcgtc tgtacttcca 540

gttgttattg atgcaggaac aaatagaaaa gaacttttag aagatcattt gtatcttgga 600

aatcatcaag aacgtattta cggtgatcaa tactacagtt tcgtcgatca atttgtagaa 660

actgcagaat caattttccc taaattgtac cttcactggg aagatttcgg acgttcaaat 720

gctgcaacaa ttttaaataa ctacaaaaca aaaatcccaa catttaatga tgacattcaa 780

ggaactggta ttgttgtttt aggtggtatt ttcggatcac ttgacattac aggtgaaaaa 840

ttaactgatc aagtatatct ttgctatggt ggtggttcag ccggtgcagg gattgctggt 900

cgtgttcatg ctgaaatggt tagtgaaggt ctttctgaag aagaagctta caaacatttc 960

ttcatgattg atcaacaagg tttacttttt gatgatatgg aagaccttac accagctcaa 1020

aaaccatttg ctaaaaaacg tgctgattat aaagatgctg gagatatgac tgaccttctt 1080

aacgttgtta agacagtaaa accaactatt ttagtaggaa cttcaactaa tccaggtgcc 1140

tttacaaaag aagttgttga agcaatgtgt gctaatacag aacgcccagt aatcttccct 1200

atctcaaatc caactaaaaa aatggaaact acagctgaac aagttattga gtggtctgat 1260

ggaaaagctt ttgtcgctac tggtgttcct tcaggaacaa tcagctacaa aggtgttgat 1320

tatcaaattg gtcaagcaaa taactcactt atctacccag gtttgggctt aggaatgttg 1380

gcatctgaag caaaactttt gacagatgaa atgatcggtg cagctgcaca ttcattgagc 1440

ggtttagtag atccaggtaa accaggtgct cctgttcttc ctccatttga atttgttgct 1500

gatgtatcaa ttaaagttgc agaagcagtt gctaagaaag ctcaagaaca aggtcttact 1560

gaatctaaag aaactgatat ggctaaagca gttcgtgatc ttaaatggta tccagagtac 1620

taa 1623

<210> 3

<211> 1308

<212> DNA

<213> 葡萄汁酵母菌株的Gal80基因(Unknown)

<400> 3

atggactaca acaagagatc ttcggtctca accgtgccta atgcagctcc cataagagtc 60

ggattcgtcg gtctcaacgc agccaaagga tgggcaatca agacacatta ccccgccata 120

ctgcaactat cgtcacaatt tcaaatcact gccttataca gtccaaaaat tgagacttct 180

attgccacca ttcagcgtct aaaattgagt aatgccactg cttttcccac tttagagtca 240

tttgcatcat cttccactat agatatgata gtgatagcta tccaagtggc cagccattat 300

gaagttgtta tgcctctctt ggaattctcc aaaaataatc cgaacctcaa gtatcttttc 360

gtagaatggg cccttgcatg ttcactagat caagccgaat ccatttataa ggctgctgct 420

gaacgtgggg ttcaaaccat catctcttta caaggtcgta aatcaccata tattttgaga 480

gcaaaagaat taatatctca aggctatatc ggcgacatta attcgatcga gattgctgga 540

aatggcggtt ggtacggcta cgaaaggcct gttaaatcac caaaatacat ctatgaaatc 600

gggaacggtg tagatctggt aaccacaaca tttggtcaca caatcgatat tttacaatac 660

atgacaagtt cgtacttttc caggataaat gcaatggttt tcaataatat tccagagcaa 720

gagctgatag atgagcgtgg taaccgattg ggccagcgag tcccaaagac agtaccggat 780

catcttttat tccaaggcac attgttaaat ggcaatgttc cagtgtcatg cagtttcaaa 840

ggtggcaaac ctaccaaaaa atttaccaaa aatttggtca ttgacattca cggtaccaag 900

ggagatttga aacttgaagg cgatgccggc ttcgcagaaa tttcaaatct ggtcctttac 960

tacagtggaa ctagagcaaa cgacttcccg ctagccaatg gacaacaagc tcctttagac 1020

ccggggtatg atgcaggtaa agaaatcatg gaagtatatc atttacgaaa ttataatgcc 1080

attgtgggta atattcatcg actgtatcaa tctatctctg acttccactt caatacaaag 1140

aaaattcctg aattaccctc acaatttgta atgcaaggtt tcgatttcga aggctttccc 1200

accttgatgg atgctctgat attacacagg ttaatcgaga gcgtttataa aagtaacatg 1260

atgggctcca cattaaacgt tagcaatatc tcgcattata gtttataa 1308

<210> 4

<211> 1737

<212> DNA

<213> 质粒pPGK1(Unknown)

<400> 4

tctaactgat ctatccaaaa ctgaaaatta cattcttgat taggtttatc acaggcaaat 60

gtaatttgtg gtattttgcc gttcaaaatc tgtagaattt tctcattggt cacattacaa 120

cctgaaaata ctttatctac aatcatacca ttcttataac atgtcccctt aatactagga 180

tcaggcatga acgcatcaca gacaaaatct tcttgacaaa cgtcacaatt gatccctccc 240

catccgttat cacaatgaca ggtgtcattt tgtgctctta tgggacgatc cttattaccg 300

ctttcatccg gtgatagacc gccacagagg ggcagagagc aatcatcacc tgcaaaccct 360

tctatacact cacatctacc agtgtacgaa ttgcattcag aaaactgttt gcattcaaaa 420

ataggtagca tacaattaaa acatggcggg cacgtatcat tgcccttatc ttgtgcagtt 480

agacgcgaat ttttcgaaga agtaccttca aagaatgggg tctcatcttg ttttgcaagt 540

accactgagc aggataataa tagaaatgat aatatactat agtagagata acgtcgatga 600

cttcccatac tgtaattgct tttagttgtg tatttttagt gtgcaagttt ctgtaaatcg 660

attaattttt ttttctttcc tctttttatt aaccttaatt tttattttag attcctgact 720

tcaactcaag acgcacagat attataacat ctgcacaata ggcatttgca agaattactc 780

gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 840

gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 900

ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 960

aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaaaaaac ccagacacgc 1020

tcgacttcct gtcttcctat tgattgcagc ttccaatttc gtcacacaac aaggtcctag 1080

cgacggctca caggttttgt aacaagcaat cgaaggttct ggaatggcgg gaaagggttt 1140

agtaccacat gctatgatgc ccactgtgat ctccagagca aagttcgttc gatcgtactg 1200

ttactctctc tctttcaaac agaattgtcc gaatcgtgtg acaacaacag cctgttctca 1260

cacactcttt tcttctaacc aagggggtgg tttagtttag tagaacctcg tgaaacttac 1320

atttacatat atataaactt gcataaattg gtcaatgcaa gaaatacata tttggtcttt 1380

tctaattcgt agtttttcaa gttcttagat gctttctttt tctctttttt acagatcatc 1440

aaggaagtaa ttatctactt tttacaacaa atataaaacc gatagatcaa tttttttctt 1500

ttctctttcc ccatccttta cgctaaaata atagtttatt ttattttttg aatatttttt 1560

atttatatac gtatatatag actattattt atcttttaat gattattaag atttttatta 1620

aaaaaaaatt cgctcctctt ttaatgcctt tatgcagttt ttttttccca ttcgatattt 1680

ctatgttcgg gttcagcgta ttttaagttt aataactcga aaattctgcg ttcgtta 1737

<210> 5

<211> 1613

<212> DNA

<213> 质粒pUG6(Unknown)

<400> 5

cagctgaagc ttcgtacgct gcaggtcgac aacccttaat ataacttcgt ataatgtatg 60

ctatacgaag ttattaggtc tagagatctg tttagcttgc ctcgtccccg ccgggtcacc 120

cggccagcga catggaggcc cagaataccc tccttgacag tcttgacgtg cgcagctcag 180

gggcatgatg tgactgtcgc ccgtacattt agcccataca tccccatgta taatcatttg 240

catccataca ttttgatggc cgcacggcgc gaagcaaaaa ttacggctcc tcgctgcaga 300

cctgcgagca gggaaacgct cccctcacag acgcgttgaa ttgtccccac gccgcgcccc 360

tgtagagaaa tataaaaggt taggatttgc cactgaggtt cttctttcat atacttcctt 420

ttaaaatctt gctaggatac agttctcaca tcacatccga acataaacaa ccatgggtaa 480

ggaaaagact cacgtttcga ggccgcgatt aaattccaac atggatgctg atttatatgg 540

gtataaatgg gctcgcgata atgtcgggca atcaggtgcg acaatctatc gattgtatgg 600

gaagcccgat gcgccagagt tgtttctgaa acatggcaaa ggtagcgttg ccaatgatgt 660

tacagatgag atggtcagac taaactggct gacggaattt atgcctcttc cgaccatcaa 720

gcattttatc cgtactcctg atgatgcatg gttactcacc actgcgatcc ccggcaaaac 780

agcattccag gtattagaag aatatcctga ttcaggtgaa aatattgttg atgcgctggc 840

agtgttcctg cgccggttgc attcgattcc tgtttgtaat tgtcctttta acagcgatcg 900

cgtatttcgt ctcgctcagg cgcaatcacg aatgaataac ggtttggttg atgcgagtga 960

ttttgatgac gagcgtaatg gctggcctgt tgaacaagtc tggaaagaaa tgcataagct 1020

tttgccattc tcaccggatt cagtcgtcac tcatggtgat ttctcacttg ataaccttat 1080

ttttgacgag gggaaattaa taggttgtat tgatgttgga cgagtcggaa tcgcagaccg 1140

ataccaggat cttgccatcc tatggaactg cctcggtgag ttttctcctt cattacagaa 1200

acggcttttt caaaaatatg gtattgataa tcctgatatg aataaattgc agtttcattt 1260

gatgctcgat gagtttttct aatcagtact gacaataaaa agattcttgt tttcaagaac 1320

ttgtcatttg tatagttttt ttatattgta gttgttctat tttaatcaaa tgttagcgtg 1380

atttatattt tttttcgcct cgacatcatc tgcccagatg cgaagttaag tgcgcagaaa 1440

gtaatatcat gcgtcaatcg tatgtgaatg ctggtcgcta tactgctgtc gattcgatac 1500

taacgccgcc atccagtgtc gaaaacgagc tctcgagaac ccttaatata acttcgtata 1560

atgtatgcta tacgaagtta ttaggtgata tcagatccac tagtggccta tgc 1613

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> PGK-F(Unknown)

<400> 6

cgcggatcct ctaactgatc tatccaaaac tg 32

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> PGK-R(Unknown)

<400> 7

acgcgtcgac taacgaacgc agaattttcg ag 32

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> mae1-F(Unknown)

<400> 8

gaattccaga tctcctcgag ttcattttct ctcttggcca c 41

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> mae1-R(Unknown)

<400> 9

tctatcgcag atccctcgag cttttgtcat gaaatccctc tta 43

<210> 10

<211> 39

<212> DNA

<213> mleS-F(Unknown)

<400> 10

gaattccaga tctcctcgag atgcgtgcac atgaaattt 39

<210> 11

<211> 45

<212> DNA

<213> mleS-R(Unknown)

<400> 11

tctatcgcag atccctcgag ttagtactct ggataccatt taaga 45

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> PGK(SmaI)-F(Unknown)

<400> 12

cggcccgggt ctaactgatc tatccaaaa 29

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> PGK(SmaI)-R(Unknown)

<400> 13

cggcccgggt aacgaacgca gaattttcg 29

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> K-F(Unknown)

<400> 14

ccgctaacaa tacctgggcc ccagctgaag cttcgtacgc 40

<210> 15

<211> 42

<212> DNA

<213> K-R(Unknown)

<400> 15

gcacacggtg tggtgggccc gcataggcca ctagtggatc tg 42

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> A-F(Unknown)

<400> 16

gtgcctctat gatgggtatg 20

<210> 17

<211> 42

<212> DNA

<213> A-R(Unknown)

<400> 17

taccgagctc gaattcgtaa taagaacggg aaaccaacta tc 42

<210> 18

<211> 39

<212> DNA

<213> B-F(Unknown)

<400> 18

tccactagtg gcctatgcac cttgatggat gctctgata 39

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> B-R(Unknown)

<400> 19

attcctggag aaccacctaa 20

<210> 20

<211> 42

<212> DNA

<213> mS-F(Unknown)

<400> 20

gatagttggt ttcccgttct tattacgaat tcgagctcgg ta 42

<210> 21

<211> 40

<212> DNA

<213> mS-R(Unknown)

<400> 21

tatcagagca tccatcaagg tgcataggcc actagtggat 40

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> YP-F(Unknown)

<400> 22

tctaactgat ctatccaaaa ctga 24

<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> YP-R(Unknown)

<400> 23

taacgaacgc agaattttc 19

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> Ymae1-F(Unknown)

<400> 24

atgggcttgt taacgaaagt tgcta 25

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> Ymae1-R(Unknown)

<400> 25

tcaagcatct aaaacacaac cgttg 25

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> YmleS-F(Unknown)

<400> 26

atgttgagaa ctcaagccgc cag 23

<210> 27

<211> 23

<212> DNA

<213> YmleS-R(Unknown)

<400> 27

ttattggttt tctggtctca act 23

<210> 28

<211> 17

<212> DNA

<213> SmaI-F(Unknown)

<400> 28

ttcgagctcg gtacccg 17

<210> 29

<211> 18

<212> DNA

<213> SmaI-R(Unknown)

<400> 29

agttagagga tccccggg 18

<210> 30

<211> 19

<212> DNA

<213> YK-F(Unknown)

<400> 30

cagctgaagc ttcgtacgc 19

<210> 31

<211> 22

<212> DNA

<213> YK-R(Unknown)

<400> 31

gcataggcca ctagtggatc tg 22

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> YA-F(Unknown)

<400> 32

gatcatcgta gtgcccaatt 20

<210> 33

<211> 19

<212> DNA

<213> YA-R(Unknown)

<400> 33

gtaccgagct cgaattcgt 19

<210> 34

<211> 19

<212> DNA

<213> YB-F(Unknown)

<400> 34

ggtttggttg atgcgagtg 19

<210> 35

<211> 21

<212> DNA

<213> YB-R(Unknown)

<400> 35

ccattcatcg tgttgttttg g 21

Claims (7)

1.一种低产高级醇和强降解苹果酸的葡萄汁酵母菌株，其特征在于：在葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)CICC1465中导入异源表达粟酒裂殖酵母的苹果酸通透酶基因mae1和乳酸乳球菌的苹果酸乳酸酶基因mleS。

2.权利要求1所述的一种低产高级醇和强降解苹果酸的葡萄汁酵母菌株，其特征在于：所述mae1基因的核苷酸序列如表中SEQ ID NO:1所示；所述mleS基因的核苷酸序列如表中SEQ ID NO:2所示。

3.权利要求1所述的一种低产高级醇和强降解苹果酸的葡萄汁酵母菌株，其特征在于：所述启动子PGK1基因的核苷酸序列如表中SEQ ID NO:4所示。

4.权利要求1所述的一种低产高级醇和强降解苹果酸的葡萄汁酵母菌株，其特征在于：以KanMX基因作为筛选标记，将基因苹果酸通透酶基因mae1和乳酸乳球菌的苹果酸乳酸酶基因mleS分别在启动子PGK1的调控下同时整合至Gal80基因位点上。

5.权利要求4所述的一种低产高级醇和强降解苹果酸的葡萄汁酵母菌株，其特征在于：所述KanMX基因的核苷酸序列如表中SEQ ID NO:5所示。

6.一种低产高级醇和强降解苹果酸的葡萄汁酵母菌株的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)重组片段的构建

①将启动子基因PGK1连接于质粒Yep352的BamHI和SalI酶切位点处，构建质粒Yep-P；

②将基因片段mae1和mleS通过同源重组原理分别整合至质粒Yep-P的基因PGK1的XhoI位点构建质粒Yep-Pm1和Yep-PS；

③将质粒Yep-PS上的PGKp-mleS-PGKt基因片段和质粒Yep-Pm1分别通过SmaI酶切而连接构建质粒Yep-Pm1S；

④将筛选标记基因片段KanMX通过同源重组原理整合至质粒Yep-Pm1S的ApaI位点构建质粒Yep-Pm1SK；

(2)异源表达mae1和mleS的重组菌株的构建

①以葡萄汁酵母为模板，PCR扩增Gal80上游同源臂和下游同源臂基因，以质粒Yep-Pm1SK为模板，PCR扩增PGK1-mae1-PGK1-mleS-KanMX基因；

②将PGK1-mae1-PGK1-mleS-KanMX基因的PCR产物导入葡萄汁酵母CICC1465中，获得同时表达mae1和mleS基因的重组菌株WYm1S。

7.权利要求1所述的低产高级醇和强降解苹果酸的葡萄汁酵母菌株在发酵葡萄酒中的应用。

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