JPWO2012147903A1 - 乳酸生産酵母変異株および乳酸の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
(1)乳酸脱水素酵素遺伝子を導入して乳酸生産能を付与した酵母の変異株であって、該変異株の培地pH3での乳酸生産能が該変異株の親株の乳酸発酵至適pHにおける乳酸生産能と同等以上であることを特徴とする、乳酸生産酵母変異株。
(2)前記乳酸脱水素酵素遺伝子がD−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子またはL−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子であることを特徴とする、(1)に記載の乳酸生産酵母変異株。
(3)前記乳酸脱水素酵素遺伝子がアメリカカブトガニ由来のD−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子であることを特徴とする、(1)または(2)に記載の乳酸生産酵母変異株。
(4)前記乳酸脱水素酵素遺伝子がアフリカツメガエル由来のL−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子であることを特徴とする、(1)または(2)に記載の乳酸生産酵母変異株。
(5)前記酵母がサッカロマイセス(Saccharomyces)属に属することを特徴とする、(1)から(4)のいずれかに記載の乳酸生産酵母変異株。
(6)前記酵母がサッカロマイセス・セレビセ(Saccharomyces cerevisiae)であることを特徴とする、(1)から(5)のいずれかに記載の乳酸生産酵母変異株。
(7)受託番号がNITE BP−1087、NITE BP−1088、NITE BP−1089、NITE BP−1189またはNITE BP−1190として寄託されている酵母であることを特徴とする、請求項1から6のいずれかに記載の乳酸生産酵母変異株。
(8)(1)から(7)のいずれかに記載の乳酸生産酵母変異株を培養することを特徴とする、乳酸の製造方法。
(9)前記乳酸生産酵母変異株の培養液をpH3以下に維持することを特徴とする、(8)に記載の乳酸の製造方法。
(10)前記乳酸生産酵母変異株の培養液をアルカリ中和せずに培養することを特徴とする、(8)に記載の乳酸の製造方法。
本発明の乳酸生産酵母変異株を得るための親株として、WO2010/140602号に記載されるアメリカカブトガニ由来のD−乳酸脱水素酵素遺伝子を酵母(サッカロマイセス・セレビセ)に導入したSU042株を使用した。
本発明の乳酸生産酵母変異株を得るための親株として、WO2009/099044号に記載されるアフリカツメガエル由来のL−乳酸脱水素酵素遺伝子を酵母(サッカロマイセス・セレビセ)に導入したHI003株を使用した。
乳酸の濃度は、以下の条件でHPLC法により測定した。
カラム:Shim−Pack SPR−H(株式会社島津製作所製)
移動相:5mM p−トルエンスルホン酸(流速0.8mL/分)
反応液:5mM p−トルエンスルホン酸、20mM ビストリス、0.1mM EDTA・2Na(流速0.8mL/分)
検出方法:電気伝導度
温度:45℃。
カラム:TSK−gel Enantio L1(東ソー株式会社製)
移動相:1mM 硫酸銅水溶液
流速:1.0ml/分
検出方法:UV254nm
温度:30℃
D−乳酸光学純度(%e.e.)=100×(D−L)/(L+D)
L−乳酸光学純度(%e.e.)=100×(L−D)/(L+D)
ここで、LはL−乳酸の濃度であり、DはD−乳酸の濃度を表す。
参考例1に記載のSU042株を、表1の発酵培地に2%(w/v)D−乳酸(>99.9e.e.)を加えた培地5ml(pH3、水酸化カルシウムでpH調整。)、サッカロマイセス・セレビセの乳酸発酵至適pH(特開2009−171879号公報の実施例に記載の乳酸発酵酵母の乳酸生産性からpH4.5が乳酸発酵至適pHであると判断した。)になるよう調整した表1の発酵培地5ml(pH4.5)でそれぞれ30℃、72時間振とう培養した。乳酸生産酵母変異株の親株となるSU042株について、培地pH3での乳酸生産能と乳酸発酵至適pH条件下(pH4.5)での乳酸生産能を酵母の乳酸生産量で比較した結果、図1に見られるとおり培地pH3での乳酸生産能は、乳酸発酵至適pH条件下での乳酸生産性より約55%まで低下することが確認できた。なお、本乳酸生産能評価結果は3回以上再現性を得た結果である。
参考例1に記載のSU042株にEMS(シグマ−アルドリッチ社製)による変異処理を行った。SU042株をサッカロマイセス・セレビセの乳酸発酵至適pH(pH4.5)に調整されたSD培地2mlで24時間培養し、さらに該培養液の0.5%を同様のSD培地に植菌して24時間培養しつつ、EMSを添加して乳酸生産酵母に突然変異を誘発させ、その後、突然変異誘発のための培養液の5%を2%(w/v)D−乳酸(>99.9e.e.)含有SD培地2ml(pH2.8、水酸化カルシウムでpH調整。)に植菌して24時間培養した。
乳酸生産酵母変異株KS45株(実施例2)、KS52株(実施例3)、KS78株(実施例4)と、親株であるSU042株(比較例2)について、それぞれ表2に示す乳酸発酵培地を用いてバッチ発酵によりD−乳酸を製造した。なお、培地組成である粗糖には“沖縄の優糖精”(ムソー株式会社)を用い、該培地は高圧蒸気滅菌(121℃、15分)して用いた。
反応槽容量(乳酸発酵培地量):2L(1L)、温度調整:30℃、反応槽通気量:0.2L/min、反応槽攪拌速度:400rpm、pH調整:5N 水酸化カルシウム懸濁液により適宜調整。
乳酸生産酵母変異株KS78株(実施例5)と、その親株であるSU042株(比較例3)をそれぞれ表2の乳酸発酵培地5ml(pH5)に植菌し、30℃、72時間の条件で振とう培養した場合の乳酸生産能を図3に示す。アルカリ中和せずに培養をしたことによって、それぞれの培養液のpHはpH2.5まで低下したにも関わらず、変異株は親株の約9倍の乳酸生産能を示し、本発明の変異株を利用すれば培養工程でアルカリ中和せずに乳酸を高生産できることが確認できた。
参考例2に記載のHI003株を、表1の発酵培地に2%(w/v)L−乳酸(>99.9e.e.)を加えた培地5ml(pH3、水酸化カルシウムでpH調整。)、サッカロマイセス・セレビセの乳酸発酵至適pHになるよう調整した表1の発酵培地5ml(pH4.5)でそれぞれ30℃、72時間振とう培養した。乳酸生産酵母変異株の親株となるHI003株について、培地pH3での乳酸生産能と乳酸発酵至適pH条件下(pH4.5)での乳酸生産能を酵母の乳酸生産量で比較した結果、図4に見られるとおり培地pH3での乳酸生産能は、乳酸発酵至適pH条件下での乳酸生産性より約70%まで低下することが確認できた。なお、本乳酸生産能評価結果は3回以上再現性を得た結果である。
参考例2に記載のHI003株にEMS(シグマ−アルドリッチ社製)による変異処理を行った。HI003株をサッカロマイセス・セレビセの乳酸発酵至適pH(pH4.5)に調整されたSD培地2mlで24時間培養し、さらに該培養液の0.5%を同様のSD培地に植菌して24時間培養しつつ、EMSを添加して乳酸生産酵母に突然変異を誘発させ、その後、突然変異誘発のための培養液の5%を2%(w/v)L−乳酸(>99.9e.e.)含有SD培地2ml(pH2.8、水酸化カルシウムでpH調整。)に植菌して24時間培養した。
乳酸生産酵母変異株KS24株(実施例7)、KS30株(実施例8)と、親株であるHI003株(比較例5)について、それぞれ表2に示す乳酸発酵培地を用いてバッチ発酵によりL−乳酸を製造した。培地及び培養条件などは前記実施例2〜4と比較例2と同様である。その結果、変異株2株はいずれもpH3以下の低pH状態であっても親株の乳酸発酵至適pH(pH4.5)と同等以上の乳酸生産能を示し、99.9e.e.以上の高い光学純度のL−乳酸を生産した。一方、親株はpH3以下の低pH状態では乳酸発酵至適pHと比較して乳酸生産能が大きく減少した。
乳酸生産酵母変異株KS24株(実施例7)と、その親株であるHI003株(比較例5)をそれぞれ表2の乳酸発酵培地5ml(pH5)に植菌し、30℃、72時間の条件で振とう培養した場合の乳酸生産能を図6に示す。アルカリ中和せずに培養をしたことによって、それぞれの培養液のpHはpH2.5まで低下したにも関わらず、変異株は親株の約3倍の乳酸生産能を示し、本発明の変異株を利用すれば培養工程でアルカリ中和せずに乳酸を高生産できることが確認できた。
NITE BP−1088(寄託機関の名称:独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(NPMD)、寄託機関のあて名:〒292−0818 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8、寄託日:2011年4月25日)
NITE BP−1089(寄託機関の名称:独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(NPMD)、寄託機関のあて名:〒292−0818 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8、寄託日:2011年4月25日)
NITE BP−1189(寄託機関の名称:独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(NPMD)、寄託機関のあて名:〒292−0818 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8、寄託日:2011年12月22日)
NITE BP−1190(寄託機関の名称:独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(NPMD)、寄託機関のあて名:〒292−0818 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8、寄託日:2011年12月22日)
Claims (10)
- 乳酸脱水素酵素遺伝子を導入して乳酸生産能を付与した酵母の変異株であって、該変異株の培地pH3での乳酸生産能が該変異株の親株の乳酸発酵至適pHにおける乳酸生産能と同等以上であることを特徴とする、乳酸生産酵母変異株。
- 前記乳酸脱水素酵素遺伝子がD−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子またはL−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子であることを特徴とする、請求項1に記載の乳酸生産酵母変異株。
- 前記乳酸脱水素酵素遺伝子がアメリカカブトガニ由来のD−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子であることを特徴とする、請求項1または2に記載の乳酸生産酵母変異株。
- 前記乳酸脱水素酵素遺伝子がアフリカツメガエル由来のL−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子であることを特徴とする、請求項1または2に記載の乳酸生産酵母変異株。
- 前記酵母がサッカロマイセス(Saccharomyces)属に属することを特徴とする、請求項1から4のいずれかに記載の乳酸生産酵母変異株。
- 前記酵母がサッカロマイセス・セレビセ(Saccharomyces cerevisiae)であることを特徴とする、請求項1から5のいずれかに記載の乳酸生産酵母変異株。
- 受託番号がNITE BP−1087、NITE BP−1088、NITE BP−1089、NITE BP−1189またはNITE BP−1190として寄託されている酵母であることを特徴とする、請求項1から6のいずれかに記載の乳酸生産酵母変異株。
- 請求項1から7のいずれかに記載の乳酸生産酵母変異株を培養することを特徴とする、乳酸の製造方法。
- 前記乳酸生産酵母変異株の培養液をpH3以下に維持することを特徴とする、請求項8に記載の乳酸の製造方法。
- 前記乳酸生産酵母変異株の培養液をアルカリ中和せずに培養することを特徴とする、請求項8に記載の乳酸の製造方法。
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