JP4269037B2 - 有機酸高含有清酒の製造方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、有機酸含量の高い清酒の製造方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
【特許文献1】
特開平3−175975号公報
【特許文献2】
特開平5−317036号公報
【特許文献3】
特開平6−121670号公報
【特許文献4】
特開2001−103958公報
【特許文献5】
特開平7−203951号公報
【特許文献6】
特開平11−46757号公報
【特許文献7】
特公昭53−19678号公報
【特許文献8】
特表2001−505777公報
【非特許文献1】
日本醸造協会誌、第88巻、第8号、第645〜647頁(1993年)
【非特許文献2】
日本醸造協会誌、第90巻、第10号、第751〜758頁(1995)
【非特許文献3】
2002年度(平成14年度)大会講演要旨集、2002年3月5日、社団法人 日本農芸化学会発行、第56頁2−6Aa11有機酸を多く生成する酵母について、コハク酸デヒドロゲナーゼの阻害剤であるジメチルサクシネートの感受性酵母(特開平3−175975号公報)、爽快な酸味を生成する泡なし清酒酵母(特開平5−317036号公報)、コハク酸デヒドロゲナーゼの阻害剤であるテノイルトリフルオロアセトン又はオキシカルボキシン耐性酵母(特開平6−121670号公報)、クエン酸シンターゼの阻害剤に耐性を示す酵母(特開2001−103958公報)が知られている。また、有機酸及び香気成分を多く生成する酵母について、シクロヘキシミド耐性酵母〔日本醸造協会誌、第88巻、第8号、第645〜647頁(1993年)〕、メタ亜硫酸カリウムに対して馴養により取得した酵母(特開平7−203951号公報)、シクロヘキシミド耐性酵母にカプロン酸エチル高生産性を付与した多酸性酵母〔日本醸造協会誌、第90巻、第10号、第751〜758頁(1995年)〕、アコニット酸ヒドラターゼの阻害剤感受性、基質感受性酵母(特開平11−46757号公報)が知られている。
【0003】
一方、清酒製造工程において汲水の全部あるいは一部に清酒を使用し、清酒醪を十分増殖させた酵母によりアルコール発酵させる清酒醸造法があり、甘口、濃醇な酒質の清酒が得られる(特公昭53−19678号公報)。この甘口、濃醇な清酒の製造には、甘味とのバランスから多酸性酵母を用いることが良く、有機酸含量が多く、甘味と酸味のバランスが良い酒質の清酒を製造できる酵母が求められている。しかしながら、従来の変異誘発剤で処理した多酸性変異酵母ではそのようなバランスの良い酒質の清酒を得ることは容易ではない。
【0004】
従来の変異処理法に変わる技術として、遺伝子組換え技術による酵母の育種も行われている。例えば、グルコース存在下で抑制されている酵母の酸化的代謝系を、HAP4遺伝子を発現する組換え体を造成することで、その抑制を解除し、バイオマス収量を増大させる技術が開示されている(特表2001−505777公報)。しかしながら、この遺伝子組換え酵母がアルコール発酵条件下で特定の有機酸を高生産することは知られていない。
【0005】
先に、本発明者らは、従来の変異処理法によりリンゴ酸、コハク酸を高生成するクエン酸シンターゼの阻害剤に耐性を示す酵母として得られた20G−R39株の遺伝的特徴を明らかにするため、マイクロアレイ解析を行い、20G−R39株の有機酸高生産には、HAP4遺伝子の発現が深く関わっているという知見を得ている〔2002年度(平成14年度)大会講演要旨集、2002年3月5日、社団法人 日本農芸化学会発行、第56頁2−6Aa11〕。しかしながら酒類、食品の製造方法の製造において、遺伝子組換え酵母を用いて特定の有機酸を高生産させる検討は行われていない。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、前記した従来技術にかんがみ、遺伝子組換え酵母を用いる有機酸含量の高い清酒の新規な製造方法を提供することにある。
【0007】
【課題を解決するための手段】
本発明を概説すれば、本発明の第1の発明は、HAP4遺伝子を発現するベクターで形質転換したサッカロミセス・セレビシエに属する清酒酵母Saccharomyces cerevisiae K701/pAUR 123−HAP4(FERM P−18933)を用いることを特徴とする有機酸高含有清酒の製造方法に関する。本発明の第2の発明は、有機酸がリンゴ酸及び/又はコハク酸である第1の発明に関する。
【0008】
本発明者らは、有機酸を高生産し、その酸組成にも特徴を有する酵母の取得を目的に、TCAサイクルに関与する酵素群の発現を促進する制御遺伝子であるHAP4遺伝子を高発現させれば有機酸を高生産するのではないかと考えた。本発明においては、TCAサイクルの働きを促進する遺伝子の一つであるHAP4遺伝子〔ジーンズ アンド デベロップメント(Genes Dev)、第3巻、第1166〜1178頁(1989年)〕を清酒酵母協会701号酵母(以降、K701と略す)からクローニングし、これを元株のK701に導入して、YPD培地での培養試験を行って、HAP4遺伝子を高発現させたところ、有機酸含量が高いことを見出した。更に、該HAP4遺伝子高発現株を用いて清酒小仕込試験を実施し、有機酸を高生産することを認めた。更に、成分分析及び官能検査により、爽快で口当りの良い従来にない酸味のバランスの良い清酒が得られることを見出し、本発明を完成した。
【0009】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について具体的に説明する。
本発明において、有機酸高含有清酒とは、少なくともリンゴ酸及び/又はコハク酸濃度が、対照よりも高い清酒のことをいい、更に好ましくは、該有機酸濃度が対照の少なくとも2倍である清酒のことをいう。
【0010】
本発明において、形質転換したサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)に属する清酒酵母が好ましい。遺伝子クローニング方法としては、酵母において公知の遺伝子クローニング方法、例えばPCR法を用いて目的遺伝子を増幅させる方法、ショットガンクローニングを行う方法等を適宜選択して用いればよく、有効な遺伝子クローニング方法としてはPCR法が好ましい。
【0011】
本発明に使用するHAP4遺伝子の塩基配列は、例えばSGD(Saccharomyces Genome Databese)のホームページ(http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces/)に記載されているので、この配列に基づいてPCRプライマーを設計し、酵母のゲノムDNAをテンプレートにしてPCRを行うことにより、目的遺伝子を得ることができる。これを発現ベクターに接続して、酵母に導入することができる。
【0012】
酵母にHAP4遺伝子を導入する際に用いるベクターとしては、多コピー型、単コピー型、染色体組込み型のいずれも利用可能である。特に、オーレオバシジン耐性をマーカーにもつpAUR101やpAUR123〔タカラバイオ(株)製〕などが使いやすい。この他、形質転換の際に用いる選択マーカーとして、アミノ酸などの栄養要求マーカーや薬剤に対する耐性マーカーなども利用可能である。
【0013】
実験例1
(形質転換株の作製法)
HAP4遺伝子の高発現株を得るために二段階のクローニング実験を実施した。
▲1▼pAUR101ベクターへのクローニング
HAP4遺伝子の上流1154bp、HAP4遺伝子のコード領域1665bp及びHAP4遺伝子の下流451bpを含むPCR産物を得るために、配列番号1及び2で示されるプライマーを設計した。
配列番号1:CGGTGACTTCGCAGTAGTGATGTA
配列番号2:CTCTTGACGTGTTTCACCATACGC
プライマー設計のためのソフトウエアは、インターネットを利用し、SGD(Saccharomyces Genome Databese)のホームページ(http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces/)に添付のものを使用した。
K701からゲノムDNAを抽出し、配列番号1及び2で示されるプライマーを用いてPCR法によりDNA増幅を実施し、PCR産物をpAUR101ベクターのSmaIサイトにクローニングした。
▲2▼pAUR123ベクターへのクローニング
HAP4遺伝子のコード領域のみが増幅されるように、配列番号3及び4で示されるプライマーを設計した。
配列番号3:ATGACCGCAAAGACTTTTCTA
配列番号4:TCAAAATACTTGTACCTTTAA
▲1▼で得たクローン化DNAをテンプレートにし、配列番号3及び4をプライマーにして、再度PCRを実施し、HAP4遺伝子のコード領域(1665bp)のみを増幅した。得られたPCR産物をpAUR123ベクターのSmaIサイトにクローニングし、エレクトロポレーションによりK701に導入した。0.5μg/mlオーレオバシジンAを含むYPD寒天培地(酵母エキス1%、ポリペプトン2%、グルコース2%)で、30℃、3日間培養し、得られた単コロニーを同じ組成のYPD培地で再度培養し、生育してきたものを形質転換株として、Saccharomyces cerevisiae K701/pAUR123−HAP4と命名した(以下、SaccharomycesをS.と略記する)。
(YPD培地でのHAP4遺伝子の発現及び有機酸生成試験)
S.cerevisiae K701/pAUR123−HAP4をYPD培地で、30℃、一晩、振とう培養した。この前培溶液0.2mlを10mlのYPD培地に加え、更に30℃で振とう培養した。菌体をOD660=1.0まで増殖させ、菌体からRNAを抽出して、ノーザンブロットを行ったところ、HAP4遺伝子の発現量が、対照と比べて約3.7倍と高発現が確認された。
また、一晩振とう培養した前培養液0.2mlを10mlのYPD15培地(YPD培地のグルコース濃度を15%に変更)に加え、15℃で10日間静置培養した。培養終了液を遠心分離し、上清部分の有機酸組成を分析した。結果を表1に示す。
【0014】
【表1】
【0015】
この結果、pAUR123ベクターにHAP4遺伝子をつないだプラスミドを含む形質転換株は、宿主K701(対照株)やベクターのみを含むK701(比較株)に比べて、爽快な酸味を呈するリンゴ酸及び旨味を呈するコハク酸が多く、各々対照株の1.6倍及び1.7倍高生産であった。
【0016】
本発明の酒類及び食品の製造方法は、HAP4遺伝子を高発現し、有機酸を高生産するサッカロミセス・セレビシエに属する酵母を用いることを特徴とし、製造方法は特に限定されるものではなく、一般的な製造方法を適宜用いることができる。
本発明のHAP4遺伝子を高発現する酵母を用いて清酒、焼酎、ワイン、ビールの各酒類、又はパン等の食品を製造すれば、爽快な口当りの良い酸味が向上した製品を製造することができる。これらの清酒、焼酎、ワイン、ビール又はパン等の原料は特に限定するものではなく、一般的な原料を適宜用いることができる。
かくして、本発明により、宿主であるK701株のHAP4遺伝子を高発現させることにより、有機酸高含有酒類及び食品の製造方法が提供される。
なお、以上の特徴をもつHAP4遺伝子高発現の代表株は、Saccharomyces cerevisiae K701/pAUR123−HAP4と命名、表示され、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにFERM P−18933として寄託されている。
【0017】
【実施例】
次に、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【0018】
実施例1
本発明の酵母及びK701を用いて、表2に示す仕込配合で清酒を製造した。
【0019】
【表2】
【0020】
掛米は精白歩合75%の白米を使用し、麹は精米歩合75%の白米を使用して製造した。酵母はYPD5培地(YPD培地のグルコース濃度を5%に変更)2.5mlの一夜振とう培養菌体を加えた。発酵温度は15℃一定とし、仕込み後13日目で上槽した。上槽液の分析結果を表3に示す。
【0021】
【表3】
【0022】
官能検査は3点法(1:良、2:普通、3:悪)で行い、パネラー10名の平均値で示した。
この結果、HAP4遺伝子を含む形質転換株は、宿主K701(対照株)やベクターのみを含むK701(比較株)に比べて、酸度が高く、爽快な酸味を呈するリンゴ酸及び旨味を呈するコハク酸が各々対照株の2.3倍及び2.1倍高生産であり、有機酸のバランスがとれていた。官能的にも、形質転換株はほどよい甘味と酸味を有するという評価が得られた。すなわち、甘味と酸味のバランスのとれた、しかも旨味を有する従来にない濃醇な酒質を有する清酒となった。
【0023】
【発明の効果】
本発明により、有機酸、詳細にはリンゴ酸及び/又はコハク酸を高生産する新規酵母を取得することができ、この酵母を使用することにより、従来の清酒に比べ、酸味が強く、その有機酸組成で嗜好的に好ましいリンゴ酸及び/又はコハク酸含有量が増加した清酒を製造できる。特に、濃醇でかつ甘味と酸味のバランスの良い酒質の清酒が製造できる。
【0024】
【配列表】
Claims (2)
- HAP4遺伝子を発現する組換えベクターで形質転換したサッカロミセス・セレビシエに属する清酒酵母Saccharomyces cerevisiae K701/pAUR 123−HAP4(FERM P−18933)を用いることを特徴とする、濃醇でかつ甘味と酸味のバランスの良い有機酸高含有清酒の製造方法。
- 有機酸がリンゴ酸及び/又はコハク酸である、請求項1に記載の清酒の製造方法。
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