JP6049015B2 - Ｈｅｍｆ高含有発酵食品の製造法 - Google Patents

Description

本発明は、４−ハイドロキシ−２（又は５）−エチル−５（又は２）−メチル−３（２Ｈ）−フラノン（以下「ＨＥＭＦ」と表記する）の製造法、及びＨＥＭＦ高含有発酵食品の製造法に関するものである。

ＨＥＭＦは醤油、味噌、日本酒、チーズなどの各種発酵食品に見出される香気成分の一種で、カラメル様の甘い香りを有し、とくに味噌・醤油における風味向上に有効な成分として知られている。また、味噌・醤油以外においても、食品に優良な風味や香味を付与する原料として期待されている。

従来、ＨＥＭＦは微生物を用いて生産され、当該ＨＥＭＦを用いることによって発酵食品等の風味や香味を向上させる様々な試みがなされてきた。例えば、ＨＥＭＦを微生物に生産せしめる方法として、タンパク質１ｇ当たり５単位以上のペプチダーゼ活性存在下でタンパク質を分解して得られた酵素分解液に酵母を接種し、当該酵母を培養する方法（特許文献１）や、ペントースとアミノ酸を含有する液体培地を加熱した後に酵母を接種し、当該酵母を培養する方法（特許文献２）などが知られている。
また発酵食品の風味や香味を改良させる方法として、前記の従来法で得られたＨＥＭＦ高含有酵母培養液を風味改良剤として添加する方法や、選抜育種によって得られたＨＥＭＦ生成能の高い酵母菌株を熟成味噌に加えて再度発酵させる方法（特許文献３）などが知られている。

一方、酵母におけるＨＥＭＦや類縁化合物の生合成経路については、チゴサッカロマイセス・ルキシーにおいていくつかの知見が得られている（非特許文献１）。

特開平８−１１６９８３号公報 特開２００１−１２０２９３号公報 特開平１１−１８７５９号公報

Sasaki et.al., J.Agric.Food.Chem.,Vol.39,934-938(1991)

しかしながら、発酵食品等の製造において、酵母のどのような遺伝子がＨＥＭＦの生成に寄与しているのか、十分な知見は得られておらず、酵母におけるＨＥＭＦや類縁化合物の生合成経路については、酵素による制御機構の詳細な解明はされていなかった。また、従来の発酵食品の風味や香味の向上方法では、本来の発酵食品の製造工程とは別に酵母の培養工程等が必要となり、通常の発酵食品の製造法に比較して工程数が増加する場合が多く、必ずしも実用に適したものとは言えなかった。

したがって本発明の目的は、微生物におけるＨＥＭＦ生成関連遺伝子を明らかにし、ＨＥＭＦ高生産微生物の育種に関する新規かつ有用な方法と共に、通常の発酵食品の製造工程と大きく変わらない方法で、簡便にＨＥＭＦの含有量を増加せしめることが可能となるＨＥＭＦ高含有発酵食品の製造方法を提供することにある。

本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、発酵食品の製造に用いられる酵母において、アルコールデヒドロゲナーゼ１（ＡＤＨ１）遺伝子を欠損した株を用いることによって、ＨＥＭＦの生産能が飛躍的に向上すること、さらに当該ＡＤＨ１遺伝子機能欠損酵母を用いることによってきわめて香り豊かな発酵食品を製造できることを見出し、本発明を完成させた。

具体的には、発酵食品の製造に用いられる酵母の一種であるサッカロマイセス・セレビシエにおいて、アルコールデヒドロゲナーゼ１（ＡＤＨ１）遺伝子を欠損した株を用いることによって、ＨＥＭＦの生産能が飛躍的に向上すること、さらに当該ＡＤＨ１遺伝子機能欠損酵母を用いることによってきわめて香り豊かな発酵食品を製造できることを見出した。

また、本発明者らは、同様に発酵食品の製造に用いられる酵母の一種であるチゴサッカロマイセス・ルキシーのゲノムデータベース（http://www.genolevures.org/）を用いて、サッカロマイセス・セレビシエのＡＤＨ１とのアミノ酸配列の相同性が高い遺伝子を検索した。その結果、チゴサッカロマイセス・ルキシーのゲノムデータベースにおいても、機能未知ではあるが、サッカロマイセス・セレビシエのＡＤＨ１と配列上の相同性が高い遺伝子（以下「ＺｒＡＤＨ１」）を見出した。

そこで本発明者らは、当該ＺｒＡＤＨ１遺伝子の機能について解析を行った結果、チゴサッカロマイセス・ルキシーにおいても、ＺｒＡＤＨ１の機能を欠損させることによってＨＥＭＦの生産能が飛躍的に向上すること、さらに当該ＺｒＡＤＨ１遺伝子機能欠損酵母を用いることによってきわめて香り豊かな発酵食品を製造できることを全く新たに見出した。さらに、ＺｒＡＤＨ１遺伝子を欠損させることに加えて、やはりサッカロマイセス・セレビシエのＡＤＨ１と高いアミノ酸配列の相同性を有するものとして見出された遺伝子（以下「ＺｒＡＤＨ２」）を同時に欠損させると、ＨＥＭＦの生産能がさらに高まることも見出した。

すなわち、本発明は次の（１）〜（９）に係るものである。
（１）ＡＤＨ１遺伝子の機能を欠損した酵母を用いることを特徴とするＨＥＭＦの製造法。
（２）酵母がサッカロマイセス・セレビシエ又はチゴサッカロマイセス・ルキシーである（１）記載の製造法。
（３）酵母がサッカロマイセス・セレビシエであり、ＡＤＨ１遺伝子が、配列番号８で示される塩基配列を含む遺伝子である（１）に記載のＨＥＭＦの製造法。
（４）酵母がチゴサッカロマイセス・ルキシーであり、ＡＤＨ１遺伝子が配列番号２１で示される塩基配列を含む遺伝子である（１）に記載のＨＥＭＦの製造法。
（５）酵母が、さらに配列番号２２で示される塩基配列を含む遺伝子の機能を欠損している（４）に記載のＨＥＭＦの製造法。
（６）発酵食品製造工程の発酵開始時〜発酵中期に、ＡＤＨ１遺伝子の機能を欠損した酵母を添加することを特徴とするＨＥＭＦ高含有発酵食品の製造法。
（７）酵母がサッカロマイセス・セレビシエ又はチゴサッカロマイセス・ルキシーである（６）に記載の製造法。
（８）さらにメイラード反応物を添加する（６）又は（７）に記載の製造法。
（９）発酵食品が、醤油、味噌、醸造酒又は酢から成る群より選ばれる（６）〜（８）のいずれかに記載の製造法。

本発明では、酵母におけるＨＥＭＦの生成に関わる遺伝子を初めて明らかにして、ＨＥＭＦ高生産酵母の選抜や作出の新規かつ有用な方法を与えることができる。また、本発明の製造法を用いれば、発酵食品の製造工程においてきわめて簡単にＨＥＭＦを高含有させた香味豊かな発酵食品を製造することが可能となる。

図１は、サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４３株について、野生株（ＷＴ）とＡＤＨ１遺伝子機能欠損株（ａｄｈ１Δ）における、細胞内ＡＤＨ活性を示したものである。 図２は、２種類のサッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４３株とＸ２１８０株について、野生株（ＷＴ）とＡＤＨ１遺伝子機能欠損株（ａｄｈ１Δ）におけるＨＥＭＦの生産能を示したものである。 図３は、サッカロマイセス・セレビシエ野生株（ＷＴ）及びＡＤＨ１遺伝子機能欠損株（ａｄｈ１Δ）をそれぞれ用いて醸造酒を製造した際の、醸造酒中におけるＨＥＭＦ含有量を示したものである。 図４は、チゴサッカロマイセス・ルキシー親株（Ｚｒ ＷＴ）、ＺｒＡＤＨ１遺伝子単独破壊株（Ｚｒ ａｄｈ１Δ）、ＺｒＡＤＨ２遺伝子単独破壊株（Ｚｒ ａｄｈ２Δ）、ＺｒＡＤＨ遺伝子二重破壊株（Ｚｒ ａｄｈ１Δａｄｈ２Δ）における、細胞内ＡＤＨ活性を示したものである。 図５は、ＨＥＭＦ生成培地を用いたときの、チゴサッカロマイセス・ルキシー親株（Ｚｒ ＷＴ）、ＺｒＡＤＨ１遺伝子単独破壊株（Ｚｒ ａｄｈ１Δ）、ＺｒＡＤＨ２遺伝子単独破壊株（Ｚｒ ａｄｈ２Δ）、ＺｒＡＤＨ遺伝子二重破壊株（Ｚｒ ａｄｈ１Δａｄｈ２Δ）における、ＨＥＭＦの生産量を示したものである。 図６は、麹高温消化液を用いたときの、チゴサッカロマイセス・ルキシー親株（Ｚｒ ＷＴ）、ＺｒＡＤＨ遺伝子二重破壊株（Ｚｒ ａｄｈ１Δａｄｈ２Δ）における、ＨＥＭＦの生産量を示したものである。

本発明に用いる酵母は、一般に発酵食品の製造に用いられる酵母菌であればとくに限定されないが、例えばサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）やチゴサッカロマイセス・ルキシー（Zygosaccharomyces rouxii）などを挙げることができる。

本発明では、酵母のアルコールデヒドロゲナーゼ１（ＡＤＨ１）遺伝子の機能を欠損させることによって、ＨＥＭＦの生産性を向上させることができる。

本発明におけるＡＤＨ１遺伝子は、酵母の遺伝子データベースなどによって定めることができ、例えばサッカロマイセス・セレビシエではＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（http://www.yeastgenome.org/）において「ＹＯＬ０８６Ｃ」で示される遺伝子を指す。また、当該遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号８に示す。

また、本発明におけるＡＤＨ１遺伝子は、例えばチゴサッカロマイセス・ルキシーのゲノムデータベース（http://www.genolevures.org/）において、「ＺＹＲＯ０Ｂ０５９４０ｇ」で示される遺伝子（以下「ＺｒＡＤＨ１」と呼ぶ）を指す。当該ＺｒＡＤＨ１遺伝子の塩基配列について、配列表の配列番号２１に示す。

本発明においてチゴサッカロマイセス・ルキシーのＡＤＨ１遺伝子を欠損させる場合、ＺｒＡＤＨ１遺伝子を欠損させるだけでなく、さらにチゴサッカロマイセス・ルキシーのゲノムデータベース（http://www.genolevures.org/）において「ＺＹＲＯ０Ｃ１２５６２ｇ」で示される遺伝子（以下「ＺｒＡＤＨ２」と呼ぶ）を欠損させてもよい。当該遺伝子の塩基配列について、配列表の配列番号２２に示す。

本発明において遺伝子の機能を欠損させる方法としては、遺伝子に変異又は欠損を生じさせる公知の方法を用いればよく、相同組換による遺伝子破壊法や、変異導入法などを利用することができる。

このような方法によって変異を生じさせた菌株の中から、遺伝子に変異又は欠損が生じた株をスクリーニングする方法としては、例えば相同組換による遺伝子破壊を行った場合であれば、組換えの際に特定の抗生物質への耐性を付与する別の遺伝子を同時に組み込み、当該抗生物質を添加した培地で正常に生育した株のみを選抜する方法などを用いることができる。ただし、上記のような選抜だけでは、目的とする遺伝子座が、導入したマーカー遺伝子と置換されたかどうか確認できないので、適宜ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法等を用いて、目的とする遺伝子座がマーカーによって置換されていることを確認することが推奨される。さらに、アルコールデヒドロゲナーゼの機能が欠損したことを確認することもできる。確認のためには公知の方法を用いてアルコールデヒドロゲナーゼ活性を測定すればよく、例えば、アルコールデヒドロゲナーゼの作用による反応過程で生じるＮＡＤＨの濃度を測定する方法などが挙げられる。

ＨＥＭＦの生産性を確認する方法としては、公知の方法に従えばよく、例えば上記特許文献２に記載の方法を用いることができる。具体的には、当該菌株をＨＥＭＦ生成に適した培地（ペントース、アミノ酸、グルコース等から成る培地）中で培養し、当該培地上のＨＥＭＦ量を高速液体クロマトグラフィーや、ガスクロマトグラフィーによって定量する方法などを用いることができる。

本発明では、上記のような方法によって得られたＡＤＨ１遺伝子機能欠損酵母菌を培養することで、ＨＥＭＦを製造することができる。ＨＥＭＦを製造する際の具体的な培養条件としては、例えばＨＥＭＦ生成培地（４１６ｍＭ グルコース，２００ｍＭ グリシン，２００ｍＭ リボース，７．３ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄，２０ｍＭ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ，０．５％ 酵母エキス，ｐＨ ６．０）中で、２５〜３５℃で１〜５日程度である。

また、ＡＤＨ１遺伝子機能欠損酵母菌を培養することによって発酵食品の製造とは別に得たＨＥＭＦを発酵食品に添加することもできるが、発酵食品の製造工程において、上記ＡＤＨ１遺伝子機能欠損酵母菌をあらかじめ添加して、各種発酵食品を製造することもできる。このとき、ＡＤＨ１遺伝子機能欠損酵母菌は、発酵食品の製造工程の開始時〜発酵中期に添加することが、食品の発酵過程において、同時にＡＤＨ１遺伝子機能欠損酵母においても十分な量のＨＥＭＦを生成せしめることが可能であることから好ましい。

発酵食品としては、例えば醤油、味噌、醸造酒、醸造酒を利用して製造される各種調味料（料理酒等）、酢などを挙げることができるが、酵母を用いて製造される発酵食品であればこれらに限定されない。なお醤油、味噌等を製造する際には酵母としてチゴサッカロマイセス・ルキシーを、醸造酒、酢等を製造する際には酵母としてサッカロマイセス・セレビシエを用いることが好ましい。

発酵食品の製造法としては常法を用いればよく、発酵食品が醤油である場合、通常の麹原料、例えば撒水して蒸煮した大豆原料と炒熬割砕した小麦原料の混合物に麹菌を接種混合して麹を調製し、得られた麹を通常の仕込みタンクに適当な濃度の食塩水で仕込み、適宜上記のＡＤＨ１遺伝子機能欠損酵母を添加して、撹拌しつつ３〜６ヶ月間程度発酵熟成させることで醤油諸味を得、常法により圧搾、精製、必要により火入れを行い、製品醤油（生醤油あるいは火入醤油）とするなどの方法をとることができる。なお、ＡＤＨ１遺伝子機能欠損酵母はもろみの発酵開始時〜発酵中期にかけて添加することができるが、とくに発酵開始時に添加するのが好ましい。

また、発酵食品が米を原料として用いた醸造酒である場合、例えば、任意の精白歩合の米、乾燥麹、水及び９０％乳酸を混合して醪（もろみ）とし、ここに上記のＡＤＨ１遺伝子機能欠損酵母を添加して、１０〜１５℃、２０〜３０日ほど発酵させた後、上槽することで目的の醸造酒を得ることができる。ＡＤＨ１遺伝子機能欠損酵母は醪の発酵開始時〜発酵中期に添加することができるが、とくに発酵開始時に添加するのが好ましい。

ＡＤＨ１遺伝子機能欠損酵母の添加量は、それぞれの発酵食品の特性に合う量を適宜加えればよいが、例えば醤油や味噌であれば、乳酸発酵終了時に１０⁴〜１０⁵（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）程度となるように加え、醸造酒又は酢であれば、仕込み時に汲み水あたり１０⁶〜１０⁸（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）程度となるように加えるのが好ましい。

なお、発酵食品の原料にＡＤＨ１遺伝子機能欠損酵母株を添加する発酵食品の製造方法において、発酵開始時には、ＡＤＨ１遺伝子の機能を欠損したサッカロマイセス属酵母の添加に加えて、メイラード反応物をＨＥＭＦの前駆体として添加してもよい。とくに、醸造酒、酢などの前駆体の含有量が低い発酵食品を製造する場合には、メイラード反応物を添加することが好ましい。

ここで、メイラード反応物とは、アミノ酸と糖との反応物をいい、例えば任意のアミノ酸水溶液と糖の水溶液を混合し、これを８０〜１４０℃、１０〜２０分ほど加熱したものが挙げられる。アミノ酸水溶液としては、食品に利用可能なアミノ酸であればどのようなものを使用してもよく、例えばグリシン、アラニン、グルタミン酸等の水溶液を用いることができる。また、糖の水溶液としては、食品に利用可能な糖であればどのようなものを使用してもよく、とくにペントースはメイラード反応が進行しやすいと言われることから好ましい。ペントースとしては、例えばリボース、キシロース、アラビノース、リブロース等を用いることができる。

メイラード反応物の添加は、ＡＤＨ１遺伝子機能欠損酵母の添加前、又は同時に行うことができる。メイラード反応物の添加量は、発酵食品の種類や希望するＨＥＭＦの濃度によって適宜調整することが可能であるが、例えば発酵食品が醸造酒である場合、醪１００ｇに対し、２Ｍのアミノ酸水溶液及び糖の水溶液から製造したメイラード反応物を、０．２〜１５ｍＬ添加することが好ましい。

以下、本発明を、実施例をあげて具体的に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。

（実施例１）サッカロマイセス・セレビシエＡＤＨ１遺伝子機能欠損株の作製及び評価
（実施例１−１）サッカロマイセス・セレビシエＡＤＨ１遺伝子破壊株の入手
サッカロマイセス・セレビシエの二倍体酵母ＢＹ４７４３、及びそのＡＤＨ１遺伝子破壊株は、フナコシ株式会社によって提供されているものを入手した。なおサッカロマイセス・セレビシエの二倍体酵母ＢＹ４７４３のＡＤＨ１遺伝子破壊株の作製方法は、Saccharomyces Genome Deletion Projectのウェブサイト（http://sequence-www.stanford.edu/group/yeast_deletion_project/deletions3.html）に記載された方法を使用した。

また、当該ＡＤＨ１遺伝子破壊株が、確かにＡＤＨ１の機能を欠損しているかの確認を行った。測定法は、公知の方法（U. Lutstorf et.al., Arch. Biochem. Biophys.,126,933-944 (1968)）に従い、アルコールデヒドロゲナーゼの作用によって生じるＮＡＤＨの濃度を吸光光度計を用いて測定することによって行った。

ＨＥＭＦ生成培地で培養した酵母細胞１ｍＬを集菌し、３２ｍＭ ピロリン酸ナトリウム（ｐＨ８．８）３００μＬと等量のガラスビーズを加え、４℃で１５分間破砕した。４℃、１００００ｒｐｍで１０分間遠心した後、上清を回収し、細胞破砕液を得た。ＡＤＨ活性は、アッセイバッファー（０．２ｍＭ エタノール、５ｍＭ ＮＡＤ、３２ｍＭピロリン酸ナトリウム（ｐＨ８．８））に一定量の細胞破砕液を添加し、３４０ｎｍの波長の吸光度を測定した。結果は、細胞破砕液中のタンパク質濃度を定量し、比活性として算出した。
その結果、図１に示すように、ＡＤＨ１破壊株では確かにＡＤＨ１遺伝子の機能が欠損していることが確認された。

（実施例１−２）サッカロマイセス・セレビシエＸ２１８０株を用いたＡＤＨ１遺伝子破壊株の作製
（１）Ｘ２１８０一倍体におけるＡＤＨ１遺伝子の破壊
ＡＤＨ１遺伝子のＨＥＭＦ生産への寄与を明らかにするため、上記ＢＹ４７４３株を親株とした破壊株とは別に、サッカロマイセス・セレビシエの二倍体酵母Ｘ２１８０株を親株とし、ＡＤＨ１遺伝子破壊株を、以下の方法で取得した。なお、Ｘ２１８０の一倍体であるＸ２１８０−１Ａ株及びＸ２１８０−１Ｂ株は、それぞれAmerican Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）からＡＴＣＣ２０４５０４、ＡＴＣＣ２６７８７として入手した。

Ｘ２１８０株の遺伝子破壊は、ｋａｎＭＸをマーカー遺伝子として用いて行った。Ｘ２１８０株は二倍体であるため、以下に記載するように、遺伝子の破壊は一倍体であるＸ２１８０−１Ａ及び−１Ｂの遺伝子をそれぞれｋａｎＭＸで破壊し、それらを交雑して２倍体にすることで取得した。なお、ｋａｎＭＸ遺伝子が導入された酵母は、抗生物質ジェネティシンに対する耐性を有する。

サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４３ ＡＤＨ１遺伝子破壊株から調製したゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーＡＤＨ１ ｄｅｌ ｃａｓｓｅｔｔｅ Ｆｗ（配列番号１）及びＡＤＨ１ ｄｅｌ ｃａｓｓｅｔｔｅ Ｒｖ（配列番号２）を用いてＰＣＲを行った。その後、マーカーであるｋａｎＭＸの両側に、ＡＤＨ１のＯＲＦに隣接する上流部分及び下流部分のＤＮＡを持つＤＮＡ断片を作製した。このＤＮＡ断片を用いてＸ２１８０−１Ａ株及びＸ２１８０−１Ｂ株を形質転換し、ジェネティシン含有培地で増殖する株を選抜した。それぞれの当該選抜株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマーＡＤＨ１−Ａ Ｆｗ（配列番号３）及びＫＡＮＢ（配列番号４）を用いてＰＣＲを行い、得られた産物のサイズを測定することによって、各一倍体のＡＤＨ１遺伝子が破壊されていることを確認した。

（２）二倍体の作製
酵母の二倍体は、常法により得ることができる。得られた各一倍体の遺伝子破壊株をＹＰＤ培地にて３０℃で一晩培養し、集菌して新たなＹＰＤ培地に再懸濁した。その後、この細胞懸濁液を等量ずつ混ぜ、３０℃にて一晩放置した。当該組換え株は抗生物質ジェネティシンへの耐性を示すものであることから、前記一晩放置した株をジェネティシン含有培地に播種し、ジェネティシン含有培地で増殖する株を選抜した。

酵母の二倍体を確認する方法として、性決定を担うＭＡＴ ｌｏｃｕｓをＰＣＲによって増幅し、そのＰＣＲ産物のサイズから判断する方法を使用することができる（Ｔ．Ｋａｔｏｕ ｅｔ ａｌ， Ｙｅａｓｔ， ２５， ７９９−８０７（２００８））。
上記選抜した二倍体破壊株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型に、ＭＡＴ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒ（配列番号５）、ＭＡＴａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒ（配列番号６）、及びＭＡＴα ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒ（配列番号７）の３つのプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られた産物のサイズを測定することによって、二倍体のＸ２１８０ ＡＤＨ１遺伝子破壊株であることを確認した。

（実施例１−３）ＡＤＨ１遺伝子破壊株のＨＥＭＦ生産性の確認
（１）ＨＥＭＦの生成
実施例１−１で入手したＢＹ４７４３ ＡＤＨ１遺伝子破壊株、又は実施例１−２で作製したＸ２１８０ ＡＤＨ１遺伝子破壊株、さらにそれぞれの親株を、５ｍＬの２×ＹＰＤ培地（酵母エキス２質量％、ペプトン４質量％、グルコース４質量％含有）中にて３０℃で６０時間培養した。その後、ＯＤ６００＝２／ｍＬとなるように１ｍＬのＨＥＭＦ生成培地（４１６ｍＭ グルコース，２００ｍＭ グリシン，２００ｍＭ リボース，７．３ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄，２０ｍＭ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ，０．５％ 酵母エキス，ｐＨ６．０）に添加し、３０℃で４８時間振とう培養することでＨＥＭＦを生成させた。

（２）ＨＥＭＦの抽出
ＨＥＭＦを生成させた培養液から培養上清６００μＬを回収し、等量の酢酸エチルと混合して３分間激しく攪拌した。攪拌後、１５０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。分離後、上清５００μＬを回収し、減圧遠心濃縮機にて溶媒を除去して乾固させた。５００μＬのメタノールで再溶解し、これを試料として高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にてＨＥＭＦ含有量を定量した。

（３）ＨＥＭＦの定量
ＨＰＬＣによるＨＥＭＦの分析は、下記表１の条件で行った。なお培養上清に含まれるＨＥＭＦの定量は、既知濃度のＨＥＭＦ（東京化成より購入可能）のピーク高さ（ｈｅｉｇｈｔ）を基にして作成した標準線から算出した。その結果を、図２に示す。

図２の結果に示すように、ＡＤＨ１遺伝子破壊株ではいずれも、野生型と比較してＨＥＭＦの生産性が著しく向上していた。

（実施例１−４）ＡＤＨ１遺伝子機能欠損株を添加した醸造酒の製造
仕込み試験には、掛米として精白歩合７０％のアルファー米を７２．８ｇ、麹として精米歩合７０％の乾燥麹１９．２ｇ、汲水１７４ｇ、及び９０％乳酸を１００μＬ添加した。この際、ＨＥＭＦの前駆体として、メイラード反応物を条件１では１．１６ｍＬ、条件２では１７．４ｍＬ汲水に加えた。なおメイラード反応物としては、２Ｍ グリシン及び２Ｍ リボース溶液をオートクレーブにて１２１℃、１５分加熱したものを利用した。実施例１−１で入手したＢＹ４７４３ ＡＤＨ１遺伝子破壊株、及びその親株（ＷＴ）は、ＹＰＤ培地（イーストエキス１質量％、ペプトン２質量％、ブドウ糖２質量％含有）において３０℃で適宜培養した後、酵母数が０．５×１０⁸ ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにあらかじめ汲み水に添加した。発酵温度は１５℃として、仕込み後２０日目で上槽し、醸造酒中に含まれるＨＥＭＦ量を上記の方法で定量した。その結果を図３に示す。

図３の結果より、条件１、２いずれの場合でもＡＤＨ１遺伝子機能欠損株を添加して製造した醸造酒では、野生株を添加して製造した醸造酒に比較してＨＥＭＦの含有量が著しく向上していた。また、ＨＥＭＦ量の増加の度合いは、ＨＥＭＦの前駆体であるメイラード反応物の添加量に応じていた。さらに、ＡＤＨ１遺伝子機能欠損株を添加して製造し、ＨＥＭＦの含有量が増加した醸造酒は、きわめて良好な香りを呈していた。

以上の結果から、サッカロマイセス・セレビシエにおいて、ＡＤＨ１遺伝子機能欠損酵母株を用いることによって、ＨＥＭＦを高生産し、また、ＨＥＭＦ高含有の品質のすぐれた発酵食品を簡便に製造できることが明らかになった。

（実施例２）チゴサッカロマイセス・ルキシーＡＤＨ１遺伝子機能欠損株の作製及び評価
（実施例２−１）チゴサッカロマイセス・ルキシー、ＡＤＨ１遺伝子破壊株の作製
親株として、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）から入手可能であるＡＴＣＣ２６２３株を用い、ＺｒＡＤＨ１遺伝子又はＺｒＡＤＨ２遺伝子のいずれかの機能を欠損した単独破壊株、及びＺｒＡＤＨ１遺伝子、ＺｒＡＤＨ２遺伝子の双方を破壊した二重破壊株を、下記の要領で取得した。

ＡＴＣＣ２６２３のＺｒＡＤＨ１遺伝子、又はＺｒＡＤＨ２遺伝子の単独破壊は、マーカー遺伝子としてｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ−ｌｏｘ−Ｐを用いて行った。ＺｒＡＤＨ１、及びＺｒＡＤＨ２遺伝子二重破壊に関しては、ＺｒＡＤＨ１遺伝子はマーカー遺伝子としてｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ−ｌｏｘＰを、ＺｒＡＤＨ２遺伝子はマーカー遺伝子としてｌｏｘＰ−ｚｅｏＭＸ−ｌｏｘＰを用いて行った。

（１）ＡＴＣＣ２６２３株のＺｒＡＤＨ１遺伝子単独破壊株の作製
ｐＵＧ６（U. Guldener et al, Nucleic Acids Res , 24, 2519-2524(1996)）を鋳型に、プライマーＡＤＨ１ｄｉｓＣｏｎｓｔ−Ｆ１（配列番号９）及びＡＤＨ１ｄｉｓＣｏｎｓｔ−Ｒ１（配列番号１０）を用いてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ反応産物を鋳型として、プライマーＡＤＨ１ｄｉｓＣｏｎｓｔ−Ｆ２（配列番号１１）及びＡＤＨ１ｄｉｓＣｏｎｓｔ−Ｒ２（配列番号１２）を用いてＰＣＲを行うことで、マーカーであるｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ−ｌｏｘＰの両側に、ＺｒＡＤＨ１のＯＲＦに隣接する上流部分及び下流部分のＤＮＡを持つＤＮＡを作製した。このＤＮＡを用いて、ＡＴＣＣ２６２３株を形質転換し、ジェネティシン含有培地で増殖する株を選抜した。当該選抜株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型に、プライマーＡＤＨ１ｄｉｓＣｏｎｆ−Ｆｗ（配列番号１３）及びＡＤＨ１ｄｉｓＣｏｎｆ−Ｒｖ（配列番号１４）を用いてＰＣＲを行い、得られた産物のサイズを測定することによって、ＺｒＡＤＨ１遺伝子が破壊されていることを確認した。これによって、ＡＴＣＣ２６２３のＺｒＡＤＨ１遺伝子単独破壊株を取得した。

（２）ＡＴＣＣ２６２３株のＺｒＡＤＨ２遺伝子単独破壊株の作製
ｐＵＧ６を鋳型に、プライマーＡＤＨ２ｄｉｓＣｏｎｓｔ−Ｆ１（配列番号１５）及びＡＤＨ２ｄｉｓＣｏｎｓｔ−Ｒ１（配列番号１６）を用いてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ反応産物を鋳型として、プライマーＡＤＨ２ｄｉｓＣｏｎｓｔ−Ｆ２（配列表の配列番号１７）及びＡＤＨ２ｄｉｓＣｏｎｓｔ−Ｒ２（配列番号１８）を用いてＰＣＲを行うことで、マーカーであるｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ−ｌｏｘＰの両側にＺｒＡＤＨ２のＯＲＦに隣接する上流部分及び下流部分のＤＮＡを持つＤＮＡを作製した。このＤＮＡを用いてＡＴＣＣ２６２３株を形質転換し、ジェネティシン含有培地で増殖する株を選抜した。当該選抜株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型に、プライマーＡＤＨ２ｄｉｓＣｏｎｆ−Ｆｗ（配列表の配列番号１９）及びｚｅｏＭＸ−ｉｎｔｒａ−Ｒｖ（配列番号２０）を用いてＰＣＲを行い、得られた産物のサイズを測定することによってＺｒＡＤＨ２遺伝子が破壊されていることを確認した。これによって、ＡＴＣＣ２６２３のＺｒＡＤＨ２遺伝子単独破壊株を取得した。

（３）ＡＴＣＣ２６２３株のＺｒＡＤＨ１、ＺｒＡＤＨ２遺伝子二重破壊株の作製
ｐＵＺ６を鋳型に、プライマーＡＤＨ２ｄｉｓＣｏｎｓｔ−Ｆ１（配列番号１５）及びＡＤＨ２ｄｉｓＣｏｎｓｔ−Ｒ１（配列番号１６）を用いてＰＣＲを行った。なお、ｐＵＺ６は、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（インビトロジェン社）を鋳型としてＰＣＲにてＺｅｏｃｉｎ耐性遺伝子（ｚｅｏＭＸ）を増幅した後、増幅した断片をｐＵＧ６のｋａｎＭＸと置換することで作製した。得られたＰＣＲ反応産物を鋳型として、プライマーＡＤＨ２ｄｉｓＣｏｎｓｔ−Ｆ２（配列番号１７）及びＡＤＨ２ｄｉｓＣｏｎｓｔ−Ｒ２（配列番号１８）を用いてＰＣＲを行うことで、マーカーであるｌｏｘＰ−ｚｅｏＭＸ−ｌｏｘＰの両側にＡＤＨ２のＯＲＦに隣接する上流部分及び下流部分のＤＮＡを持つＤＮＡを作製した。このＤＮＡを用いて、上記（２）において作製したＡＴＣＣ２６２３株ＺｒＡＤＨ１遺伝子破壊株を形質転換し、ジェネティシン、ゼオシン含有培地で増殖する株を選抜した。当該選抜株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型に、プライマーＡＤＨ２ｄｉｓＣｏｎｆ−Ｆｗ（配列番号１９）及びｚｅｏＭＸ−ｉｎｔｒａ−Ｒｖ（配列番号２０）を用いてＰＣＲを行い、得られた産物のサイズを測定することによって、ＺｒＡＤＨ１遺伝子及びＺｒＡＤＨ２遺伝子が同時に破壊されている株（以下、ＺｒＡＤＨ遺伝子二重破壊株と呼ぶ）を取得した。

（４）ＡＤＨ１遺伝子機能欠損の確認
さらに、当該ＡＤＨ１遺伝子破壊株が、確かにＡＤＨ１の機能を欠損しているかの確認を行った。測定法は、公知の方法（U. Lutstorf et.al., Arch. Biochem. Biophys.,126,933-944 (1968)）に従い、アルコールデヒドロゲナーゼの作用によって生じるＮＡＤＨの濃度を吸光光度計を用いて測定することによって行った。方法は、実施例１−１に記載の方法と同様とした。
その結果、図４に示すように、ＺｒＡＤＨ１破壊株、及びＺｒＡＤＨ１遺伝子、及びＺｒＡＤＨ２遺伝子双方が破壊されたＡＤＨ遺伝子二重破壊株では確かにＡＤＨ１遺伝子の機能が欠損していることが確認された。

（実施例２−２）ＺｒＡＤＨ遺伝子破壊株のＨＥＭＦ生産性
実施例２−１にて作製したＡＴＣＣ２６２３株のＺｒＡＤＨ１遺伝子単独破壊株、ＺｒＡＤＨ２単独破壊株、ＺｒＡＤＨ遺伝子二重破壊株をそれぞれ、５ｍＬの２×ＹＰＤ培地（２％ 酵母エキス，４％ グルコース，４％ ペプトン）中にて２８℃で６０時間程度培養した。その後、ＯＤ６００＝２となるように２ｍＬのＨＥＭＦ生成培地（４１６ｍＭ グルコース，２００ｍＭ グリシン，２００ｍＭ リボース，７．３ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄，２０ｍＭ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ，０．５％ 酵母エキス，ｐＨ６．０）に添加し、２８℃で４８時間振とう培養することで、ＨＥＭＦを生成させた。

ＨＥＭＦを生成させた培養液から培養上清６００μＬを回収し、等量の酢酸エチルと混合して３分間激しく攪拌した。攪拌後、１５０００×ｒｐｍで３分間遠心分離して上清５００μＬを回収し、減圧遠心濃縮機にて溶媒を除去して乾固させた。５００μＬのメタノールで再溶解し、これを試料として高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にてＨＥＭＦ含有量を定量した。ＨＥＭＦの定量は、実施例１−３（３）に示したものと同じ方法で行った。

その結果、図５に示すように、ＺｒＡＤＨ１遺伝子の機能を破壊した単独破壊株を用いたとき、野生株と比較してＨＥＭＦの生産能は著しく増大することが明らかになった。また、ＺｒＡＤＨ１遺伝子、及びＺｒＡＤＨ２遺伝子双方が破壊されたＡＤＨ遺伝子二重破壊株を用いたときには、ＺｒＡＤＨ１だけを破壊した株と比較して、ＨＥＭＦの生産能がさらに向上することが判明した。

（実施例２−３）ＺｒＡＤＨ遺伝子二重破壊株を添加した麹高温消化液の調製
撒水して蒸煮した大豆と炒熬割砕した小麦の混合物に麹菌を接種混合し、醤油麹を調製した。当該醤油麹に、５０℃に加温しておいた蒸留水を３倍量加え、５０℃の恒温槽で一晩放置した後、濾紙ろ過を行って濾液を回収した。回収した濾液に濃度５％となるように塩化ナトリウムを加え、加熱滅菌したものを麹高温消化液として試験に使用した。

実施例２−１で作製したＡＴＣＣ２６２３のＺｒＡＤＨ遺伝子二重破壊株を、それぞれ５ｍＬの２×ＹＰＤ培地（２％ 酵母エキス，４％ グルコース，４％ ペプトン）中にて２８℃で６０時間程度培養した後、ＯＤ６００＝２となるように２ｍＬの麹高温消化液に添加し、２８℃で４８時間振とう培養することでＨＥＭＦを生成させた。

ＨＥＭＦを生成させた培養液から培養上清６００μＬを回収し、等量の酢酸エチルと混合して３分間激しく攪拌した。攪拌後、１５０００×ｒｐｍで３分間遠心分離して上清５００μＬを回収し、減圧遠心濃縮機にて溶媒を除去して乾固させた。５００μＬのメタノールで再溶解し、これを試料として高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にてＨＥＭＦ含有量を定量した。その結果を図６に示す。なお、ＨＰＬＣによるＨＥＭＦの分析は実施例１−３（３）と同様の条件で行った。なお、対照として親株（ＷＴ）を用いた。

図６に示すように、ＺｒＡＤＨ１遺伝子及びＺｒＡＤＨ２遺伝子双方の機能が破壊されたＡＤＨ遺伝子二重破壊株を添加することによって、麹高温消化液のＨＥＭＦの生産量は増大した。また、それぞれの消化液の香気を比較してみたところ、ＡＤＨ遺伝子二重破壊株を添加した麹高温消化液は、野生株を添加した麹高温消化液と比較して穏やかで、好ましい香気を有するものであった。

（まとめ）
以上のことから、サッカロマイセス・セレビシエやチゴサッカロマイセス・ルキシーのような、発酵食品の製造に常用される酵母において、ＡＤＨ１遺伝子を欠損させることにより、ＨＥＭＦの生産能が著しく向上することが明らかになった。

Claims (7)

1. アルコールデヒドロゲナーゼ１遺伝子の機能を欠損した、サッカロマイセス・セレビシエ及びチゴサッカロマイセス・ルキシーからなる群より選ばれる酵母を、ペントース、アミノ酸及びグルコースを含有する培地中で培養することを特徴とする４−ハイドロキシ−２（又は５）−エチル−５（又は２）−メチル−３（２Ｈ）−フラノンの製造法。
2. 酵母がサッカロマイセス・セレビシエであり、アルコールデヒドロゲナーゼ１遺伝子が、配列番号８で示される塩基配列を含む遺伝子である請求項１に記載の４−ハイドロキシ−２（又は５）−エチル−５（又は２）−メチル−３（２Ｈ）−フラノンの製造法。
3. 酵母がチゴサッカロマイセス・ルキシーであり、アルコールデヒドロゲナーゼ１遺伝子が配列番号２１で示される塩基配列を含む遺伝子である請求項１に記載の４−ハイドロキシ−２（又は５）−エチル−５（又は２）−メチル−３（２Ｈ）−フラノンの製造法。
4. 酵母が、さらに配列番号２２で示される塩基配列を含む遺伝子の機能を欠損した請求項３に記載の４−ハイドロキシ−２（又は５）−エチル−５（又は２）−メチル−３（２Ｈ）−フラノンの製造法。
5. 発酵食品製造工程の発酵開始時〜発酵中期に、アルコールデヒドロゲナーゼ１遺伝子の機能を欠損した、サッカロマイセス・セレビシエ及びチゴサッカロマイセス・ルキシーからなる群より選ばれる酵母を添加することを特徴とする４−ハイドロキシ−２（又は５）−エチル−５（又は２）−メチル−３（２Ｈ）−フラノン高含有発酵食品の製造法。
6. さらにメイラード反応物を添加する請求項５に記載の製造法。
7. 発酵食品が、醤油、味噌、醸造酒及び酢からなる群より選ばれる請求項５又は６に記載の製造法。