JP2008029329A - 酵母及びl−乳酸の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】カエル由来のL−ldh遺伝子が導入された酵母を培養することにより、従来より高い対糖収率でL−乳酸の製造ができる。
【選択図】なし
Description
本発明では、カエル由来のL−ldh遺伝子として、配列番号1に示す核酸配列を有するゼノプス・レービス(Xenopus laevis)由来のL−ldh遺伝子を使用した。カエル由来のL−ldh遺伝子のクローニングはPCR法により行った。PCRには、ゼノプス・レービスの腎臓由来cDNAライブラリー(STRATAGENE社製)より付属のプロトコールに従い調製したファージミドDNAを鋳型とした。
比較例として、ウシ由来のL−ldh遺伝子が導入された酵母を作成した。
実施例1のようにして得られたpTRS102を酵母サッカロミセス・セレビセNBRC10505株のpdc1遺伝子を破壊した株(以下、29−1B株と示す。)に形質転換した。形質転換は、YEASTMAKER YEAST Transformation System(CLONTECH社製)を用いた酢酸リチウム法により行い、詳細は付属のプロトコールに従った。宿主とする29−1B株はウラシル合成能を欠損した株であり、pTRS102の持つURA3遺伝子の働きにより、ウラシル非添加培地上でpTRS102の導入された形質転換株の選択が可能である。このようにして得られた形質転換株へのカエル由来のL−ldh遺伝子発現ベクター導入の確認は、形質転換株から、ゲノムDNA抽出キットGenとるくん(タカラバイオ社製)によりプラスミドDNAを含むゲノムDNAを抽出し、これを鋳型としてPremix Taq(タカラバイオ社製)を用いたPCRにより行った。確認用プライマーには、カエル由来のL−ldh遺伝子をクローニングした際に用いたプライマー(配列番号3,4)を使用した。その結果、pTRS102を形質転換した株において、カエル由来L−ldh遺伝子が導入されていることを確認した。以下、上記pTRS102が導入された形質転換株を29−1B/pTRS102株とする。
比較例1のようにして得られたpTRS49を、実施例2と同様な方法で29−1Bに形質転換した。また、ウシ由来のL−ldh遺伝子導入の確認も実施例2と同様な方法で行い、プライマーとして配列番号5,6に示すオリゴヌクレオチドを用いた。以下、上記pTRS49が導入された形質転換株を29−1B/pTRS49株とする。
実施例1で得られたpTRS102を増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド(配列番号7,8)をプライマーセットとしたPCRにより、カエル由来のL−ldh遺伝子及びTDH3ターミネーター配列を含む1.3kbのPCR断片を増幅した(図1のステップ1に相当)。ここで配列番号7は、PDC1遺伝子の開始コドンから上流65bpに相当する配列が付加されるようデザインした。
比較例1で得られたpTRS49を増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド(配列番号8,9)をプライマーセットとしたPCRにより、ウシ由来のL−ldh遺伝子及びTDH3ターミネーターを含む1.3kbのPCR断片を増幅した。ここで配列番号9は、配列番号7と同様にPDC1遺伝子の開始コドンから上流65bpに相当する配列が付加されるようデザインした。
実施例2、比較例2のようにして得られた29−1B/pTRS102株及び29−1B/pTRS49株を用いてL−乳酸生産性テストを行った。
移動相:5mM p−トルエンスルホン酸(流速0.8mL/min)
反応液:5mM p−トルエンスルホン酸、20mM ビストリス、0.1mM EDTA・2Na(流速0.8mL/min)
検出方法:電気伝導度
温度:45℃。
実施例3、比較例3のようにして得られたB2株及びL5株を用いて、実施例4と同様な方法でL−乳酸生産性テストを行った。培地として、表1に示したものに152mg/Lのウラシルを追加した培地(以下、SC3培地と略す。)を用いた。
染色体中に挿入するカエル由来のL−ldh遺伝子をTDH3プロモーターの下流に導入することで乳酸生産性の向上が可能であるか検討を行った。
実施例6のようにして得られたB3株を用いて、実施例4,5と同様な方法でL−乳酸生産性テストを行った。培地として、実施例5と同様SC3培地を用いた。
実施例2、比較例2で得られた29−1B/pTRS102株及び29−1B/pTRS49株を用いて、pH5〜7におけるカエル由来のL−乳酸脱水素酵素活性及びウシ由来のL−乳酸脱水素酵素活性を比較した。
SC−Ura培地10mLを試験管に入れ、そこに少量の29−1B/pTRS102株及び29−1B/pTRS49株を植菌し、30℃で一晩培養した(前培養)。次に、SC−Ura培地20mLを100mL容坂口フラスコに入れ、そこに前培養液を2%植菌し、24時間振とう培養した(本培養)。本培養液10mLを遠心により集菌、10mLのリン酸バッファーで洗浄後、1mLのリン酸バッファーに懸濁した。上記菌体懸濁液をエッペンドルフチューブに移し、さらに等量のガラスビーズ(SIGMA社製、直径0.6mm)を加え、Micro Tube Mixer(TOMY社製)を用い4℃で菌体を破砕した。上記のようにして菌体を破砕した後、遠心して得られる上清をL−乳酸脱水素酵素液(以下、L−LDH酵素液と略す。)とした。
(a)で得られたL−LDH酵素液の濃度を、ウシIgG(1.38mg/mL、BIO−RAD社製)をスタンダードとして作製した検量線をもとにBCA Protein Assay Kit(PIERCE社製)により測定し、各L−LDH酵素液が0.5mg/mLになるように滅菌水で希釈した。次に、表5に示した割合の6水準の混合液(L−LDH酵素液及びNADHを除く)をセミミクロキュベットに分注し、測定を始める直前にL−LDH酵素液及びNADHを加え混合した。ここで、2xBRバッファーとは、0.08M酢酸、リン酸、ホウ酸溶液を5NNaOHでpH5,6,7にそれぞれ調節した緩衝バッファーである。
Claims (8)
- カエル由来のL−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入された酵母。
- 前記L−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が、ゼノプス・レービス(Xenopus laevis)由来のL−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子であることを特徴とする、請求項1に記載の酵母。
- 前記L−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が、配列番号1に示す核酸配列を有する遺伝子であることを特徴とする、請求項1または2に記載の酵母。
- 前記酵母がサッカロミセス(Saccharomyces)属に属することを特徴とする、請求項1〜3のいずれかの項に記載の酵母。
- 前記酵母がサッカロミセス・セレビセ(Saccharomyces cerevisiae)であることを特徴とする、請求項1〜4のいずれかの項に記載の酵母。
- 前記L−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が、該遺伝子の発現を可能とするプロモーターの下流に導入されたことを特徴とする、請求項1〜5のいずれかの項に記載の酵母。
- 前記L−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が、染色体上のピルビン酸脱炭酸酵素1遺伝子(PDC1遺伝子)のプロモーターの下流に発現可能な状態で導入されたことを特徴とする、請求項1〜6いずれかの項に記載の酵母。
- 請求項1〜7のいずれかの項に記載の酵母を培養することを含む、L−乳酸の製造方法。
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