JPH07509372A - 酵母凝集性遺伝子及びそれを含有する酵母 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

酵母凝集性遺伝子及びそれを含有する酵母技術分野 本発明は凝集性酵母の凝集性遺伝子及びそれを含有する酵母に関する。 従来の技術 発酵産業において酵母の凝集性産業上重要な現象であり、凝集性酵母の利用も検 討され、この凝集性の原因について多くの研究が行われている。酵母の凝集性は 複数の遺伝子によって制御されていることが知られていて、その中でも酵母第１ 染色体の右腕にマツプされている凝集性遺伝子はＦＬＯＩと呼ばれていて比較的 よく研究されている。 酵母サツカロマイセス・セレビシェ由来の凝集性遺伝子ＦＬＯＩの構造について は従来全く未知であったが、１９８９年に発明者等に初めてクローン化され、そ の制限酵素開裂地図も明らかにされている

【渡等、アグリカルチュラル・アンド ・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）、 ５３巻、３号、９０１−９０３頁（１９８９）］（但し、塩基配列は未知であっ た）。 この凝集性遺伝子ＦＬＯＩを各種産業用酵母に導入して、非凝集性の産業用酵母 を凝集性の実用酵母に改変することが可能であることを発明者等は報告したが［ 渡等、アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉ ｃ、　Ｂｉｏｌ。 Ｃｈｅｍ、）、５５巻、６号、１５４７−１５５２頁（１９９１）ｌ必ずしも全 ての産業用酵母に強力かつ安定な凝集性を付与することはできなかった。 本発明者らはその後ＦＬＯＩ遺伝子の研究を鋭意進めていく上で、以前発明者等 がＦＬＯ１遺伝子と報告した遺伝子［ａ等、アグリカルチュラル・アンド・バイ オロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）、５３巻 、３号、９０１−９０３頁（１９８９）］は酵母サツカロマイセス・セレビシェ ＡＢＸＬ−ＩＤ株の第Ｉ染色体上のインタクトなＦＬＯＩ遺伝子ではなく、大腸 菌エシェリヒア・コリに１２株中でインタクトなＦＬＯＩ遺伝子を含むプラスミ ドを保持中に、ＦＬＯｌ）ｆｉ伝子の一部が欠失したもの（以後、この遺伝子を ＦＬＯＩＳと呼ぶ）であることを見出した。 発明の開示 本発明は、インタクトなＦＬＯＩ遺伝子（以後、この遺伝子をＦＬＯＩＬと呼ぶ ）の構造を明らかにし、各種産業用酵母に、より強力かつ安定な凝集特性を付与 する技術を提供することを目的とするものである。 そこで本発明者等は、ＦＬＯＩ遺伝子について種々検討した結果、インタクトな ＦＬＯＩ遺伝子、すなわちＦＬＯＩＬ遺伝子を単離することに成功し、また本遺 伝子の全塩基配列を明らかにし、さらにこのＦＬＯＩＬ遺伝子を用し１てＦＬＯ ＩＳを用しまた場合に比べて、より強力で安定な凝集力を有する各種実用酵母の 育種を行うことが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。 すなわち本発明は、酵母において凝集活性を示すポリペプチドをコードする４、 ７±０．２ｋｂの凝集性遺伝子であり、具体的には酵母サツカロマイセス・セレ ビシェに由来し、図１の制限酵素開裂地図で規定される上記凝集性遺伝子であり 、さらに具体０つには、配列番号１に示されるアミノ酸配列を実′ｆｔ的にコー ドする上３己凝集性遺伝子である。 本発明はまた、酵母において凝集活性を示すポリペプチドをコードする２、６± ０．２ｋｂの凝集性遺伝子であり、具体的には酵母サツカロマイセス・セレビシ ェに由来し、図２の制限酵素開裂地図で規定される上記凝集性遺伝子であり、さ らに具体的には、配列番号２に示されるアミノ酸配列を実質的にコードする上記 凝集性遺伝子である。 本発明はさらに、上記された１疑集性遺伝子のｂｌずれかを含有し、凝集性を有 する酵母に関する。 水明細書中で記す凝集性遺伝子とは、酵母の凝集性を支配する遺伝子を意味する 。 発明の効果 上述゛−たことから明らかな如く、本発明による凝集遺伝子は、非凝集性の酵母 →ノカロマイセス、セレビシェに凝集特性を付与することができる。ここで、発 酵産業にＪ３いて、凝集性酵母を使用するき義は、１）発酵移了後番二発酵液と 菌イ本を速やかに分離することができ、遠心分子Ｉｔ機の使用等酵母を発酵液か ら分離する余計な操作を必要とせずプロセスが単純化できる、２）発酵液の清澄 度が高いので、最終的な発酵液のろ適時の負担が少なく生産性が向上する、３） 固定化菌体と同様に連続発酵が可能でしかもリアクター等の特殊な装置が不要で ある、等である。また、凝集性酵母の育種は、従来、自然あるいは人為的突然変 異株誘導法・交配法・細胞融合法等が試みられてきたが、これらの方法は育種す べき元株の遺伝的性質の変化を必然的に伴い、これらの方法は通常元株の好まし い性質までも損なうことがしばしば報告されている。しかし、本発明によれば、 本発明の遺伝子を育種すべき株に導入するだけでその凝集性を向上させることが 可能であり、元株の有する他の好ましい性質を損なうことはない点が、最大の長 所である。 図面の簡単な説明 図１ 本発明によるＦＬＯＩＬ遺伝子の制限酵素開裂地図である。 図中、ＡｃはＡｃｃｌ、　ＢｇはＢｇｌＩＩ、ＲＶはＥｃｏＲＶ、　ＫはＫｐｎ ｌ、　ＰｖはＰｖｕＩＩの各制限酵素の切断部位を示す。 図２ 本発明によるＦＬ○ＩＳ遺伝子の制限酵素開裂地図である。 図中、ＡｃはＡｃｃｌ、　ＢｇはＢｇｌＩＩ、ＲＶはＥｃｏＲＶ、　ＫはＫｐｎ ｌ、　ＰｖはＰｖｕＩＩの各制限酵素の切断部位を示す。 図３ ・凝集性遺伝子ＦＬＯＩＳ及びＦＬＯＩＬ遺伝子を含む酵母の直接選抜用プラス ミドＹＲｐＧＬＦ１４Ｓ及びＹＲｐＧＬＦ８Ｌの作成のフローチャートである。 図４ ＹＣｐＨＦ１９Ｓ（２０，０ＯＫｂ）を示す図５ ＹＩｐＨＦ１９Ｓ（１５，８０Ｋｂ）を示す。 図６ ＹＣｐＨＦ１９ＳのＦＬＯＩＳ遺伝子を含む５．８ＫｂのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ 断片を示す。 図７ ＹＣｐＨＦ１９Ｌ（２２，１０Ｋｂ））を示す。 図８ ＹＣｐＨＦ１９ＬのＦＬＯＩＬ遺伝子を含む７．９ＫｂのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ 断片を示す。 図９ ＹＲｐＧＬｌｏ（９，７０Ｋｂ）を示す。 図１０ ＹＲｐＧＬＦ１４Ｓ（１５，５０Ｋｂ）を示す。 図１１ ＹＲｐＧＬＦ８Ｌ（１７，６６Ｋｂ）を示す。 図１２ 凝集性遺伝子ＦＬＯＩＳ及びＦＬＯＩＬを含む酵母染色体への組み込み用プラス ミドｐＢＲ−ＡＤＨＩ−ＦＬＯＩＳ及びｐＢＲ−ＡＤＨＩ−ＦＬＯＩＬの作成の フローチャートである。 図１３ ｐＡＡＨ５（１２，６０Ｋｂ）を示す。 図１４ ｐＡＡＨ５（１２，６０Ｋｂ）をＢａｍＨＩ消化した生成物を示す。 図１５ ｐＢＲ３２２（４，３０Ｋｂ）を示す。 図１６ ｐＢＲ３２２−ｄＨ（（４，３０Ｋｂ）を示す。 図１７ ｐＢＲ−ｄＥＰｌ（２，５０Ｋｂ）を示す。 図１８ ＰＣＲで作成したＦＬＯＩＳのオープン、リーディング、フレームを示す。 図１９ ｐＢＲ−ｄＥＰｌ−ＦＬＯＩＳ（５，１０Ｋｂ）を示す。 図２０ ＦＬＯＩＳのオープン・リーディング・フレームを示す。 図２１ ｐＢＲ−ｄＨ−ＡＤＨＩ（６，２０Ｋｂ）を示す。 図２２ ｐＢＲ−ＡＤＨＩ−ＦＬＯＩＳ（８，８０Ｋｂ）を示す。 図２３ ＹＣｐＨＦ１９Ｌ（２２，１０Ｋｂ）を示す。 図２４ ＹＣｐＨＦ１９ＬをＥｃｏＲＶ＋ＢｇｌＩＩ消化した生成物を示す。 図２５ ｐＢＲ−ｄＥＰｌ−ＦＬＯＩＬ（７，２０Ｋｂ）を示す。 図２６ ＦＬＯＩＬオーブン・リーディング・フレームを示す。 図２７ ｐＢＲ−ＡＤＨＩ−ＦＬＯＩＬ（１０，８０Ｋｂ）を示す。 本発明の詳細な説明 以下、本発明を具体的に説明する。 ［凝集性遺伝子］ 本発明による酵母サツカロマイセス・セレビシェに凝集性を付与する遺伝子とは 、酵母において凝集活性を示すポリペプチドをコードする４、７±０．２Ｋｂの 凝集性遺伝子及び前記凝集性遺伝子に由来する２、６±０．２ｋｂの凝集性遺伝 子を意味し、これらは各々、上記に説明した酵母サツカロマイセス・セレビシェ の凝集性遺伝子ＦＬ０１４：由来するＦＬ０１Ｌ遺伝子（単にＦＬＯＩＬとも記 す）及びＦＬＯＩＳ遺伝子（単にＦＬＯＩＳとも記す）に相当する。ＦＬＯＩＳ はＦＬＯＩＬの塩基配列の一部が欠失したものである。また、後述する様に、Ｆ ＬＯＩＬ遺伝子より人為的にあるいは自然発生的に誘導されたところの、凝集活 性を有するがそのオープン・リーディング・フレームの反さが異なるものもＦＬ ＯＩ遺伝子の範鴫に入る。ここで、ＦＬＯＩＬ遺伝子は酵母サツカロマイセス・ セレビシェの保工染色体上のインタクトなＦＬＯＩ遺伝子であり、ＦＬＯＩＳは ＦＬＯＩＬ遺伝子のオープン・リーディング・フレームの一部がインフレームで 欠失したものである。ここで、ＦＬＯＩＬは導入する宿主酵母に比較的強力な凝 集性を付与し、ＦＬＯＩＳはＦＬＯＩＬに比べて宿主酵母に弱し）凝集性を付与 することが特徴である。 本発明による凝集性遺伝子の存在形態は、この遺伝子を構成頁の一部とするプラ スミド並びにこの遺伝子が宿王のゲノムに挿入された形で酵母す・ノカロマイ七 ス・セレビシェ中に存在する形態である。また、凝集性遺伝子が酵母中で安定番 二発現しうるように、本発明の凝集性遺伝子を適当なプロモーター及びターミネ ータ−の支配化番二おき、これがプラスミドとしであるし）はゲノムＧこ挿入さ れた形態で存在してもよい。プロモーター及びターミネータ−としては、ア！レ コールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＡＤＨＩ）やホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝 子（ＰＧＫ）等、公知のものを適宜組み合わせて用いることができる。 ［この遺伝子がコードするポリペプチド］本発明によるＦＬＯＩＬ遺伝子は、こ れがコードするポリペプチドのアミノ酸西己列によって特定されている。このポ リペプチドは凝集活性を有してりλてアミノ酸配列が実質的に配列番号１に示さ れているものである。ここで、「アミノ酸西己列が実質的に配列番号１に示され て′ｊするもの」とＶ）うことは、この目？　ＩＪペプチドが凝集活性を有する 限りアミノ酸のいくつかにつし）て欠失、置換、付加等力（あってもよいことを 示すものである。 本発明で凝集活性を示す典型的なポリペプチドは配列番号１（コテされるアミノ 酸配列であり、１，５３７個のアミノ酸からなるものであり、従来そのアミノ酸 自己ダリは知られていなかったものである。 本発明で「アミノ酸配列が実質的に配列番号１に示されてν・るもの」とし１う ことは、このポリペプチドが凝集活性を有する限りアミノ酸のす）＜つ力・０二 つり）て火災、置換、付加等があってもよいことな示すものであることは前述し たことであるが、そのようなアミノ酸に関して変化の生じているペプチドの一例 は、配列番号１に示されているアミノ酸配列（ＦＬ０１Ｌ配列）の３２９番目か ら１，００３番目までが欠失したもの（ＦＬＯＩＳ配列、配列番号２参照）であ って、このペプチドは、凝集活性がやや弱くなるものの凝集活性を有する。発酵 において酵母の凝集性が強すぎると、浮遊酵母数が減少し一般に発酵速度は遅く なる傾向があるので、各々の発酵系において適度な強さの凝集性を付与するよう に酵母を育種することが望ましい。その場合、ＦＬＯＩＬ遺伝子の導入では凝集 性が強すぎるのでＦＬＯＩＳ遺伝子の導入を行った方が良い場合もある。その意 味で、本発明のポリペプチドの長さは配列番号１に示されているものを基本とし ながらも、いくつかのアミノ酸の欠失、置換、付加等は望む強さの凝集活性を各 々の酵母で実現するために重要な意味がある。すなわち、それらの改変されたポ リペプチドは、本発明で言う凝集活性を有するポリペプチドの範噴に入るもので ある。 ［・疑集性ｊｎ伝子の塩基配列１ ＦＬＯＩＬ遺伝子のＤＮＡ鎖は、配列表の配列番号１に示す塩基配列を持つもの 、またはその縮重異性体、ならびに配列番号１に示すアミノ酸配列に対応する塩 基配列を持つものまたはその縮重異性体、である。ここで、「縮重異性体」とは 、縮重コドンにおいてのみ異なっていて同一のポリペプチドをコードすることの できるＤＮＡ鎖を意味する。 尚、配列番号１に示すＤＮＡ鎖の塩基配列は、サツカロマイセス・七しビシエＡ ＢＸＬ−ＩＤ株（イーストジェネテイノク、ストック、センター、米国カリフォ ルニア大学）より取得したＦＬＯＩ遺伝子についてダイデオキシ法によって決定 したものである。 ［１疑集性遺伝子ＤＮＡ鎖の取得１ 凝集活性を有するＦＬＯ１遺伝子の産物についての情報（ＦＬＯＩ遺伝子がコー ドするポリペプチドのアミノ酸配列）は現在のところ全くないので、通常よく用 いられるアミノ酸配列をもとに化学合成した適当なりＮＡプローブを用いるハイ ブリダイゼーシコン法によりＦＬＯＩ遺伝子をクローニングすることは不可能で ある。 従って、本発明者らはサツカロマイセス・七しビシエＡＢＸＬ−ＩＤ株の全ＤＮ Ａのジーン・ライブラリーを酵母・大腸菌のシャトルベクタープラスミドで構築 し、それを非凝集性酵母に形質転換して凝集性に変化したクローンを取得し、そ の形質転換株からプラスミドを回収した（詳細は後記実施例参照）。 ［凝集性遺伝子の酵母への導入１ 上記のようにして取得される本発明の凝集性遺伝子のＤＮＡ鎖を生物工学的手法 により、発酵産業に用いられている酵母、例えばビール酵母、ワイン酵母、ウィ スキー酵母、日本酒酵母、焼酎酵母、アルコール生産用酵＠（いずれもサツカロ マイセス・セレビシェ）等に導入してこれを形質転換させれば、もしそれらが非 凝集性株であれば凝集性株へ変化させること力呵能であり、またそれらが凝集性 であってもその凝集性を増強することができる。 ［酵は１ 本発明における形質転換の対象となる酵母は、「ザ・イースツ・ア・タフソノミ ック・スタディＪ　（Ｔｈｅ　ｙｅａｓｔｓ、　ａ　ｔａｘｏｎｏｍｉｃ　５ｔ ｕｄｙ、）　３ｒｄ　Ｅｄ、　（Ｙａｒｒｏｗ、　Ｄ、、　ｅпA　ｂｙ　Ｎ、 Ｊ、Ｗ。 Ｋｒｅｇｅｒ−Ｖａｎ　Ｒ４ｊ、　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂ ｌｉｓｈｅｒｓ　Ｂ、Ｖ、、　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ　（１９W４）、　ｐ、３７ ９）記載 のサツカロマイセス・セレビシェに属する酵母およびそのシノニムないし変異株 であるが、本発明の目的からすれば、サツカロマイセス・セレビシェに属する各 種産業用酵母、例えばビール酵母、ワイン酵母、ウィスキー酵母、日本酒酵母、 焼酎酵母、アルコール生産用酵母等が好ましい。 具体的には、例えば、下面ビール酵ｅ：　Ｗ１６４（ミュンヘン工科大学、ドイ ツ）、Ｗ２Ｏ４（ミュンヘン工科大学、ドイツ）、ＳＭＡ−８（ベルリン工科大 学）、Ｈ，Ｈ，（ベルリン工科大学）、ｏｂｇ、　１６０（ベルリン工科大学、 ドイツ）、ワイン酵母：ＩＡＭ４１７５（東京大学）、ウィスキー酵母：　ＡＨ Ｕ３２００（北海道大学）、日本酒酵＠：協会６号（日本醸造協会）、焼酎酵母 ：　ＩＦｏ　０２８２（（財）発酵研究所）、アルコール生産用酵母：　ＩＦＯ ０２１６（（財）発酵研究所）、等がある。尚、これらの産業用酵母は、長年に わたって各々の発酵産業に適する形質、すなわち発酵原料を効率的に発酵するこ とができること、香味の良い酒類をつくること、遺伝的性質が安定していること 、等々な指標として選抜、純粋培養が重ねられてきたものである。 ［形質転換］ 形質転換体作成のための手順ないし方法そのものは、分子生物学なし１し遺伝子 工学の分野において慣用されているものであり、本発明においても下記したとこ ろ以外のものについてはこれら慣用技術に準じて実施すればよい。酵母中で本発 明の凝集性遺伝子を発現させるためには、まず酵母中で安定に存在するプラスミ ドベクター中にこの遺伝子をつなぎかえる必要がある。この際に用し鴨れるプラ スミドベクターとしては、ＹＲｐ系、ＹＥｐ系、ＹＯ２系、Ｙｌｌ）系等種々知 られてＶ％るもの全てを用いることができる。これらのプラスミドベクターは、 文献上公知であるばかりでなく、容易に作成することができるものである。 本発明によって得られるべき形質転換体を選択するためのマーカーとしては、産 業用酵母の場合それ自体に適当なアミノ酸や核酸等要求性の遺伝的マーカーはな いので、０４１８等の薬剤に対する耐性遺伝子を用いることができる。しかし、 本凝集性遺伝子が優性遺伝子として発現することを利用して、凝集性そのものを 指標として形質転換体を取得することも可能である。 本発明の凝集性遺伝子のＤＮＡ鎖をプラスミドベクターにつなｌ／１で酵母へ導 入することは容易に行うことができるが、反面このようなプラスミドは細胞内に おいて安定に保持されないことが多く、形質転換細胞から脱落して−くこと力（ シ＋１しばである。 本発明の凝集性遺伝子のＤＮＡ鎖をより安定的に酵母に保持させるために、これ を酵母のゲノムに挿入することもできる。特に食品産業に用し）る酵母の場合、 酵母以外の大腸菌由来のＤＮＡ断片（大腸菌内でのプラスミドの増殖のためにプ ラスミドベクターに含まれている）が最終的な組み込み体に存在せず、酵母の遺 伝子のみで酵母を改良した方が好ましい。そこで発明者等は、酵母の遺伝子のみ をゲノムＤＮＡに組み込むペンテイラ（Ｐｅｎｔｔｉｌａ）等のコ・トランスフ ォーメーションおよびジーン、リプレースメント法［カレントジエネテイソクス （Ｃｕｒｒ、　Ｇｅｎｅｔ、）、１２巻、４１３−４２０頁（１９８７）］を用 いて酵母の遺伝子のみを導入することにした。また、ここで形質転換は、分子生 物学ないし遺伝子工学の分野で慣用されている合目的的な任意の方法、例えばヒ ンネン（Ｈｉｎｎｅｎ）等のプロトプラスト法［プロシーディング・イブ・ナシ ョナル・アカデミ−、イブ・サイエンシズ・イブ・ザ・ユナイテイツド・ステー ク・イブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ、　ＮＩＩＬｌ、　Ａｃｎｄ、　Ｓｃｉ、、　Ｕ ＳＡ）、７５巻、１９２９−１９３３頁（１９７Ｂ）］、ｆＰ藤等のリチウム・ アセテート法［ジャーナル・イブ・バクテリオロジ−（Ｊ。 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）、１５３巻、１６３−１６８頁（１９８３）］％’によ って行うことができる。このようにして得られる本発明の酵母は、導入した外来 ＤＮＡ以外の遺伝的性質は導入前の元株と全く同一であり、さらに上記のコ・ト ランスフォーメーションおよびジーン・リプレースメント法による本発明ＤＮＡ 鎖のみの染色体導入法によれば、不要ベクター配列は含まれていないので得られ る組換え体酵母は使用ベクター由来の性質を持たない。その結采、元株の優良形 質を全く損なうことがなく、凝集性のみが特異的に改良された産業用酵母を育種 することができる。 ［酒類の製造Ｊ 上ｇ己のような本発明による凝集性遺伝子により形質転換した酵母によって発酵 原料を発酵させれば、上記のような効果を伴って発酵を行うことができる。発酵 原料は発酵の目的に応じて決まることは言うまでもなく、例えばビールやウィス キー製造においては麦芽汁が、ワイン製造においては果汁が、日本酒製造におい ては麹が、焼酎製造においてはでんぷんあるいは糖質原料が、アルコール生産に おいては廃糖富やでんぷんあるいは糖質原料が使用される。また、発酵条件は通 常の場合こ同じ条件を用いることが可能であり、本発明を利用する際に現存の発 酵工程の変更や装置の改変等を行う必要がない。 製造される酒類は、使用した酵母が１疑集性を示すので、発酵終了後酵母は速や かに発酵容器の下部に凝集沈降−でおり、発酵液と酵母菌体の分離が容易である ここは前記したところである。 実施例 以下、本発明を実施例を挙げて更に詳細に説明する。 実施例１ ［酵母の凝集性を支配する遺伝子の取得Ｊ本発明の凝集性遺伝子の内、ＦＬＯＩ Ｓ遺伝子取得のために以下の実験を行った［渡等、アグリカルチュラル、アンド ・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ。 Ｃｈｅｍ、）、５３巻、３号、９０１−９０３（１９８９）］。サツカロマイセ ス・セレビシェＡＪ３ＸＬ−ＩＤ株（遺伝子型はＭＡＴａ　ＦＬＯ１、イースト ・ジエネティック・ストック・センター、カリフォルニア大学、米国）の染色体 ＤＮＡはクライヤー（Ｃｒｙｅｒ）等の方法［メソッヅ・イブ・セル・バイオロ ジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）、１２巻、３９−４ ４頁（１９７５）］に従って調製した。得られた染色体ＤＮＡを制限酵素５ａｕ ３ＡＩで部分消化し、５ｋｂより長いＤＮＡ断片をショ糖密度勾配遠心で回収し 、このＤＮＡ断片をヒスチジン生合成遺伝子ＨＩＳ４を選択マーカーとして持つ クローニングベクターＹＣｐＨ４［渡等、アグリカルチュラル・アンド・バイオ ロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）、５３巻、 ３号、９０１−９０３（１９８９）］のＢａｍＨＩ部位に１ｎｖｉｔｒｏで挿入 連結（ライゲーション）反応を行った。このライゲーションミクスチュアで大腸 菌（エシェリヒア・コリ、Ｅ。 ｃｏｌｉ）Ｍ０１０６１株（遺伝子型はｈｓｄＲｍｃｒＢ　ａｒａＤ１３９Δ（ ａｒａＡＢＣ−１ｅｕ）７６７９Δ１ａｃＸ７４ｇａｌＵ　ｇａｌＫ　ｒｐｓＬ 　ｔｈｉ）を形質転換し、その形質転換体からプラスミドを抽出してＡＢＸＬｄ Ｄ株のジーン・ライブラリーを作成した。尚、大腸菌ＭＣ１０６１株は組換えＤ ＮＡ技術分野において繁用されている菌株である。 このジーン、ライブラリーを用いてヒスチジン要求性の非凝集性パン酵母サツカ ロマイセス・セレビシェＹＪＷ６株（遺伝子型はＭＡＴａａｄｅｌ　ｕｒａｌ　 ｈｉｓ４　ｃａｎｌｋａｒｌ）［アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル 、ケミストリー（Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ。 Ｃｈｅｍ、）、５３巻、３号、９０１−９０３（１９８９）］を形質転換した。 サツカロマイセス、セレビシェＹＪＷＳ株の形質転換は、基本的に伊藤等のリチ ウム・アセテート法に従った［ジャーナル、万ブ・バクテリオロジ−（Ｊｏｕｒ ｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、１５３巻、１６３−１６８頁（１ ９８３）］。丁なわち、１００ｍ１のＹＰＤｉｉ体培地（１％酵母エキス、２％ バクトペブトン、２％グルコース）にＹＪＶ／６株を１白金耳植菌し３０°Ｃで 一夜培養し、翌朝この菌体を遠心分離機にて分離し、この菌体を同林の組成の新 しい培地に植菌しさらに３時間３０°Ｃにて培養した。集菌後菌体を４０ｍ１の 滅菌水で洗浄後、菌体を最終的に２０ｍ１のＴＥ液［１ｍＭのＥＤＴＡを含む１ ０ｍＭのトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）］に懸濁させた。 この５ｍｌをＬ字型試験管（モノ−管）に移し、これに５ｍｌの０．２Ｍ酢酸リ チウム液を加え、室温にて１時間１００ｃｙｃｌｅｓ／ｍｉｎで振盪した。これ より０．１ｍｌを取り、既に５０μｇの組換え体プラスミド（エタノール沈澱後 、風乾させたもの）を含む１．５ｍｌ用のエノベンドルフチューブに加え、よく 撹拌した後３０分間３０°Ｃ静置した。静置後、エノペンドルフチューブをよく 撹拌し、０．１ｍｌの７０％ポリエチレングリコール＃４，０００を加え、さら によく撹拌後１時間３０°Ｃで静置した。つし）で、４２°Ｃで５分間加温しく ヒートショック処理）、室温放冷後、菌体を滅菌水にて洗浄した。最終的に菌体 を０．５ｍｌの滅菌水に懸濁し、その液の０．１ｍｌずつをヒスチジンを含まな １７）最少培地（０，６７％ディフコ社製イースト・ナイトロジエンベース・ウ イザウト・アミノアジノ人２％グルコース、４０μｇ／ｍｌ硫酸アデニン、４０ μｇ／ｍｌウラシル、２％ディフコ社製バクトアガー）に塗布し、ヒスチジンを 要求しなくなった形質転換体を得た。この様な形質転換実験を１０回繰り返して 行い、ヒスチジン非要求性の形質転換体を約１０，０００クローン得た。 次に、この形質転換体の中から、凝集性クローンのスクリーニングを行った。 これらの形質転換体をプレートから１個ずつつま楊子にて取り、９６穴のマイク ロプレート［各々２００□ｌの最少液体培地（上記の最少培地から寒天をぬ−た もの）が人っている］に植菌し、２５°Ｃで３日間培養した。凝集性の検定鵬培 養後のマイクロプレートをマイクロプレートミキサー（タイテ・ツク社製マイク ロミキサー）で６０秒間強く振盪して行い、目視にて凝集性のクローンを捜した 。約６，０００個のヒスチジン非要求性の形質転換体の中から、１個の比較的強 し）凝集性を示すクローンを得た。この株を非選択下のＹＰＤ培地で培養後、ヒ スチジン要求性を示すよう番線なったクローン、すなわちプラスミドが脱落した クローンを得た。このクローンは、ヒスチジン要求性を示すと同時に凝集性も失 われてし）だ。また、最初に得られた凝集性を示す形質転換株からＤＮＡを回収 して大腸菌ＭＣ１０６１株を通じてプラスミドを回収し、それをＹＪＷ６株に再 び形質転換し得られたヒスチジン非要求性の形質転換体を調べたところ、全て凝 集性を示した。以上の事実は、形質転換株の示す凝集性は宿主細胞の何らかの遺 伝的な変異によるものではなく、形質転換株の有するプラスミドに起因するもの であると結論した。ここで、発明者等は凝集性を支配する遺伝子配列を含む本プ ラスミドをＹＣｐＨＦ１９Ｓと名付けた。その制限酵素地図を図４に示した。 尚、このマイクロプレートを用いた凝集性酵母のスクリーニング実験がら考えら れるように、このような凝集性遺伝子を含むプラスミドを用いて、マーカーを有 しない酵母を凝集性を選択マーカーとして形質転換体を得ることが可能である。 事実、本実験においても、非凝集性酵母の中がら本プラスミドが導入された形質 転換体を得ることができた。すなわち、このような凝集性遺伝子を、遺伝的マー カーのないサツカロマイセス・セレビシェに属する酵母の形質転換体取得のため に応用できることは明白である。さらに、本スクリーニング過程において、形質 φＬ換鉢体スクリーニングための特別な培地（最小培地や抗生物質入りの培地） の調整は基本的に必要なく、通常の培地で行えるメリットがある。また、酵母に おける形質転換体取得のためのマーカーとして、現在酵母由来の遺伝子のものは 少なく、酵母のセルフクローン系実験における有用性力吠きい。 実施例２ ［クローン化した凝集性遺伝子のマツピング及び同定］実施例１でクローン化し た凝集性遺伝子が酵母第１染色体上のＦＬＯＩＬ伝子であるかどうかを知るため に、以下に示す本凝集性遺伝子の物理的マツピング実験を行った［波等、アグリ カルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ。 Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）、５３巻、３号、９０１−９０３頁（１９８９）］。 プラスミドＹＣｐＨＦ１９Ｓから凝集性を支配する遺伝子を含むＤＮＡ領域内の ２．６ｋｂのＥｃｏＲＶ断片をプローブとして用い、染色体ＤＮＡ電気泳動（パ ルスフィールド電気泳動）と組み合わせて本遺伝子断片の染色体上の物理的マツ ピングを行った。すなわち、サツカロマイセス・セレビシェＡＢＸＬ−ＩＤ株の 染色体電気泳動はカール（Ｃａｒｌｅ）等の方法［ブロシーデインダス・サブ・ ナショナル・アカデミ−・サブ・サイエンシズ・サブ・ザ・ユナイテイソド・ス テーク・サブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。 ＵＳＡ）、８２巻、３７５６−３７６０頁（１９８５）］によってサンプルを調 製し、バイオラド社のＣＨＥＦ電気泳動装置を用いて行った。電気泳動終了後、 泳動ゲルのＤＮＡバンドをマニアティス等の方法［モレキュラ町クローニング（ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、３８２−３８９頁、コールド・スプリ ング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂ ｏｒａｔｏｒｙＸ１９Ｂ２）］に従って、サザンブロッティングおよびハイブリ ダイゼーション実験を行った。その結果、上記の２．６ｋｂのＥｃｏＲＶ断片は ＡＢＸＬ−ＬＤ株の第１染色体にハイブリダイズし、本実験でクローン化した凝 集性遺伝子は第１染色体上の遺伝子であることが示された。 次に、クローン化した凝集性遺伝子の遺伝学的マツピングを試みた［渡等、アグ リカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉ ｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）、５５巻、６号、１５４７−１５５２頁（１９９１）］。 ＹＣｐＨＦ１９Ｓを制限酵素ＸｂａＩで部分消化し酵母セントロメア遺伝子（Ｃ ＥＮ４）と酵は複製起点ＡＲ８Ｉを削除しＹＩｐ型の組み込み用プラスミドＹＩ ｐＨＦ１９Ｓを作成した（図５参ｊｊ９．）。クローニングした凝集性遺伝子の 部分での酵母への組み込み効率を上げるためにこのプラスミドを制限酵素Ｂａｍ ＨＩで消化した後、サツカロマイセス、セレビシェＹＪＷＺＡ株（遺伝子型はＭ ＡＴａ　ＦＬＯＩ　ｈｉｓ４）に上記の方法で形質転換し、ヒスチジン非要求性 の形質転換体を得た。得られた株を″ｆｌカロマイセス・セレビシェＹＪＷＧ株 （遺伝子型はＭｋＴａ　ａｄｅｌ　ｕｒａｌ　ｈｉｓ４　ｃａｎｌｋａｒｌ）と 交配し二倍体を得て、それを胞子形成させ遺伝解析（テトララド・アナリシス） を行った。その結果、Ｈｉｓ十形質（ヒスチジン非要求性）と第Ｉ染色体のＡＤ ＥＩと遺伝学的リンケージが得られ（ペアレンタルダイタイブ：ノンペアレンタ ルダイタイブ：テトラタイプ：２２：Ｏニア）、ＹＩｐＨＦ１９Ｓプラスミドが クローン化した凝集性遺伝子の部分で、ＹＪＷ２Ａ株の第Ｉ染色体上に組み込ま れたことが明らかになった。 以上の、物理的マツピングと遺伝学的マツピングの結果から、発明者等はここで クローン化した凝集性遺伝子は、酵母第Ｉ染色体上のＦＬＯＩＬ伝子であると考 えた。但し、この時点では、ここで得られたＦＬＯ１遺伝子が、酵母染色体上の インタクトなＦＬＯＩＬ伝子（すなわちＦＬＯＩＬＬ伝子）ではなく、後述する 様にＦＬＯＩＬの一部のＤＮＡ配列が欠失しているＦＬＯＩＳＬ伝子であったこ とは未知であった。 実施例３ ［ＦＬＯＩＳの塩基配列の解析］ 発明者等は上記で得たＦＬＯＩＬ伝子（実際はＦＬＯＩＳＬ伝子）の塩基配列を 決定する実騎を行った。 サブクローニングの結果、ＦＬＯＩＳＬ伝子の凝集性発現に必要な領域は図４の プラスミドＹＣｐＨＦ１９ＳのＢａｍＨＩ−（ＢａｍＨＩ／５ａｕ３ＡＩ）間の ４．１ｋｂのＤＮＡ断片ににあることがわかっていた。そこで、このＤＮＡ断片 を含む領域をシーフェンス用ベクターｐＵｃ１１８およびｐＵｃ１１９　（いず れも宝酒造社製）のマルチリンカ−サイトにサブクローン化した。次に、各々の サブクローンをヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）等の方法［ジーン（Ｇｅｎｅ）、 ２８巻、３５１−３５９頁（１９８４）］およびヤニッシュ・ペロン（Ｙａｎｉ ｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ）等の方法〔ジーン（Ｇｅｎｅ）、３３巻、１０３−１１ ９頁（１９８５）］に従って、これらのプラスミドの挿入部分をエキソヌクレア ーゼ■およびマングビーンヌクレアーゼで処理して短鎖化し、当該挿入断片の一 部が脱落し異なる鎖長を有する種々のクローンを作成した。この過程では、キロ シーフェンス用デレージョン・キット（宝酒造社製）を使用した。得られた種々 のクローンの挿入断片についてサンガー（Ｓａｎｇｅｔ）等のジデオキシ法［サ イエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２１４巻、１２０５−１２１０頁（１９８１）］ に従い、アプライド・バイオシステムズ（株）の自動ＤＮＡシークエンサーを用 いて上記４．１ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。これを解析した結果、 アミノ酸８６２個、推定分子量８９，３６８のポリペプチドをコードすることが 可能な２．５８６ｂｐのオーブン・リーディング・フレームが存在した。 実施例４ ［サザーン・ハイブリザイゼーション実験Ｊ実施例１で得られた凝集性遺伝子が 、酵母第Ｉ染色体上のＦＬＯＩ座にあることは上述したように明らかであるが、 これがインタクトなＦＬＯＩＬ伝子であるかどうか確認するために、以下の様な サザーン・ハイブリダイゼーション実験を行った。 まず、本凝集性遺伝子をクローン化した酵母サツカロマイセス・セレビシェＡＢ ＸＬ−ＩＤ株より全ＤＮＡを抽出し、制限酵素ＥｃｏＲＶで完全消化後電気泳動 し、上記実施例２で示したオーブン・リーディング・フレームを含む２．６ｋｂ のＥｃｏＲＶＤＮＡ断片をプローブとしたジェノミック・サザーン解析を行った 。ここで、サザーン・プロッティングおよびハイブリダイゼーションはマニアテ イス等の方法［モレキュラー、クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ ｎｇ）、３Ｂ２−３８９頁、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（ Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８２） ］に従った。 その結果、驚くべきことに２．６ｋｂ付近に相当する位置にハイブリダイゼーシ ヨンシグナルは得られず、４．７ｋｂ付近に相当する位置にハイブリダイゼーシ ョンシグナルが得られた。このことは、クローン化した凝集性遺伝子がＡＢＸＬ −ＩＤ株のＦＬＯ１遺伝子と同一ではなく、クローン化の過程で何らかの理由に よりインタクトなＦＬＯ１遺伝子の一部ＤＮＡ配列力吹失したものではないかと 発明者等は推定した。 実施例５ ［ＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）実験］そこも発明者等は、 ＡＢＸＬ−ＬＤのＦＬＯ１遺伝子の溝道をＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リ アクション）法で確認すべく以下のような実験を行った。まず、上記実施例３で 示した塩基配列を利用してＤＮＡ鎖を化学合成した。すなわち、本遺伝子のオー ブン・リーディング・フレームのイニシェーションコドン領域を含む３３塩基の ＤＮＡ配列をＤＮＡ合成ａ（ＡＢＩ社製）で化学合成しＰＣＨの５°プローブと した。（配列番号３） リンカ−サイト （上記配列の５°末端より１４番目からのＡＴＧ−がＦＬＯＩＳの５°末端配列 である。）また、本凝集性遺伝子のオーブン・リーディング・フレームのターミ ネーションコドン（ＴＡＡ）を含む領域の相補鎖（リーバース・ストランド）を 含む３３塩基のＤＮＡ配列を上記と同様に化学合成し、ＰＣＨの３°プローブと した。（配列番号４）リンカ−サイト （上記配列の５“末端より１０番目がらのＡＴＧ−がＦＬＯＩＳの３゛末端配列 （リーバース・ストランド）である。） 次に、これらの５′および３プローブを用いて、サツカロマイ七ス・セレビシェ ＡＢＸＬ−ＩＤ株の全ＤＮＡを鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）としてＰＣＲ実験を行 った。 ＰＣＲ実験は、アトー社製ザイモリアクターＡＢ−１８００型を用い、ＤＮＡポ リメラーゼはＰｆｕ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ストラタジーン社、５Ｔ ＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用いた。また、ＰＣＲ実験条件はイエス等の方法［ビー ・シー・アール・テクノロジー（ＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、３−１２頁、 ストックトン・プレス（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ）、ヘンリー・ニー・エ ーリッヒ（Ｈｅｎｒｙ　Ａ、　Ｅｒ１ｉｃｈ）ｉ（１９８９）］に従った。ＰＣ Ｒ実験の結果増幅されたＤＮＡバンドをアガロース・ゲル・電気泳動で確認した ところ、約４．７ｋｂの付近に唯一のバンドが得られ、ＡＢＸＬ−ＩＤ株におい てはＦＬＯＩのオーブン・リーディング・フレームは約４．７ｋｂと推定された 。また、発明者らがクローン化した凝集性遺伝子を含むプラスミドＹＣｐＨＦ１ ９を鋳型として用いたコントロール実験では、ｉ′り２．６ｋｂ付近にバンドが 得られた。この結果から、サツカロマイ七ス・セレビシェＡＢＸＬｄＤ株のＦＬ ＯＩ遺伝子の酵母内でのインタクトなオーブン・リーディング・フレームは約２ ．６ｋｂではなく約４．７ｋｂであること発明者等は判断した。 従って、発明者等が得た凝集性遺伝子は、何らかの理由により、おそらくＹＣｐ ＨＦ１９を大腸菌Ｍ０１０６１株で維持していく過程で分子内組換えの結果ＦＬ ＯＩ遺伝子の一部が欠失したものであると発明者等は判断した。 実施例６ ［ＦＬＯＩＬ遺伝子の取得１ そこで、発明者等は、ＦＬＯ１のクローニングの際、最初に大腸菌より回収した プラスミドＹＣｐＨＦ１９Ｓ溶液には、インタクトなＦＬＯ１遺伝子を含むプラ スミドが混在しているかもしれないという予想のもとに、再調査を行った。まず 、このプラスミド溶液の一部を取り制限酵素ＥｃｏＲＶで消化してアガロース・ ゲル電気泳動を行ったところ、ＹＣｐＨＦ１９Ｓで得られる２、６ｋｂのバンド 以外に４．７ｋｂ付近に非常に薄いが明らかに観察されるバンドを発見した。こ のことは、このプラスミド溶液が二種のプラスミドの混合溶液であることを示唆 している。そこで、発明者等はこのプラスミド液を用いて大腸菌ＪＡ２２１株（ 遺伝子型はｒｅｃＡｌ　１ａｃＹ　１ｅｕＢ　ｔｒｐΔＥ５ｔｈｒ　ｔｈｉ　ｈ ｓｄＲｈｓｄＭ）を形質転換し、得られた形質転換体からプラスミドの抽出を行 い調べたところ、ＹＣｐＨＦ１９Ｓの他にもう一種類のＹＣｐＨＦ１９Ｓよりサ イズが約２．１ｋｂ大きいプラスミドが分離された。ここで最初にクローン化さ れたプラスミドをＹＣｐＨＦ１９Ｓ、またＹＣｐＨＦ１９Ｓプラスミド溶液から 分離されたサイズが２．１ｋｂ大きいプラスミドをＹＣｐＨＦ１９Ｌと命名した 。また、ＹＣｐＨＦ１９ＳとＹＣｐＨＦ１９Ｌの各種制限酵素切断パターンを解 析した結果、これらのプラスミドは凝集性遺伝子のオーブン・リーディング・フ レームを含むＤＮＡ領域以外の他のＤＮＡ領域に違いは見いだされなかった（図 ４及び図７参照）。すなわち、ＹＣｐＨＦ１９Ｌの凝集性遺伝子のオーブン・リ ーディング・フレームはＹＣｐＨＦ１９Ｓのそれ、より２．１ｋｂ長いことを示 している。このことは、まず最初にインタクトなＦＬＯＩ遺伝子（すなわちＦＬ ＯＩＬ）のクローン化に成功していたが、大腸菌Ｍ０１０６１株でこのＹＣｐＨ Ｆ１９Ｌを維持していく過程において、ｉｎ　ｖｉｖｏでの分子内組換えにより ＦＬＯＩＬ遺伝子のオーブン・リーディング・フレームの一部がイン・フレーム で欠失してＦＬＯＩＬからＦＬＯＩＳへ変化した、すなわちＹＣｐＨＦ１９Ｌか らＹＣｐＨＦ１９Ｓへ変化したと判断した。ここで、この欠失はイン・フレーム で起こったため、ＦＬＯＩＳは凝集活性を示すポリペプチドをコードすることが できたと考えられる。 以後、ＹＣｐＨＦ１９Ｓ上の凝集性遺伝子をＦＬＯＩＳと、ＹＣｐＨＦ１９Ｌ上 の凝集性遺伝子をＦＬＯＩＬとして区別する。 また、この欠失のおこる頻度はＹＣｐＨＦ１９Ｌプラスミドを保持する大腸菌の 種類によって５大きく影響し、例えばＭＣ１０６１株（遺伝子型はｈｓｄＲｍｃ ｒＥａｒａＤ１３９Δ（ａｒａＡＢＣ−１ｅｕ）７６７９△ＩａｃＸ７４　ｇａ ｌＵ　ｇａｌＫ　ｒｐｓＬ　ｔｈｉ）やＤＨ５ａ株（遺伝子型は５ｕｐＥ４４　 Δ１ａｃＵ１６９（＄８０１ａｃＺΔＭ１５）　ｈｓｄＲ１７ｒｅｃＡｌ　ｅｎ ｄＡｌ　ｇｙｒＡ９６　ｔｈｉ−１ｒｅｌＡ戟jでは 高傾度で変化するがＪＡ２２１株（遺伝子型はｒｅｃＡｌ　１ａｃＹ　１ｅｕＢ 　ｔｒｐル５　ｔｈｒ　ｔｈｉ　ｈｓｄＲｈｓｄＭ）では変化は比較的少ないと いう現象も発明者等は見いだした。従って、以１り発明者・等はこれらのプラス ミドを大腸菌で維持していく場合、主にＪＡ２２１株を用いていくことにした。 但し、現在のところこの変化の理由は明らかではない。 実施例７ ［ＦＬＯＩＬの塩基配列の解析１ 上ε己で得られたプラスミドＹＣｐＨＦ１９ＬよりＦＬＯＩＬを含むＤＮＡ断片 を切り出し、実施例３と全く同様な方法で、全塩基配列を決定した。その結果、 ＦＬＯＩＬのオーブン・リーディング・フレームは１，５３７個のアミノ酸から 成るポリペプチドをコードする４、６１１ｂｐの塩基配列であることがわかった （推定分子量は１６０，６９２）。また、ＦＬＯＩＳはＦＬＯＩＬのオーブン・ リーディング・フレームの開始コドンより９８５番目から３，００９番目までの ＤＮＡ鎖（アミノ酸配列では３２９番目から１，００３番目までに対応、する） がインフレームで欠失したものであることが明らかになった（配列番号１及び配 列番号２参照）。 また、ＦＬＯＩＬのアミノ酸配列の解析結果によると、２７８番目のアミノ酸か られ、その括弧内にｌを挟んで示されたアミノ酸はそれらのいずれがでよいこと を表す。 配列であり（ダイレクトリピート）、ＦＬＯＩＬにおいてはこの繰り返し配列が １８個ある。一方、ＦＬＯＩＳにおいてはこの繰り返し配列領域のほとんどの部 分が欠失しているので（ＦＬＯＩＳはＦＬＯＩＬのアミノ酸配列の３２９番目か ら１，００３番目までが欠失している）、繰り返し配列に関しては３コピーしか 存在しない。発明者等は、現在のところＦＬＯＩＬとＦＬＯＩＳの凝集力の違い （前者の方が後宮に比べて強力な凝集性を重工細胞に与える）は、このダイレク トリピートの数に関係があると推測している。将来的には、このダイレクトリピ ートの数を調節することにより細胞の凝集力を望む程度にする、すなわち凝集力 の自在の調節が可能になると発明者等は推ｌ則している。 実施例８ ［ＦＬＯＩＬ遺伝子の各種実用醇母株への導入（その１：プラスミドベクター使 用）］上記で得た凝集性遺伝子ＦＬＯＩＳおよびＦＬＯＩＬが実際に凝集性実用 酵母の育種に有効かどうか、各種産業用酵母（いずれも非凝集性）への導入を試 みた。まず、産業用酵母に形質転換するために、直接選抜可能なＦＬＯＩＳまた はＦＬＯＩＬ遺伝子を有するブラスミドの作成を行った（フローチャートを図３ に示す。該フローチャート中の各プラスミド及びオープン・リーディング．フレ ーム（ＯＲＦ）に付された番号は、図４−１１に詳しく示されるそれらブラスミ ド及びオーブン・リーディング・フレームに付された番一号と一致する。）。直 接選抜用のベクターブラスミドＹＲｐＧＬ１０（直接選抜用のマーカー遺伝子と してＧ４１８耐性のＴｎ９０３遺伝子を有し、酵ほ内での複製起点としてＡＲＳ Ｉ配列を持つ、図９参照）のＢａｍＨＩ−ＳａｌＩのギャップにＹＣｐＨＦ１９ ＳのＦＬ０１Ｓ遺伝子を含む５．８ｋｂのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片（図６）を 挿入してブラスミドＹＲｐＧＬＦ１４Ｓ（図１０）を作成した。また、ＦＬＯＩ Ｌブラスミドを含む同様なブラスミドとして、ＹＣｐＨＦ１９Ｌの７．９ｋｂの ａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片（図８）をＹＲｐＧＬ１０のＢａｍＨＩ−ＳａｌＩギャ ノプに挿入しＹＲｐＧＬＦ８Ｌ（図１１）を作成した。 次に、産業用酵母のこれらのブラスミドによる形質転換法を示す。産業用酵母の 形質転換法は、基本的には実施例１で示した実験室酵母を用いる場合と同様であ るが、発明者等は以下に示す様な若干の修飾を行った［渡等、アグリ力ルチュラ ルアンド・バイオロジカル・ケミストリ−（Ａｇｒｉｃ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅ ｍ．）、５５巻、６号、１５４７−１５５２頁（１９９１）］。すなわち、１０ ０ｍｌのＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％バクトペブトン、２％グルコー ス）に菌株を１白金耳植菌し３０゜Ｃで一夜培養し、翌朝この菌体を遠心分離機 にて分離し、この菌体を同様の組成の新しい培地に植菌しさらに３時間３０”Ｃ にて培養した。集菌後菌体を４０ｍｌの滅菌水で洗浄後、菌体を最終的に約２０ ｍｌのＴＥ液［１ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭのトリス・塩酸緩衝液（ＰＨ７ ．５）］に懸濁させた（但し、ここでヘマトメーターを用いて、最終的に菌体濃 度が２ｘｌ０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ程度になる様に懸濁液の濃度を調整する）。こ の５ｍｌをＬ字型試験管（モノー管）に移盪した。これより０．１ｍｌを取り、 すでに５０μｇの組換え体ブラスミド（エタノール沈澱後、風乾させたもの）を 含む１．５ｍｌ用のエソペンドルフチューブに加え、よく撹拌した後３０分間３ ０゜Ｃ静置した。静置後、エッペンドルフチューブをよく撹拌し、０．１ｍｌの ７０％ポリエチレングリコール＃４，０００を加え、きらによく撹拌後１時間３ ０’Ｃで静置した。ついで、４２゜Ｃで５分間加γｌし（ヒートショック処理） 、室温放冷後、菌体を滅菌水にて洗浄した。最終的にエッペンドルフチューブ中 で１．４ｍｌのＹＰＤ液に懸濁して１６−２０時間３０゜Ｃで静置培養を行う。 その後、その培養液０．１ｍｌずつを２００ｐｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤ 寒天培地に塗布し３０゜Ｃで２−３日間インキュベーション後、形質転換体を取 得した。 この方法を用いて各種産業用酵母の形質転換実験を試みた。結果を下記表１に示 す。また、凝集性の評価方法は次のように実施した。各々の形質転換体を１０ｍ ｌのＹＰＤｉｆｌｉ体培地（Ｇ４１８を１００μｇ／ｍｌ含む）が入ったＬ字型 試験管（モノー管）に植菌し２８゜Ｃで３日間振盪培養し（１００ｃｙｃｌｅｓ ／ｍｉｎ）、目視にて凝集性を評価した。尚、凝集性の程度の評価スケールはジ ョンストン等のスケーリング方法に従った［イーストジエネティノクス・ファン ダメンタル・アンド・アブライド・アスベクツ（ＹｅａｓｔＧｅｎｅｔｉｃｓ： 　Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ａｓｐｅｃｔｓ）、２０ ５−２２４頁、スブリンガー・フエアラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）、ジエー・エフ，ティー・スペンサ−（ Ｊ．　Ｆ．　Ｔ．　Ｓｐｅｎｃｅｒ）、ディー．エム・スペンサー（Ｄ．　Ｍ． 　Ｓｐｅｎｃｅｒ）、工一・アール．ダブリュー・スミス（Ａ．　Ｒ．　Ｗ．　 Ｓｍｉｔｈ）ｉ（１９８３）］。 ［表１］ 各種実用酵母への凝集性遺伝子ＦＬＯＩＳおよびＦＬＯＩＬの導入とその発現酵 母の種類／ブラスミド　ＹＲｐＯＬＦ１４Ｓ　ＹＲｐＧＬＦ８Ｌ下面ビール酵母 　！１２０４　４　５ Ｗ１６４　４　５ 上面ビール酵母　ｏｂｇ．　１６０　２　Ｓウ４；＋４−一酵母　ＡＩＩＩＩ３ ２０Ｑ　４　Ｓワイン酵母　ＩＡＭ４１７５　１　３ 日本酒酵母　協会６号　４５ 焼酎酵母　ＩＦ０　０２８２　２　４ アルコール酵母　ＩＦ０　０２１６　２　４注）凝集性の評価は、０から５の６ 段階で表示した。０：非凝集性、１：ｌｌｌ．常に幻弓ν）凝集性、２．弱い凝 集性、３．中程度の１疑集性、４．強レ１凝集性、５：ｌ−常レこぢ虫一凝集性 。 このｊ店果から、．疑集性ａ伝子ＦＬＯＩＳまたはＦＬＯＩＬｔ導入すること塾 こより、凝集性の程度の差はあるものの、各種産業用非凝集性酵母を全て凝集性 酵母（こ変換することができた。この場合、ベクタープラスミドＹＲｐＧＬ１０ の導入で１よ宿主細胞は非ｒＱｊ９性のままであることは言うまでもな１，１。 また、ＦＬＯＩＳ型遺伝子の導入の場合よりＦＬＯＩＬ型遺ｆ云子の導入の場合 の方力《、よ旧コ・い凝集性を宿主株に引き起こすこと力（Ａつ力・つた。 実施ｉ５’ｉ９ ［ＦＬＯＩＬｉｆｔｆＥ子の各種実用酵母株への導入（その２：酵母染色体への 組み込み）】一般に、外来遺伝子をブラスミドの形で宿主細胞に導入した場合、 非這択圧下での継代培歪の結果、プラスミドは細胞から脱落していく。実際に上 記実施例８で得た形質転換体も０４１８による選択圧をかけなければ容易にブラ スミドは脱落していくことが観察された。そこで、ＦＬＯＩ遺伝子を酵母中で安 定に保持させるために、発明者等はＦＬＯＩ遺伝子の酵母染色体への組み込みを 試みた。 （ｉ）　組み込みのためのＦＬ○１発現力セットの作成（フローチャートを図１ ２＆二示す。該フローチャート中の各ブラスミド及びオープン・リーディング・ フレーム（ＯＲＦ）に付された番号は、図１３−２７に詳しく示されるそれらブ ラスミド及びオーブン・リーディング．フレームに付された番号と一致する。） 。 ＦＬＯＩ遺伝子を酵母中で高発現させるために、醇母アルコール・デヒドロゲナ ーゼ遺伝子の転写．翻訳を制御するユニットにあたる、プロモーターをＦＬＯＩ 遺伝子の珂一ブン・リーディング・フレーｌ１の５゜側上流に、ターミネーター を３′側下流番二それぞれ組み込んだ。すなわち、酵母アルコール・デヒドロゲ ナーゼ遺伝子のプロモーターとターミネーター配列を含むブラスミドｐＢＲ−ｄ Ｈ−ＡＩ）Ｉ｛１のＨｉｎｄＩＩ［部位にＦＬＯＩＳのオーブン・リーディング ．フレーム配列またはＦＬＯＩＬのオーブン・リーディング・フレーム配列を挿 入し、それぞれｐＢＲ−ＡＤＨＩ−ＦＬＯＩＳ（図２２）とｐＢＲ−ＡＤＨＩ− ＦＬＯＩＬ（図２７）を得た。尚、本発現カセ・ノトを作成する番二あたって、 ＦＬＯＩＳのオーブン・リーディング・フレーム作成時にＰＣＲ法を用Ｉ／）て 行った力｛（ＰＣＲ実験法は実施例５の場合と同じ）、このようにして作成した ＦＬＯＩＳ遺伝子の塩基配列は制限酵素解析およびＤＮＡシークエンスの結果、 実施例３の結果得られた図２の制限酵素開裂地図及び配列番号２に示される塩基 配列と全く同一であることを発明者等は確認している。 （ｉｉ）　コ・トランスフォーメーション法によるＦＬＯ　１発現カセ・ノトの ビーノレ酵母ゲノムへの組み込み例。 酵ひ（非凝集性の下面ビール酵母Ｗ２０４）染色体ＤＮＡにベクター由来配列（ ベクターブラスミドｐＢＲ３２２由来配列）を含まなν）ＦＬＯ１発現力七・ノ トをａ且み込むためにベンテイラ（Ｐｅｎｔｔｉｌａ）等のコ・トランスフォー メンジョン法［カレント・ジエネテイソクス、（Ｃｕｒｒ、　Ｇｅｎｅｔ、）、 １２巻、４１３−４２０頁（１９８７）］を行った。すなわち、上記（ｉ）で得 たプラスミドｐＢＲ−ＡＤＨＩ−ＦＬＯＩＳまたはｐＢＲ−ＡＤＨｌ−ＦＬＯＩ Ｌ　５０μｇを制限酵素Ｂａｒｎ）ｉＩで消化し、フェノール・クロロホルム処 理後、０４１８耐性プラスミドＹＲｐＧ１．．１０５０μｇを加え一緒にエタノ ール沈澱を行った。このＤＮＡサンプルを風乾後、上記実施例８で示した方法に 従い酵母の形質転換法を行った。形質転換体は０４１８耐性を指標として選択し 、得られた形質転換体をマイクロプレート・アッセイ法（実施例１参照）により スクリーニングを行い凝集性株を得た。ここで、具体的には、マイクロプレート ・アッセイ法とは以下の如くである。得られたこれらの形質転換体をプレートか ら１個ずつつま楊子にて取り、９６穴のマイクロプレート（各々２００μｍのＹ ＰＤ液体培地が入っている）に植菌し、２５°Ｃで３日間培養した。凝集性の検 定は、培養後のマイクロプレートをマイクロプレートミキサー（タイチック社製 マイクロミキサー）で６０秒間強く振盪して行い、目視にて凝集性のクローンを 捜した。 このようにして得られた凝集性株をＹＰＤ培地で非選択的に１Ｏ−２ＯＬ！−代 培養した後、適宜希釈してＹＰＤ寒天培地に塗布し３０°Ｃで２−３日培養した 。プレート上に得られたコロニーを０４１８２００μｇ／ｍｌを含むＹＰＤ寒天 培地および０４１８を含まなしｔＹＰＤｍ天培地にレプリカし、そのコロニーの ０４１８耐性を調べて、０４１８耐性を示さない株を得た。これらの株は、プラ スミドＹＲｐＧＬ１０が細胞から欠落してし）るが、ＦＬＯＩＡ現カセット（す なわちＡＤＨＩプロモーターとＡＤＨＩターミネータ−の発現支配下にあるＦＬ ＯＩＳまたはＦＬＯＩＬ遺伝子のオーブン・リーディング・フレーム）が、ＡＤ Ｈ１遺伝子の相同間タリ部分を利用してｉｎ　ｖｉｖｏでジーン・リプレースメ ン）　（ｇｅｎｅ　ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）により染色体のＡＤＨ１座位に組 み込まれたものであると考えられる。 これらの株のうち、ＦＬＯＩＳ発現カセットが組み込まれた株をＷ２Ｏ４−ＦＬ ＯＩＳ株、ＦＬＯＩＬ発現カセットが組み込まれた株をＷ２Ｏ４−ＦＬＯＩＬ株 と呼ぶことにした。これらの株を５０址代培養したところ、凝集性は培養前と同 じ程度に維持された。また、Ｗ２Ｏ４−ＦＬＯＩＳ株およＩ、）”Ｗ２Ｏ４−Ｆ ＬＯＩＬ４朱のジェノミック・サザン解析を行ったところ、いずれのＦＬＯＩカ セットも染色体ＤＮＡに組み込まれていることを発明者等は確認している。 （ｉｉｉ）　発酵試験 （ｉｉ）で得られたＷ２Ｏ４ＦＬ０１Ｓ株およびＷ２Ｏ４−ＦＬＯＩＬ株を用い て２Ｌスケールの小スケールビール発酵試験を行った。すなわち、方法は欧州醸 造学会の統一方法［ジャーナル・オブ、ジ、インスティテユート・オブ・ブリュ ーイング（Ｊ、　Ｉｎ５ｔ、　Ｂｒｅｗ、）、イービーシー、アナリティカ・ミ クロビオロジ力・メソッド・２．５．４．チューブズイービーシー、（ＥＢＣＡ ｎａｌｙｔｉｃａ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ、　Ｍｅｔｈｏｄ　２．５． ４．　Ｔｕｂｅｓ　Ｅ、Ｂ、Ｃ，）、@８３巻。 １１７−１１８頁、１９７７年］に従った。麦汁５０ｍ１で２０°Ｃ３日間静置 培養し、その全量を麦汁ＩＬに加えて１５°Ｃで１週間静置培養した。生育した 菌体を遠心分離（５，０００ｒｐｍ　ｘ　１０分）により集菌した。得られた酵 母菌体を１１°Ｐ（プラト一度）の麦汁（予め酸素濃度は９ｐｐｍに調製しであ る）に０．５％（ｗｅｔ　ｖ／ｖ）となるように添加した。これを１０°Ｃで１ ０日間静置発酵させた。この時点で酵母の凝集沈降量を比較したところ、親株の Ｗ２Ｏ４株は非凝集性であるため沈下酵母の量が少なく、回収量は最初の添加酵 母の量とほぼ同じ量（すなわち１００％の回収率）。しかし、ＦＬＯＩＬ発現カ セットが組み込まれているＷ２Ｏ４−ＦＬＯＩＬ株は強い凝集性を示し、回収量 は最初の添加酵母量の倍以上（すなわち２００％以上）であった。しかしながら 、ＦＬＯＩＳ発現カセットが組み込まれたＷ２Ｏ４−ＦＬＯＩＳ株は非常に弱い 凝集性しか示さず、回収量は親株Ｗ２Ｏ４の場合と同程度でしかなかった。この ことは、ＦＬＯＩＳのシングルコピーでの導入では、その宿王細胞に麦汁中で十 分な凝集性を引き起こすことができないことを意味していると推察される（実施 例８で得たマルチコピーでＦＬＯＩＳを導入したＷ２Ｏ４は麦汁中でも凝集性を 示す。）。 しかし、シングルコピーのＦＬＯＩＳが染色体に導入されているＷ２Ｏ４−ＦＬ ＯＩＳ株がＹＰＤ培地中では中程度の凝集性を示すが、麦汁中では示さない理由 は現在のところ不明である。 また、上記の発酵終了後（前発醇終了後）その上澄み液（若ビール）の熟成（を 表発酵）を行った。すなわち、５°Ｃ２週間、０°Ｃ１週間の後発酵工耳呈１冬 了ｔＦ−メンフ゛レンフイルターでろ過を行い、０°Ｃ２気圧で２日間カーボネ ーション後、イし学分析および試飲を行った。その結果、Ｗ２Ｏ４とＷ２Ｏ４− ＦＬＯＩＬで１よ何等の差異１！認められな力１つだ。従って、本発明の酵母を 用Ｉ／１だビール醸造では、対照採番コ香味成分のイ可等の変化を与えずに酵母 の凝集性のみを改良することができたこと力（明ら力）となった。 ［寄託］ 本発明のＤＮＡ鎖（ＦＬＯＩＬ遺伝子のオープン・リーディング、フレーム自己 ツ１］）を含むプラスミドｐＢＲ−ｄＥＰ１−ＦＬ０１Ｌ（図２７）は、大腸菌 ＪＡ２２１株番二導入し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ　ＦＬＯＩＬとして 、１９９３年１月１３日通商産業省工業技術院生命工学工業士支律ｉ研究所に寄 託されて、微工研条寄第ＦＥＲＭＢＰ−４１３６号の受託番号を得てしする。 配列表 配列番号：１ 配列の長さ：４６１４ 配列の型、核酸 鎮の数°二本鎖 トポロジー二直鎮状 配列の種類：　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ起源：サツカロマイセス・セレビシェＡ ＢＸＬ−１０Ｋ配列　１ ＧＡＣＣＴＡ　ＡＧＴ　ＣＡＡ　ＴＣＴ　ＭＣＴＧＴ　ＡＣＴ　ＧＴＣＣＣＴ　 ＧＡＣＣＣＴ　ＴＣＡ　ＡＡＴ　ＴＡＴ　ＧＣＴ　８１６ＧＴＣＡＧＴ　ＡＣＣ ＡＣＴ　ＡＣＡ　ＡＣＴ　ＡＣＡ　ＡＣＧ　ＧＭ　ＣＣＡＣＡＧ　ＡＣＣＧＧＴ 　ＡＣＴ　ＴＴＣＡＣＴ　８６４ＴＣＴ　ＡＣＡ　ＴＣＴ　ＡＣＴ　ＧＭ　ＡＴ Ｇ　ＡＣＣＡＣＣＧＴＣＡＣＣＧＧＴ　ＡＣＣＡＡＣＧＧＣＧＴＴ　ＣＣＡ　９ １２ＡＣＴ　ＧＡＣＧＭ　ＡＣＣＧＴＣＡＴＴ　ＧＴＣＡＴＣＡＧＡ　ＡＣＴ　 ＣＣＡ　ＡＣＡ　ＡＣＴ　ＧＣＴ　ＡＧＣＡＣＣ９６０ＡＴＣＡＴＡ　ＡＣＴ　 ＡＣＡ　ＡＣＴ　ＧＡＧ　ＣＣＡ　ＴＧＧ　ＭＣＡＧＣＡＣＴ　ＴＴＴ　ＡＣＣ ＴＣＣＭＣＴＴＣＴ　１００８ＡＣＣＧＡＡ　ＴＴＧ　ＡＣＣＡＣＡ　ＧＴＣＡ ＣＴ　ＧＧＣＡＣＣＭＴ　ＧＧＴ　ＧＴＡ　ＣＧＡ　ＡＣＴ　ＧＡＣＧＭ　１０ ６６ＡＣＣＡＴＣＡＴＴ　ＧＴＡ　ＡＴＣＡＧＡ　ＡＣＡ　ＣＣＡ　ＡＣＡ　Ａ ＣＡ　ＧＣＣＡＣＴ　ＡＣＴ　ＧＣＣＡＴＡ　ＡＣＴ　１１０４ＡＣＡ　ＡＣＴ 　ＧＡＧ　ＣＣＡ　ＴＧＧ　ＡＡＣＡＧＣＡＣＴ　ＴＴＴ　ＡＣＣＴＣＴ　ＡＣ Ｔ　ＴＣＴ　ＡＣＣＧＡＡ　ＴＴＧ　１１５Q ＧＴＣＡＴＣＡＧＡ　ＡＣＡ　ＣＣＡ　ＡＣＡ　ＡＣＡ　ＧＣＣＡＣＴ　ＡＣＴ 　ＧＣＣＡＴＧ　ＡＣＴ　ＡＣＡ　ＡＣＴ　ＣＡＧ　１２４W ＣＣＡ　ＴＧＧ　ＭＣＧＡＣＡＣＴ　ＴＴＴ　ＡＣＣＴＣＴ　ＡＣＡ　ＴＣＣＡ ＣＴ　ＧＭ　ＡＴＧ　ＡＣＣＡＣＣＧＴＣ１２９６ＡＣＣＧＧＴ　ＡＣＣＭＣＧ ＧＴ　ＴＴＧ　ＣＣＡ　ＡＣＴ　ＧＡＴ　ＧＭ　ＡＣＣＡＴＣＡＴＴ　ＧＴＣＡ 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＾ＢＸＬ−１０株配列　２ ＧＴＣＡＧＴ　ＡＣＣＡＣＴ　ＡＣＡ　ＡＣＴ　ＡＣＡ　ＡＣＧ　ＧＭ　ＣＣＡ 　丁ＧＧ　ＡＣＣＧＧＴ　ＡＣＴ　ＴＴＣＡＣＴ　８６４ＴＣＴ　ＡＣＡ　ＴＣ Ｔ　ＡＣＴ　ＧＭ　ＡＴＣＡＣＣＡＣＣＧＴＣＡＣＣＧＣＴ　ＡＣＣＭＣＧＧＣ ＧＴＴ　ＣＣＡ　９１２ＡＣ丁　ＧＡＣＧＡＡ　ＡＣＣＧＴＣＡＴＴ　ＧＴＣＡ ＴＣＡＧＡ　ＡＣＴ　ＣＣＡ　ＡＣＡ　ＡＣＴ　ＧＣＴ　ＡＧＣＡＣＣ９６０Ａ ＴＣＡＴＡ　ＡＣＴ　ＡＣＡ　ＡＣＴ　ＧＡＧ　ＣＣＡ　ＴＧＧ　ＡＣＴ　ＧＧ Ｔ　ＡＣＴ　ＴＴＣＡＣＴ　ＴＣＴ　ＡＣＡ　ＴＣＴ　１O０８ ＴＣＴ　ＴＣＡ　ＧＧＡ　ＣＭ　ＡＴＣＡＣＣＡＧＣＴＣＴ　ＡＴＣＡＣＧ　Ｔ ＣＴ　ＴＣＧ　ＣＧＴ　ＣＣＡ　ＡＴＴ　ＡＴＴ　１２９６１１ｅ　Ｓｅｒ　Ｓ ｅｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｓ ｅｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　ＩＩｓＳｅｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｖａ ｌ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｔｈ ｒ　Ａｌａ　ＳｅｒＣＣＴ　ＧＣＧ　ＡＴＴ　ＧＴＴ　ＴＣＣＡＣＡ　ＧＣＴ　 ＡＣＴ　ＧＴＴ　ＡＣＴ　ＧＴＴ　ＡＧＣＧＧＣＧＴＣＡＣＡ　ＡＣＡ　１７７ U ＧＡＧ　ＴＡＴ　ＡＣＣＡＣＡ　ＴＧＧ　ＴＧＣＣＣＴ　ＡＴＴ　ＴＣＴ　ＡＣ Ｔ　ＡＣＡ　ＧＡＧ　ＡＣＡ　ＡＣＡ　ＭＧ　ＣＭ　１８２S ＡＣＣＡＡＡ　ＧＧＧ　ＡＣＡ　ＡＣＡ　ＧＡＧ　ＣＡＡ　ＡＣＣＡＣＡ　ＧＭ 　ＡＣＡ　ＡＣＡ　ＡＡＡ　ＣＭ　ＡＣＣＡＣＧ　１８７２ＧＴＡ　ＧＴＴ　Ａ ＣＡ　ＡＴＴ　ＴＣＴ　ＴＣＴ　ＴＧＴ　ＧＡＡ　ＴＣＴ　ＧＡＣＧＴＡ　ＴＧ ＣＴＣＴ　ＭＧ　ＡＣＴ　ＧＣＴ　１９Q０ ＴＣＴ　ＣＣＡ　ＧＣＣＡＴＴ　ＧＴＡ　ＴＣＴ　ＡＣＡ　ＡＧＣＡＣＴ　ＧＣ Ｔ　ＡＣＴ　ＡＴＴ　ＭＣＧＧＣＧＴＴ　ＡＣＴ　１９６８ＡＣＡ　ＧＭ　ＴＡ ＣＡＣＡ　ＡＣＡ　ＴＧＧ　ＴＧＴ　ＣＣＴ　ＡＴＴ　ＴＣＣＡＣＣＡＣＡ　Ｇ Ｍ　ＴＣＧ　ＡＧＧ　ＣＭ　２０１６ＣＡＡ　ＡＣＡ　ＡＣＧ　ＣＴＡ　ＧＴＴ 　ＡＣＴ　ＧＴＴ　ＡＣＴ　ＴＣＣＴＧＣＧＭ　ＴＣＴ　ＧＧ丁Ｇ丁Ｇ　ＴＧＴ 　ＴＣＣ２０６４ＧＭ　ＡＣＴ　ＧＣＴ　ＴＣＡ　ＣＣＴ　ＧＣＣＡＴＴ　ＧＴ Ｔ　ＴＣＧ　ＡＣＧ　ＧＣＣＡＣＧ　ＣＣＴ　ＡＣＴ　ＧＴＧ　ＭＴ　２１１Q 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フィンランド国　ニスボー市　ニスエフ−０２１５１ティエト　ティエ　２　オ イパニモラポラトリオ内

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. １．酵母において凝集活性を示すポリペプチドをコードする４．７±０．２ｋｂ の凝集性遺伝子。
2. ２．酵母において凝集活性を示すポリペプチドをコードする２．６±０．２ｋｂ の凝集性遺伝子。
3. ３．酵母サッカロマイセス・セレビシエに由来し、図１の制限酵素開裂地図で規 定される請求項１記載の凝集性遺伝子。
4. ４．配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を実質的にコードする請求項１ または３記載の凝集性遺伝子。
5. ５．酵母サッカロマイセス・セレビシエに由来し、図２の制限酵素開裂地図で規 定される請求項２記載の凝集性遺伝子。
6. ６．配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列を実質的にコードする請求項２ または５記載の凝集性遺伝子。
7. ７．請求項１−７のいずれかに記載された凝集性遺伝子を含有し、凝集性を有す る酵母。