WO2007097260A1 - 化学品の製造方法、および、連続発酵装置 - Google Patents

化学品の製造方法、および、連続発酵装置 Download PDF

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WO2007097260A1
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Hideki Sawai
Katsushige Yamada
Takashi Mimitsuka
Kenji Sawai
Tetsu Yonehara
Yohito Ito
Masahiro Henmi
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Toray Industries, Inc.
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Definitions

  • the present invention relates to a chemical production method and a continuous fermentation apparatus.
  • Fermentation which is a material production method involving the cultivation of microorganisms and cultured cells, is largely divided into (1) batch fermentation (batch fermentation) and fed-batch fermentation (Fed-batch fermentation), and (2) continuous It can be classified as a fermentation method.
  • the batch and fed-batch fermentation methods have the advantage that they are simple in terms of equipment, cultivate in a short time, and are less damaged by contamination with various bacteria.
  • the product concentration in the culture solution increases with time, and the productivity and yield decrease due to the influence of osmotic pressure or product inhibition. For this reason, it is difficult to stably maintain a high yield and high productivity over a long period of time.
  • the continuous fermentation method is characterized in that high yield and high productivity can be maintained over a long period of time by avoiding accumulation of the target substance at a high concentration in the fermenter.
  • a continuous culture method has been disclosed for the fermentation of L-daltamic acid L-lysine (Non-patent Document 1).
  • the raw material is continuously supplied to the culture solution and the microorganisms and cells in the culture solution are diluted to extract the culture solution containing microorganisms and cells. Efficiency gains were limited.
  • microorganisms and cultured cells are filtered through a separation membrane, the product is collected from the filtrate, and at the same time, the filtered microorganisms and cultured cells are retained or refluxed in the culture solution.
  • a method for maintaining a high concentration of microorganisms and cells in the culture solution has been proposed.
  • Patent Document 1 For example, techniques for continuous fermentation in a continuous fermentation apparatus using a ceramic membrane have been disclosed (Patent Document 1, Patent Document 2, and Patent Document 3).
  • Patent Document 2 For example, techniques for continuous fermentation in a continuous fermentation apparatus using a ceramic membrane have been disclosed (Patent Document 1, Patent Document 2, and Patent Document 3).
  • the disclosed technology has a problem in reduction of filtration flow rate and filtration efficiency due to clogging of the ceramic membrane, and back cleaning or the like is performed to prevent clogging.
  • Patent Document 4 A method for producing succinic acid using a separation membrane is disclosed (Patent Document 4). With this technology In membrane separation, high filtration pressure (about 200kPa) is adopted. The high filtration pressure is a disadvantage in terms of cost, and the microorganisms and cells are physically damaged by the pressure in the filtration process that requires force. Therefore, the microorganisms and cells are continuously returned to the culture medium. Not suitable for fermentation.
  • microorganisms are discharged out of the tank together with the culture solution, and it is difficult to maintain a high microorganism concentration in the fermenter.
  • fermentation production efficiency per fermentation volume can be improved if the microorganisms undergoing fermentation can be kept at a high concentration.
  • the discharged culture solution is subjected to solid-liquid separation by gravity, for example, centrifugation, and the microorganisms as precipitates are returned to the fermentor.
  • a method of separating the microorganisms and discharging only the supernatant of the culture solution to the outside of the tank can be mentioned.
  • the centrifugal method is not practical because of its high power cost. Since the filtration method requires a high pressure to filter as described above, most studies have been conducted at the laboratory level.
  • the conventional continuous fermentation method has various problems, and is difficult and powerful for industrial application.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 5-95778
  • Patent Document 2 Japanese Patent Application Laid-Open No. 62-138184
  • Patent Document 3 JP-A-10-174594
  • Patent Document 4 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2005-333886
  • Non-Patent Document 1 Toshihiko Hirao et. Al. (Hirano 'Toshihiko et al.), Appl. Microbiol. Biotechn ol. (Applied Microvials and Microbiology), 32, 269-273 (1 989)
  • the present invention is directed to filtering a culture solution of microorganisms or cultured cells through a separation membrane, recovering the product from the filtrate, holding or refluxing the unfiltered solution in the culture solution,
  • a porous membrane with an average pore size of 0.01 ⁇ m or more and less than 1 ⁇ m is used as the separation membrane, and the chemicals are filtered using a transmembrane differential pressure in the range of 0.1 to 20 kPa. It is a manufacturing method.
  • the present invention is, preferably, pure water permeability coefficient of the porous membrane, 2 X 10- 9 m 3 Zm 2 ZsZpa than on 6 X 10- 7 m 3 Zm 2 ZsZpa method for producing less of chemicals It is.
  • the average pore diameter of the porous membrane is 0.01 ⁇ m or more and less than 0.2 m, and the standard deviation of the pore diameter of the porous membrane is 0.1 m or less.
  • the present invention is preferably a method for producing a chemical product, which is a porous membrane having a membrane surface roughness of 0.1 m or less.
  • the present invention is preferably a method for producing a chemical product, wherein the porous membrane is a porous membrane including a porous resin layer.
  • the fermentation broth of microorganisms or cultured cells is filtered through a separation membrane, the filtrate power product is collected, and the unfiltrated liquid is held or refluxed in the fermentation broth.
  • An apparatus for producing a chemical product by continuous fermentation in which fermentation raw materials are added to the fermentation broth, a fermentation reaction tank for fermenting and culturing microorganisms or cultured cells, and a fermentation broth circulating in the fermentation reaction tank
  • another continuous fermentation apparatus of the present invention is a method in which a fermentation broth of microorganisms or cultured cells is filtered through a separation membrane to collect a filtrate and a product, and an unfiltered liquid is used as the fermentation broth.
  • a device for producing a chemical product by continuous fermentation in which a fermentation raw material is added or retained to the fermentation broth, and a fermentation reaction for fermenting microorganisms or cultured cells.
  • a tank a separation membrane element for filtering the fermentation broth provided in the fermentation reaction tank and provided with a separation membrane, and means for discharging the filtered fermentation product connected to the separation membrane element And a means for controlling the transmembrane pressure difference of the separation membrane within a range of 0.1 to 20 kPa, and the separation membrane is a porous membrane having pores having an average pore diameter of 0.01 ⁇ m or more and less than 1 ⁇ m. It is a continuous fermentation device.
  • FIG. 1 is a schematic side view for explaining an example of a membrane separation type continuous fermentation apparatus used in the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic side view for explaining an example of another membrane separation type continuous fermentation apparatus used in the present invention.
  • FIG. 3 is a schematic perspective view for explaining an example of a separation membrane element used in the present invention.
  • FIG. 4 is a cross-sectional explanatory view for explaining an example of another separation membrane element used in the present invention.
  • FIG. 5 is a diagram showing a physical map of an expression vector for yeast, pTRSll. Explanation of symbols
  • the present invention is directed to filtering a culture solution of microorganisms or cultured cells through a separation membrane, recovering the product from the filtrate, holding or refluxing the unfiltered solution in the culture solution, and a fermentation raw material
  • a porous membrane with an average pore size of 0.01 ⁇ m or more and less than 1 ⁇ m is used as the separation membrane, and the chemicals are filtered using a transmembrane differential pressure in the range of 0.1 to 20 kPa. It is a manufacturing method.
  • the structure of the porous membrane used as the separation membrane in the present invention will be described.
  • the porous membrane in the present invention preferably has separation performance and water permeability according to the quality of water to be treated and the application.
  • the porous membrane is preferably a porous membrane including a porous resin layer from the viewpoints of blocking performance, water permeation performance and separation performance, for example, stain resistance.
  • the porous membrane including the porous resin layer preferably has a porous resin layer that acts as a separation functional layer on the surface of the porous substrate.
  • the porous substrate supports the porous resin layer and gives strength to the separation membrane.
  • the porous resin layer penetrates the porous substrate. Even if the porous resin layer does not penetrate into the porous substrate, either is selected depending on the use.
  • the average thickness of the porous substrate is preferably 50 ⁇ m or more and 3000 ⁇ m or less.
  • the material of the porous substrate is composed of an organic material and Z or an inorganic material, and an organic fiber is preferably used.
  • a preferred porous substrate is a woven fabric or a non-woven fabric using organic fibers such as cellulose fiber, cellulose triacetate fiber, polyester fiber, polypropylene fiber and polyethylene fiber, and more preferably, the density control is relatively
  • a non-woven fabric that is easy, easy to manufacture and inexpensive is used.
  • an organic polymer film can be preferably used.
  • the material of the organic polymer film include polyethylene resin, polypropylene resin, polyvinyl chloride resin, polyvinylidene fluoride resin, polysulfone resin, polyethersulfone resin, and polysulfone resin.
  • Examples include acrylonitrile-based resin, cellulose-based resin, and cellulose triacetate-based resin.
  • the organic polymer film may be a mixture of resins mainly composed of these resins.
  • the main component means that the component is contained in an amount of 50% by weight or more, preferably 60% by weight or more.
  • the material of the organic polymer film is easy to form with a solution and is excellent in physical durability and chemical resistance, such as polyvinyl chloride-based resin, polyvinylidene fluoride-based resin, A polyvinylidene fluoride resin or a resin based on it is most preferably used, such as a polysulfone resin, a polyethersulfone resin, and a polyacrylonitrile resin.
  • the polyvinylidene fluoride resin a homopolymer of vinylidene fluoride is preferably used. Further, as the polyvinylidene fluoride resin, a copolymer of vinylidene copolymerizable with vinylidene fluoride is also preferably used. Examples of the bure monomers that can be copolymerized with vinylidene fluoride include tetrafluoroethylene, hexafluoropropylene, and trisalt fluorinated styrene.
  • the porous membrane used in the present invention has an average pore diameter of 0.01 ⁇ m or more and less than 1 ⁇ m.
  • the average pore size of the porous membrane is 0.01 ⁇ m or more and less than 1 ⁇ m, clogging by microorganisms used for fermentation hardly occurs, and the filtration performance continues stably for a long period of time.
  • the average pore diameter of the porous membrane is 0.01 ⁇ m or more and less than 1 ⁇ m, it is possible to achieve both a high exclusion rate without leakage of microorganisms or cultured cells and a high water permeability. High accuracy and reproducibility can be maintained for a long time Can be carried out with sex.
  • the average pore diameter of the porous membrane is less than 1 ⁇ m.
  • the average pore diameter of the porous membrane is preferably not too large compared to the size of the microorganism or cultured cell in order to prevent the occurrence of leakage of microorganisms or cultured cells, that is, the occurrence of a problem that the rejection rate decreases.
  • the average pore diameter is preferably 0.4 ⁇ m or less, and preferably less than 0.2 ⁇ m.
  • a substance other than the target chemical product of the microorganism or cultured cell may be produced, for example, a substance that easily aggregates, such as a protein or a polysaccharide.
  • one of the microorganism or cultured cell in the culture solution may be produced.
  • cell crushed material may be generated due to the death of the part, and the average pore diameter is preferably 0.1 ⁇ m or less in order to avoid clogging of the porous membrane by these substances. is there.
  • the average pore diameter of the porous membrane is preferably 0.4 ⁇ m or less, more preferably less than 0.2 / zm, and more preferably less than 0.2. ! / ⁇ .
  • the average pore size of the porous membrane in the present invention is 0.01 ⁇ m or more.
  • the average pore diameter of the porous membrane is preferably 0.02 ⁇ m or more, and more preferably 0.04 ⁇ m or more.
  • the average pore diameter is 9.2 in observation with a scanning electron microscope at a magnification of 10,000.
  • the average pore diameter can be obtained by taking a photograph of the membrane surface with a scanning electron microscope at a magnification of 10,000, and randomly selecting 10 or more, preferably 20 or more pores. It can also be obtained by measuring and number average.
  • a circle having an area equal to the area of the pores is obtained by an image processing apparatus or the like, and the equivalent circle diameter is used as the diameter of the pores.
  • the standard deviation ⁇ of the average pore diameter of the porous membrane used in the present invention is preferably 0.1 ⁇ m or less.
  • Average pore diameter The standard deviation ⁇ of N is the number of pores that can be observed within the above-mentioned range of 9.2 / zm X lO. 4 m, where N is the measured diameter and Xk is the average pore diameter. Calculated according to (Equation 1) below, which is ave).
  • the permeability of the culture solution is one of the important performances.
  • the pure water permeability coefficient of the porous membrane before use can be used.
  • the pure water permeability coefficient of the porous membrane is 2 X 10-9 m 3 when calculated by measuring the water permeability at a head height of lm using purified water at a temperature of 25 ° C by a reverse osmosis membrane.
  • the pure water permeability coefficient which is preferably Zm 2 ZsZpa or more, is 2 X 10 " 9 mVmVs Zpa or more and 6 X 10 _7 m 3 Zm 2 ZsZpa or less, a practically sufficient permeate flow rate can be obtained.
  • the surface roughness is an average value of heights in a direction perpendicular to the surface.
  • Membrane surface roughness is one of the factors that make it easier for microorganisms or cultured cells adhering to the separation membrane surface to peel off due to the membrane surface cleaning effect of the liquid flow by agitation and circulation pump.
  • the surface roughness of the porous membrane is preferably 0.1 m or less. When the surface roughness is 0.1 ⁇ m or less, microorganisms or cultured cells attached to the membrane are easily detached.
  • the membrane surface roughness of the porous membrane is 0.1 m or less, and the average pore diameter is 0.
  • the film surface roughness was measured under the following conditions using the following atomic force microscope (AFM).
  • Probe SiN cantilever manufactured by Digital Instruments
  • Sample preparation Membrane samples were immersed in ethanol at room temperature for 15 minutes, then immersed in RO water for 24 hours, washed, and then air-dried.
  • the film surface roughness drough was calculated by the following (Equation 2) from the height of each point in the Z-axis direction using the atomic force microscope (AFM).
  • the shape of the porous membrane used in the present invention is preferably a flat membrane.
  • Porous membrane shape Is a flat membrane, its average thickness is selected according to the application.
  • the average thickness is preferably 20 ⁇ m or more and 5000 ⁇ m or less, and more preferably 50 ⁇ m or more and 2000 ⁇ m or less.
  • the shape of the porous membrane used in the present invention is preferably a hollow fiber membrane.
  • the inner diameter of the hollow fiber is preferably 200 m or more and 5000 m or less, and the film thickness is preferably 20 m or more and 2000 m or less.
  • a film of a stock solution containing a resin and a solvent is formed on the surface of the porous substrate, and the porous substrate is impregnated with the stock solution. Thereafter, only the coating-side surface of the porous substrate having a coating is brought into contact with a coagulation bath containing a non-solvent to coagulate the resin, and a porous resin layer is formed on the surface of the porous substrate.
  • the stock solution is prepared by dissolving rosin in a solvent.
  • the temperature of the stock solution is usually preferably selected within the range of 5 to 120 ° C. from the viewpoint of film forming properties.
  • the solvent dissolves the resin and acts on the resin to encourage them to form a porous resin layer.
  • Solvents include N-methylpyrrolidinone (NMP), N, N-dimethylacetamide (DMAc), N, N-dimethylformamide (DMF), dimethyl sulfoxide (DMSO), N-methyl-2-pyrrolidone, methylethyl Ketone, tetrahydrofuran, tetramethylurea, trimethyl phosphate, cyclohexanone, isophorone, ⁇ -butyrolatatane, methyl isoamyl ketone, dimethyl phthalate, propylene glycol methyl ether, propylene carbonate, diacetone alcohol, glycerol triacetate, acetone and Methyl ethyl ketone can be used.
  • NMP N-methylpyrrolidinone
  • DMAc N, N-dimethylacetamide
  • DMF N-dimethylformamide
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • N-methyl-2-pyrrolidone N-methyl
  • ⁇ -methylpyrrolidinone ⁇ ⁇
  • DMAc ⁇ -dimethylacetamide
  • DMF N-dimethylformamide
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • components other than the solvent such as polyethylene glycol, polybulal alcohol, polybulurpyrrolidone, and glycerin may be added to the solvent.
  • a non-solvent is a liquid that does not dissolve cocoa butter.
  • the non-solvent acts to control the pore size by controlling the rate of coagulation of the resin.
  • water and alcohols such as methanol and ethanol can be used. Among these, water and methanol are preferable as non-solvents.
  • Components other than the solvent and the non-solvent may be a mixture.
  • a pore-opening agent may be added to the stock solution.
  • the pore-opening agent is extracted when immersed in the coagulation bath and has a function of making the resin layer porous.
  • the pore-opening agent is preferably one having high solubility in the coagulation bath.
  • inorganic salts such as calcium chloride and calcium carbonate can be used.
  • polyoxyalkylenes such as polyethylene glycol and polypropylene glycol, water-soluble polymer compounds such as polybulualcohol, polypropylene and polyacrylic acid, and glycerin as pore-opening agents! Can do.
  • the hollow fiber membrane discharges a stock solution that also has a resin and solvent power from the outer tube of the double-tube base, and discharges a hollow portion forming fluid from the inner tube of the double-tube base. It can be produced by cooling and solidifying in a cooling bath.
  • the stock solution can be prepared by dissolving the rosin described in the above-mentioned method for producing a flat film in a concentration of 20% by weight or more and 60% by weight or less in the solvent described in the above-mentioned method for forming a flat film. . Further, a gas or a liquid can be usually used as the hollow portion forming fluid. Further, a new porous resin layer can be coated (laminated) on the outer surface of the obtained hollow fiber membrane. Stacking can be performed to change the properties of the hollow fiber membrane, for example, hydrophilicity / hydrophobicity, pore diameter, and the like to desired properties.
  • a new porous resin layer to be laminated can be prepared by bringing a stock solution in which resin is dissolved in a solvent into contact with a coagulation bath containing a non-solvent to coagulate the resin.
  • a stock solution in which resin is dissolved in a solvent for example, the same material as that of the organic polymer film described above can be preferably used.
  • the lamination method is not particularly limited, and the hollow fiber membrane may be immersed in the stock solution, or the stock solution may be applied to the surface of the hollow fiber membrane, and after lamination, a part of the attached stock solution is sprinkled. You can adjust the stacking amount by taking it off or blowing it off with an air knife. wear.
  • the porous membrane used in the present invention can be made into a separation membrane element by attaching and sealing the hollow portion of the hollow fiber membrane using a member such as a resin and placing it on a support. .
  • the porous membrane used in the present invention can be made into a separation membrane element by being combined with a support.
  • a separation membrane element in which a support plate is used as a support and the porous membrane used in the present invention is disposed on at least one side of the support plate is a preferred embodiment of the separation membrane element having a porous membrane used in the present invention.
  • One. In order to increase the amount of water permeation, it is also a preferred aspect of the separation membrane element to provide a porous membrane on both sides of the support plate.
  • filtration is performed at a transmembrane pressure difference of 0.1 to 20 kPa. If filtration is performed at a transmembrane pressure higher than 20 kPa to filter the fermentation broth, the power required to apply the pressure is required, which reduces the economic effect of producing chemicals. Applying a transmembrane pressure higher than 2 OkPa may disrupt microorganisms or cultured cells, reducing the ability to produce chemicals.
  • the transmembrane differential pressure which is a filtration pressure, is in the range of 0.1 to 20 kPa, and the transmembrane differential pressure can be obtained by the water head difference.
  • the ability to produce chemicals that do not need to remain in condition will not decline.
  • the transmembrane pressure difference is preferably filtered within the range of 0.1 to 2 kPa.
  • the method for producing a chemical product of the present invention uses a fermentation raw material.
  • the fermentation raw material used in the present invention may be any material that promotes the growth of the microorganisms to be cultured and can produce the desired fermentation product as a chemical product.
  • the fermentation raw material used in the present invention is preferably a normal liquid medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and if necessary, organic micronutrients such as amino acids and vitamins.
  • the carbon source include sugars such as glucose, sucrose, fructose, galactose, and ratatose, starch syrup containing these sugars, sweet potato molasses, sugar beet molasses, organic acids such as sugarcane, itest molasses, acetic acid, ethanol Alcohols, glycerin and the like are used.
  • nitrogen Sources include ammonia gas, aqueous ammonia, ammonia salts, urea, nitrates, and other supplementary organic nitrogen sources such as oil cakes, soybean hydrolysates, casein hydrolysates, and other sources.
  • Amino acids, vitamins, corn steep liquor, yeast or yeast extract, meat extract, peptides such as peptone, various fermented cells and hydrolysates thereof are used.
  • inorganic salts phosphates, magnesium salts, calcium salts, iron salts, manganese salts and the like can be appropriately added.
  • the nutrient is added as a preparation or a natural product containing it.
  • the culture solution refers to a solution obtained as a result of growth of microorganisms or cultured cells on the fermentation raw material.
  • the composition of the fermentation raw material to be added may be appropriately changed so that the composition of the fermentation raw material at the start of the culture is increased so that the productivity of the target chemical product is increased.
  • the saccharide concentration in the culture solution is preferably maintained at 5 gZl or less.
  • the reason why it is preferable to maintain the saccharide concentration in the culture solution at 5 gZl or less is to minimize the loss of saccharide due to withdrawal of the culture solution.
  • Microorganisms are usually cultured in the range of pH 4-8 and temperature 20-40 ° C.
  • P H of the culture an inorganic or organic acid, alkali substance, further ⁇ This urea, calcium carbonate, Ann mode - such as by Agasu, usually value determined because Ji roughness force in P H4-8 range Adjust.
  • it is necessary to increase the oxygen supply rate means such as adding oxygen to the air to keep the oxygen concentration at 21% or higher, pressurizing the culture, increasing the agitation rate, or increasing the aeration rate can be used.
  • batch culture or Fed-Batch culture may be performed at the initial stage of culture to increase the microorganism concentration, and then continuous culture (pulling) may be started.
  • continuous culture after increasing the microbial concentration, a high concentration of cells may be seeded, and continuous culture may be performed at the start of the culture.
  • the supply of the raw material culture solution and the withdrawal of the culture may be continuous or intermittent. May be.
  • Nutrients necessary for cell growth may be added to the raw material culture solution so that the cell growth is continuously performed. Maintaining a high concentration of microorganisms or cultured cells in the culture solution as long as the environment of the culture solution is not appropriate for the growth of microorganisms or cultured cells and does not increase the rate of death is effective. It is preferable to obtain For example, good production efficiency can be obtained by maintaining the concentration of microorganisms or cultured cells in the culture solution at 5 gZL or more as a dry weight.
  • microorganisms or cultured cells can be extracted from the fermenter as necessary. For example, if the concentration of microorganisms or cultured cells in the fermenter becomes too high, clogging of the separation membrane is likely to occur. Therefore, by pulling out, it can be avoided from clogging.
  • the production performance of chemicals may vary depending on the concentration of microorganisms or cultured cells in the fermenter, and the production performance can be maintained by extracting microorganisms or cultured cells using the production performance as an index.
  • the continuous culture operation performed while growing fresh bacterial cells capable of fermentation production is a continuous culture method for producing a product while growing the bacterial cells.
  • the number of fermenters does not matter.
  • the continuous culture operation is usually performed in a single fermenter. It is possible to use a plurality of fermenters because the fermenter capacity is small. In this case, high productivity of the fermented product can be obtained even if continuous fermentation is performed by connecting a plurality of fermenters in parallel or in series by piping.
  • microorganisms or cultured cells that can be used in the method for producing a chemical product of the present invention will be described. There are no restrictions on the microorganisms or cultured cells used in the method for producing a chemical product of the present invention.
  • the microorganisms and cultured cells used in the present invention include, for example, yeasts such as baker's yeast often used in the fermentation industry, bacteria such as Escherichia coli and coryneform bacteria, filamentous fungi, actinomycetes, animal cells, and insect cells. Etc.
  • yeasts such as baker's yeast often used in the fermentation industry
  • bacteria such as Escherichia coli and coryneform bacteria
  • filamentous fungi actinomycetes
  • animal cells and insect cells.
  • insect cells Etc.
  • the microorganisms and cells used may be isolated from the natural environment or may have been partially modified by mutation or genetic recombination.
  • Examples of the chemical product produced by the method for producing a chemical product of the present invention include the above microorganisms and cells. There is no limitation as long as it is a substance produced in the culture solution.
  • Examples of the chemical product produced by the method for producing a chemical product of the present invention include substances that are mass-produced in the fermentation industry, such as alcohol, organic acid, amino acid, and nucleic acid.
  • the alcohol may be ethanol, 1,3 propanediol, 1,4 butanediol, glycerol, etc.
  • the organic acid may be acetic acid, lactic acid, pyruvic acid, succinic acid, malic acid, itaconic acid, citrate, or nucleic acid.
  • nucleosides such as inosine and guanosine
  • nucleotides such as inosinic acid and guaric acid
  • diamine compounds such as cadaverine.
  • the present invention can also be applied to the production of substances such as enzymes, antibiotics, and recombinant proteins.
  • a microorganism or cultured cell that can be used for producing L-lactic acid is not limited as long as it is a microorganism that can produce L-lactic acid.
  • lactic acid bacteria can be preferably used as microorganisms or cultured cells that can be used for the production of L-lactic acid.
  • lactic acid bacteria can be defined as prokaryotic microorganisms that produce 50% or more of lactic acid in terms of sugar yield with respect to consumed glucose.
  • Preferred lactic acid bacteria include, for example, Genus Lactobacillus, Genus Pediococcus, Genus Tetragenococcus, Genus Carnobacterium, Genus Vagococcus , Leuconostoc, Genus Oenococcus, Atopobium, Genus Streptococcus, Genus Enterococcus, Loc Among them, lactic acid bacteria belonging to the genus Bacillus can be selected and preferably used for the production of lactic acid by selecting lactic acid bacteria having a high yield of lactate to sugar. In the production method, among lactic acid, lactic acid bacteria with a high yield of L-lactic acid to saccharide are selected and preferred for lactic acid production.
  • L-Lactic acid is a kind of optical isomer of lactic acid and can be clearly distinguished from its enantiomer, D-lactic acid.
  • L-lactic acid is produced by the method for producing a chemical product of the present invention
  • microorganisms or cultured cells having artificially imparted or enhanced lactic acid production ability can be used.
  • microorganisms or cultured cells in which an L-lactate dehydrogenase gene (hereinafter sometimes referred to as L-LDH) is introduced to impart or enhance L-lactic acid production ability.
  • L-LDH L-lactate dehydrogenase gene
  • a conventionally known method using drug mutation can also be used. More preferably, a recombinant microorganism whose L-lactic acid-producing ability is enhanced by incorporating L-LDH into the microorganism can be mentioned.
  • prokaryotic cells such as Escherichia coli, lactic acid bacteria, and eukaryotic cells such as yeast are preferred as hosts for recombinant microorganisms. is there.
  • yeasts yeast belonging to the genus Saccharomyces is preferable, and Saccharomyces cerevisiae is more preferable.
  • the L LDH used in the present invention includes reduced nicotinamide adenine dinucleotide.
  • L-LDH derived from lactic acid bacteria having a high yield of L-lactic acid with respect to sugar can be used.
  • L-LDH derived from mammals can be used.
  • L-LDH derived from Homo sap iens and derived from Hell L can be used.
  • L-LDH derived from the power elephant belonging to the frog family Pieris subtilis
  • L-LDH derived from Xenopus laevis can be preferably used.
  • the L-LDH derived from human or force L used in the present invention includes genetic polymorphisms and mutated genes caused by mutagenesis.
  • Genetic polymorphism is a partial change in the base sequence of a gene due to a natural mutation on the gene.
  • Mutagenesis refers to artificially introducing mutations into a gene. Mutagenesis is, for example, a method using a site-specific mutagenesis kit (Mutan-K (Takara Bio)) or a random mutagenesis kit (BD Diversify PCR Random Mutagenesis (CLONTECH)). and so on.
  • L-LDH derived from human or force L used in the present invention encodes a protein having an activity of converting NADH and pyruvic acid into NAD + and L-lactic acid, so that it is included in a part of the base sequence. It does not matter if there is a deletion or insertion.
  • L-lactic acid is produced by the method for producing a chemical product of the present invention
  • separation / purification of L-lactic acid contained in the produced filtration / separation fermented liquid is performed by conventionally known concentration, distillation and crystallization.
  • Etc. can be performed in combination.
  • a method of extracting the filtrate with a separated fermented liquor at a pH of 1 or less with force jetyl ether or ethyl acetate a method of elution after adsorption washing with an ion exchange resin, or a reaction with alcohol in the presence of an acid catalyst.
  • a method of distilling as an ester and a method of crystallizing as a calcium salt or a lithium salt are examples of a method of distilling as an ester and a method of crystallizing as a calcium salt or a lithium salt.
  • the concentrated L lactic acid solution obtained by evaporating the water from the filtered and separated fermentation broth can be used for distillation operation.
  • distilling it is preferable to distill while supplying moisture so that the moisture concentration of the undistilled stock solution is constant.
  • the water can be concentrated by heating and evaporating to obtain purified L-lactic acid at the desired concentration.
  • an L-lactic acid aqueous solution containing low-boiling components such as ethanol and acetic acid
  • impurities can be removed from the distillate by ion exchange resin, activated carbon and chromatographic separation, if necessary, to obtain higher purity L-lactic acid.
  • microorganisms that can be used for D-lactic acid production or cultured cells are limited as long as they are microorganisms capable of producing D-lactic acid. Flower!/,.
  • D There are microorganisms that can be used for lactic acid production! Examples of the cells include, in the wild type strain, microorganisms belonging to the genera Lactobacillus, Bacillus and Pediococcus having the ability to synthesize D-lactic acid.
  • D-lactic acid is produced by the method for producing a chemical product of the present invention
  • the enzyme activity of wild-type D-lactate dehydrogenase (hereinafter sometimes referred to as D-LDH) is enhanced. It is preferable.
  • a method for enhancing enzyme activity a conventionally known method using drug mutation can also be used. More preferably, a recombinant microorganism in which the enzyme activity of D-lactate dehydrogenase is enhanced by incorporating a gene that codes D-lactate dehydrogenase.
  • prokaryotic cells such as Escherichia coli, lactic acid bacteria, and eukaryotic cells such as yeast are preferred as recombinant microorganism hosts. It is.
  • D-lactic acid when producing D-lactic acid by the method for producing a chemical product of the present invention, the genetic ability to encode D-lactate dehydrogenase Lactobacillus plantarum, and Pediococcus ashideirakuteishi (A gene derived from Pediococcus acidilactici) and Bacillus laevoboraticus (Bacillus laevolacticus) is preferred, and a gene derived from Bacillus laevolacticus is more preferred.
  • filtration 'separation of D-lactic acid contained in the separated fermentation broth' purification can be performed by conventionally known methods such as concentration, distillation and crystallization.
  • a combination of methods can be performed.
  • the pH of filtered and separated fermentation broth should be 1 or less and then extracted with jetyl ether or ethyl acetate, the method of elution after adsorption washing with ion exchange resin, or the reaction with alcohol in the presence of an acid catalyst.
  • a method of distilling as an ester and a method of crystallizing as a calcium salt or a lithium salt are examples of the pH of filtered and separated fermentation broth.
  • a concentrated D-lactic acid solution obtained by evaporating the water in the filtered and separated fermentation solution can be subjected to a distillation operation.
  • distilling it is preferable to distill while supplying water so that the concentration of water in the distillation stock solution is constant. After distilling the D-lactic acid aqueous solution, the water is evaporated by heating. Concentrated to obtain purified D-lactic acid at the desired concentration.
  • a D-lactic acid aqueous solution containing a low-boiling component ethanol, acetic acid, etc.
  • a low-boiling component ethanol, acetic acid, etc.
  • impurities can be removed from the distillate by ion exchange resin, activated carbon, chromatographic separation, or the like, if necessary, to obtain higher purity D-lactic acid.
  • microorganisms or cultured cells that can be used for ethanol production are microorganisms or cultured cells that can produce pyruvic acid.
  • microorganisms or cultured cells that can be used for ethanol production include yeasts belonging to the genus Saccharomyces, Genus Kluyveromyces, and Genus Schizosaccharomyces. it can. Of these, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, and Schizosaccharomyces pombe can be preferably used.
  • bacteria belonging to the genus Lactobacillus and Genus Zymomonas can also be preferably used.
  • Lactobacillus brevis Lactobacillus brevis
  • Zymomonas mobilis can be preferably used.
  • the microorganisms or cultured cells that can be used for ethanol production in the present invention may be microorganisms or cultured cells that have artificially increased ethanol production ability.
  • the microorganisms or cultured cells that can be used for ethanol production in the present invention may be specifically those whose properties are partially modified by mutation or genetic recombination.
  • An example of a modified part of its properties is a yeast that has acquired the ability to assimilate raw starch by incorporating the fungal darcoamylase gene belonging to the genus Rhizopus (microbe, 3: 555- 564 (1987) ).
  • the filtration 'separation of ethanol contained in the separated fermentation broth' produced by the production method of the present invention was purified using, for example, a distillation purification method, NF, RO membrane, or a zeolite separation membrane.
  • the “concentration” purification method can be suitably used.
  • pyruvic acid When pyruvic acid is produced by the chemical production method of the present invention, it is used for the production of pyruvic acid.
  • Any microorganism or cultured cell that can produce pyruvic acid is not limited.
  • the microorganisms or cultured cells that can be used for the production of pyruvic acid include bacteria belonging to Genus Pseudomonas, Genus Corynebacterium, Genus Es cherichia, and Genus Acinetobacter. Preferably it can be used.
  • the Shiyudomonasu 'Furuoreesensu (Pseudomo nas fuluorescens), Nyu ⁇ Tomonasu, "> erotic Roh 1 ⁇ ⁇ support (Pseudomonas aerugmos a), Eshierishia' it is possible to use a bacteria such as E. coli (Escherichia coli).
  • E. coli Escherichia coli
  • These fine Bacteria whose properties have been partially modified by mutation or genetic recombination may be used, for example, by mutating or deleting the ATPase gene directly involved in ATP production by acid phosphate. Bacteria, yeast, etc.
  • Saccharomyces can also be preferably used, for example, Saccharomyces, Genus Toluropusis, Genus Candida, Genus Schizophyllum. Molds and yeasts belonging to Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces cerevisiae, and Saccharose ⁇ Molds such as Saccharom yces copsis, Candida glabrata, Candida lipolytics, Toluropusis glabrata, molds such as Schizophyllum commune, yeast Thus, pyruvic acid can be produced.
  • the separation and purification of pyruvic acid contained in the filtered / separated fermentation broth can be performed by a method using an anion exchange column.
  • a purification method using a weak salt ion exchanger disclosed in JP-A-6-345683 can be suitably used.
  • a microorganism that can be used for production of succinic acid or a cultured cell is particularly a microorganism that can produce succinic acid.
  • microorganisms or cultured cells that can be used for the production of succinic acid bacteria belonging to the genus Anaerobiospirillum and the genus Actinobadllus can be suitably used.
  • Xu first described in 5143833 Pat analyst Erobi O Spyri Ramtha comb - Cipro du sense (Anaerobiospirnlum succiniciproducens) and James B. Mckinlay (.
  • microorganism a microorganism whose succinic acid production ability has been improved by genetic recombination can be used, whereby the succinic acid productivity can be improved.
  • microorganisms include Brevibaterium 'flavum MJ233AB-41 (FERM BP-1498) lacking lactate dehydrogenase described in JP-A-2005-27533, and non-patent literature.
  • a deficient strain such as Escherichia coli AFP111 strain can be used.
  • succinic acid is produced by the method for producing a chemical product of the present invention
  • a conventional succinic acid purification method can be applied to separation and purification of succinic acid.
  • a purification method combining water-splitting electrodialysis treatment, vacuum concentration and crystallization as disclosed in JP-A-2005-333886 can be suitably used.
  • microorganisms or cultured cells that can be used for the production of itaconic acid are limited as long as they are microorganisms that can produce itaconic acid.
  • Flower As microorganism cells that can be used for the production of itaconic acid, molds or yeasts can be preferably used as cultured cells. More preferably, the genus Aspergillus is! /, Is a mold belonging to the genus Ustil ago, Genus Candida, and Genus R production of itaconic acid using yeast belonging to hodotorula).
  • Candida antarctica can be preferably used for the production of itaconic acid.
  • itaconic acid When itaconic acid is produced by the chemical production method of the present invention, itaconic acid can be separated and purified preferably using ultrafiltration or electrodialysis.
  • ultrafiltration method disclosed in Japanese Patent Publication No. SHO-050958 and a purification method by electrofiltration using a salt-type cation exchange resin membrane can be suitably used.
  • 1,3-propanediol is produced by the method for producing a chemical product of the present invention
  • 1,3-propanediol is used as a microorganism or cultured cell that can be used for production of 1,3-propanediol. If it is microorganisms which can be produced, there will be no restriction
  • microorganisms or cultured cells that can be used for the production of 1,3-propanediol include, for example, the genus Klebsiella and Clostridium, which have the ability to synthesize 1,3-propanediol from glycerol in the wild type strain. And microorganisms belonging to the genus Lactobacillus.
  • the microorganism comprises: (a) at least one gene encoding a polypeptide having glycerol dehydratase activity; (b) glycerol dehydratase reactivation. At least one gene encoding an active factor; and (c) at least one gene encoding a non-specific catalytic activity that converts 3-hydroxypropionaldehyde to 1,3-propanediol. Is preferred.
  • the microorganism is capable of producing 1,3-propanediol by a recombinant microorganism.
  • the microorganism having the ability to synthesize 1,3-propanediol from glycerol is preferably Crebsiella ( Klebsiella), Clostridium, Lactobac illus, Citronobacter (Cytrobacter), Enteroracter (Enterobacter), Aero Nobtenore (Aerobacter), Aspengilinores (Aspergillus), Saccharomyces (Saccharo myces), Schizosaccharomyces, Zygos accharomyces, Pichia (Pichia), Kunoreiveromyces ), Hansenula, Debaryomyces, Mucor, Torulopsis, Methylobacter, Salmonella, Bacillus, erobacter, erobacter Recombinant microorganisms selected from the group consisting of Eschericia and Pseudomona
  • the recombinant microorganism should be improved so that it can produce 1,3 propanediol efficiently with glucose.
  • the recombinant microorganism can be, for example, (a) at least one gene encoding a polypeptide having glycerol-3-phosphate dehydrogenase activity; and (b) at least one gene encoding a polypeptide having glycerol-3-phosphatase activity.
  • a recombinant microorganism containing a gene is preferred.
  • a recombinant microorganism containing a gene encoded by orfX and orfZ isolated from the glycerol dehydratase reactivating factor Sdha regulon.
  • the recombinant microorganism is more preferably a recombinant microorganism that lacks glycerol kinase activity and Z or glycerol dehydrogenase activity and / or triosephosphate isomerase activity.
  • the filtration 'separation of 1,3 propanediol contained in the separated fermentation liquor' purification should be performed by concentration and crystallization.
  • concentration and crystallization can do.
  • a refining method using vacuum concentration and crystallization described in JP-A-35785 can be suitably used.
  • any microorganism can be used as long as it can be used for producing cadaverine or a microorganism capable of producing cadaverine as a cultured cell.
  • microorganisms that can be used for the production of cadaverine. Examples of cultured cells include lysine decarboxylase and Z or lysine.
  • a microorganism that enhances the enzyme activity of the davelin antiporter is preferred.
  • a recombinant microorganism into which a microorganism has incorporated a gene encoding lysine decarboxylase and Z or lysine 'cadaverine antiporter More preferably, a microorganism in which one or two or more types of genes encoding lysine decarboxylase are incorporated in the recombinant microorganism is used.
  • Escherichia coli and coryneform bacteria are preferred as the recombinant microorganism, more preferably lysine decarboxylase activity and homoserine auxotrophy. Or S- (2-aminoethyl) -L-coryneform bacterium with at least one characteristic of resistance to cysteine.
  • the genus of coryneform bacteria is at least one genus selected from the group consisting of the genus Corynebataterum and the genus Brevibaterium. More preferably, in Corynebacterium dartamicum (Coryneb acutenum gulutamicum).
  • cadaverine is produced by the method for producing a chemical product of the present invention
  • separation / purification of cadaverine contained in the filtered / separated fermentation broth is performed by a conventionally known method such as concentration, distillation and crystallization.
  • a purification method using crystallization disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-222569 can be suitably used.
  • various polymer raw materials can be obtained depending on the acid used in continuous culture, and a purification method by crystallization is preferably used for polymer raw materials that require high purity. If the pH of the culture solution is maintained with hydrochloric acid, cadaverine dihydrochloride can be recovered from the filtrate by a crystallization process.
  • the pH of the culture solution is maintained with dicarboxylic acid, and cadaverine 'dicarboxylate is recovered from the filtrate by a crystallization step.
  • the dicarboxylic acid is an aliphatic and Z or aromatic dicarboxylic acid having only two carboxyl groups as functional groups. More preferably, examples of the dicarboxylic acid include adipic acid, sebacic acid, 1,12-dodecanedicarboxylic acid, succinic acid, isophthalic acid, and terephthalic acid.
  • a nucleic acid When a nucleic acid is produced by the method for producing a chemical product of the present invention, it may be used for nucleic acid production. There are no restrictions on the microorganisms or cultured cells that can produce nucleic acids. Microorganisms or cultured cells that can be used for the production of nucleic acids are originally prokaryotic microorganisms that have a high production capacity for nucleic acids and can be separated from nature! May be. Specifically, it may have been partially altered by mutation or genetic recombination.
  • microorganisms or cultured cells such as enhancement of enzymes involved in nucleic acid biosynthetic pathways, reduction of enzyme activities involved in nucleic acid degradation pathways, modification of proteins involved in in vitro release of nucleic acids or biomembrane composition, etc.
  • microorganisms or cultured cells such as enhancement of enzymes involved in nucleic acid biosynthetic pathways, reduction of enzyme activities involved in nucleic acid degradation pathways, modification of proteins involved in in vitro release of nucleic acids or biomembrane composition, etc.
  • inosine when producing inosine, it is desirable that it does not have or is weakly adeno-succinate synthetase activity. In addition, it is desirable that the inosinate dehydrogenase activity is not present or weak. In addition, it is desirable that the nucleosidase activity does not have or is weak. When producing guanosine, it is desirable that it does not have or is weakly adeno-succinate synthetase activity. Further, it is desirable that the guanylate reductase activity does not have or is weak. Moreover, it is desirable that the nucleosidase activity does not have or is weak.
  • the force is weak and has no nucleotidase activity.
  • uridine it is desirable that it does not have uridine phosphorylase activity or is weak.
  • cytidine it has no homoserine dehydrogenase activity which is preferably not weak or weak, but it is preferably weak.
  • coryneform bacteria and Bacillus subtilis can be more preferably used among the microorganisms or cultured cells.
  • examples of coryneform bacteria include bacteria belonging to the genus Corynebacterium.
  • Corynebacterium 'Glutamicum Corynebacterium
  • Corynebacterium ammoniagenes Corynebacterium ammoniagenes
  • Corynebacterium' Guanfaciens Co rynebacterium guanofaciens
  • Corynebacterium petrophilium are preferably used.
  • Bacillus subtilis include bacteria belonging to the genus Bacillus.
  • Bacillus subtilis, Bacillus liquenif ormi s, and Bacillus pumilus are preferably used.
  • examples of coryneform bacteria include bacteria belonging to the genus Corynebacterium.
  • examples of Bacillus subtilis preferred by Corynebacterium include bacteria belonging to the genus Bacillus.
  • Bacillus subtilis Bacillus liqu eniformis, and Bacillus pumilus are preferably used.
  • Bacillus subtilis can be used, and among the Bacillus subtilis, bacteria belonging to the genus Bacillus are preferably used.
  • Bacillus subtilis is preferably used.
  • Bacillus subtilis is preferably used.
  • Bacillus subtilis is preferably used.
  • Bacillus subtilis is preferably used.
  • Bacillus subtilis When producing cytidine, Bacillus subtilis can be used, and bacteria belonging to the genus Bacillus among the Bacillus subtilis are preferably used.
  • Bacillus subtilis is preferably used.
  • nucleic acids are produced by the method for producing a chemical product of the present invention
  • filtration 'separation of nucleic acids contained in the separated fermentation solution' purification is preferably performed by an ion exchange resin treatment method, a concentrated cooling crystallization method, a membrane. This is done by combining separation methods and other methods. In order to remove impurities, it can be purified using the conventional activated carbon adsorption method and recrystallization method!
  • an amino acid is produced by the method for producing a chemical product of the present invention
  • a microorganism that can be used for amino acid production or a microorganism that can produce amino acids as cultured cells.
  • Microorganisms or cultured cells that can be used for the production of amino acids may be naturally separated from those with high amino acid production ability, or may be microorganisms or cultured cells that have artificially increased production capacity.
  • the amino acid is preferably L-threon, L-lysine, L-glutamic acid, L-tryptophan, L-isoleucine, L-g.
  • the amino acid is preferably L-threon, L-lysine, L-glutamic acid, L-tryptophan, L-isoleucine, L-g.
  • Examples include rutamine, L-arginine, L-alanine, L-histidine, L-proline, L-ferulanine, L-aspartic acid, L-tyrosine, methionine, serine, parin, and leucine.
  • microorganisms or cultured cells that can be used for the production of L-threonine are Genus Esch erichia, Genus Providencia, Corynebaterilium.
  • Bacteria belonging to any of the genera Genus Corynebacterium, Genus Brevibacterium or Genus Serratia can be used. Among them, bacteria are particularly preferred, such as Escherichia coli, Providencia rettgeri, Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium flavum, ⁇ Ratatofamentum, or Serratia marcescens.
  • microorganisms or cultured cells that can be used for production of L-lysine are corynebataterum dartamicam, Brevibactinium flavum, or Brevi. Bataterium Ratatofumentum is preferred.
  • microorganisms or cultured cells that can be used for the production of L-glutamic acid are corynebataterum dartatum, brevibaterium flavum or brevibateru Mu Ratatofumentum is preferred.
  • microorganisms or cultured cells that can be used for producing L-tributophan are corynebataterum 'Dartamicam, Brevibaterium' flavum. , Brevibaterium 'Ratatofamentum, Bachinoles • Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens or Escherichia coli! / ,.
  • Microorganisms or cultured cells that can be used for production are preferably Corynebataterum dartamimu, Brevibaterium flavum, Brevibaterumum ratatofamentum or Serrat marcescens.
  • microorganisms or cultured cells that can be used for production of L-glutamine are corynebataterum 'Dartamicam, Brevibaterium' flavum. Brevibaterium 'Latatofmentum or Flavobacterium rigense is preferred! / ⁇ .
  • microorganisms or cultured cells that can be used for production of L-arginine are corynebataterum dartamim, brevibaterium. Prefer flavum, Serratia 'Manolescens, Escherichia coli or Bachinoles subtilis.
  • L-alanine is produced by the method for producing a chemical product of the present invention
  • microorganisms or cultured cells that can be used for production of L-alanin are Brevibaterium flavum or Arthrobacter oxydans (Arthrobacter oxydans) U prefer.
  • microorganisms or cultured cells that can be used for the production of L-histidine are corynebataterum d'artamicam, brevibaterium 'flavum Brevibacterium ammoniagenes, Serratia manolecense, Escherichia coli, Batinoles subtilis or Streptomyces coelicolor are preferred! / ⁇ .
  • L-proline is produced by the method for producing a chemical product of the present invention
  • microorganisms or cultured cells that can be used for production of L-proline are corynebataterum dartamicam, force Lucia catenaforma (Kurthia catenaforma). ), Serratia manolecens or Escherichia coli are preferred.
  • L-phenylalanine is produced by the method for producing a chemical product of the present invention
  • microorganisms or cultured cells that can be used for production of L-phenylalanine are Corynebacterium 'glutamicum, Brevibaterium'. Flavum, Brevibaterium 'Lattofamentum or Escherichia' prefers U.
  • Microorganisms or cultured cells that can be used for the production of acid are Brevibaterium flavum, Bacillus megatherium, Escherichia coli or Pseudomonas fluorescens force! /.
  • L-tyrosine is produced by the method for producing a chemical product of the present invention
  • microorganisms or cultured cells that can be used for production of L-tyrosine are Corynebataterum d'artamicam, Brevibaterium flavum, Brevibata Terium ratatofamentum or Escherichia coli is preferred.
  • the microorganism or cultured cell that can be used for the production of methionine is preferably Corynebatatum dartamicam.
  • microorganisms or cultured cells that can be used for the production of serine are corynebataterum 'Dartamicam, Brevibacterium flavum, Brevibaterium ratato A flamentum or an oleoreslobacter oxydance is preferred.
  • microorganisms or cultured cells that can be used for the production of norin are Brevibaterium 'Ratofamentumum, Serratia marcescens or Klebsiella pneumonia The key is Klebsiella pneumoniae.
  • microorganisms or cultured cells that can be used for production of leucine are corynebataterum 'Dartamicam, Brevibaterium rumatafatementum or Serratia marcescens. Is preferred.
  • the microorganisms or cultured cells that can be used for the production of amino acids have artificially increased production capacity over the exemplified microorganisms or cultured cells. It may be a microorganism or a cultured cell. Microorganisms or cultured cells that can be used for the production of amino acids may have been partially altered by mutation or genetic recombination. As an example of cultured cells, microorganisms that can be used for the production of amino acids with partially modified properties are described in Japanese Patent Application Laid-Open No. H2-219582, and provide L. threonine with improved productivity. And special As described in Table 3-500486, Corynebatarum with improved L-alanine productivity
  • the fermentation production rate in batch culture is calculated based on the amount of product (g) at the time when all of the raw carbon source was consumed, the time (h) required to consume the carbon source, and the amount of culture at that time. Divided by (L).
  • the continuous fermentation apparatus of the present invention includes alcohols such as ethanol, 1,3 propanediol, 1,4 butanediol, and glycerol, acetic acid, lactic acid, pyruvic acid, succinic acid, malic acid, itaconic acid, citrate, and the like.
  • alcohols such as ethanol, 1,3 propanediol, 1,4 butanediol, and glycerol, acetic acid, lactic acid, pyruvic acid, succinic acid, malic acid, itaconic acid, citrate, and the like.
  • the continuous fermentation apparatus of the present invention filters the fermentation broth of microorganisms or cultured cells through a separation membrane, collects the filtrate power product, and holds or refluxs the unfiltered liquid in the fermentation broth. And it is the manufacturing apparatus of the chemical product by continuous fermentation which adds a fermentation raw material to the said fermentation culture solution.
  • the continuous fermentation apparatus of the present invention has a fermentation reaction tank for fermentation culture of microorganisms or cultured cells.
  • One form of the continuous fermentation apparatus of the present invention includes a fermentation culture medium circulation means in a fermentation reaction tank. And a membrane separation tank for filtering the fermentation broth with a separation membrane inside, and means for controlling the transmembrane pressure difference of the separation membrane within the range of 0.1 to 20 kPa. It is a porous membrane with a pore diameter of 0.01 ⁇ m or more and less than 1 ⁇ m.
  • Another form of the continuous fermentation apparatus of the present invention is a separation membrane element for filtering a fermentation broth provided in the fermentation reaction tank and provided with a separation membrane, and connected to the separation membrane element and filtered. And a means for controlling the transmembrane pressure difference of the separation membrane within the range of 0.1 to 20 kPa, and the separation membrane has an average pore diameter of 0.01 ⁇ m or more and 1 ⁇ m. It is a porous membrane having less than pores.
  • the continuous fermentation apparatus of the present invention preferably has a pure water permeability coefficient of 2 X 10 " 9 m 3 of the porous membrane.
  • the average pore diameter of the porous membrane is 0.01 ⁇ m or more and less than 0.2 m, and the standard deviation of the pore diameter of the porous membrane is 0.1 m or less.
  • the continuous fermentation apparatus of the present invention is preferably a porous membrane having a membrane surface roughness of 0.1 m or less.
  • the porous membrane is a porous membrane including a porous resin layer.
  • the porous resin layer is a porous resin layer having an organic polymer strength.
  • the organic polymer membrane is made of polyvinylidene fluoride.
  • FIG. 1 is a schematic side view for explaining an example of a membrane separation type continuous fermentation apparatus used in the method for producing a chemical product of the present invention.
  • Figure 1 shows a typical example in which the separation membrane element is installed outside the fermentation reactor.
  • a membrane separation type continuous fermentation apparatus is basically composed of a fermentation reaction tank 1, a membrane separation layer 12, and a water head difference control device 3.
  • a porous membrane is incorporated in the separation membrane element 2.
  • a separation membrane and a separation membrane element disclosed in WO 2002Z064240 pamphlet are preferably used.
  • the membrane separation tank 12 is connected to the fermentation reaction tank 1 via the fermentation liquid circulation pump 11. ing.
  • the medium is introduced into the fermentation reaction tank 1 by the medium supply pump 7, and the fermented liquid in the fermentation reaction tank 1 is stirred by the stirrer 5 as necessary.
  • Necessary gas can be supplied by the supply device 4. At this time, the supplied gas can be recovered and recycled and supplied again by the gas supply device 4.
  • the pH of the fermentation broth is adjusted by the pH sensor control device 9 and the pH adjustment solution supply pump 8, and the temperature of the fermentation broth is adjusted by the temperature controller 10 as necessary. Fermentative production with high productivity can be performed.
  • the fermentation liquid in the apparatus is circulated between the fermentation reaction tank 1 and the membrane separation tank 12 by the fermentation liquid circulation pump 11.
  • the fermentation liquor containing the fermentation product is filtered and separated into the microorganism and the fermentation product by the separation membrane element 2, and the system power can be taken out.
  • the microorganisms filtered and separated can remain in the apparatus system so that the microorganism concentration in the apparatus system can be maintained high, so that the productivity is high and fermentation production is possible.
  • the filtration 'separation by the separation membrane element 2 is performed by the water head differential pressure with the water surface of the membrane separation tank 12, and no special power is required.
  • the level sensor 6 and the head differential pressure control device 3 can appropriately adjust the filtration speed of the separation membrane element 2 and the amount of fermentation liquid in the system.
  • the required gas can be supplied into the membrane separation tank 12 by the gas supply device 4.
  • the supplied gas can be recovered and recycled and supplied again by the gas supply device 4.
  • the filtration / separation by the separation membrane element 2 can be separated by suction filtration using a pump or the like, or by pressurizing the inside of the apparatus system, if necessary.
  • microorganisms or cultured cells can be cultured for continuous fermentation in a culture tank and supplied to the fermentation tank as necessary. By culturing microorganisms or cultured cells for continuous fermentation in a culture tank and supplying them into the fermentation tank as needed, continuous fermentation with microorganisms or cultured cells that are always fresh and have high production capacity for chemical products becomes possible. , Continuous fermentation with high production performance can be maintained for a long time.
  • FIG. 2 is a schematic side view for explaining an example of another membrane separation type continuous fermentation apparatus used in the present invention.
  • a typical example of the continuous fermentation apparatus used in the method for producing a chemical product of the present invention in which the separation membrane element is installed inside the fermentation reaction tank is shown in the schematic diagram of FIG.
  • the membrane separation type continuous fermentation apparatus is basically composed of a fermentation reaction tank 1 and a water head difference control apparatus 3.
  • a separation membrane element 2 in the fermentation reaction tank 1 has a porous membrane incorporated therein.
  • the porous membrane for example, a separation membrane and a separation membrane element disclosed in WO 2002Z064240 pamphlet can be used. Details of the separation membrane element will be described later.
  • the medium is pumped continuously or intermittently into the fermentation reaction tank 1 by the medium supply pump 7.
  • the medium can be sterilized by heat sterilization, heat sterilization, or sterilization using a filter as necessary before addition.
  • the fermented liquid in the fermentation reaction tank 1 is agitated by the agitator 5 in the fermentation reaction tank 1 as necessary.
  • the necessary gas can be supplied into the fermentation reaction tank 1 by the gas supply device 4 as necessary.
  • the pH of the fermentation broth in the fermentation reaction tank 1 is adjusted by the pH sensor controller 9 and the pH adjustment solution supply pump 8 as necessary, and the temperature controller 10 is used as necessary. Therefore, by adjusting the temperature of the fermentation liquor in the fermentation reaction tank 1, fermentative production with high productivity can be performed.
  • the physico-physical conditions of the fermentation broth are adjusted by the instrumentation / control device.
  • the power exemplifies the pH and temperature.
  • the dissolved oxygen and ORP are controlled by an analytical device such as an online chemical sensor.
  • the concentration of chemicals in the fermentation broth can be measured, and the physical and physical conditions can be controlled using the concentration of the chemicals in the fermentation broth as an index.
  • continuous or intermittent addition of the medium is preferably performed by appropriately adjusting the amount and speed of the medium input using the measured value of the physicochemical environment of the fermentation broth by the instrumentation apparatus as an index.
  • the fermentation liquor is filtered and separated from microorganisms and fermentation products by the separation membrane element 2 installed in the fermentation reaction tank 1, and the fermentation products are taken out from the apparatus system.
  • the microorganism concentration in the apparatus system can be maintained high, enabling highly productive fermentation production.
  • the filtration / separation by the separation membrane element 2 is performed by the differential pressure of the head with respect to the water surface of the fermentation reaction tank 1, and no special power is required. If necessary, the level sensor 6 and the head differential pressure control device 3 can appropriately adjust the filtration speed of the separation membrane element 2 and the amount of fermentation liquid in the fermentation reaction tank 1.
  • microorganisms or cultured cells can be cultured for continuous fermentation in a culture tank and supplied to the fermentation tank as necessary. By culturing microorganisms or cultured cells for continuous fermentation in a culture tank and supplying them into the fermentation tank as needed, continuous fermentation with microorganisms or cultured cells that are always fresh and have a high production capacity for chemical products is possible. It becomes possible, and continuous fermentation with high production performance maintained for a long time becomes possible.
  • a separation membrane element preferably used in the continuous fermentation apparatus used in the method for producing a chemical product of the present invention will be described.
  • the separation membrane element shown in Fig. 3 will be described.
  • a separation membrane and a separation membrane element disclosed in International Publication No. 2002Z064240 pamphlet can be used.
  • the separation membrane element is configured by arranging the flow path material 14 and the separation membrane 15 in this order on both surfaces of a rigid support plate 13.
  • the support plate 13 has recesses 16 on both sides.
  • the separation membrane 15 filters the fermentation broth.
  • the flow path member 14 is for efficiently flowing the permeated water filtered by the separation membrane 15 to the support plate 13.
  • the permeated water that has flowed to the support plate 13 passes through the recess 16 of the support plate 13 and is taken out of the fermentation culture tank through the water collecting pipe 17.
  • methods such as differential pressure at the water head, pump, suction filtration with liquid or gas, or pressurization in the apparatus system can be used.
  • the separation membrane element shown in FIG. 4 is mainly composed of a separation membrane bundle 18 composed of a hollow fiber membrane, an upper resin sealing layer 19 and a lower resin sealing layer 20.
  • the separation membrane bundle is bonded and fixed in a bundle by the upper resin sealing layer 19 and the lower resin sealing layer 20. Adhesion 'immobilization by the lower resin sealing layer seals the hollow part of the hollow fiber membrane and prevents leakage of the fermentation broth.
  • the upper resin sealing layer 19 does not seal the inner hole of the hollow fiber membrane and has a structure in which permeate flows through the water collecting pipe 22.
  • This separation membrane element can be installed in the continuous fermentation apparatus via the support frame 21.
  • the permeated water filtered by the separation membrane bundle 18 passes through the hollow portion of the hollow fiber membrane and is taken out to the outside of the fermentation culture tank through the water collecting pipe 22.
  • water head differential pressure, pump, liquid or gas, etc. For example, suction filtration or pressurizing the inside of the apparatus system can be used.
  • the member constituting the separation membrane element of the continuous fermentation apparatus used in the method for producing a chemical product of the present invention is preferably a member resistant to high-pressure steam sterilization operation. If the inside of the fermentation apparatus can be sterilized, it is possible to avoid the risk of contamination by undesirable microorganisms during continuous fermentation, and more stable continuous fermentation is possible.
  • the members constituting the separation membrane element are preferably resistant to 15 minutes at 121 ° C., which is the condition of high-pressure steam sterilization operation.
  • Separation membrane elements include, for example, metals such as stainless steel and aluminum, polyamide-based resin, fluorine-based resin, polycarbonate-based resin, polyacetal-based resin, polybutylene terephthalate-based resin, PVDF, modified A resin such as polyphenylene ether-based resin or polysulfone-based resin can be preferably selected.
  • the separation membrane element may be installed outside the fermentation tank or in the fermentation tank.
  • a separate membrane separation tank can be installed and a separation membrane element can be installed inside it.
  • the fermentation broth can be continuously filtered.
  • the membrane separation tank is preferably capable of high-pressure steam sterilization. If the membrane separation tank can be autoclaved, it is easy to avoid contamination with various bacteria.
  • the above chemical products include L-lactic acid, D-lactic acid, ethanol, pyruvic acid, succinic acid, 1,3 propanediol, itaconic acid, cadaverine, nucleic acid.
  • a yeast strain capable of producing L-lactic acid was constructed as follows.
  • a yeast strain capable of producing L-lactic acid was constructed by linking the human LDH gene downstream of the PDC1 promoter on the yeast genome.
  • For polymerase 'chain' reaction (PCR), La— Taq (treasure Sake Brewery) or KOD-Plus-polymerase (Toyobo) was used according to the attached instruction manual.
  • Cloning of the Lldh gene was performed by PCR with KOD-Plus-polymerase using the cDNA obtained by the above operation as an amplification cage and using the oligonucleotides represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 as a primer set. .
  • Each PCR amplified fragment was purified, and the end was phosphorylated with T4 Polynucleotide Kinase (manufactured by TAKARA), and then ligated into pUC 118 vector (cut with restriction enzyme Hindi and the cut surface was dephosphorylated). Ligation was performed using DNA Ligation Kit Ver.2 (TAKARA).
  • Escherichia coli DH5a was transformed with the ligation plasmid product, and plasmid DNA was recovered to obtain a plasmid in which various L Idh genes (SEQ ID NO: 3) were subcloned.
  • the obtained pUCl18 plasmid in which the L-ldh gene was inserted was digested with restriction enzymes Xhol and Notl, and each of the obtained DNA fragments was inserted into the XholZNotl cleavage site of the yeast expression vector pTRSll (FIG. 5).
  • a human-derived L-ldh gene expression plasmid pL-ldh5 (L-ldh gene) was obtained.
  • pL-ldh5 which is a human-derived L ldh gene expression vector, is a plasmid alone in the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary Center (Tsukuba Rokuto Ibaraki Pref. 1-1-1 Central No. 6).
  • FERM AP Deposited as 20421 (Deposit date: February 21, 2005).
  • a DNA fragment containing TRP1 gene derived from Saccharomyces cerevisiae of 1.2 kb was obtained by PCR using plasmid pRS424 as an amplification template and oligonucleotides represented by SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7 as a primer set. Amplified. Each DNA fragment was separated by 1.5% agarose gel electrophoresis and purified by a conventional method. The product obtained by PCR using the mixture of the 1.3 kb fragment and the 1.2 kb fragment obtained here as an amplification template and the oligonucleotides represented by SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 7 as a primer set 1.
  • 5% agarose gel electrophoresis was carried out to prepare a 2.5 kb DNA fragment to which human-derived LDH gene and TRP1 gene were linked according to a conventional method.
  • the budding yeast strain NBRC10505 was transformed to tryptophan-unnecessary according to a conventional method.
  • Reaction solution 5 mM p Toluenesulfonic acid, 20 mM Bistris, 0. ImM EDTA-2Na (flow rate 0.8 mL / min
  • L represents the concentration of L-lactic acid
  • D represents the concentration of D-lactic acid
  • PVDF Polyvinylidene fluoride
  • polyvinylidene mold - isopropylidene 13.0 weight 0/0
  • N, N-dimethyl ⁇ Seto amide 70.0 wt 0/0.
  • the porous substrate was peeled off from the glass plate, and then immersed in hot water at a temperature of 80 ° C three times to wash out N, N-dimethylacetamide to obtain a separation membrane.
  • the surface of the porous resin layer was observed with a scanning electron microscope at a magnification of 10,000 within the range of 9.2 ⁇ ⁇ ⁇ 10.4 ⁇ m.
  • the average diameter of all the pores that can be observed is 0.1 ⁇ m.
  • the pure water permeability coefficient of the separation membrane was evaluated. 50 X 10 " 9 mVm 2 -s-Pa. The pure water permeability coefficient was measured using purified water at 25 ° C with a reverse osmosis membrane at a head height of lm.
  • PVDF Polyvinylidene fluoride
  • PEG polyethylene glycol
  • N, N-dimethylacetamide as the solvent
  • non-solvent Pure water was used as a starting material, and these were sufficiently stirred at a temperature of 90 ° C. to obtain a stock solution having the following composition.
  • polyvinylidene mold - isopropylidene 13.0 weight 0/0
  • Polyethylene glycol 5.5% by weight
  • the pure water permeability coefficient was 2 X 10 " 9 mV m 2 's'Pa.
  • the pure water permeability coefficient was measured using purified water at 25 ° C with a reverse osmosis membrane at a head height of lm. .
  • the standard deviation of the average pore diameter was 0.0053 ⁇ m, and the membrane surface roughness was 0.1 m.
  • the porous membrane produced in this way could be suitably used in the present invention.
  • a separation membrane was obtained in the same manner as in Reference Example 3 except that the stock solution having the composition shown below was used.
  • polyvinylidene mold - isopropylidene 13.0 weight 0/0
  • Polyethylene glycol 5.5% by weight
  • the pure water permeability coefficient of this separation membrane was evaluated to be 100 X 10 " 9 mVm 2 -s -Pa.
  • the pure water permeability coefficient was measured using purified water at 25 ° C with a reverse osmosis membrane. The head height was lm.
  • the standard deviation of the average pore diameter was 0.060 ⁇ m, and the membrane surface roughness was 0.08 ⁇ m.
  • the porous membrane thus produced could be suitably used in the present invention.
  • PVDF Polyvinylidene fluoride
  • polyvinylidene mold - isopropylidene 15. 0 wt 0/0
  • the porous substrate was peeled off from the glass plate, and then immersed in hot water at a temperature of 80 ° C. three times to wash out N and N dimethylacetamide to obtain a separation membrane.
  • the surface of the porous resin layer was observed with a scanning electron microscope at a magnification of 10,000 times within a range of 9.2 m X IO.4 m, the average diameter of all observable pores was 0. 008 m.
  • pure water permeation amount with the above separation membrane was 0. 3 X 10- 9 m 3 Zm 2 's' Pa.
  • Water permeability was measured using purified water at 25 ° C with a reverse osmosis membrane and a head height of lm. The standard deviation of the average pore diameter was 0.002 m, and the membrane surface roughness was 0.06 m.
  • L-lactic acid was produced using the continuous fermentation apparatus shown in Fig. 1 and a yeast lactic acid fermentation medium having the composition shown in Table 1. The medium was used after autoclaving (121 ° C, 15 minutes).
  • a separation membrane element member a molded product of stainless steel and polysulfone resin was used.
  • a separation membrane The porous membrane produced in Reference Example 2 was used. The operating conditions in Example 1 are as follows unless otherwise specified.
  • Aeration capacity of membrane separation tank 0.3 (L / min)
  • Lactic acid fermentation medium supply rate Variable control in the range of 50-300mlZhr.
  • Circulating fluid volume by fermentation fluid circulation device 0.1 (L / min)
  • Membrane permeate flow control Flow control by transmembrane pressure difference
  • the yeast SW-1 strain prepared in Reference Example 1 was used as the microorganism, the lactic acid fermentation medium having the composition shown in Table 1 was used as the medium, and Using the HPLC shown, glucose test ⁇ C (Wako Pure Chemical Industries) was used to measure the glucose concentration.
  • the SW-1 strain was cultured overnight in a test tube with 5 ml of lactic acid fermentation medium (cultured in advance).
  • the obtained culture solution was inoculated into 100 ml of a fresh lactic acid fermentation medium, and cultured with shaking at 500 ° C. Roflasco for 24 hours at 30 ° C. (pre-culture).
  • Pre-culture medium is inoculated into a 1.5 L lactic acid fermentation medium of the continuous fermentation apparatus shown in Fig. 1.
  • Stir reaction tank 1 with the attached stirrer 5 to adjust the aeration volume and temperature of reaction tank 1.
  • the culture was performed for 24 hours without adjusting the pH and operating the fermenter circulation pump 10 (pre-culture).
  • the fermenter circulation pump 10 is operated, and in addition to the operating conditions during pre-culture, the membrane separation tank 2 is vented to continuously supply the lactic acid fermentation medium! ⁇ , Continuous culture was performed while controlling the amount of permeated water in the membrane separation type continuous fermentation apparatus so that the amount of fermentation liquid was 2 L, and L-lactic acid was produced by continuous fermentation. Control of the amount of permeated water during the continuous fermentation test was carried out by measuring the head differential as the transmembrane differential pressure with the head differential control device 3 and changing it under the membrane permeate control conditions. Appropriately, the L-lactic acid concentration produced and the residual glucose concentration in the membrane permeation fermentation broth were measured.
  • Table 2 shows the results of a 300-hour continuous fermentation test.
  • Example 2 Production of L-lactic acid by continuous fermentation using yeast (Part 2) Using the porous membrane prepared in Reference Example 3 as the separation membrane, the same L-lactic acid continuous fermentation test as in Example 1 was performed. The results are shown in Table 2. As a result, stable production of L-lactic acid by continuous fermentation was possible. The transmembrane pressure difference during the whole continuous fermentation remained below 2 kPa.
  • the separation membrane As the separation membrane, the porous membrane prepared in Reference Example 4 was used, and the same L-lactic acid continuous fermentation test as in Example 1 was performed. The results are shown in Table 2. As a result, stable production of L-lactic acid by continuous fermentation was possible. The transmembrane pressure difference during the continuous fermentation was 2 kPa or less.
  • L-lactic acid was produced using a continuous fermentation apparatus shown in Fig. 2 and a lactic acid fermentation medium having the composition shown in Table 1. The medium was used after autoclaving (121 ° C, 15 minutes).
  • As the separation membrane element member a molded product of stainless steel and polysulfone resin was used.
  • the porous membrane prepared in Reference Example 1 was used as the separation membrane.
  • the operating conditions in this example are as follows unless otherwise specified.
  • Membrane separation element effective filtration area 120 square cm
  • Aeration volume of fermentation reaction tank 0.05 (L / min)
  • Lactic acid fermentation medium supply rate Variable control in the range of 50-300mlZhr.
  • Membrane permeate flow control Flow control by transmembrane pressure difference
  • the culture tank containing the separation membrane element and the working medium are all 121 ° C and 20 min. High-pressure steam sterilization with autoclave.
  • the SW-1 strain was shaken overnight in a test tube in a 5 ml lactic acid fermentation medium (cultured in advance).
  • the obtained culture solution was inoculated into 100 ml of a fresh lactic acid fermentation medium, and cultured with shaking at 30 ° C. for 24 hours in 500 ml of Rosco 500 ml (pre-culture).
  • Pre-culture medium was inoculated into 1.5 L of lactic acid fermentation medium of the membrane separation type continuous fermentation apparatus shown in Fig. 2, and reaction tank 1 was stirred at 400 rpm with attached stirrer 5 to Aeration, temperature, and pH were adjusted and cultured for 24 hours (pre-culture).
  • the lactic acid fermentation medium is continuously supplied, and the continuous culture is performed while controlling the amount of permeate through the membrane so that the amount of fermentation liquid in the membrane separation type continuous fermentation apparatus is 1.5 L. Lactic acid was produced. Control of the amount of permeated water during the continuous fermentation test was carried out by measuring the head differential as a transmembrane differential pressure by the head differential control device 3 and changing it under the above-mentioned membrane permeate control conditions. The produced L-lactic acid concentration and residual glucose concentration in the membrane permeation fermentation broth were measured appropriately. Table 2 shows the L-lactic acid to sugar yield and the L-lactic acid production rate in which the L-lactic acid and the glucose concentration power calculated were also calculated.
  • Example 4 Using the porous membrane produced in Reference Example 3 as the separation membrane, the same L-lactic acid continuous fermentation test as in Example 4 was performed. The results are shown in Table 2. As a result, stable production of L-lactic acid by continuous fermentation was possible. The transmembrane pressure difference during the whole continuous fermentation remained below 2 kPa.
  • the porous membrane prepared in Reference Example 4 was used as the separation membrane, and the same L-lactic acid series as in Example 5 was used. A secondary fermentation test was conducted. The results are shown in Table 2. As a result, stable production of L-lactic acid by continuous fermentation was possible. The transmembrane pressure difference during the whole continuous fermentation remained below 2 kPa.
  • Reactor capacity (lactic acid fermentation medium volume): 1 (L)
  • pH adjustment Adjust to pH 5 with IN NaOH.
  • the SW-1 strain was cultured with shaking in a 5 ml lactic acid fermentation medium overnight in a test tube (pre-culture).
  • the culture solution was inoculated into 100 ml of fresh lactic acid fermentation medium and cultured with shaking in a 500 ml Sakaguchi flask for 24 hours (pre-culture).
  • the preculture was inoculated into a 1.5 L lactic acid fermentation medium of a membrane separation type continuous fermentation apparatus, the reaction tank 1 was stirred at lOOrpm with the attached stirrer 5, and the reaction tank 1 was aerated. Temperature adjustment and pH adjustment were carried out, and batch fermentation culture was performed without operating the fermentation liquid circulation pump 10.
  • the amount of bacterial cell growth at this time was 14 in terms of absorbance at 600 nm.
  • the results of batch fermentation are shown in Table 2.
  • the separation membrane use the porous membrane with a small pore diameter and small pure water permeability coefficient prepared in Reference Example 5, and control the flow rate of membrane permeate through the transmembrane differential pressure (total continuous fermentation time 0. Ik Pa or more The control was carried out in the same manner as in Example 1 except that the control was performed at 20 kPa or less.
  • the separation membrane use the porous membrane with a small pore diameter and small pure water permeability coefficient prepared in Reference Example 5, and control the flow rate of membrane permeate through the transmembrane differential pressure (total continuous fermentation time 0. Ik Pa or more The control was carried out in the same manner as in Example 4 except that the control was performed at 20 kPa or less.
  • Ethanol was produced using the continuous fermentation apparatus in Fig. 1 and an ethanol fermentation medium with the composition shown in Table 3. The medium was used after autoclaving (121 ° C, 15 minutes). As the separation membrane, the porous membrane prepared in Reference Example 2 was used. The operating conditions in this example are as follows unless otherwise specified.
  • Membrane separation element effective filtration area 120 square cm
  • Aeration capacity of membrane separation tank 0.3 (L / min)
  • Ethanol fermentation medium supply rate Variable control in the range of 50-300mlZhr.
  • Circulating fluid volume by fermentation fluid circulation device 0.1 (L / min)
  • Membrane permeate flow control Flow control by transmembrane pressure difference
  • the NBRC10505 strain was used as the microorganism, the ethanol fermentation medium having the composition shown in Table 1 was used as the medium, and the ethanol concentration was quantified by gas chromatography for evaluation of the concentration of the ethanol product.
  • glucose test KO-C (Wako Pure Chemical Industries) was used for measuring the glucose concentration.
  • the NBRC10505 strain was cultured in a test tube with 5 ml of ethanol fermentation medium by shaking (pre-culture).
  • the obtained culture solution was inoculated into 100 ml of a fresh ethanol fermentation medium and cultured with shaking in a 500 ml volumetric flask at 30 ° C. for 24 hours (pre-culture).
  • Pre-culture medium is inoculated into 1.5 L ethanol fermentation medium of membrane separation type continuous fermentation equipment shown in Fig. 1 and reaction Tank 1 was agitated at lOOrpm with the attached stirrer 5, adjusted the aeration volume of the reaction tank 1, adjusted the temperature, adjusted the pH, and cultured for 24 hours without operating the fermenter circulation pump 10 (previous) culture).
  • the fermentation liquid circulation pump 10 is operated, in addition to the operating conditions during pre-culture, the membrane separation tank 2 is vented, the ethanol fermentation medium is continuously supplied, and the fermentation liquid of the membrane separation type continuous fermentation apparatus Continuous culture was carried out while controlling the amount of permeate through the membrane so that the volume was 2 L, and ethanol was produced by continuous fermentation.
  • Control of the membrane permeate amount when performing the continuous fermentation test was performed by measuring the water head difference as the transmembrane differential pressure by the water head difference control device 3 and changing it under the above-mentioned membrane permeate water amount control conditions.
  • Table 4 shows the results of measurement of the ethanol concentration and residual glucose concentration produced in the membrane permeation fermentation broth as appropriate.
  • Ethanol was produced using the continuous fermentation apparatus shown in Fig. 2 and the ethanol fermentation medium having the composition shown in Table 3. The medium was used after autoclaving (121 ° C, 15 minutes).
  • As the separation membrane element member a molded product of stainless steel and polysulfone resin was used.
  • the porous membrane produced in Reference Example 2 was used as the separation membrane.
  • the operating conditions in this example are as follows unless otherwise specified.
  • Membrane separation element effective filtration area 120 square cm
  • Aeration volume of fermentation reaction tank 0.05 (L / min)
  • Lactic acid fermentation medium supply rate Variable control in the range of 50-300mlZhr.
  • Membrane permeate flow control Flow control by transmembrane pressure difference
  • Sterilization All culture tanks containing separation membrane elements and medium used are autoclaved at 121 ° C for 20 min.
  • the yeast NBRC10505 strain was used as the microorganism, the ethanol fermentation medium having the composition shown in Table 2 was used as the medium, and the concentration of ethanol as a product was evaluated by measuring the glucose concentration using the gas chromatograph shown in Example 7.
  • Glucose test ⁇ C (Wako Pure Chemical Industries) was used.
  • the NBRC10505 strain was cultured in a test tube with 5 ml of ethanol fermentation medium by shaking (pre-culture).
  • the obtained culture solution was inoculated into 100 ml of a fresh ethanol fermentation medium and cultured with shaking in a 500 ml volumetric flask at 30 ° C. for 24 hours (pre-culture).
  • Pre-culture medium was inoculated into 1.5 L of lactic acid fermentation medium of the membrane separation type continuous fermentation apparatus shown in Fig. 2, and reaction tank 1 was stirred at 400 rpm with attached stirrer 5 and the aeration volume of reaction tank 1 After adjusting the temperature, adjusting the temperature and adjusting the pH, the cells were cultured for 24 hours (pre-culture).
  • the ethanol fermentation medium is continuously supplied, and the amount of permeated water in the membrane separation type continuous fermentation equipment is controlled to 1.5 L! Ethanol was produced.
  • Control of the amount of permeated water when performing the continuous fermentation test was performed by measuring the water head difference as the transmembrane differential pressure by the water head difference control device 3, and changing it under the above-mentioned membrane permeated water control conditions. Where appropriate, the ethanol concentration produced and the residual glucose concentration in the membrane permeation fermentation broth were measured.
  • Table 4 shows the ethanol-to-sugar yield and ethanol production rate calculated from the ethanol and the glucose input, in which the glucose concentration power was also calculated.
  • the most typical batch fermentation was performed using microorganisms, and ethanol productivity was evaluated.
  • ethanol fermentation medium shown in Table 3 a batch fermentation test was conducted using only the reaction tank 1 of the membrane separation type continuous fermentation apparatus of FIG. The medium is autoclaved (121 ° C, 15 minutes).
  • strain NBRC10505 was used as a microorganism, the concentration of ethanol as a product was evaluated using the gas chromatography shown in Example 6, and the glucose concentration was measured using a glucose test. (Wako Pure Chemical Industries) was used.
  • the operating conditions of this comparative example are shown below.
  • Reactor capacity (ethanol fermentation medium volume): 1 (L)
  • pH adjustment Adjust to pH 5 with IN NaOH.
  • the NBRC10505 strain was shake-cultured in a test tube in 5 ml of ethanol fermentation medium (pre-culture). O The pre-culture was inoculated into 100 ml of fresh ethanol fermentation medium and placed in a 500 ml Sakaguchi flask. Cultured with shaking for 24 hours (preculture). The preculture was inoculated into a 1.5 L ethanol fermentation medium of a membrane-separated continuous fermentation apparatus, the reaction tank 1 was stirred at lOO rpm with the attached stirrer 5 and the reaction tank 1 was vented. Temperature adjustment and pH adjustment were performed, and batch fermentation culture was performed without operating the fermenter circulation pump 10. The amount of bacterial cell growth at this time was 18 in terms of absorbance at 600 nm. The results of batch fermentation are shown in Table 4.
  • Membrane separation element effective filtration area 120 square cm
  • Fermentation reactor aeration rate 1.5 (L / min)
  • the culture tank containing the separation membrane element and the medium used are all autoclaved at 121 ° C for 20 min under high pressure steam sterilization.
  • Toluropsis glabrata P120-5a strain (FERM P-16745) was used as a microorganism, and a pyruvic acid fermentation medium having the composition shown in Table 5 was used as a medium. It measured by HPLC method on the conditions shown in.
  • Reaction solution 5 mM p-toluenesulfonic acid, 20 mM Bistris, 0. ImM EDTA '2Na (flow MO. 8 mL / min
  • glucose test KO-C (Wako Pure Chemical Industries) was used for measuring the glucose concentration.
  • the P120-5a strain was cultured overnight in a test tube with 5 ml of pyruvic acid fermentation medium overnight (pre-culture).
  • the obtained culture broth was inoculated into 100 ml of a fresh pyruvate fermentation medium, and cultured with shaking in a 500 ml volumetric flask for 24 hours at 30 ° C (pre-culture).
  • the culture solution was inoculated in a 1.5 L pyruvic acid fermentation medium of the membrane-separated continuous fermentation apparatus shown in Fig. 1, and the fermentation reaction tank 1 was stirred at 800 rpm with the attached stirrer 5 to give a fermentation reaction tank. After adjusting the aeration volume, adjusting the temperature, and adjusting the pH, the culture was performed for 24 hours (pre-culture).
  • the fermentation liquid circulation pump is operated, in addition to the operating conditions at the time of pre-culture, the membrane separation tank 2 is vented and the pyruvic acid fermentation medium is continuously supplied.
  • Continuous culture was performed while controlling the amount of permeate through the membrane so that the liquid volume was 2 L, and pyruvic acid was produced by continuous fermentation.
  • Control of the amount of water permeating when performing the continuous fermentation test was carried out by measuring the water head difference as the transmembrane differential pressure using 3 heads of the water head difference control device and changing it under the conditions for controlling the amount of water permeated through the membrane.
  • the produced pyruvic acid concentration and residual glucose concentration in the membrane permeation fermentation broth were measured appropriately. Table 6 shows the results of a 300-hour fermentation test.
  • Pyruvate was produced using the continuous fermentation apparatus shown in Fig. 2 and the pyruvate fermentation medium having the composition shown in Table 5. The medium was used after autoclaving (121 ° C, 15 minutes).
  • As the separation membrane element member a molded product of stainless steel and polysulfone resin was used.
  • the porous membrane produced in Reference Example 2 was used as the separation membrane.
  • the operating conditions in this example are as follows unless otherwise specified.
  • Membrane separation element effective filtration area 120 square cm
  • Fermentation reactor aeration rate 1 (L / min)
  • Lactic acid fermentation medium supply rate Variable control in the range of 50-300mlZhr.
  • Membrane permeate flow control Flow control by transmembrane pressure difference.
  • the culture tank containing the separation membrane element and the culture medium used are all autoclaved at 121 ° C for 20 min.
  • Toluropsis glabrata strain P120-5a (FERM P-16745) was used as a microorganism, and a pyruvic acid fermentation medium having the composition shown in Table 5 was used as a medium. It measured by HPLC method on the conditions shown in.
  • the P120-5a strain was cultured with shaking in a 5 ml pyruvic acid fermentation medium overnight in a test tube (pre-culture).
  • the obtained culture broth was inoculated into 100 ml of fresh pyruvate fermentation medium, and 500 The culture was shaken at 30 ° C for 24 hours in a ml-volume flask (pre-culture).
  • Pre-culture medium is inoculated into 1.5 L of lactic acid fermentation medium of the membrane-separated continuous fermentation apparatus shown in Fig. 2, and reaction tank 1 is stirred at 800 rpm with the attached stirrer 5 and aeration in reaction tank 1 The amount was adjusted, the temperature was adjusted, and the pH was adjusted, and cultured for 24 hours (pre-culture).
  • the pyruvate fermentation medium is continuously supplied, and the amount of permeated water in the membrane separation type continuous fermentation equipment is controlled to 1.5 L! Produced pyruvic acid.
  • Control of the amount of permeated water when performing the continuous fermentation test was performed by measuring the water head difference as the transmembrane differential pressure by the water head difference control device 3 and changing it under the above-mentioned membrane permeated water amount control conditions.
  • the produced pyruvic acid concentration and residual glucose concentration in the membrane permeation fermentation broth were measured as appropriate.
  • Table 6 shows the yield of lactic acid versus sugar and the lactic acid production rate calculated from the input glucose in which the pyruvic acid and glucose concentration power were also calculated.
  • the NBRC0005 strain was used as the microorganism using the continuous fermentation apparatus of FIG. 1, and all other conditions were the same as in Example 9.
  • Table 6 shows the results of continuous fermentation. As a result of 300 hours fermentation test, stable production of pyruvic acid by continuous fermentation was possible by the method for producing a chemical product of the present invention using the continuous fermentation apparatus shown in FIG. The transmembrane pressure difference during the whole continuous fermentation remained below 2 kPa.
  • the NBRC0005 strain was used as the microorganism using the continuous fermentation apparatus of FIG. 2, and all other conditions were the same as in Example 10.
  • Table 6 shows the results of continuous fermentation. As a result of 300 hours fermentation test, stable production of pyruvic acid by continuous fermentation was possible by the method for producing a chemical product of the present invention using the continuous fermentation apparatus shown in FIG. The transmembrane pressure difference during the continuous fermentation remained below 2 kPa.
  • the most typical batch fermentation using microorganisms To evaluate pyruvic acid productivity.
  • the medium shown in Table 5 was used as the medium, and autoclaved (121 ° C, 15 minutes).
  • the strain P120 5a was used as the microorganism, and HPLC shown in Example 9 was used to evaluate the concentration of the product pyruvic acid.
  • Test ⁇ ⁇ ⁇ C (Wako Pure Chemical Industries) was used. The operating conditions of this comparative example are shown below.
  • Fermentation reactor capacity (Pyruvate fermentation medium volume): 1 (L)
  • Fermentation reactor aeration rate 1 (L / min)
  • pH adjustment Adjust to pH 5.5 with 4N NaOH.
  • the P120-5a strain was cultured with shaking in a 5 ml pyruvic acid fermentation medium overnight in a test tube (pre-culture).
  • the culture solution was inoculated into 50 ml of fresh pyruvate fermentation medium and cultured with shaking in a 500 ml Sakaguchi flask for 24 hours (pre-culture).
  • the preculture was inoculated into 1 L pyruvate fermentation medium of a jar mentor, and batch fermentation was performed. The results of batch fermentation are shown in Table 6.
  • the production rate of binic acid was greatly improved.
  • Succinic acid was produced using the continuous fermentation apparatus shown in Fig. 1.
  • succinic acid and glucose in the production of succinic acid were measured by the following methods.
  • Succinic acid was analyzed by HPLC (Shimadzu LC10A, RI monitor: RID-10A, column: Aminex HPX-87H) for the supernatant of the culture broth.
  • HPLC Shimadzu LC10A, RI monitor: RID-10A, column: Aminex HPX-87H
  • Column temperature is 50 ° C, equilibrate the column with O.OIN H SO, and then inject the sample.
  • the measurement was performed using a sub-measuring instrument.
  • the medium used was autoclaved (121 ° C, 15 minutes).
  • the porous membrane produced in Reference Example 2 was used as the separation membrane.
  • the operating conditions in this example are as follows unless otherwise specified.
  • Lactic acid fermentation medium supply rate Variable control in the range of 50-300mlZhr.
  • Circulating fluid volume by fermentation fluid circulation device 0.1 (L / min)
  • Membrane permeate flow control Flow control by transmembrane pressure difference.
  • Anaerobiospirillumsa Succinic acid produced by Anaerobiospirillum succiniciproducens ATCC53488 was continuously produced. 20g / L glucose, 10g / L polypeptone, 5g / L fermentation mother extract, 3g / LK HPO, lg / L NaCl, lg / L (NH) SO, 0.2g / L MgCl, 0.2
  • ATCC53488 strain was inoculated and left to stand at 39 ° C. (pre-culture). After adding 5 mL of a reducing solution consisting of 0.25 g / L cysteine 'HC1, 0.25 g / L Na S-9 H 2 O to a 1.5 L succinic acid fermentation medium (Table 7) of the continuous fermentation apparatus shown in Figure 1, Cultivated
  • P-Aminobenzoic acid 500 g / L Vitamin B 6 1 jUg / L Yeast extract 5.0 g / L Corn steep liquor 10.0 g / L Polypeptone 1 g / L
  • Succinic acid was produced using the continuous fermentation apparatus shown in Fig. 2.
  • the medium used was autoclaved (121 ° C, 15 minutes).
  • the succinic acid and glucose concentrations were measured in the same manner as in Example 13.
  • the porous membrane prepared in Reference Example 2 was used as the separation membrane. Unless otherwise specified, the operating conditions in this example are as follows.
  • Membrane separation element effective filtration area 120 square cm
  • Fermentation reactor CO aeration rate 10 (mL / min)
  • Lactic acid fermentation medium supply rate Variable control in the range of 50-300mlZhr
  • Membrane permeate flow control Flow control by transmembrane pressure difference.
  • the culture tank containing the separation membrane element and the culture medium used are all autoclaved at 121 ° C for 20 min.
  • Anaerobiospirillumsa Succinic acid produced by Anaerobiospirillum succiniciproducens ATCC53488 was continuously produced. 20g / L glucose, 10g / L polypeptone, 5g / L fermentation mother extract, 3g / LK HPO, lg / L NaCl, lg / L (NH) SO, 0.2g / L MgCl, 0.2
  • the strain ATCC53488 was inoculated and left to stand at 39 ° C for 1 hour (pre-culture). After adding 5 mL of a reducing solution consisting of 0.25 g / L cystine 'HC1 and 0.25 g / L Na S-9 H 2 O to a 5 L succinic acid fermentation medium (Table 7) of the continuous fermentation apparatus shown in Fig. 2. , Culture before
  • the succinic acid fermentation medium is continuously supplied, and the continuous culture is performed while controlling the amount of permeate through the membrane so that the amount of the fermentation broth in the membrane separation type continuous fermentation apparatus becomes 1.5 L.
  • Succinic acid was produced by fermentation.
  • the amount of water permeated through the membrane during the continuous fermentation test is controlled by the head differential controller 3 so that the head difference is appropriately adjusted so that the head of the fermentation reaction tank is within 2 m at maximum, that is, the transmembrane pressure difference is within 0.1 to 20 kPa. It was done by letting.
  • the produced succinic acid concentration and residual glucose concentration in the membrane permeation fermentation broth were measured appropriately.
  • Table 8 shows the production rate of succinic acid and the yield of succinic acid in which the succinic acid and glucose concentration power were also calculated.
  • the transmembrane pressure difference during the whole period of all continuous fermentation was kept below 2 kPa.
  • Seed culture consisting of L NaCl, lg / L (NH) SO, 0.2 g / L MgCl, 0.2 g / L CaCl
  • the culture medium lOOmL was placed in a 125 mL Erlenmeyer flask and sterilized by heating. In an anaerobic glove box, add 30MmNa CO 1mL and 180mMH SO 0.15mL, and add 0.25g / L Cystein 'HC1, 0.25g / L Na S
  • Succinic acid was produced using the continuous fermentation apparatus shown in Fig. 1.
  • the succinic acid and darose concentrations were measured in the same manner as in Example 13.
  • the medium used was autoclaved (121 ° C, 15 minutes).
  • the porous membrane produced in Reference Example 2 was used as the separation membrane.
  • the operating conditions in the present example are the same as those in Example 13 except for the following membrane permeate control.
  • Membrane permeate flow control Flow control by transmembrane pressure difference.
  • succinic acid was continuously produced using Actinobacillus succinogenes ATCC55618 as a microorganism capable of producing succinic acid.
  • Succinic acid was produced using the continuous fermentation apparatus shown in Fig. 2.
  • the medium used was autoclaved (121 ° C, 15 minutes).
  • the succinic acid and glucose concentrations were measured in the same manner as in Example 13.
  • the porous membrane produced in Reference Example 2 was used as the separation membrane.
  • the operating conditions in this example are the same as those in Example 14 except for the following membrane permeate control.
  • Membrane permeate flow rate control Flow rate control by transmembrane pressure difference.
  • succinic acid was continuously produced using Actinobacillus succinogenes ATCC55618 as a microorganism capable of producing succinic acid.
  • the fermentation tank CO aeration is 75mLZmin and pH adjustment is 5.
  • the sample was placed in a 00 mL sea ram test tube, purged with CO, and then heat sterilized. in advance
  • 7.5 mL of ATCC55618 strain suspension that had been cryopreserved was inoculated and cultured at 37 ° C for 24 hours to prepare a seed culture (pre-culture).
  • a continuous fermentation apparatus shown in Fig. 2 was charged with 1.5 L of succinic acid fermentation medium (Table 7), inoculated with 75 mL of the previous culture, and cultured for 24 hours while adjusting the pH to 6.8. (Pre-culture).
  • the succinic acid fermentation medium listed in Table 9 The succinic acid was produced by continuous fermentation while controlling the amount of permeate through the membrane so that the amount of fermentation liquid in the membrane separation type continuous fermentation apparatus in Fig. 2 was 1.5 L.
  • the sample was placed in a sealum test tube, replaced with CO, and sterilized by heating. Raise and freeze
  • Example 17 Continuous production of succinic acid by continuous fermentation (Part 5) Succinic acid was produced using the continuous fermentation apparatus shown in Fig. 1. The succinic acid and darose concentrations were measured in the same manner as in Example 13. The medium used was autoclaved (121 ° C, 15 minutes). The porous membrane produced in Reference Example 2 was used as the separation membrane. The operating conditions in the present example are the same as those in Example 13 except for the following membrane permeate control.
  • Membrane permeate flow rate control Flow rate control by transmembrane pressure difference.
  • succinic acid was continuously produced using Escherichia coli B strain ATCC11303 as a microorganism capable of producing succinic acid.
  • E. coli 12g / L glucose, 10g / L polypeptone, 5g / L yeast extract, lg / L K H
  • ATCC11303 strain was inoculated in an anaerobic glove box and left to stand at 37 ° C for 1 hour (pre-culture).
  • continuous fermentation apparatus shown in Fig. 1 12 g / L glucose, 1 Og / L polypeptone, 5 g / L yeast extract, lg / L K HPO, lg / L NaCl, 0.2 g / L Mg
  • a succinic acid fermentation medium consisting of CI (1.5 L) was charged, and 150 mL of the culture solution was inoculated before. Cultivation
  • Succinic acid was produced using the continuous fermentation apparatus shown in Fig. 2.
  • the medium used was autoclaved (121 ° C, 15 minutes).
  • the succinic acid and glucose concentrations were measured in the same manner as in Example 13.
  • the porous membrane produced in Reference Example 2 was used as the separation membrane.
  • the operating conditions in this example are the same as those in Example 14 except for the following membrane permeate control.
  • Membrane permeate flow control Flow control by transmembrane pressure difference
  • Escherichia coli was used as a microorganism capable of producing succinic acid.
  • the strain was inoculated and left to stand at 37 ° C for 1 hour (pre-culture).
  • E. coli B strain Escherichia coli B ATCC 11303 strain was inoculated and incubated at 37 ° C for one hour. Fermentation medium consisting of 12g / L glucose, 10g / L polypeptone, 5g / L yeast extract, lg / L K HPO, lg / L NaCl, 0.2g / L MgCl 1
  • the degree was adjusted to 37 ° C.
  • the seed culture lOOmL was inoculated, stirred at 600 rpm using the attached stirring blade, and cultured while adjusting the pH to 6.8 with 5.5 M NaCO. Dal in culture
  • Example 1 Fermentation time (hr) 36 200 1 80 Input glucose (g) 32 732 850 Succinic acid produced (g) 3 72 81 Unused glucose (g) 0 1 2 40 Yield ( g / g) 0.1 0.1 0.1 Production rate (g / L / hr) 0.09 0.24 0.30
  • 1,3-propanediol was produced using the continuous fermentation apparatus shown in FIG. 1 and a 1,3-propanediol production medium having the composition shown in Table 13.
  • RI detection glucose
  • glycerol 1,3-propanediol
  • UV and RI detection trimethylacetic acid
  • a derivative of the sample was subjected. 1. To an OmL sample (eg culture supernatant), 30 ⁇ L of concentrated (70% ⁇ ) perchloric acid was added. After mixing, the sample was lyophilized. A 1: 1 mixture of bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamide: pyridine (300 ⁇ L) was added to the lyophilized material, mixed vigorously and placed at 65 ° C. for 1 hour. The sample was cleared by removing insoluble material by centrifugation. The resulting liquid was divided into two phases, and the upper phase was used for analysis.
  • the medium was used after autoclaving (121 ° C, 15 minutes).
  • As the separation membrane element member a molded product of stainless steel and polysulfone resin was used.
  • the porous membrane prepared in Reference Example 2 was used as the separation membrane.
  • the operating conditions in this example are as follows unless otherwise specified.
  • Membrane separation element effective filtration area 120 square cm
  • Aeration volume of fermentation reactor 0.6 (LZmin) nitrogen gas
  • Membrane permeate flow control Flow control by transmembrane pressure difference
  • Klebsiella pneumoniae ATCC 25955 strain was used as the microorganism, and 1,3-propanediol production medium with the composition shown in Table 13 was used as the medium. The evaluation of was measured by the HPLC method described above.
  • Glucose test ⁇ C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used for measuring the glucose concentration.
  • Klebsiella pneumoniae ATCC 25955 strain was cultured overnight in a test tube with 5 ml of 1,3-propandiol production medium overnight (pre-culture).
  • the obtained culture broth was inoculated into 50 ml of a fresh 1,3-propanediol production medium and cultured with shaking in a 500 ml volumetric flask at 30 ° C. for 24 hours (pre-culture).
  • Pre-culture medium was inoculated into 1.5 L of 1,3-propanediol production medium of the membrane-separated continuous fermentation apparatus shown in Fig.
  • the fermentation reaction tank 1 was stirred at 800 rpm with the attached stirrer 5 Then, the amount of aeration in the fermentation reaction tank 1 was adjusted, the temperature was adjusted, and the pH was adjusted, and cultured for 24 hours (pre-culture). Immediately after completion of the pre-culture, Operate the ring pump, vent the membrane separation tank 2 in addition to the operating conditions during pre-culture, and continuously supply 1,3-pumpan diol production medium (glycerol concentration is lOOgZL)! The culture broth was continuously cultured while controlling the amount of permeated water so that the amount of fermentation broth became 1.5 L, and 1,3-propanediol was produced by continuous fermentation.
  • 1,3-pumpan diol production medium glycerol concentration is lOOgZL
  • Control of the amount of permeated water in the continuous fermentation test was performed by measuring the head differential as the transmembrane pressure difference with the head differential control device 3 and changing it under the membrane permeate control conditions. Where appropriate, the concentration of 1,3-propanediol produced and the residual glucose concentration in the membrane permeation fermentation broth were measured. In addition, Table 14 shows the production rate of 1,3-propanediol calculated from the 1,3-propanediol and input glycerol.
  • 1,3-propanediol was produced using the continuous fermentation apparatus shown in FIG. 2 and a 1,3-propanediol production medium having the composition shown in Table 13.
  • the medium was used after autoclaving (121 ° C, 15 minutes).
  • As the separation membrane element member a molded product of stainless steel and polysulfone resin was used.
  • the porous membrane produced in Reference Example 2 was used as the separation membrane.
  • the operating conditions in this example are as follows unless otherwise specified.
  • Membrane separation element effective filtration area 120 square cm
  • Aeration volume of fermentation reactor 0.6 (LZmin) nitrogen gas
  • Klebsiella pneumoniae ATCC 25955 was used as the microorganism, 1,3-propanediol production medium having the composition shown in Table 9 was used as the medium, and the concentration of 1,3-propandiol as the product Evaluation was carried out by HPLC method. In addition, the glucose concentration was measured using Gnolecose Test Sakai C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • Klebsiella pneumoniae ATCC 25955 strain was cultured overnight in a test tube with 5 ml of 1,3-propandiol production medium overnight (pre-culture).
  • the obtained culture broth was inoculated into 50 ml of a fresh 1,3-propanediol production medium and cultured with shaking in a 500 ml volumetric flask at 30 ° C. for 24 hours (pre-culture).
  • Pre-culture medium was inoculated into 1.5 L of 1,3-propanediol production medium of the membrane-separated continuous fermentation apparatus shown in Fig.
  • Control of the amount of water permeated through the continuous fermentation test was performed by measuring the water head difference as the transmembrane pressure difference with the water head difference control device 3 and changing it under the above-mentioned conditions for controlling the amount of water permeated through the membrane.
  • concentration of 1,3-propanediol produced and the residual glucose concentration in the membrane permeation fermentation broth were measured.
  • Table 1 shows the production rate of 1,3-propane diol for which the 1,3-propanediol and the input glycerol power were also calculated.
  • the most typical type of fermentation using microorganisms is a 2L jar -Mentor was used to evaluate 1,3 propanediol productivity.
  • the medium was used after high-pressure steam sterilization (121 ° C, 15 minutes).
  • Klebsiella pneumoniae ATCC 25955 was used as the microorganism, the concentration of the product 1,3 propanediol was evaluated using HPLC, and the glucose test was performed using glucose test Drug).
  • the operating conditions of Comparative Example 10 are shown below.
  • Fermentation reactor capacity (1, 3 propanediol production medium volume): 1.0 (L)
  • Aeration volume of fermentation reactor 0.4 (LZmin) nitrogen gas
  • pH adjustment Adjust to pH 7.0 with 5N NaOH.
  • Klebsiella pneumoniae ATCC 25955 strain was cultured in a test tube with shaking overnight in 5 ml of 1,3-propandiol production medium (pre-culture).
  • the previous culture was inoculated into 50 ml of fresh 1,3-propanediol production medium and cultured with shaking in a 500 ml Sakaro flask for 24 hours (pre-culture).
  • the preculture was inoculated into 1.5 L of 1,3 propanediol production medium of a jar mentor.
  • 1,3 Propanediol production medium (Glycerol concentration was 5 OOgZU, glycerol concentration was continuously supplied from OgZL to lOgZL, and fedbatch fermentation was performed. The results are shown in Table 14.
  • Example 21 Production of Itaconic Acid by Continuous Fermentation (Part 1) Itaconic acid was produced using the continuous fermentation apparatus shown in Fig. 1. The medium shown in Table 15 was used as the medium, and autoclaved (121 ° C, 15 minutes). Stainless steel and polysulfone resin molded products were used as separation membrane element members. The porous membrane prepared in Reference Example 2 was used as the separation membrane. The operating conditions in this example are as follows unless otherwise specified.
  • Membrane separation element effective filtration area 120 square cm
  • Fermentation reactor aeration rate 1.5 (L / min)
  • the culture tank containing the separation membrane element and the culture medium used are all autoclaved at 121 ° C for 20 min.
  • Membrane permeate flow control Flow rate is controlled by the difference in water head of the membrane
  • Aspergillus terreus ATCC 10020 is used as the microorganism, itaconic acid fermentation medium having the composition shown in Table 11 is used as the culture medium, and the concentration of the product itaconic acid is determined by the method of Koppeshaar. (Kyoritsu Shuppan, Microbiology Optics Course No. 5 “Must Utilization Industry” P 72-73, published in 1951). For the measurement of glucose concentration, Glucose Test Toko C (Wako Pure Chemical Industries) was used.
  • the Aspergillus terreus ATCC10020 strain was cultured overnight in a test tube with 5 ml of the preculture medium shown in Table 15 (previously cultured).
  • the obtained culture solution was inoculated into 100 ml of a fresh preculture medium, and cultured with shaking at a temperature of 35 ° C. for 48 hours in a 500 ml volumetric flask (pre-culture).
  • the culture solution was inoculated in a 1.5L continuous batch culture medium of the membrane separation type continuous fermentation apparatus shown in Fig. 1 and the fermentation reaction tank 1 was stirred at 200 rpm with the attached stirrer 5 to give the fermentation reaction tank 1
  • the aeration volume and temperature were adjusted, and culture was performed for 24 hours (pre-culture).
  • the fermenter circulation pump is operated, in addition to the operating conditions at the time of pre-culture, the membrane separation tank 2 is vented, the itaconic acid fermentation medium is continuously supplied, and the fermentation broth of the membrane separation type continuous fermentation apparatus It was continuously cultured while controlling the amount of permeate through the membrane so that the volume was 2 L, and itaconic acid was produced by continuous fermentation.
  • the control of the amount of permeated water during the continuous fermentation test was performed by measuring the head differential as a transmembrane differential pressure with the head differential control device 3 and changing it under the membrane permeate control conditions. The produced itaconic acid concentration and residual glucose concentration in the membrane permeation fermentation broth were measured appropriately.
  • Table 16 shows the itaconic acid production rate in which the input glucose force calculated from the itaconic acid and glucose concentrations was also calculated.
  • Itaconic acid was produced using the continuous fermentation apparatus shown in Fig. 2.
  • the medium shown in Table 15 was used as the medium, and autoclaved (121 ° C, 15 minutes).
  • Separation membrane element As the material, a molded product of stainless steel and polysulfone resin was used.
  • the porous membrane prepared in Reference Example 2 was used as the separation membrane.
  • the operating conditions in this example are as follows unless otherwise specified.
  • Membrane separation element effective filtration area 120 square cm
  • Fermentation reactor aeration rate 1.5 (L / min)
  • the culture tank containing the separation membrane element and the culture medium used are all autoclaved at 121 ° C for 20 min.
  • Membrane permeate flow control Flow rate is controlled by the difference in water head of the membrane
  • Aspergillus terreus ATCC10020 strain was used as the microorganism, itaconic acid fermentation medium having the composition shown in Table 11 was used as the medium, and the concentration of itaconic acid as the product was determined by the method shown in Example 17. It was measured. For the measurement of glucose concentration, Dulose Test ⁇ C (Wako Pure Chemical Industries) was used.
  • the Aspergillus terreus ATCC10020 strain was cultured overnight in a test tube with 5 ml of the preculture medium shown in Table 15 (pre-culture).
  • the obtained culture solution was inoculated into 100 ml of a fresh preculture medium, and cultured with shaking at a temperature of 35 ° C. for 48 hours in a 500 ml volumetric flask (pre-culture).
  • Pre-culture medium is inoculated into a 1.5 L continuous' batch fermentation medium of the continuous fermentation apparatus shown in Fig. 2, and the fermentation reaction tank 1 is stirred at 200 rpm with the attached stirrer 5 and the aeration in the fermentation reaction tank 1 The amount was adjusted and the temperature was adjusted and cultured for 24 hours (pre-culture).
  • the continuous fermentation batch medium is continuously supplied and the continuous fermentation apparatus is continuously cultured while controlling the amount of permeated water so that the amount of the fermentation broth is 1.5 L.
  • Taconic acid was produced. Control of the amount of permeated water during the continuous fermentation test was carried out by measuring the head differential as a transmembrane differential pressure by the head differential control device 3 and changing it under the above-mentioned membrane permeate control conditions. The produced itaconic acid concentration and residual glucose concentration in the membrane permeation fermentation broth were measured appropriately. In addition, Table 16 shows the itaconic acid production rate in which the input glucose force was also calculated.
  • Fermentation reactor capacity (Itaconic acid fermentation medium volume): 1.5 (L)
  • Fermentation reactor aeration rate 1.5 (L / min)
  • pH adjustment Adjust to pH 5 with 4N NaOH.
  • ATCC10020 strain was cultured in a test tube in 5 ml of the preculture medium shown in Table 1 and shaken (preculture). O The preculture was inoculated into 50 ml of fresh preculture medium, and the volume was 500 ml. Cultured with shaking at Sakaguchi Frasco for 48 hours. The preculture was inoculated in a continuous batch fermentation medium shown in Table 15 of 1.5 L of a jar mentor, and batch fermentation was performed. The results of batch fermentation are shown in Table 16.
  • Cadaverine was produced using the continuous fermentation apparatus shown in Fig. 1 and the cadaverine fermentation medium having the composition shown in Table 17.
  • Cadaverine is shown below
  • Analytical sample 25 1 contains 1, 4-diaminobutane (0.03M) as 25 1, sodium hydrogen carbonate (0.075M) as 150 1, and 2,4-di-trifluorobenzene (0.2M Add the ethanol solution of) and mix at 37 ° C for 1 hour.
  • the above reaction solution 50 1 was dissolved in 1 ml of acetonitrile, and then 10 ⁇ 1 of the supernatant after centrifugation at 10, OOOrpm for 5 minutes was analyzed by HPLC.
  • the medium was used after autoclaving (121 ° C, 15 minutes).
  • As the separation membrane element member a molded product of stainless steel and polysulfone resin was used.
  • the porous membrane prepared in Reference Example 2 was used as the separation membrane.
  • the operating conditions in this example are as follows unless otherwise specified.
  • Membrane separation element effective filtration area 120 square cm Temperature adjustment: 30 (° C)
  • pH adjustment Adjusted to pH 7.0 with 3M HC1 and 3M ammonia water
  • the culture tank containing the separation membrane element and the working medium are all autoclaved at 121 ° C for 20 min.
  • Membrane permeate flow control Flow control by transmembrane pressure difference.
  • a microorganism for producing cadaverine one Corynebataterum dartamicam TR-CAD strain described in JP-A-2004-222569 was used, and a cadaverine production medium having the composition shown in Table 17 was used as the medium.
  • the concentration of the product cadaverine was evaluated by the HPLC method.
  • glucose test KO-C manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. was used for measuring the glucose concentration.
  • Cadaverine fermentation medium Gel course 150 g / L
  • Corynebata terumum Dartamicam TR—CADI strain was cultured overnight in a test tube with shaking of cadaverine supplemented with 5 ml of kanamycin (25 ⁇ g / ml). ). The obtained culture solution is inoculated into 50 ml of cadaverine production medium supplemented with fresh kanamycin (25 ⁇ g / ml), and then in a 500 ml volumetric flask for 24 hours at a temperature of 30 ° C and an amplitude of 30 cm, 180 rpm. Culturing was performed under the conditions (pre-culture). Pre-culture medium is inoculated into 2. OL cadaverine fermentation medium of continuous fermentation apparatus shown in Fig. 1, and fermentation reaction tank 1 is stirred at 800 rpm by attached agitator 5 and aeration in fermentation reaction tank 1 The amount was adjusted, the temperature was adjusted, and the pH was adjusted, and cultured for 24 hours (pre-culture).
  • the fermenter circulation pump 10 is operated, in addition to the operating conditions during pre-culture, the membrane separation tank 2 is vented, the cadaverine fermentation medium is continuously supplied, and the fermented liquid of the continuous fermenter Continuous culture was performed while controlling the amount of permeate through the membrane so that the volume was 2 L, and cadaverine was produced by continuous fermentation.
  • the control of the amount of permeated water when performing a continuous fermentation test is performed by measuring the head differential as the transmembrane differential pressure with the head differential control device 3, and under the above-mentioned membrane permeated water control conditions. It was done by changing. Where appropriate, the produced lactic acid concentration and residual glucose concentration in the membrane permeation fermentation broth were measured.
  • Table 18 shows the results of a 160-hour continuous fermentation test.
  • Cadaverine was produced using the continuous fermentation apparatus shown in Fig. 2 and the cadaverine fermentation medium having the composition shown in Table 17. The medium was used after autoclaving (121 ° C, 15 minutes). Stainless steel and polysulfone resin molded products were used as separation membrane elements. The porous membrane produced in Reference Example 2 was used as the separation membrane.
  • the operating conditions in this example are as follows unless otherwise specified.
  • Membrane separation element effective filtration area 120 square cm
  • pH adjustment Adjusted to pH 7.0 with 3M HC1 and 3M ammonia water
  • the culture tank containing the separation membrane element and the working medium are all autoclaved at 121 ° C for 20 min.
  • Membrane permeate flow control Flow control by transmembrane pressure difference.
  • Corynebataterum 'Dartamicam TR-CAD1 strain was used as the microorganism, the cadaverine fermentation medium having the composition shown in Table 17 was used as the medium, and the concentration of the product cadaverine was evaluated by the HPLC method. .
  • glucose test KO-C manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. was used for measuring the glucose concentration.
  • the Corynebataterum dartamicum TR—CADI strain was cultured overnight in a test tube by shaking with cadaverine production medium supplemented with 5 ml of kanamycin (25 ⁇ g / ml). ).
  • the obtained culture solution is inoculated into 50 ml of cadaverine production medium supplemented with fresh kanamycin (25 ⁇ g / ml), and then in a 500 ml volumetric flask for 24 hours at a temperature of 30 ° C and an amplitude of 30 cm, 180 rpm. Culturing was performed under the conditions (pre-culture).
  • the previous culture solution was inoculated into a 1.5 L cadaverine production medium of the continuous fermentation apparatus shown in Fig. 2, and the fermentation reaction tank 1 was stirred at 800 rpm with the attached stirrer 5 and the fermentation reaction tank 1 was vented. The amount was adjusted, the temperature was adjusted, and the pH was adjusted, and cultured for 24 hours (pre-culture). Immediately after completion of the pre-culture, cadaverine fermentation medium is continuously supplied, and continuous cultivation is performed while controlling the amount of permeated water so that the amount of fermentation broth in the continuous fermentation apparatus is 1.5 L. went.
  • the amount of permeated water in the continuous fermentation test is controlled by the head differential control device 3 by appropriately changing the head differential so that the head of the fermentation reaction tank is within 2 m at maximum, that is, the transmembrane pressure difference is within 20 kPa. I went there. Where appropriate, the produced force davelin concentration and residual glucose concentration in the membrane permeation fermentation broth were measured. Table 18 shows the cadaverine production rates in which the cadaverine and input glucose power were also calculated.
  • Table 18 shows the results of a 320-hour continuous fermentation test.
  • Comparative Example 8 The operating conditions of Comparative Example 8 are as follows.
  • Fermentation reactor capacity forced davelin production medium volume: 1. O (L)
  • Fermentation reactor aeration 1.5 (LZmin) air Fermentation reactor stirring speed: 800 (rpm)
  • pH adjustment Adjust to pH 7.0 with 3M HC1 and 3M ammonia water.
  • Corynebataterum dartamicum TR-CAD1 strain was cultured overnight in a test tube with shaking of cadaverine supplemented with 5 ml of kanamycin (25 ⁇ g / ml) (pre-culture). .
  • the obtained culture solution is inoculated into 50 ml of cadaverine production medium supplemented with fresh kanamycin (25 ⁇ g / ml), and placed in a 500 ml volumetric flask for 24 hours at a temperature of 30 ° C with an amplitude of 30 cm and 180 rpm.
  • the culture was performed under the conditions of (Pre-culture).
  • the preculture was inoculated into 1.0 L of cadaverine production medium (glucose concentration: lOOgZL) of a jar armor. Batch fermentation was performed using cadaverine production medium. The results are shown in Table 18.
  • Nucleic acids were produced using the continuous fermentation apparatus shown in Fig. 1.
  • the medium shown in Table 19 was used as the medium, and it was used after high-pressure steam sterilization (121 ° C, 15 minutes).
  • As the separation membrane element member a molded product of stainless steel and polysulfone resin was used.
  • As the separation membrane the porous membrane prepared in Reference Example 2 was used. Unless otherwise specified, the operating conditions in this example are as follows.
  • Fermentation reactor aeration rate 1000 (mL / min)
  • the culture tank containing the separation membrane element and the medium used are all autoclaved at 121 ° C for 20 min in an autoclave.
  • Membrane permeate flow control Flow control by transmembrane pressure difference
  • Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21479 strain was used, and a nucleic acid fermentation medium having the composition shown in Table 19 was used as a medium. Guanosine and inosine contained in the fermentation broth were confirmed by measuring the amount of each nucleic acid by the HP LC method under the conditions shown below.
  • the culture was performed with shaking at 150 ° C. for 24 hours using 150 ml of the preculture medium shown in Table 15 (pre-culture).
  • the obtained pre-culture solution was inoculated into 1 L of the pre-culture medium of the continuous fermentation apparatus shown in Fig. 1, and the fermentation reaction tank 1 was agitated at 800 rpm with the attached agitator 5, and the fermentation reaction tank 1
  • the aeration was adjusted and the temperature was adjusted to 30 ° C, and the cells were cultured for 24 hours (pre-culture).
  • the fermenter circulation pump is operated, in addition to the operating conditions during pre-culture, the membrane separation tank 2 is vented, and the continuous fermentation medium is continuously supplied.
  • Nucleic acids were produced using the continuous fermentation apparatus shown in FIG.
  • the medium shown in Table 19 was used as the medium, and it was used after high-pressure steam sterilization (121 ° C, 15 minutes).
  • As the separation membrane element member a molded product of stainless steel and polysulfone resin was used.
  • As the separation membrane the porous membrane prepared in Reference Example 2 was used. Unless otherwise specified, the operating conditions in this example are as follows.
  • Membrane separation element effective filtration area 120 square cm
  • Fermentation reactor aeration rate 1000 (mL / min)
  • the culture tank containing the separation membrane element and the medium used are all autoclaved at 121 ° C for 20 min in an autoclave.
  • pH adjustment adjusted to pH 6.8 with 25% aqueous ammonia
  • Membrane permeate flow control Flow control by transmembrane pressure difference
  • Corynebacterium ammoniagenes ATCC21479 strain was cultured with shaking in a Sakaguchi flask using 150 ml of the preculture medium shown in Table 19 for 24 hours at a temperature of 30 ° C. culture).
  • the obtained pre-culture solution was inoculated into 1 L of the pre-culture medium of the continuous fermentation apparatus shown in Fig. 2, and the fermentation reaction tank 1 was stirred at 800 rpm with the attached stirrer 5, and the fermentation reaction tank 1 The aeration was adjusted and the temperature was adjusted to 30 ° C, and the cells were cultured for 24 hours (pre-culture).
  • the continuous fermentation medium is continuously supplied, and the continuous fermentation apparatus is controlled to control the amount of permeated water so that the amount of fermentation broth is 1.5 L. went.
  • Control of the amount of permeated water in the continuous fermentation test was performed by measuring the head differential as the transmembrane pressure difference with the head differential control device 3 and changing it under the membrane permeate control conditions.
  • the produced nucleic acid concentration and residual glucose concentration in the membrane permeation fermentation broth were measured as appropriate.
  • Table 20 shows the nucleic acid production rates in which the input glucose force was also calculated, in which the nucleic acid and glucose concentration powers were also calculated.
  • the most typical batch fermentation using microorganisms was performed using a 2L jar mentor, and its nucleic acid productivity was evaluated.
  • a continuous fermentation medium shown in Table 19 was used as the medium, and the mixture was used after high-pressure steam sterilization (121 ° C, 15 minutes).
  • Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21479 strain was used as a prokaryotic microorganism, and the concentration of the product nucleic acid was evaluated using the method shown in Example 21, For the measurement of glucose concentration, “Glucose Test Sakai C” (registered trademark) (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used. The operating conditions of this comparative example are shown below.
  • the culture tank containing the separation membrane element and the working medium are all autoclaved at 121 ° C for 20 min.
  • pH adjustment Adjusted to pH 6.8 with 25% aqueous ammonia solution.
  • the amount of L-threonine contained in the culture solution was measured by the following method. Take 25 ⁇ L of the culture solution containing L-threonine to be measured, and add 150 ⁇ 1 NaHC03 (75 mM) and 25 ⁇ L L-methionine (2 gZL) as the internal standard. Add 900 1 ethanol and 150 1 DNFB (0.2 M) to the above solution and mix. The solution was allowed to stand at 37 ° C for 1 hour, and then subjected to HPLC analysis under the following conditions.
  • the calibration curve was analyzed using L threonine with a known concentration as the standard, and the horizontal axis plotted the L threonine concentration, and the vertical axis plotted the L s threonine area ZL-methionine (internal standard) area ratio. And produced.
  • the medium was used after autoclaving (121 ° C, 15 minutes).
  • the separation membrane the porous membrane prepared in Reference Example 2 was used.
  • the fermentation liquid circulation pump is operated, in addition to the operating conditions during pre-culture, the membrane separation tank 2 is vented, and the fermentation medium having the composition shown in Table 17 is continuously supplied, and the fermentation of the continuous fermentation apparatus is performed.
  • L-threonine was produced by continuous fermentation while controlling the amount of permeate through the membrane so that the liquid volume was 2 L.
  • the amount of membrane permeate when conducting a continuous fermentation test The control was performed by measuring the water head difference as the transmembrane pressure difference with the water head difference control device 3 and changing the water permeation amount control condition. The produced L-threonine concentration and residual glucose concentration in the membrane permeation fermentation broth were measured appropriately.
  • the head of the fermentation reaction tank was adjusted to a maximum of 2 m, that is, by changing the head difference appropriately so that the transmembrane pressure difference was within 20 kPa. Where appropriate, the produced L-threonine concentration and residual glucose concentration in the membrane permeation fermentation broth were measured. Table 22 shows the results of a 200-hour continuous fermentation test.
  • L-threon was produced using the membrane-separated continuous fermentation apparatus shown in Fig. 2 and the fermentation medium having the composition shown in Table 21, L-threon was produced.
  • the medium was used after autoclaving (121 ° C, 15 minutes).
  • As the separation membrane element a molded product of stainless steel and polysulfone resin was used.
  • As the separation membrane the porous membrane prepared in Reference Example 2 was used.
  • the operating conditions in this example are as follows unless otherwise specified.
  • Membrane separation element effective filtration area 120 square cm
  • L-threonine fermentation medium supply speed Variable control in the range of 50-300mlZhr.
  • Membrane permeate flow control Flow control by transmembrane pressure difference
  • the culture tank containing the separation membrane element and the medium used are all autoclaved at 121 ° C for 20 minutes and autoclaved.
  • the culture tank containing the separation membrane element and the medium used are all autoclaved at 121 ° C for 20 minutes and autoclaved.
  • Providedia 'Letgery SGR588-77 strain (FERM P-10528) of Buffalo' Letgery as the L-Seonin-producing microorganism fermentation medium with the composition shown in Table 21 was used as the medium, and the product L-Sleonine was used.
  • the HPLC shown in Example 23 was used for the evaluation of the concentration of Dalcose Test, and the measurement of the dulcose concentration was performed using Dalcose Test Co-C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • the amount was adjusted, the temperature was adjusted, and the pH was adjusted, and cultured for 24 hours (pre-culture).
  • the fermentation medium having the composition shown in Table 21 is continuously supplied, and the continuous fermentation apparatus is continuously cultured while controlling the amount of permeated water so that the amount of the fermentation broth is 1.5 L.
  • L-threonine was produced by fermentation.
  • the control of the amount of permeated water when performing the continuous fermentation test was performed by measuring the head differential as the transmembrane differential pressure with the head differential control device 3 and changing it under the above-mentioned conditions for controlling the amount of permeated water.
  • the produced L-threonine concentration and residual glucose concentration in the membrane permeation fermentation broth were measured appropriately.
  • Table 18 shows the sugar yield per glucose input and the lactic acid production rate calculated for the L-threonine and darose concentration power.
  • the most typical batch fermentation using microorganisms was performed using a 2L jar mentor, and its L-threonine productivity was evaluated.
  • the preculture medium shown in Table 21 was used as the medium at the start of batch culture. These media were used after high-pressure steam sterilization (121 ° C, 15 minutes).
  • the Buffalo 'Letgery SGR588-77 strain was used as the microorganism, and the concentrations of L-threonine and glucose contained in the fermentation broth were determined in the examples.
  • the method shown in 27 was used. The operating conditions of this comparative example are shown below.
  • Fermentation reactor volume (L-Seonin fermentation medium volume): 1 (L)
  • Fermentation reactor aeration rate 1 (L / min)
  • pH adjustment Adjusted to pH 7 with 28% aqueous ammonia solution.
  • L-lactic acid was produced using the continuous fermentation apparatus shown in Fig. 1.
  • the medium used was L-lactic acid bacteria lactic acid fermentation medium shown in Table 23, and used after high-pressure steam sterilization (121 ° C, 15 minutes).
  • the medium was used after autoclaving (121 ° C, 15 minutes).
  • the porous membrane prepared in Reference Example 2 was used as the separation membrane.
  • the operating conditions in this example are as follows unless otherwise specified. [0397] Fermentation reactor capacity: 2 (L)
  • Membrane separation element effective filtration area 120 square cm
  • the culture tank containing the separation membrane element and the culture medium used are all autoclaved at 121 ° C for 20 min.
  • pH adjustment Adjust to pH 6.5 with 8N aqueous ammonia solution.
  • Membrane permeate flow control Flow control by transmembrane pressure difference

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Abstract

　本発明は、微生物もしくは培養細胞の培養液を、分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収し、さらに、未濾過液を培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を培養液に追加する連続発酵において、分離膜として、平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の多孔性膜を用い、膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲で濾過処理する化学品の製造方法である。 本発明により、安定に低コストで、発酵による化学品の生産効率を著しく向上させることが可能となる。

Description

化学品の製造方法、および、連続発酵装置
技術分野
[0001] 本発明は、化学品の製造方法、および、連続発酵装置に関するものである。
背景技術
[0002] 微生物や培養細胞の培養を伴う物質生産方法である発酵法は、大きく (1)回分発 酵法 (Batch発酵法)および流加発酵法 (Fed— Batch発酵法)と（2)連続発酵法に 分類することができる。
[0003] 回分および流加発酵法は、設備的には簡素であり、短時間で培養が終了し、雑菌 汚染による被害が少ないというメリットがある。しかし、時間経過とともに培養液中の生 産物濃度が高くなり、浸透圧あるいは生産物阻害等の影響により生産性及び収率が 低下してくる。このため、長時間にわたり安定して高収率かつ高生産性を維持するの が困難である。
[0004] 連続発酵法は、発酵槽内で目的物質が高濃度に蓄積するのを回避することによつ て、長時間にわたって高収率かつ高生産性を維持できるという特徴がある。 L—ダル タミン酸ゃ L—リジンの発酵にっ 、て連続培養法が開示されて 、る (非特許文献 1)。 しかし、これらの例では、培養液へ原料の連続的な供給を行うとともに、微生物や細 胞を含んだ培養液を抜き出すために、培養液中の微生物や細胞が希釈されることか ら、生産効率の向上は限定されたものであった。
[0005] 連続発酵法にお!ヽて、微生物や培養細胞を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回 収すると同時に濾過された微生物や培養細胞を培養液に保持または還流させること で、培養液中の微生物や細胞濃度を高く維持する方法が提案されている。
[0006] 例えば、セラミックス膜を用いた連続発酵装置において、連続発酵する技術が開示 されている (特許文献 1、特許文献 2、特許文献 3)。しかし、開示された技術は、セラ ミックス膜の目詰りによる濾過流量や濾過効率の低下に問題があり、目詰まり防止の ために、逆洗浄等を行っている。
[0007] 分離膜を用いたコハク酸の製造方法が開示されて!ヽる (特許文献 4)。この技術で は、膜分離において、高い濾過圧 (約 200kPa)が採用されている。高い濾過圧は、 コスト的にも不利であるば力りでなぐ濾過処理において微生物や細胞が圧力によつ て物理的なダメージをうけることから、微生物や細胞を連続的に培養液に戻す連続 発酵法にぉ 、ては適切ではな 、。
[0008] 従来の連続培養は、発酵槽へ新鮮培地を一定速度で供給し、これと同量の培養液 を槽外へ排出することによって、発酵槽内の液量を常に一定に保つ培養法である。 回分培養では初発基質濃度が消費されると培養が終了するが、連続培養では理論 的には無限に培養を持続できる。すなわち、理論的には無限に発酵できる。
[0009] 一方、上述従来の連続培養では培養液と共に微生物も槽外に排出され、発酵槽内 の微生物濃度を高く維持することは難しい。ここで、発酵生産を行う場合には発酵を 行う微生物を高濃度に保つことができれば、発酵容積当たりの発酵生産効率を向上 させることができる。そのためには、微生物を発酵槽内に保持、あるいは還流させる 必要がある。微生物を発酵槽内に保持あるいは還流させる方法としては、排出された 培養液を重力、例えば遠心分離により固液分離し、沈殿物である微生物を発酵槽に 返送する方法、ろ過することで固形分である微生物を分離し、培養液上清のみを槽 外に排出する方法があげられる。しかし、遠心分離による方法は動力費が高く現実 的ではない。ろ過による方法は、前述のようにろ過するために高い圧力要することか ら、実験室レベルでの検討がほとんどであった。
[0010] このように、従来の連続発酵法には様々な問題があり、産業的応用が難し力つた。
[0011] すなわち、連続発酵法において、微生物や細胞を分離膜で濾過し、濾液から生産 物を回収すると同時に濾過された微生物や細胞を培養液に還流させ、培養液中の 微生物や細胞濃度を向上させ、かつ、高く維持させることで高い物質生産性を得るこ とは、依然として困難であり、技術の革新が望まれていた。
特許文献 1：特開平 5— 95778号公報
特許文献 2：特開昭 62— 138184号公報
特許文献 3 :特開平 10— 174594号公報
特許文献 4：特開 2005— 333886号公報
非特許文献 1 : Toshihiko Hirao et. al. (ヒラノ 'トシヒコ ら）、 Appl. Microbiol. Biotechn ol. (アプライド マイクロバイアル アンド マイクロバイオロジー）， 32, 269- 273 (1 989)
発明の開示
[0012] 本発明は、微生物もしくは培養細胞の培養液を、分離膜で濾過し、濾液から生産 物を回収し、さら〖こ、未濾過液を培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を培養 液に追加する連続発酵において、分離膜として、平均細孔径が 0.01 μ m以上 1 μ m 未満の多孔性膜を用い、膜間差圧を 0.1から 20kPaの範囲で濾過処理する化学品 の製造方法である。
[0013] 本発明は、好ましくは、多孔性膜の純水透過係数は、 2 X 10—9m3Zm2ZsZpa以 上 6 X 10—7m3Zm2ZsZpa以下である化学品の製造方法である。
[0014] 本発明は、好ましくは、多孔性膜の平均細孔径が、 0.01 μ m以上 0.2 m未満で あり、かつ、多孔性膜の細孔径の標準偏差が 0.1 m以下である。
[0015] 本発明は、好ましくは、多孔性膜の膜表面粗さが 0.1 m以下の多孔性膜である化 学品の製造方法である。
[0016] 本発明は、好ましくは、多孔性膜が、多孔質榭脂層を含む多孔性膜である化学品 の製造方法である。
[0017] 本発明の連続発酵装置は、微生物もしくは培養細胞の発酵培養液を分離膜で濾 過し、濾液力 生産物を回収するとともに未濾過液を前記の発酵培養液に保持また は還流し、かつ、発酵原料を前記の発酵培養液に追加する連続発酵による化学品 の製造装置であって、微生物もしくは培養細胞を発酵培養させるための発酵反応槽 と、該発酵反応槽に発酵培養液循環手段を介して接続され内部に分離膜を備えた 発酵培養液を濾過するための膜分離槽と、分離膜の膜間差圧を 0.1から 20kPaの範 囲に制御する手段力 なり、該分離膜が平均細孔径 0.01 μ m以上 1 μ m未満の多 孔性膜である連続発酵装置である。
[0018] また、本発明の別の連続発酵装置は、微生物もしくは培養細胞の発酵培養液を分 離膜で濾過し、濾液カゝら生産物を回収するとともに未濾過液を前記の発酵培養液に 保持または還流し、かつ、発酵原料を前記の発酵培養液に追加する連続発酵による 化学品の製造装置であって、微生物もしくは培養細胞を発酵させるための発酵反応 槽と、その発酵反応槽内部に配設され分離膜を備えた発酵培養液を濾過するため の分離膜エレメントと、該分離膜エレメントに接続され濾過された発酵生産物を排出 するための手段と、該分離膜の膜間差圧を 0.1から 20kPaの範囲に制御するための 手段からなり、該分離膜が平均細孔径 0.01 μ m以上 1 μ m未満の細孔を有する多 孔性膜である連続発酵装置である。
図面の簡単な説明
[0019] [図 1]図 1は、本発明で用いられる膜分離型連続発酵装置の例を説明するための概 略側面図である。
[図 2]図 2は、本発明で用いられる他の膜分離型連続発酵装置の例を説明するため の概略側面図である。
[図 3]図 3は、本発明で用いられる分離膜エレメントの例を説明するための概略斜視 図である。
[図 4]図 4は、本発明で用いられる他の分離膜エレメントの例を説明するための断面 説明図である。
[図 5]図 5は、酵母用発現ベクター pTRSl lのフィジカルマップを示す図である。 符号の説明
[0020] 1 発酵反応槽
2 分離膜エレメント
3 水頭差制御装置
4 気体供給装置
5 攪拌機
6 レべノレセンサ
7 培地供給ポンプ
8 pH調整溶液供給ポンプ
9 pHセンサ '制御装置
10 温度調節器
11 発酵液循環ポンプ
12 膜分離槽 13 支持板
14 流路材
15 分離膜
16 凹部
17 集水パイプ
18 分離膜束
19 上部樹脂封止層
20 下部榭脂封止層
21 支持フレーム
22 集水パイプ
発明を実施するための最良の形態
[0021] 本発明は、微生物もしくは培養細胞の培養液を、分離膜で濾過し、濾液から生産 物を回収し、さら〖こ、未濾過液を培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を培養 液に追加する連続発酵において、分離膜として、平均細孔径が 0.01 μ m以上 1 μ m 未満の多孔性膜を用い、膜間差圧を 0.1から 20kPaの範囲で濾過処理する化学品 の製造方法である。
[0022] 本発明にお 、て分離膜として用いられる多孔性膜にっ 、て説明する。
[0023] 本発明で分離膜として用いられる多孔性膜の構成について説明する。本発明にお ける多孔性膜は、好ましくは、被処理水の水質や用途に応じた分離性能と透水性能 を有するものである。
[0024] 多孔性膜は、阻止性能および透水性能や分離性能、例えば、耐汚れ性の点から、 多孔質榭脂層を含む多孔性膜であることが好ましい。
[0025] 多孔質榭脂層を含む多孔性膜は、好ましくは、多孔質基材の表面に、分離機能層 として作用とする多孔質榭脂層を有している。多孔質基材は、多孔質榭脂層を支持 して分離膜に強度を与える。
[0026] 本発明で用いられる多孔性膜が、好ましくは、多孔質基材の表面に、多孔質榭脂 層を有している場合、多孔質基材に多孔質榭脂層が浸透していても、多孔質基材に 多孔質榭脂層が浸透していなくてもどちらでも良ぐ用途に応じて選択される。 [0027] 多孔質基材の平均厚みは、好ましくは、 50 μ m以上 3000 μ m以下である。
[0028] 多孔質基材の材質は、有機材料および Zまたは無機材料等からなり、有機繊維が 望ましく用いられる。好ましい多孔質基材は、セルロース繊維、セルローストリァセテ ート繊維、ポリエステル繊維、ポリプロピレン繊維およびポリエチレン繊維などの有機 繊維を用いてなる織布ゃ不織布であり、より好ましくは、密度の制御が比較的容易で あり製造も容易で安価な不織布が用いられる。
[0029] 多孔質榭脂層は、有機高分子膜を好適に使用することができる。有機高分子膜の 材質としては、例えば、ポリエチレン系榭脂、ポリプロピレン系榭脂、ポリ塩ィ匕ビニル 系榭脂、ポリフッ化ビニリデン系榭脂、ポリスルホン系榭脂、ポリエーテルスルホン系 榭脂、ポリアクリロニトリル系榭脂、セルロース系榭脂およびセルローストリアセテート 系榭脂などが挙げられる。有機高分子膜は、これらの榭脂を主成分とする樹脂の混 合物であってもよい。ここで主成分とは、その成分が 50重量％以上、好ましくは 60重 量％以上含有することをいう。有機高分子膜の材質は、溶液による製膜が容易で物 理的耐久性ゃ耐薬品性にも優れて 、るポリ塩ィ匕ビ二ル系榭脂、ポリフッ化ビ-リデン 系榭脂、ポリスルホン系榭脂、ポリエーテルスルホン系榭脂およびポリアクリロニトリル 系榭脂が好ましぐポリフッ化ビニリデン系榭脂またはそれを主成分とする樹脂が最も 好ましく用いられる。
[0030] ここで、ポリフッ化ビ -リデン系榭脂としては、フッ化ビ-リデンの単独重合体が好ま しく用いられる。さらに、ポリフッ化ビ-リデン系榭脂は、フッ化ビ-リデンと共重合可 能なビニル系単量体との共重合体も好ましく用いられる。フッ化ビニリデンと共重合 可能なビュル系単量体としては、テトラフルォロエチレン、へキサフルォロプロピレン および三塩ィ匕フッ化工チレンなどが例示される。
[0031] 本発明で使用される多孔性膜は、平均細孔径が、 0.01 μ m以上 1 μ m未満である ことが重要である。多孔性膜の平均細孔径が、 0.01 μ m以上 1 μ m未満であると、発 酵に使用される微生物による目詰まりが起こりにくぐかつ、濾過性能が長期間安定 に継続する性能を有する。また、多孔性膜の平均細孔径が、 0.01 μ m以上 1 μ m未 満であると、微生物あるいは培養細胞がリークすることのない高い排除率と、高い透 水性を両立させることができ、透水性を長時間保持することが、より高い精度と再現 性を持って実施することができる。
[0032] 生物もしくは培養細胞の大きさに近 、と、これらが直接孔を塞 、でしまう場合がある ので、多孔性膜の平均細孔径は、 1 μ m未満である。多孔性膜の平均細孔径は、微 生物もしくは培養細胞の漏出、すなわち排除率が低下する不具合の発生を防止する ため、微生物もしくは培養細胞の大きさと比較して大きすぎないことが好ましい。微生 物もしくは培養細胞のうち、細胞の小さい細菌などを用いる場合には、平均細孔径と して 0.4 μ m以下が好ましぐ 0.2 μ m未満であれば、より好適に実施することができる
[0033] また、微生物もしくは培養細胞が目的とする化学品以外の物質、例えば、タンパク 質、多糖類など凝集しやすい物質を生産する場合があり、更に、培養液中の微生物 もしくは培養細胞の一部が死滅することで細胞の破砕物が生成する場合があり、これ ら物質によって多孔性膜の閉塞することから回避するために、平均細孔径が 0. 1 μ m以下であることが好適である。
[0034] 一般的に、多孔性膜の平均細孔径は、多孔性膜の平均細孔径は、 0.4 μ m以下が 好ましく、 0.2 /z m未満、ある!/ヽは、 0. 以下力 より好まし!/ヽ。
[0035] 平均細孔径カ 、さすぎると多孔性膜の透水性能が低下し、膜が汚れて 、なくても 効率的な運転ができなくなるため、本発明における多孔性膜の平均細孔径は、 0.01 μ m以上である。多孔性膜の平均細孔径は、好ましくは、 0. 02 μ m以上であり、 0. 04 μ m以上であることが更に好適である。
[0036] ここで、平均細孔径は、倍率 10, 000倍の走査型電子顕微鏡観察における、 9. 2
/z m X IO. 4 mの範囲内で観察できる細孔すベての直径を測定し、平均すること により求めることができる。平均細孔径は、あるいは、膜表面を走査型電子顕微鏡を 用いて倍率 10, 000倍で写真撮影し、 10個以上、好ましくは 20個以上の細孔を無 作為に選び、それら細孔の直径を測定し、数平均して求めることもできる。細孔が円 状でない場合、画像処理装置等によって、細孔が有する面積と等しい面積を有する 円（等価円）を求め、等価円直径を細孔の直径とする方法により求められる。
[0037] 本発明に用いる多孔性膜の平均細孔径の標準偏差 σは、 0. 1 μ m以下であること が好ましい。平均細孔径の標準偏差は小さければ小さい方が望ましい。平均細孔径 の標準偏差 σは、上述の 9. 2 /z m X lO. 4 mの範囲内で観察できる細孔数を Nと して、測定した各々の直径を Xkとし、細孔直径の平均を X(ave)とした下記の（式 1) により算出される。
[0038] [数 1]
· - ·■ (式 1 )
Figure imgf000009_0001
[0039] 本発明で用いられる多孔性膜にぉ 、ては、培養液の透過性が重要な性能の一つ である。多孔性膜の透過性の指標として、使用前の多孔性膜の純水透過係数を用い ることができる。本発明において、多孔性膜の純水透過係数は、逆浸透膜による 25 °Cの温度の精製水を用い、ヘッド高さ lmで透水量を測定し算出したとき、 2 X 10—9 m3Zm2ZsZpa以上であることが好ましぐ純水透過係数が、 2 X 10"9mVmVs Zpa以上 6 X 10_7m3Zm2ZsZpa以下であれば、実用的に十分な透過水量が得 られる。
[0040] 本発明で用いられる多孔性膜においては、表面粗さとは、表面に対して垂直方向 の高さの平均値である。膜表面粗さは、分離膜表面に付着した微生物もしくは培養 細胞が、撹拌や循環ポンプによる液流による膜面洗浄効果で剥離しやすくするため の因子の一つである。多孔性膜の表面粗さは、 0.1 m以下であることが好ましい。 表面粗さが 0. 1 μ m以下であると、膜に付着した微生物もしくは培養細胞が剥がれ やすい。
[0041] さらに好ましくは、多孔性膜の膜表面粗さが 0.1 m以下であり、平均細孔径が、 0.
01 μ m以上 1 μ m未満径と、多孔性膜の純水透過係数が、 2 X 10"9mVmVs/p a以上の膜を使用することにより、膜面洗浄に必要な動力を過度に必要としない運転 1S より容易に、可能であることがわ力つた。多孔性膜の表面粗さを、 0.1 m以下と することにより、微生物もしくは培養細胞の濾過において、膜表面で発生する剪断力 を低下させることができ、微生物の破壊が抑制され、多孔性膜の目詰まりも抑制され ることにより、長期間安定な濾過が、より容易に、可能になる。多孔性膜の表面粗さを
、 0.1 m以下とすることにより、より低い膜間差圧で連続発酵が実施可能であり、膜 が目詰まりした場合でも高い膜間差圧で運転した場合に比べて、洗浄回復性が良好 であり、好ましい。目詰まりを抑えることで、安定した連続発酵が可能になることから、 多孔性膜の表面粗さは小さければ小さ 、ほど好ま 、。
[0042] ここで、膜表面粗さは、下記の原子間力顕微鏡装置 (AFM)を使用して、下記の条 件で測定した。
[0043] 装置 原子間力顕微鏡装置 (Digital Instruments (株）製 Nanoscope Ilia)
条件
探針 SiNカンチレバー (Digital Instruments (株）製）
走査モード コンタクトモード (気中測定）
水中タッピングモード (水中測定）
走査範囲 10 m、 25 m四方 (気中測定）
5 /ζ πι、 10 /z m四方（水中測定）
走査解像度 512 X 512
試料調製 測定に際し膜サンプルは、常温でエタノールに 15分浸漬後、 RO水中 に 24時間浸漬し洗浄した後、風乾し用いた。
[0044] 膜表面粗さ droughは、上記、原子間力顕微鏡装置 (AFM)により各ポイントの Z軸 方向の高さから、下記の（式 2)により算出した。
[0045] [数 2] J«―ん
N '…（式 2) 平均表面粗さ（ m)
Figure imgf000010_0001
Z軸方向の高さ（ i m)
走査範囲の平均高さ ( m)
[0046] 本発明で用いられる多孔性膜の形状は、好ましくは、平膜である。多孔性膜の形状 が平膜の場合、その平均厚みは、用途に応じて選択される。多孔性膜の形状が平膜 の場合の平均厚みは、好ましくは、 20 μ m以上 5000 μ m以下であり、より好ましくは 50 μ m以上 2000 μ m以下である。
[0047] 本発明で用いられる多孔性膜の形状は、好ましくは中空糸膜である。多孔性膜が 中空糸膜の場合、中空糸の内径は、好ましくは、 200 m以上 5000 m以下であり 、膜厚は、好ましくは、 20 m以上 2000 m以下である。また、有機繊維または無 機繊維を筒状にした織物や編物を中空糸の内部に含んで ヽても良 ヽ。
[0048] 本発明で用いられる多孔性膜の作成法の概要を例示して説明する。
[0049] まず、多孔性膜のうち、平膜の作成法の概要について説明する。
[0050] 多孔質基材の表面に、榭脂と溶媒とを含む原液の被膜を形成するとともに、その原 液を多孔質基材に含浸させる。その後、被膜を有する多孔質基材の被膜側表面の みを、非溶媒を含む凝固浴と接触させて榭脂を凝固させると共に多孔質基材の表面 に多孔質榭脂層を形成する。
[0051] 原液は、榭脂を溶媒に溶解させて調整する。原液の温度は、製膜性の観点から、 通常、 5〜120°Cの範囲内で選定することが好ましい。溶媒は、榭脂を溶解するもの であり、榭脂に作用してそれらが多孔質榭脂層を形成するのを促すものである。溶媒 としては、 N—メチルピロリジノン（NMP)、 N, N—ジメチルァセトアミド（DMAc)、 N , N—ジメチルホルムアミド（DMF)、ジメチルスルホキシド（DMSO)、 N -メチルー 2 -ピロリドン、メチルェチルケトン、テトラヒドロフラン、テトラメチル尿素、リン酸トリメ チル、シクロへキサノン、イソホロン、 γ —ブチロラタトン、メチルイソアミルケトン、フ タル酸ジメチル、プロピレングリコールメチルエーテール、プロピレンカーボネート、ジ アセトンアルコール、グリセロールトリアセテート、アセトンおよびメチルェチルケトンな どを用いることができる。なかでも、榭脂の溶解性の高い Ν—メチルピロリジノン (ΝΜ Ρ)、 Ν, Ν—ジメチルァセトアミド（DMAc)、 Ν, N—ジメチルホルムアミド（DMF)、 ジメチルスルホキシド（DMSO)を好ましく用いることができる。これらを単独で用いて も良いし、 2種類以上を混合して用いても良い。
[0052] 例えば、ポリエチレングリコール、ポリビュルアルコール、ポリビュルピロリドン、グリ セリンなどの溶媒以外の成分を溶媒に添加しても良い。溶媒に非溶媒を添加すること もできる。非溶媒は、榭脂を溶解しない液体である。非溶媒は、榭脂の凝固の速度を 制御して細孔の大きさを制御するように作用する。非溶媒としては、水や、メタノール 、およびエタノールなどのアルコール類を用いることができる。なかでも、非溶媒とし て、価格の点力 水やメタノールが好ましい。溶媒以外の成分および非溶媒は、混合 物であってもよい。
[0053] 原液には、開孔剤を添加することもできる。開孔剤は、凝固浴に浸漬された際に抽 出されて、榭脂層を多孔質にする作用を持つものである。開孔剤を添加することで、 平均細孔径の大きさの制御することができる。開孔剤は、凝固浴への溶解性の高い ものであることが好ましい。開孔剤としては、例えば、塩ィ匕カルシウムや炭酸カルシゥ ムなどの無機塩を用いることができる。また、開孔剤として、ポリエチレングリコールや ポリプロピレングリコールなどのポリオキシアルキレン類や、ポリビュルアルコール、ポ リビュルプチラールおよびポリアクリル酸などの水溶性高分子化合物や、グリセリンを 用!/、ることができる。
[0054] 次に、多孔性膜のうち、中空糸膜の作成法の概要について説明する。
[0055] 中空糸膜は、榭脂と溶媒力もなる原液を二重管式口金の外側の管から吐出すると ともに、中空部形成用流体を二重管式口金の内側の管から吐出して、冷却浴中で冷 却固化して作製することができる。
[0056] 原液は、上述の平膜の作成法で述べた榭脂を 20重量％以上 60重量％以下の濃 度で、上述の平膜の生成法で述べた溶媒に溶解させることで調整できる。また、中空 部形成用流体には、通常気体もしくは液体を用いることができる。また、得られた中 空糸膜の外表面に、新たな多孔性榭脂層をコーティング (積層)することもできる。積 層は中空糸膜の性質、例えば、親水'疎水性、細孔径等を所望の性質に変化させる ために行うことができる。積層される新たな多孔性榭脂層は、榭脂を溶媒に溶解させ た原液を、非溶媒を含む凝固浴と接触させて榭脂を凝固させることによって作製でき る。その樹脂の材質は、例えば、上述有機高分子膜の材質と同様のものが好ましく 用いることができる。また、積層の方法は特に限定されず、原液に中空糸膜を浸漬し てもよいし、中空糸膜の表面に原液を塗布してもよぐ積層後、付着した原液の一部 を搔き取ったり、エアナイフを用いて吹き飛ばしすることで積層量を調整することもで きる。
[0057] 本発明で用いられる多孔性膜は、榭脂などの部材を用いて中空糸膜の中空部を接 着'封止し、支持体に設置することによって分離膜エレメントとすることができる。
[0058] 本発明で用いられる多孔性膜は、支持体と組み合わせることによって分離膜エレメ ントとすることができる。支持体として支持板を用い、該支持板の少なくとも片面に、 本発明で用いられる多孔性膜を配した分離膜エレメントは、本発明で用いられる多孔 性膜を有する分離膜エレメントの好適な形態の一つである。透水量を大きくするため に、支持板の両面に多孔性膜を配することも分離膜エレメントの好まし 、態様である
[0059] 本発明の化学品の製造方法は、膜間差圧を 0.1から 20kPaの範囲で濾過処理す る。発酵培養液をろ過するために、 20kPaより高い膜間差圧で濾過処理すると、圧力 を加えるための動力が必要であり、化学品を製造するときの経済効果が低下する。 2 OkPaより高い膜間差圧を加えることによって微生物あるいは培養細胞が破砕される 場合があり、化学品を生産する能力が低下する。本発明の化学品の製造方法は、ろ 過圧力である膜間差圧が 0.1から 20kPaの範囲であり、水頭差により膜間差圧を得ら れることから、特別に発酵槽内を加圧状態に保つ必要がなぐ化学品を生産する能 力が低下しない。また、特別に発酵槽内を加圧状態に保つ必要がないことから、多 孔性膜を発酵槽内部に設置する様態も可能となり、発酵装置がコンパ外ィ匕できる利 点も挙げられる。本発明の化学品の製造方法では、膜間差圧を、好ましくは、 0.1か ら 2kPaの範囲で濾過処理する。
[0060] 本発明の化学品の製造方法は、発酵原料を、使用する。本発明で使用する発酵原 料としては、培養する微生物の生育を促し、目的とする発酵生産物である化学品を 良好に生産させうるものであればょ 、。
[0061] 本発明で使用する発酵原料は、炭素源、窒素源、無機塩類、及び必要に応じてァ ミノ酸、ビタミンなどの有機微量栄養素を適宜含有する通常の液体培地が良い。炭素 源としては、グルコース、シユークロース、フラクトース、ガラクトース、ラタトース等の糖 類、これら糖類を含有する澱粉糖ィ匕液、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、ノ、ィテストモラセス、 酢酸等の有機酸、エタノールなどのアルコール類、グリセリンなどが使用される。窒素 源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモ-ゥム塩類、尿素、硝酸塩類、そ の他補助的に使用される有機窒素源、例えば油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分 解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカ一、酵母または酵母エキス 、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使 用される。無機塩類としては、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガ ン塩等を適宜添加することができる。
[0062] 本発明に使用する微生物が生育のために特定の栄養素を必要とする場合には、そ の栄養物を標品もしくはそれを含有する天然物として添加する。また、消泡剤を必要 に応じて使用する。本発明において、培養液とは、発酵原料に微生物または培養細 胞が増殖した結果得られる液のことを言う。追加する発酵原料の組成は、目的とする 化学品の生産性が高くなるように、培養開始時の発酵原料組成力 適宜変更しても 良い。
[0063] 本発明では、培養液中の糖類濃度は 5gZl以下に保持されるのが好ましい。培養 液中の糖類濃度は 5gZl以下に保持することが好ましい理由は、培養液の引き抜き による糖類の流失を最小限にするためである。
[0064] 微生物の培養は、通常、 pH4— 8、温度 20— 40°Cの範囲で行われる。培養液の p Hは、無機あるいは有機の酸、アルカリ性物質、さら〖こは尿素、炭酸カルシウム、アン モ-ァガスなどによって、通常、 PH4— 8範囲内のあら力じめ定められた値に調節す る。酸素の供給速度を上げる必要があれば、空気に酸素を加えて酸素濃度を 21% 以上に保つ、あるいは培養を加圧する、攪拌速度を上げる、通気量を上げるなどの 手段を用いることができる。
[0065] 本発明の化学品の製造方法では、培養初期に Batch培養または Fed— Batch培 養を行って、微生物濃度を高くした後に、連続培養 (引き抜き)を開始しても良い。本 発明の化学品の製造方法では、微生物濃度を高くした後に、高濃度の菌体をシード し、培養開始とともに連続培養を行っても良い。本発明の化学品の製造方法では、 適当な時期から原料培養液の供給及び培養物の引き抜きを行うことが可能である。 原料培養液供給と培養物の弓 Iき抜きの開始時期は必ずしも同じである必要はな ヽ。 また、原料培養液の供給と培養物の引き抜きは連続的であってもよいし、間欠的であ つてもよい。
[0066] 原料培養液には菌体増殖に必要な栄養素を添加し、菌体増殖が連続的に行われ るようにすればよい。培養液中の微生物または培養細胞の濃度は、培養液の環境が 微生物または培養細胞の増殖にとって不適切となって死滅する比率が高くならない 範囲で、高い状態で維持することが、効率よい生産性を得るのに好ましい。培養液中 の微生物または培養細胞の濃度は、一例として、乾燥重量として、 5gZL以上に維 持することで良好な生産効率が得られる。
[0067] 本発明の化学品の製造方法では、必要に応じて発酵槽内から微生物または培養 細胞を引き抜くことができる。例えば、発酵槽内の微生物または培養細胞濃度が高く なりすぎると、分離膜の閉塞が発生しやすくなることから、引き抜くことで、閉塞から回 避することができる。また、発酵槽内の微生物または培養細胞濃度によって化学品の 生産性能が変化することがあり、生産性能を指標として微生物または培養細胞を引き 抜くことで生産性能を維持させることも可能である。
[0068] 本発明の化学品の製造方法では、発酵生産能力のあるフレッシュな菌体を増殖さ せつつ行う連続培養操作は、菌体を増殖しつつ生産物を生成する連続培養法であ れば、発酵槽の数は問わない。本発明の化学品の製造方法では、連続培養操作は 、通常、単一の発酵槽で行うのが、培養管理上好ましい。発酵槽の容量が小さい等 の理由から、複数の発酵槽を用いることも可能である。この場合、複数の発酵槽を配 管で並列または直列に接続して連続培養を行っても発酵生産物の高生産性は得ら れる。
[0069] 本発明の化学品の製造方法に用いることができる微生物あるいは培養細胞につい て説明する。本発明の化学品の製造方法で使用される微生物や培養細胞について は、制限はない。本発明で使用される微生物や培養細胞は、例えば、発酵工業にお いてよく使用されるパン酵母などの酵母、大腸菌、コリネ型細菌などのバクテリア、糸 状菌、放線菌、動物細胞、昆虫細胞などが挙げられる。使用する微生物や細胞は、 自然環境力 単離されたものでもよぐまた、突然変異や遺伝子組換えによって一部 性質が改変されたものであってもょ 、。
[0070] 本発明の化学品の製造方法で製造される化学品としては、上記微生物や細胞が 培養液中に生産する物質であれば制限はない。本発明の化学品の製造方法で製造 される化学品は、アルコール、有機酸、アミノ酸、核酸など発酵工業において大量生 産されている物質を挙げることができる。例えば、アルコールとしては、エタノール、 1 , 3 プロパンジオール、 1,4 ブタンジオール、グリセロールなど、有機酸としては、 酢酸、乳酸、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、ィタコン酸、クェン酸、核酸であれば、 イノシン、グアノシンなどのヌクレオシド、イノシン酸、グァ-ル酸などのヌクレオチド、 またカダベリンなどのジァミンィ匕合物を挙げることができる。また、本発明は、酵素、抗 生物質、組換えタンパク質のような物質の生産に適用することも可能である。
[0071] 次に、本発明の化学品の製造方法に用いることができる微生物あるいは培養細胞 について、具体的な化学品を例示しながら説明する。
[0072] 本発明の化学品の製造方法において、 L 乳酸の生産に用いることが出来る微生 物あるいは培養細胞としては L 乳酸を生産することが可能な微生物であれば制限 はない。本発明の化学品の製造方法において、 L 乳酸の生産に用いることが出来 る微生物あるいは培養細胞としては、好ましくは乳酸菌を用いることができる。ここで 乳酸菌とは、消費したグルコースに対して対糖収率として 50%以上の乳酸を産生す る原核微生物として定義することができる。好ましい乳酸菌としては、例えば、ラタトバ シフス属 (Genus Lactobacillus)、へティォコッカス属 (Genus Pediococcus)、 テトラゲノコッカス属 (Genus Tetragenococcus)、力ノレノバクテリウム属 (Genus Carnobacterium 、ノ ゴコッ 7ス腐 (Genus Vagococcus)、ロイコノストツク為 (Ge nus Leuconostoc)、ォエノコッ 7ス (Genus Oenococcus)、アトポビゥム属 (G enus Atopobiumリ、ストレフ。トコッカス属 (Genus Streptococcus八ェンテロコッ カス腐 (Genus Enterococcus)、フクトノヽンフス J禺 ( enus Lactococcus)、お びバシラス属（Genus Bacillus)に属する乳酸菌が挙げられる。それらの中でも、乳 酸の対糖収率が高い乳酸菌を選択して乳酸の生産に好ましく用いることができる。 本発明の化学品の製造方法においては、更に、乳酸の内でも、 L 乳酸の対糖収率 の高い乳酸菌を選択して乳酸の生産に好ましく用いることができる。 L 乳酸とは、乳 酸の光学異性体の一種であり、その鏡像体である D 乳酸と明確に区別することが できる。 L 乳酸の対糖収率が高い乳酸菌としては、例えば、ラタトバシラス'ャマナ シェンシス (Lactobacillus yamanashiensis)、ラクトノくシラス 'アニマリス (Lactobacillus a nimalis)、ラタトバシラス'アジリス（Lactobacillus agilis)、ラタトバシラス'アビアリエス（L actobacillus aviaries)、ラクトノ シラス -；^セィ (Lactobacillus casei)、ラクトノ シラス-ァ ノレブレツキ (Lactobacillus delbruekii)、ラクトノくシラス'ノ ラカセィ (Lactobacillus parac asei)、ラクトノくシラス'ラムノサス (Lactobacillus rhamnosus)、ラクトノくシラス'ノレミニス ( Lactobacillus ruminisノ、フクトノヽンフス 'サリノくリス (Lactobacillus saiivanus)、フクトノヽ シラス 'シヤーピィ（Lactobacillus sharpeae)、ラタトバシラス 'デタストリ-タス（Pediococ cus dextrinicus)、およびラクトノくシラス'ラクテイス (Lactococcus lactis)などが挙げら れ、これらを選択して、 L—乳酸の生産に用いることが可能である。
[0073] 本発明の化学品の製造方法で L 乳酸を製造する場合、人為的に乳酸生産能力 を付与、あるいは増強した微生物または培養細胞を用いることができる。例えば、 L— 乳酸脱水素酵素遺伝子 (以下、 L— LDHと言うことがある）を導入して、 L 乳酸生産 能力を付与、あるいは増強した微生物または培養細胞を用いることができる。 L—乳 酸生産能力を付与、あるいは増強させる方法としては、従来知られている薬剤変異 による方法も用いることができる。更に好ましくは、微生物が L— LDHを組み込むこと により L 乳酸生産能力が増強した組換え微生物が挙げられる。
本発明の化学品の製造方法で L 乳酸を製造する場合、組換え微生物の宿主とし ては、原核細胞である大腸菌、乳酸菌、および真核細胞である酵母などが好ましぐ 特に好ましくは酵母である。酵母のうち好ましくはサッカロマイセス属（Genus Sacc haromyces)に属する酵母であり、更に好ましくはサッカロマイセス.セレビセ（Sacch aromyces cerevisiaeノで &)る。
[0074] 本発明で使用する L LDHとしては、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
(NADH)とピルビン酸を、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD + )と L 乳酸に変換する活性を持つタンパク質をコードしていれば限定されない。例えば 、 L 乳酸の対糖収率の高い乳酸菌由来の L— LDHを用いることができる。好適に はほ乳類由来 L— LDHを用いることができる。このうちホモ'サピエンス（Homo sap iens)由来、および力エル由来の L—LDHを用いることができる。力エルの中でもコ モリガエル科（Pipidae)に属する力エル由来の L— LDHを用いることが好ましぐコ モリガエル科に属する力エルの中でも、アフリカッメガエル（Xenopus laevis)由来 の L— LDHを好ましく用いることができる。
[0075] 本発明に用いられるヒトまたは力エル由来の L— LDHには、遺伝的多型性や、変 異誘発などによる変異型の遺伝子も含まれる。遺伝的多型性とは、遺伝子上の自然 突然変異により遺伝子の塩基配列が一部変化しているものである。また、変異誘発と は、人工的に遺伝子に変異を導入することをいう。変異誘発は、例えば、部位特異的 変異導入用キット (Mutan-K (タカラバイオ社製) )を用いる方法や、ランダム変異導入 用キット（BD Diversify PCR Random Mutagenesis (CLONTECH社製） )を用いる方 法などがある。また、本発明で使用するヒトまたは力エル由来の L— LDHは、 NADH とピルビン酸を NAD +と L 乳酸に変換する活性を持つタンパク質をコードして 、る ならば、塩基配列の一部に欠失または挿入が存在して ヽても構わな 、。
[0076] 本発明の化学品の製造方法で L 乳酸を製造する場合、製造された濾過'分離発 酵液に含まれる L 乳酸の分離 ·精製は、従来知られている濃縮、蒸留および晶析 などの方法を組み合わせて行うことができる。例えば、濾過'分離発酵液の pHを 1以 下にして力 ジェチルエーテルや酢酸ェチル等で抽出する方法、イオン交換樹脂に 吸着洗浄した後に溶出する方法、酸触媒の存在下でアルコールと反応させてエステ ルとし蒸留する方法、およびカルシウム塩やリチウム塩として晶析する方法などが挙 げられる。好ましくは、濾過'分離発酵液の水分を蒸発させた濃縮 L 乳酸溶液を蒸 留操作に力けることができる。ここで、蒸留する際には、蒸留原液の水分濃度が一定 になるように水分を供給しながら蒸留することが好ましい。 L 乳酸水溶液の留出後 は、水分を加熱蒸発することにより濃縮し、目的とする濃度の精製 L 乳酸を得ること ができる。留出液としてエタノールや酢酸等の低沸点成分を含む L 乳酸水溶液を 得た場合は、低沸点成分を L 乳酸濃縮過程で除去することが好ましい態様である 。蒸留操作後、留出液について必要に応じて、イオン交換榭脂、活性炭およびクロマ ト分離等による不純物除去を行い、さらに高純度の L 乳酸を得ることもできる。
[0077] 本発明の化学品の製造方法で D 乳酸を製造する場合、 D 乳酸生産に用いるこ とが出来る微生物あるいは培養細胞としては D 乳酸を生産することが可能な微生 物であれば制限はな!/、。 D 乳酸生産に用 、ることが出来る微生物ある!/ヽは培養細 胞は、例えば、野生型株では、 D—乳酸を合成する能力を有するラタトバシラス属 (L actobacillus)、バシラス属 (Bacillus)属およびぺディォコッカス (Pediococcus)に 属する微生物が挙げられる。
[0078] 本発明の化学品の製造方法で D—乳酸を製造する場合、野生型株の D—乳酸デ ヒドロゲナーゼ（以下、 D— LDHともいうことがある。）の酵素活性を増強していること が好ましい。酵素活性を増強させる方法としては、従来知られている薬剤変異による 方法も用いることができる。更に好ましくは、微生物が D—乳酸デヒドロゲナーゼをコ ードする遺伝子を み込むことにより D—乳酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を増強し た組換え微生物が挙げられる。
本発明の化学品の製造方法で D—乳酸を製造する場合、組換え微生物の宿主とし ては、原核細胞である大腸菌、乳酸菌、および真核細胞である酵母などが好ましぐ 特に好ましくは酵母である。
[0079] 本発明の化学品の製造方法で D—乳酸を製造する場合、 D—乳酸デヒドロゲナー ゼをコードする遺伝子力 ラクトノくチノレス'プランタラム (Lactobacillus plantarum) 、およびぺディォコッカス'ァシデイラクテイシ (Pediococcus acidilactici)、および バシラス ·ラエボラタティカス（Bacillus laevolacticus)由来の遺伝子であることが好 ましぐ更に好ましくはバシラス ·ラエボラタティカス（Bacillus laevolacticus)由来の 遺伝子である。
[0080] 本発明の化学品の製造方法で D—乳酸を製造する場合、濾過'分離発酵液に含ま れる D—乳酸の分離'精製は、従来知られている濃縮、蒸留および晶析などの方法 を組み合わせて行うことができる。例えば、濾過'分離発酵液の pHを 1以下にしてか らジェチルエーテルや酢酸ェチル等で抽出する方法、イオン交換樹脂に吸着洗浄 した後に溶出する方法、酸触媒の存在下でアルコールと反応させてエステルとし蒸 留する方法、およびカルシウム塩やリチウム塩として晶析する方法などが挙げられる。 本発明の化学品の製造方法で D—乳酸を製造する場合、好ましくは、濾過'分離発 酵液の水分を蒸発させた濃縮 D—乳酸溶液を蒸留操作にかけることができる。ここで 、蒸留する際には、蒸留原液の水分濃度が一定になるように水分を供給しながら蒸 留することが好ましい。 D—乳酸水溶液の留出後は、水分を加熱蒸発することにより 濃縮し、目的とする濃度の精製 D—乳酸を得ることができる。留出液として低沸点成 分 (エタノール、酢酸等）を含む D—乳酸水溶液を得た場合は、低沸点成分を D—乳 酸濃縮過程で除去することが好ましい態様である。蒸留操作後、留出液について必 要に応じて、イオン交換榭脂、活性炭およびクロマト分離等による不純物除去を行い 、さらに高純度の D—乳酸を得ることもできる。
[0081] 本発明の化学品の製造方法でエタノールを製造する場合、エタノールの生産に用 いることが出来る微生物あるいは培養細胞としては、ピルビン酸を生産することが可 能な微生物あるいは培養細胞であれば制限はな 、。エタノールの生産に用いること が出来る微生物あるいは培養細胞としては、例えば、サッカロミセス属（Genus Sac charomyces)、クノレべ口マイセス属 (Genus Kluyveromyces)、シゾサッカロミセス 属（Genus Schizosaccharomyces)に属する酵母を用いることができる。このうち サッカロミセス ·セレビセ (Saccharomyces cerevisiae)、クノレべ口マイセス ·ラクティ ス (Kluyveromyces lactis)、シゾサッカロ セス ·ポンへ (Schizosaccharomyces pombe)を好適に用いることができる。また、ラクトバチルス属（Genus Lactobacil lus)、ザィモモナス属（Genus Zymomonas)に属する細菌も好ましく用いることが できる。このうち、ラクトバチルス ·ブレビス（Lactobacillus brevis)、ザィモモナス · モビリス（Zymomonas mobilis)を好適に用いることができる。
[0082] 本発明におけるエタノールの生産に用いることができる微生物あるいは培養細胞は 人為的にエタノール生産能力を高めた微生物あるいは培養細胞であってもよい。本 発明におけるエタノールの生産に用いることができる微生物あるいは培養細胞は、具 体的には、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであっても よい。一部性質が改変されたものの一例としては、リゾパス属に属するカビのダルコア ミラーゼ遺伝子を組み込み生でんぷんの資化能力を獲得した酵母を挙げることがで きる（微生物、 3 : 555— 564 (1987) )。また、本発明の製造方法により製造された濾 過'分離発酵液に含まれるエタノールの分離'精製は、例えば、蒸留法による精製法 や、 NF、 RO膜、あるいはゼォライト製の分離膜を用いた濃縮'精製法を好適に用い ることがでさる。
[0083] 本発明の化学品の製造方法でピルビン酸を製造する場合、ピルビン酸の生産に用 いることが出来る微生物あるいは培養細胞としてはピルビン酸を生産することが可能 な微生物あるいは培養細胞であれば制限はな 、。ピルビン酸の生産に用いることが 出来る微生物あるいは培養細胞としては、シユードモナス属（Genus Pseudomona s)、コリネノ クテリゥム属 (Genus Corynebacterium)、ェシエリシァ属 (Genus Es cherichia)、ァシネトパクター属（Genus Acinetobacter)に属する細菌を好ましく 用いることができる。さらに好ましくは、シユードモナス 'フルォレエセンス（Pseudomo nas fuluorescens)、ンュ ~~トモナス ·">エロ ノ1 ~~サ (Pseudomonas aerugmos a)、ェシエリシァ 'コリ（Escherichia coli)などの細菌を用いることができる。これら細 菌を突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変したものを用いてもよい。例 えば、酸ィ匕的リン酸ィ匕による ATP生産に直接関与する ATPase遺伝子を変異、また は欠失させた細菌も好ましく用いられる。またカビ、酵母なども好ましく用いることがで きる。例えば、サッカロミセス属 (Genus Saccharomyces)、トノレロプシス属 (Genus Toluropusis)、カンジダ属 (Genus Candida)、シゾフィリウム属 (Genus Schiz ophyllum)に属するカビ、酵母を用いることができる。さらに好ましくは、サッカロミセ ス ·セレビ、セ (Saccharomyces cerevisiae)、サッカロ セス ·コフンス (Saccharom yces copsis)、カンジダ'グラブラータ（Candida glabrata)、カンジダ'リボリチカ（ Candida lipolytics)、トノレ口プシス ·グラブラータ (Toluropusis glabrata)、シゾ フイリゥム ·コムネ（Schizophyllum commune)などのカビ、酵母を用いてピルビン 酸を製造することが出来る。
[0084] 本発明の化学品の製造方法でピルビン酸を製造する場合、濾過'分離発酵液に含 まれるピルビン酸の分離 ·精製は、陰イオン交換カラムを用いた方法により行うことが できる。例えば、特開平 6— 345683に示される弱塩性イオン交換体を用いた精製法 を好適に用いることができる。
[0085] 本発明の化学品の製造方法でコハク酸を製造する場合、コハク酸の生産に用いる ことができる微生物あるいは培養細胞としてはコハク酸を生産することが可能な微生 物であれば特に制限はない。コハク酸の生産に用いることができる微生物あるいは培 養細胞としては、アナエロビォスピリラム（Anaerobiospirillum)属ゃァクチノバシラス（A ctinobadllus)属に属する細菌を好適に利用することができる。具体的には、米国特 許第 5143833号明細書に記載のアナエロビォスピリラムサクシ-シプロデュセンス ( Anaerobiospirnlum succiniciproducens)や James B. Mckinlay (ンェ ~~ムズ β.マツ3 rン リー）らが開示しているァクチノバシラス 'サクシノジェネス（Actinobacillus succinogene s)を挙げることができる（Appl. Microbiol. Biotechnol. (アプライド マイクロバイアル アンド マイクロノくィォロジ一）， 71, 6651— 6656 (2005)。また、コリネバクテリウム（ Corynebacterium)属ゃブレビバタテリゥム（Brevibacterium)属などのコリネ型細菌（C oryneform bacterium)、および大腸菌（Escherichia)なども利用可能である。コリネ型 細菌では、コリネバタテリゥム 'グルタミカム（Corynebacterium glutamicum)、ブレビバ クテリゥム 'フラバム（Brevibacterium flavum)、およびブレビバタテリゥム'ラクトファーメ ングム (Brevibacterium lactofermentumノなと 好適で ¾> 。
[0086] また、微生物としては、遺伝子組換えによって、コハク酸の生産能力が改善された 微生物を用いることができ、これによりコハク酸の生産性を向上させることも可能であ る。このような微生物としては、例えば、特開 2005— 27533号公報に記載の乳酸脱 水素酵素（lactate dehydrogenase)を欠損したブレビバタテリゥム 'フラバム MJ233AB -41 (FERM BP— 1498)や、非特許文献 1に記載のコリネバタテリゥム'ダルタミ力 ム（Corynebacterium glutamicum)、米国特許第 5770435号明細書に記載のピルビ ン酸.ギ酸開裂酵素（pyruvate formate lyase)と乳酸脱水素酵素（lactate dehydrogen ase)の欠損株である大腸菌 AFP111株などを使用することができる。
[0087] 本発明の化学品の製造方法でコハク酸を製造する場合、コハク酸の分離'精製は、 通常のコハク酸の精製法を適用することができる。例えば、特開 2005— 333886号 公報に示されている水分解電気透析処理と減圧濃縮，晶析を組み合わせた精製法 を好適に用いることができる。
[0088] 本発明の化学品の製造方法でィタコン酸を製造する場合、ィタコン酸の生産に用 いることが出来る微生物あるいは培養細胞としては、ィタコン酸を生産することが可能 な微生物であれば制限はな 、。ィタコン酸の生産に用いることが出来る微生物ある 、 は培養細胞としては、カビあるいは酵母を好ましく用いることができる。更に好ましくは 、ァスペルギルス属（Genus Aspergillus)、ある!/、はウスティラゴ属 (Genus Ustil ago)に属するカビ、およびカンジダ属（Genus Candida)、ロドトルラ属（Genus R hodotorula)に属する酵母を用いたィタコン酸の生産が挙げられる。中でも、ァスぺ ルギルス テレウス（Aspergillus terreus)、ァスペルギルス イタコ-タス（Aspergi llus itaconicus)、ウスティラゴ メイデイス（Ustilago maydis)、ウスティラゴ シノ ドンティス（Ustilago cynodontis)、およびウスティラゴ ラベンホルスティナ（Ustil ago rabenhorstina)のカビ、あるいはカンジダ アンタルクティカ（Candia antarc tica)を、ィタコン酸の生産に好ましく用いることができる。
[0089] 本発明の化学品の製造方法でィタコン酸を製造する場合、ィタコン酸の分離'精製 は、好ましくは、限外濾過や電気透析を用いて行うことができる。例えば、特公昭— 5 0958号公報に示される限外濾過、および塩型カチオン交換榭脂膜を用いた電気透 析による精製法を好適に用いることができる。
[0090] 本発明の化学品の製造方法で 1, 3—プロパンジオールを製造する場合、 1, 3— プロパンジオールの生産に用いることが出来る微生物あるいは培養細胞としては、 1 , 3—プロパンジオールを生産することが可能な微生物であれば特に制限はない。 1 , 3—プロパンジオールの生産に用いることが出来る微生物あるいは培養細胞として は、例えば、野生型株ではグリセロールから 1, 3—プロパンジオールを合成する能力 を有するクレブシエラ（Klebsiella)属、クロスッリジゥム（Clostridium)属、ラタトバシ ルス（Lactobacillus)属に属する微生物が挙げられる。
[0091] 本発明の化学品の製造方法で 1, 3—プロパンジオールを製造する場合、微生物 は、（a)グリセロールデヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも 1 つの遺伝子；（b)グリセロールデヒドラターゼ再活性ィ匕因子をコードする少なくとも 1つ の遺伝子；及び（c) 3—ヒドロキシプロピオンアルデヒドを 1, 3—プロパンジオールに 転換する非一特異的触媒活性をコードする少なくとも 1つの遺伝子を含んでいること が好ましい。本発明では、更に好ましくは、微生物は、組換え微生物で 1, 3—プロパ ンジオールを生産可能にすることが挙げられる。
[0092] 本発明の化学品の製造方法で 1, 3—プロパンジォールを製造する場合、グリセ口 ールから 1, 3—プロパンジオールを合成する能力を有する微生物は、好ましくは、ク レブシエラ（Klebsiella)、クロスッリジゥム（Clostridium)、ラクトバシルス (Lactobac illus)、シトロノくクテノレ (Cytrobacter)、ェンテロノくクテノレ (Enterobacter)、ァエロ ノ クテノレ (Aerobacter)、ァスぺノレギノレス (Aspergillus)、サッカロミセス (Saccharo myces)、シゾサッカロ セス (Schizosaccharomyces)、チゴサッカロ セス (Zygos accharomyces)、ピチア (Pichia)、クノレイベロミセス (Kluyvero myces)、カンング ( Candida)、ノヽンセヌラ (Hansenula)、テノ リオミセス (Debaryomyces)、ムコノレ (M ucor)、 トルロプシス (Torulopsis)、メチロバクテノレ (Methylobacter)、サノレモネラ（ Salmonella)、バシルス（Bacillus)、ァェロバクテル（Aerobacter)、ストレプトミセス (streptomyces)、エツンエリンフ (Eschericia)及ひンュ ~~トモナス (Pseudomona s)より成る群力も選ばれる組換え微生物で、更に好ましくはエツシェリシァ コリである
[0093] 本発明の化学品の製造方法で 1, 3 プロパンジオールを製造する場合、組換え 微生物は、グルコース力 効率よく 1, 3 プロパンジオールを生産する事ができるよ うにする改良を行ったほうが好ましい。組換え微生物は、例えば、（a)グリセロール— 3 リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも 1つの遺 伝子;及び (b)グリセロール 3—ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコード する少なくとも 1つの遺伝子を含んだ組換え微生物であることが好ましく。 更にグリセ ロールデヒドラターゼ再活性化因子力 Sdhaレギュロンから単離される orfX及び orfZに よりコードされる遺伝子を含んだ組換え微生物であることが更に好ましい。更には、組 換え微生物は、グリセロールキナーゼ活性および Zまたはグリセロールデヒドロゲナ ーゼ活性および/またはトリオースリン酸イソメラーゼ活性を欠失した組換え微生物 であることが更に好ましい。
[0094] 本発明の化学品の製造方法で 1, 3 プロパンジオールを製造する場合、濾過'分 離発酵液に含まれる 1, 3 プロパンジオールの分離'精製は、濃縮、晶析させて行う ことができる。例えば、特開平— 35785号公報に示される減圧濃縮 '晶析を用いた精 製法を好適に用いることができる。
[0095] 本発明の化学品の製造方法でカダベリンを製造する場合、カダベリンの生産に用 いることが出来る微生物あるいは培養細胞としてはカダベリンを生産することが可能 な微生物であれば制限はな 、。カダベリンの生産に用いることが出来る微生物ある 、 は培養細胞としては、例えば、微生物がリジン脱炭酸酵素および Zまたはリジン'力 ダベリンアンチポーターの酵素活性を増強して 、る微生物が好まし 、。更に好ましく は、微生物がリジン脱炭酸酵素および Zまたはリジン'カダべリンアンチポーターをコ ードする遺伝子を組み込んだ組換え微生物が挙げられる。更に好ましくは、組換え 微生物がリジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子が、 1または 2種類以上組み込まれて いる微生物が挙げられる。
[0096] 本発明の化学品の製造方法でカダベリンを製造する場合、組換え微生物としては 大腸菌およびコリネ型細菌が好ましぐ更に好ましくは、リジン脱炭酸酵素活性を有し 、かつホモセリン栄養要求性または S— (2—アミノエチル）—L—システィン耐性の少 なくともいずれ力 1つの特徴を有しているコリネ型細菌である。更には、ホモセリンデヒ ドロゲナーゼ活性を欠損していることが好ましく。遺伝子挿入変異生成によりホモセリ ンデヒドロゲナーゼ活性を欠損していることが更に好ましい。本発明では、コリネ型細 菌の属が、コリネバタテリゥム属およびブレビバタテリゥム属からなる群より選ばれる少 なくとも 1つの属であることが好ましい。更に好ましくは、コリネバクテリア ·ダルタミカム ( C oryneb acutenum gulutamicum)で to 。
[0097] 本発明の化学品の製造方法でカダベリンを製造する場合、濾過'分離発酵液に含 まれるカダベリンの分離 ·精製は、濃縮、蒸留および晶析などの従来知られている方 法を組み合わせて行うことができる。例えば、特開 2004— 222569号公報に示され る晶析を用いた精製法を好適に用いることができる。本発明では、連続培養の際に 用いられる酸によって様々なポリマー原料にすることができ、好純度が求められるポリ マー原料用途では晶析による精製方法が好ましく用いられる。塩酸により培養液の p Hを維持すると、その濾過液から晶析工程によりカダベリン二塩酸塩を回収すること ができる。更に好ましくは、連続培養の際にジカルボン酸により培養液の pHを維持し 、そのろ過液から晶析工程によりカダベリン'ジカルボン酸塩を回収することが挙げら れる。更に好ましくは、そのジカルボン酸は、官能基としては 2つのカルボキシル基の みを有する脂肪族および Zまたは芳香族のジカルボン酸である。更に好ましくは、該 ジカルボン酸として、アジピン酸、セバシン酸、 1, 12—ドデカンジカルボン酸、コハク 酸、イソフタル酸またはテレフタル酸の 、ずれかを挙げることができる。
[0098] 本発明の化学品の製造方法で核酸を製造する場合、核酸の生産に用いることが出 来る微生物あるいは培養細胞としては核酸を生産することが可能な微生物であれば 制限はない。核酸の生産に用いることが出来る微生物あるいは培養細胞は、元来核 酸の生産能力が高!、ものを自然界から分離してもよ!、し、人為的に生産能力を高め た原核微生物であってもよい。具体的には、突然変異や遺伝子組換えによって一部 性質が改変されたものであってもょ 、。
[0099] ここで一部性質の改変に関して説明する。核酸を効率よく生産するためには、核酸 を生合成して蓄積し、生体外に放出する必要がある。そのため、核酸の生合成系路 に関与する酵素の増強、核酸の分解路に関与する酵素活性低下、また核酸を生体 外放出に関わるタンパク質、あるいは生体膜組成等の改変など、微生物あるいは培 養細胞の性質を変えることによって効率的に核酸を生産する微生物あるいは培養細 胞を作出することができる。
[0100] 具体的には、一部性質の内、イノシンを生産する場合には、アデ-口コハク酸シン テターゼ活性を持たないか、微弱であることが望ましい。また、イノシン酸デヒドロゲナ ーゼ活性を持たないか、微弱であることが望ましい。また、ヌクレオシダーゼ活性を持 たないか、微弱であることが望ましい。グアノシンを生産する場合には、アデ-口コハ ク酸シンテターゼ活性を持たないか、微弱であることが望ましい。また、グァニル酸レ ダクターゼ活性を持たないか、微弱であることが望ましい。また、ヌクレオシダーゼ活 性を持たないか、微弱であることが望ましい。また、ヌクレオチダーゼ活性を持たない 力 微弱であることが望ましい。ゥリジンを生産する場合には、ゥリジンホスホリラーゼ 活性を持たないか、微弱であることが望ましい。シチジンを生産する場合には、シジ チンデアミナーゼ活性を持たないか、微弱であることが望ましぐホモセリンデヒドロゲ ナーゼ活性を持たな 、か、微弱であることが望ま 、。
[0101] 本発明の化学品の製造方法で核酸を製造する場合、その微生物あるいは培養細 胞のうちで更に好ましくはコリネ型細菌および枯草菌を用いることができる。例えば、 イノシンを生産する場合には、コリネ型細菌として、コリネバタテリゥム属（Genus Cor ynebacterium)に属する細菌が挙げられる。コリネバタテリゥム属の中でも、コリネバ クテリゥム 'グルタミカム（Corynebacterium )、コリネバクテリゥム 'アンモニアゲネス (Corynebacterium ammoniagenes)、コリネノ クテリゥム 'グアノファシエンス (Co rynebacterium guanofaciens)、およびコリネノ クテリゥム 'ペトロフイリゥム (Cory nebacterium petrophilium)が好ましく用いられる。た、枯草菌として、バチルス属 (Genus Bacillus)に属する細菌が挙げられる。バチルス属の中でも、バチスル 'サ チルス (Bacillus subtilis)、バチスル ·ライケ-フオルミス（Bacillus liquenif ormi s)、およびバチスル 'プミラス（Bacillus pumilus)が好ましく用いられる。また、グァ ノシンを生産する場合には、コリネ型細菌として、コリネバタテリゥム属（Genus Cory nebacterium)に属する細菌が挙げられる。コリネバタテリゥム属の中でも、コリネバタ テリゥム.ダルタミカム（Corynebacterium )が好ましぐ枯草菌としては、例えば、 バチルス属（Genus Bacillus)に属する細菌が挙げられる。バチルス属の中でも、バ チスル ·サチルス (Bacillus subtilis)、バチスル ·ライケ-フオルミス（Bacillus liqu eniformis)、バチスル'プミラス（Bacillus pumilus)が好ましく用いられる。また、ゥ リジンを生産する場合には、枯草菌を用いることができ、枯草菌の中でもバチルス属（ Genus Bacillus)に属する細菌が好ましく用いられる。バチルス属の中でも、バチス ル-サチルス（Bacillus subtilis)が好ましく用いられる。シチジンを生産する場合に は、枯草菌を用いることができ、枯草菌の中でもバチルス属（Genus Bacillus)に属 する細菌が好ましく用いられる。バチルス属の中でも、バチスル 'サチルス（Bacillus subtilis)が好ましく用いられる。
[0102] 本発明の化学品の製造方法で核酸を製造する場合、濾過'分離発酵液に含まれる 核酸の分離'精製は、好ましくは、イオン交換榭脂処理法、濃縮冷却晶析法、膜分離 法およびその他の方法を組み合わせることにより行なわれる。不純物を除くためには 、常法の活性炭吸着法および再結法を用いて精製してもよ!、。
[0103] 本発明の化学品の製造方法でアミノ酸を製造する場合、アミノ酸の製造に用いるこ とが出来る微生物あるいは培養細胞としてはアミノ酸を生産することが可能な微生物 であれば制限はな 、。アミノ酸の製造に用いることが出来る微生物あるいは培養細胞 は、元来アミノ酸の生産能力が高いものを自然界力 分離してもよいし、人為的に生 産能力を高めた微生物あるいは培養細胞であってもよ 、。
本発明の化学品の製造方法でアミノ酸を製造する場合、アミノ酸は、好ましくは、 L- スレオ-ン、 L—リジン、 L—グルタミン酸、 L—トリプトファン、 L—イソロイシン、 L—グ ルタミン、 L アルギニン、 L ァラニン、 L ヒスチジン、 L プロリン、 L—フエ-ルァ ラニン、 Lーァスパラギン酸、 Lーチロシン、メチォニン、セリン、パリン、ロイシンが挙 げられる。
[0104] 次に、具体的なアミノ酸を例示しながら、アミノ酸の生産に用いることができる微生 物あるいは培養細胞にっ 、て説明する。
本発明の化学品の製造方法で Lースレオニンを製造する場合、 Lースレオニンの製 造に用いることができる微生物あるいは培養細胞は、ェシエリシァ属（Genus Esch erichia)、プロビデンシァ属（Genus Providencia)、コリネバタテリゥム属（Genus Corynebacterium)、ブレビノクテリゥム属 (Genus Brevibacterium)またはセ ラチア属（Genus Serratia)のいずれかに属する細菌を用いることができる。そのう ちで、特に好まし 、細菌は、ェシエリシァ 'コリ（Escherichia coli)、プロビデンシァ · レトゲリ (Providencia rettgeri)、コリネノ クテリゥム ·グノレタミカム (Corynebacteri um glutamicum 、ブレヒノヽクァリウム ·フフノ ム (Brevibacterium flavum)、フ レビバタテリゥム ·ラタトフアーメンタム（Brevibacterium lactofermentum)、または 、セラチア ·マノレセセンス (Serratia marcescens)である。
[0105] 本発明の化学品の製造方法で L—リジンを製造する場合、 L—リジンの製造に用い ることができる微生物あるいは培養細胞は、コリネバタテリゥム 'ダルタミカム、ブレビバ クテリゥム ·フラバムまたはブレビバタテリゥム ·ラタトフアーメンタムが好まし 、。
本発明の化学品の製造方法で L グルタミン酸を製造する場合、 L グルタミン酸の 製造に用いることができる微生物あるいは培養細胞は、コリネバタテリゥム'ダルタミ力 ム、ブレビバタテリゥム ·フラバムまたはブレビバタテリゥム ·ラタトフアーメンタムが好ま しい。
[0106] 本発明の化学品の製造方法で L—トリブトファンを製造する場合、 L—トリブトファン の製造に用いることができる微生物あるいは培養細胞は、コリネバタテリゥム 'ダルタミ カム、ブレビバタテリゥム 'フラバム、ブレビバタテリゥム'ラタトフアーメンタム、バチノレス •サブチリス（Bacillus subtilis)、バチルス ·アミロリケファシエンス (Bacillus amyl oliquefaciens)またはェシエリシァ 'コリが好まし!/、。
[0107] 本発明の化学品の製造方法で L—イソロイシンを製造する場合、 L—イソロイシンの 製造に用いることができる微生物あるいは培養細胞は、コリネバタテリゥム'ダルタミ力 ム、ブレビバタテリゥム 'フラバム、ブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタムまたはセラチ ァ ·マルセセンスが好まし 、。
[0108] 本発明の化学品の製造方法で L—グルタミンを製造する場合、 L—グルタミンの製 造に用いることができる微生物あるいは培養細胞は、コリネバタテリゥム'ダルタミカム 、ブレビバタテリゥム 'フラバム、ブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタムまたはフラボバ クテリゥム ·リゲンス (Flavobacterium rigense)が好まし!/ヽ。
[0109] 本発明の化学品の製造方法で L—アルギニンを製造する場合、 L—アルギニンの 製造に用いることができる微生物あるいは培養細胞は、コリネバタテリゥム'ダルタミ力 ム、ブレビバタテリゥム.フラバム、セラチア'マノレセセンス、ェシエリシァ 'コリまたはバ チノレス ·サブチリスが好まし 、。
[0110] 本発明の化学品の製造方法で Lーァラニンを製造する場合、 Lーァラニンの製造に 用いることができる微生物あるいは培養細胞は、ブレビバタテリゥム 'フラバムまたは ァルスロパクタ^ ~ ·ォキシダンス (Arthrobacter oxydans)が好ま U、。
[0111] 本発明の化学品の製造方法で L—ヒスチジンを製造する場合、 L—ヒスチジンの製 造に用いることができる微生物あるいは培養細胞は、コリネバタテリゥム'ダルタミカム 、ブレビバタテリゥム 'フラバム、ブレビバタテリゥム'ァモ-アジェネス（Brevibacteriu m ammoniagenes)、セラチア'マノレセセンス、ェシエリシァ'コリ、バチノレス'サブチ リスまたはストレプトマイセス ·コエリコラー (Streptomyces coelicolor)が好まし!/ヽ。
[0112] 本発明の化学品の製造方法で L—プロリンを製造する場合、 L—プロリンの製造に 用いることができる微生物あるいは培養細胞は、コリネバタテリゥム 'ダルタミカム、力 ルチア ·カテナフオルマ（Kurthia catenaforma)、セラチア ·マノレセセンスまたはェ シエリシァ'コリが好ましい。
[0113] 本発明の化学品の製造方法で L—フエ二ルァラニンを製造する場合、 L—フエニル ァラニンの製造に用いることができる微生物あるいは培養細胞は、コリネバクテリウム' グルタミカム、ブレビバタテリゥム 'フラバム、ブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタムま たはェシエリシァ 'コリが好ま U、。
[0114] 本発明の化学品の製造方法で Lーァスパラギン酸を製造する場合、 Lーァスパラギ ン酸の製造に用いることができる微生物あるいは培養細胞は、ブレビバタテリゥム 'フ ラバム、バチルス 'メガテリゥム（Bacillus megatherium)、ェシエリシァ ·コリまたは シユードモナス ·フノレオレツセンス (Pseudomonas fluorescens)力 子まし！/、。
[0115] 本発明の化学品の製造方法で Lーチロシンを製造する場合、 Lーチロシンの製造 に用いることができる微生物あるいは培養細胞は、コリネバタテリゥム'ダルタミカム、 ブレビバタテリゥム ·フラバム、ブレビバタテリゥム ·ラタトフアーメンタムまたはェシェリシ ァ'コリが好ましい。
[0116] 本発明の化学品の製造方法でメチォニンを製造する場合、メチォニンの生産に用 いることができる微生物あるいは培養細胞は、コリネバタテリゥム 'ダルタミカムが好ま しい。
[0117] 本発明の化学品の製造方法でセリンを製造する場合、セリンの製造に用いることが できる微生物あるいは培養細胞は、コリネバタテリゥム 'ダルタミカム、ブレビバクテリウ ム ·フラバム、ブレビバタテリゥム ·ラタトフアーメンタムまたはァノレスロバクタ一'ォキシ ダンスが好ましい。
[0118] 本発明の化学品の製造方法でパリンを製造する場合、ノ リンの製造に用いることが できる微生物あるいは培養細胞は、ブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム、セラチア •マルセセンスまたはクレブシエラ ·ニューモ-ァ（Klebsiella pneumoniae)が好ま しい。
[0119] 本発明の化学品の製造方法でロイシンを製造する場合、ロイシンの製造に用いるこ とができる微生物あるいは培養細胞は、コリネバタテリゥム 'ダルタミカム、ブレビバタ テリゥム ·ラタトフアーメンタムまたはセラチア ·マルセセンスが好まし 、。
[0120] 本発明の化学品の製造方法でアミノ酸を製造する場合、アミノ酸の製造に用いるこ とができる微生物あるいは培養細胞は、例示した微生物あるいは培養細胞に対して 、人為的に生産能力を高めた微生物あるいは培養細胞であってもよい。アミノ酸の製 造に用いることができる微生物あるいは培養細胞は、突然変異や遺伝子組換えによ つて一部性質が改変されたものであってもょ 、。一部性質が改変されたアミノ酸の製 造に用いることができる微生物ある 、は培養細胞の一例としては、特開 H2— 21958 2に記載されて 、る L—スレオニン生産性の向上したプロビデンシァ ·レトゲリや、特 表平 3 - 500486に記載されて 、る L -ァラニン生産性の向上したコリネバタテリゥム
-グノレタミカムなどがある。
[0121] 本発明の化学品の製造方法に従って、連続発酵をおこなった場合、従来の回分発 酵と比較して、高い体積生産速度が得られ、極めて効率のよい発酵生産が可能とな る。ここで、連続培養における生産速度は、次の式（3)で計算される。
[0122] [数 3] 発酵生産速度 (gZLZhr)
=抜き取り液中の生産物濃度 (gZL) X発酵液抜き取り速度（LZhr) ÷装置の運転液量（L) ■■■■ (式 3)
[0123] また、回分培養での発酵生産速度は、原料炭素源をすベて消費した時点の生産 物量 (g)を、炭素源の消費に要した時間 (h)とその時点の培養液量 (L)で除して求 められる。
[0124] 次に、本発明の連続発酵装置について説明する。本発明の連続発酵装置は、エタ ノール、 1, 3 プロパンジオール、 1,4 ブタンジオール、グリセロールなどのアルコ ール、酢酸、乳酸、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、ィタコン酸、クェン酸などの有機 酸、 L—スレオ-ン、 L リジン、 L グルタミン酸、 L トリプトファン、 L—イソロイシン 、 L グルタミン、 L アルギニン、 L ァラニン、 L ヒスチジン、 L プロリン、 Lーフ ェニルァラニン、 L ァスパラギン酸、 L チロシン、メチォニン、セリン、ノ リン、口イシ ンなどのアミノ酸、イノシン、グアノシンなど核酸、カダベリンなどのジァミン化合物、酵 素、抗生物質、組換えタンパク質の生産に適用することが可能である。
[0125] 本発明の連続発酵装置は、微生物もしくは培養細胞の発酵培養液を分離膜で濾 過し、濾液力 生産物を回収するとともに未濾過液を前記の発酵培養液に保持また は還流し、かつ、発酵原料を前記の発酵培養液に追加する連続発酵による化学品 の製造装置である。
[0126] 本発明の連続発酵装置は、微生物もしくは培養細胞を発酵培養させるための発酵 反応槽をもつ。
[0127] 本発明の連続発酵装置のひとつの形態は、発酵反応槽に発酵培養液循環手段を 介して接続され内部に分離膜を備えた発酵培養液を濾過するための膜分離槽と、分 離膜の膜間差圧を 0.1から 20kPaの範囲に制御する手段力もなり、該分離膜が平均 細孔径 0.01 μ m以上 1 μ m未満の多孔性膜である。
[0128] 本発明の連続発酵装置の別の形態は、発酵反応槽内部に配設され分離膜を備え た発酵培養液を濾過するための分離膜エレメントと、該分離膜エレメントに接続され 濾過された発酵生産物を排出するための手段と、該分離膜の膜間差圧を 0.1から 20 kPaの範囲に制御するための手段力もなり、該分離膜が平均細孔径 0.01 μ m以上 1 μ m未満の細孔を有する多孔性膜である。
[0129] 本発明の連続発酵装置は、好ましくは、多孔性膜の純水透過係数が、 2 X 10"9m3
/ s/ pa以上 6 X 10 m /m / s/ pa以下でめる。
[0130] 本発明の連続発酵装置は、好ましくは、多孔性膜の平均細孔径が、 0.01 μ m以上 0.2 m未満であり、かつ、多孔性膜の細孔径の標準偏差が 0.1 m以下である。
[0131] 本発明の連続発酵装置は、好ましくは、多孔性膜の膜表面粗さが 0.1 m以下の 多孔性膜である。
[0132] 本発明の連続発酵装置は、好ましくは、多孔性膜が、多孔質榭脂層を含む多孔性 膜である。本発明の連続発酵装置は、より好ましくは、多孔質榭脂層が、有機高分子 力もなる多孔質榭脂層である。本発明の連続発酵装置は、さらにより好ましくは、有 機高分子膜の材質が、ポリフッ化ビ-リデンである。
[0133] 次に、本発明の化学品の製造方法で用いられる連続発酵装置について、図を用い て説明する。
[0134] 図 1は、本発明の化学品の製造方法で用いられる膜分離型連続発酵装置の例を 説明するための概要側面図である。図 1は、分離膜エレメントが、発酵反応槽の外部 に設置された代表的な例である。
[0135] 図 1において、膜分離型連続発酵装置は、発酵反応槽 1と膜分離層 12と水頭差制 御装置 3で基本的に構成されている。ここで、分離膜エレメント 2には、多孔性膜が組 み込まれている。この多孔性膜としては、例えば、国際公開第 2002Z064240号パ ンフレットに開示されている分離膜、および分離膜エレメントを使用することが好適で ある。また、膜分離槽 12は、発酵液循環ポンプ 11を介して発酵反応槽 1に接続され ている。
[0136] 図 1において、培地供給ポンプ 7によって培地を発酵反応槽 1に投入し、必要に応 じて、攪拌機 5で発酵反応槽 1内の発酵液を攪拌し、また必要に応じて、気体供給装 置 4によって必要とする気体を供給することができる。この時、供給した気体を回収リ サイクルして再び気体供給装置 4で供給することができる。また必要に応じて、 pHセ ンサ '制御装置 9およびよび pH調整溶液供給ポンプ 8によって発酵液の pHを調整し 、また必要に応じて、温度調節器 10によって発酵液の温度を調節することにより、生 産性の高い発酵生産を行うことができる。さらに、装置内の発酵液は、発酵液循環ポ ンプ 11によって発酵反応槽 1と膜分離槽 12の間を循環する。発酵生産物を含む発 酵液は、分離膜エレメント 2によって微生物と発酵生産物に濾過'分離され、装置系 力も取り出すことができる。また、濾過'分離された微生物は、装置系内にとどまること で装置系内の微生物濃度を高く維持でき、生産性の高 、発酵生産を可能として 、る 。ここで、分離膜エレメント 2による濾過 '分離には膜分離槽 12の水面との水頭差圧 によって行い、特別な動力を必要としない。必要に応じて、レベルセンサ 6および水 頭差圧制御装置 3によって、分離膜エレメント 2の濾過'分離速度および装置系内の 発酵液量を適当に調節することができる。必要に応じて、気体供給装置 4によって必 要とする気体を膜分離槽 12内に供給することができる。この時、供給した気体を回収 リサイクルして再び気体供給装置 4で供給することができる。分離膜エレメント 2による 濾過 ·分離は、必要に応じて、ポンプ等による吸引濾過あるいは装置系内を加圧する ことにより濾過 '分離することもできる。また、培養槽で連続発酵に微生物または培養 細胞を培養し、必要に応じて発酵槽内に供給することができる。培養槽で連続発酵 に微生物または培養細胞を培養し、必要に応じて発酵槽内に供給することにより、常 にフレッシュでィ匕学品の生産能力の高い微生物または培養細胞による連続発酵が 可能となり、高い生産性能を長期間維持した連続発酵が可能となる。
[0137] 次に、図 2は、本発明で用いられる他の膜分離型連続発酵装置の例を説明するた めの概要側面図である。本発明の化学品の製造方法で用いられる連続発酵装置の うち、分離膜エレメントが発酵反応槽の内部に設置された代表的な一例を図 2の概要 図に示す。 [0138] 図 2において、膜分離型連続発酵装置は、発酵反応槽 1と水頭差制御装置 3で基 本的に構成されている。発酵反応槽 1内の分離膜エレメント 2には多孔性膜が組み込 まれている。この多孔性膜としては、例えば、国際公開第 2002Z064240号パンフ レットに開示されている分離膜、および分離膜エレメントを使用することができる。分 離膜エレメントに関しては、追って詳述する。
[0139] 次に、図 2の膜分離型連続発酵装置による連続発酵の形態について説明する。
[0140] 培地供給ポンプ 7によって、培地を発酵反応槽 1に連続的もしくは断続的に投入す る。培地は、投入前に必要に応じて加熱殺菌、加熱滅菌あるいはフィルターを用いた 滅菌処理を行うことができる。酵生産時には、必要に応じて、発酵反応槽 1内の攪拌 機 5で発酵反応槽 1内の発酵液を攪拌する。発酵生産時には、必要に応じて、気体 供給装置 4によって必要とする気体を発酵反応槽 1内に供給することができる。発酵 生産時は、必要に応じて、 pHセンサ'制御装置 9および pH調整溶液供給ポンプ 8に よって発酵反応槽 1内の発酵液の pHを調整し、必要に応じて、温度調節器 10によつ て発酵反応槽 1内の発酵液の温度を調節することにより、生産性の高い発酵生産を 行うことができる。ここでは、計装 ·制御装置による発酵液の物理ィ匕学的条件の調節 に、 pHおよび温度を例示した力 必要に応じて、溶存酸素や ORPの制御、オンライ ンケミカルセンサーなどの分析装置により、発酵液中の化学品の濃度を測定し、発酵 液中の化学品の濃度を指標とした物理ィ匕学的条件の制御を行うことができる。また、 培地の連続的もしくは断続的投入は、好ましくは、上記計装装置による発酵液の物 理化学的環境の測定値を指標として、培地投入量および速度を適宜調節する。
[0141] 図 2において、発酵液は、発酵反応槽 1内に設置された分離膜エレメント 2によって 、微生物と発酵生産物が、濾過 ·分離され、発酵生産物が装置系から取り出される。 また、濾過 ·分離された微生物が装置系内に留まることにより装置系内の微生物濃度 を高く維持することができ、生産性の高い発酵生産を可能としている。ここで、分離膜 エレメント 2による濾過 ·分離は発酵反応槽 1の水面との水頭差圧によって行い、特別 な動力を必要としない。また、必要に応じて、レベルセンサ 6および水頭差圧制御装 置 3によって、分離膜エレメント 2の濾過'分離速度およびよび発酵反応槽 1内の発酵 液量を適当に調節することができる。上記の分離膜エレメントによる濾過 ·分離には、 必要に応じて、ポンプ等による吸引濾過あるいは装置系内を加圧することにより、濾 過 ·分離することもできる。また、培養槽で連続発酵に微生物または培養細胞を培養 し、必要に応じて発酵槽内に供給することができる。培養槽で連続発酵に微生物ま たは培養細胞を培養し、必要に応じて発酵槽内に供給することにより、常にフレツシ ュでィ匕学品の生産能力の高い微生物または培養細胞による連続発酵が可能となり、 高い生産性能を長期間維持した連続発酵が可能となる。
[0142] 本発明の化学品の製造方法で用いられる連続発酵装置で、好ましく用いられる分 離膜エレメントについて、説明する。
[0143] 図 3に示す分離膜エレメントについて説明する。本発明の化学品の製造方法で用 いられる連続発酵装置では、好ましくは、国際公開第 2002Z064240号パンフレツ トに開示されている分離膜および分離膜エレメントを用いることができる。分離膜エレ メントは、図 3に示すように、剛性を有する支持板 13の両面に、流路材 14と前記の分 離膜 15をこの順序で配し構成されている。支持板 13は、両面に凹部 16を有している 。分離膜 15は、発酵液をろ過する。流路材 14は、分離膜 15でろ過された透過水を 効率よく支持板 13に流すためのものである。支持板 13に流れた透過水は、支持板 1 3の凹部 16を通り、集水パイプ 17を介して発酵培養槽外部に取り出される。透過水 を取り出すための動力として、水頭差圧、ポンプ、液体や気体等による吸引濾過、あ るいは装置系内を加圧するなどの方法を用いることができる。
[0144] 次に、図 4に示す分離膜エレメントについて説明する。分離膜エレメントは、図 4〖こ 示すように、中空糸膜で構成された分離膜束 18と上部榭脂封止層 19、下部榭脂封 止層 20によって主に構成される。分離膜束は上部榭脂封止層 19、および下部榭脂 封止層 20よって束状に接着 ·固定化されている。下部榭脂封止層による接着 '固定 化は中空糸膜の中空部を封止しており、発酵培養液の漏出を防ぐ構造になっている 。一方、上部榭脂封止層 19は中空糸膜の内孔を封止しておらず、集水パイプ 22に 透過水が流れる構造となっている。この分離膜エレメントは、支持フレーム 21を介し て連続発酵装置内に設置することが可能である。分離膜束 18によって濾過された透 過水は、中空糸膜の中空部を通り、集水パイプ 22を介して発酵培養槽外部に取り出 される。透過水を取り出すための動力として、水頭差圧、ポンプ、液体や気体等によ る吸引濾過、あるいは装置系内を加圧するなどの方法を用いることができる。
[0145] 本発明の化学品の製造方法で用いられる連続発酵装置の分離膜エレメントを構成 する部材は、高圧蒸気滅菌操作に耐性の部材であることが好ましい。発酵装置内が 滅菌可能であれば、連続発酵時に好ましくない微生物による汚染の危険を回避でき 、より安定した連続発酵が可能となる。分離膜エレメントを構成する部材は、高圧蒸 気滅菌操作の条件である、 121°Cで 15分間に耐性であることが好ましい。分離膜ェ レメント部材は、例えば、ステンレス、アルミニウムなどの金属、ポリアミド系榭脂、フッ 素系榭脂、ポリカーボネート系榭脂、ポリアセタール系榭脂、ポリブチレンテレフタレ 一ト系榭脂、 PVDF、変性ポリフエ-レンエーテル系榭脂、ポリサルホン系榭脂等の 榭脂を好ましく選定できる。
[0146] 本発明の化学品の製造方法で用いられる連続発酵装置では、分離膜エレメントは 、発酵槽外に設置しても良いし、発酵槽内に設置しても良い。発酵槽外に設置する 場合には、別途膜分離槽を設けてその内部に分離膜エレメントを設置することができ 、発酵槽と膜分離槽の間を発酵液を循環させながら、分離膜エレメントにより発酵液 を連続的にろ過することができる。
[0147] 本発明の化学品の製造方法で用いられる連続発酵装置では、膜分離槽は、高圧 蒸気滅菌可能なことが望ましい。膜分離槽が高圧蒸気滅菌可能であると、雑菌によ る汚染回避が容易である。
実施例
[0148] 以下、本発明をさらに詳細に説明するために、上記化学品として、 L—乳酸、 D— 乳酸、エタノール、ピルビン酸、コハク酸、 1, 3 プロパンジオール、ィタコン酸、カダ ベリン、核酸、およびアミノ酸を選定し、それぞれの化学品を生産する能力のある微 生物あるいは培養細胞による図 1及び図 2の概要図に示す装置を用いた連続発酵の 具体的な実施形態について、実施例を挙げて説明する。
[0149] 参考例 1 L 乳酸生産能力を持つ酵母株の作製
L—乳酸生産能力を持つ酵母株を下記のように造成した。ヒト由来 LDH遺伝子を 酵母ゲノム上の PDC1プロモーターの下流に連結することで L 乳酸生産能力を持 つ酵母株を造成した。ポリメラーゼ'チェーン'リアクション (PCR)には、 La— Taq (宝 酒造）、あるいは KOD- Plus-polymerase (東洋紡）を用い、付属の取扱説明に従って 行った。
[0150] ヒト乳ガン株化細胞（MCF— 7)を培養回収後、 TRIZOL Reagent (Invitrogen)を用 いて total RNAを抽出し、得られた total RNAを铸型として Superscript Choice Syste m (Invitrogen)を用いた逆転写反応により cDN Aの合成を行った。これらの操作の詳 細は、それぞれ付属のプロトコールに従った。得られた cDNAを続く PCRの増幅铸 型とした。
[0151] 上記操作で得られた cDNAを増幅铸型とし、配列番号 1および配列番号 2で表され るオリゴヌクレオチドをプライマーセットとした KOD- Plus- polymeraseによる PCRにより L ldh遺伝子のクローユングを行った。各 PCR増幅断片を精製し末端を T4 Polynuc leotide Kinase (TAKARA社製）によりリン酸ィ匕後、 pUC 118ベクター（制限酵素 Hindi で切断し、切断面を脱リン酸化処理したもの）にライゲーシヨンした。ライゲーシヨンは 、 DNA Ligation Kit Ver.2 (TAKARA社製）を用いて行った。ライゲーシヨンプラスミド 産物で大腸菌 DH5 aを形質転換し、プラスミド DNAを回収することにより各種 L Id h遺伝子 (配列番号 3)がサブクローユングされたプラスミドを得た。得られた L—ldh 遺伝子が挿入された pUCl 18プラスミドを制限酵素 Xholおよび Notlで消化し、得ら れた各 DNA断片を酵母発現用ベクター pTRSl l (図 5)の XholZNotl切断部位に 挿入した。このようにしてヒト由来 L—ldh遺伝子発現プラスミド pL— ldh5 (L—ldh遺 伝子）を得た。なお、ヒト由来の L ldh遺伝子発現ベクターである上記 pL— ldh5は 、プラスミド単独で独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター (茨 城県つくば巿東 1 - 1 - 1中央第 6)に FERM AP— 20421として寄託した (寄託日： 平成 17年 2月 21日）。
[0152] ヒト由来 LDH遺伝子を含むプラスミド pL-ldh5を増幅铸型とし、配列番号 4および 配列番号 5で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとした PCRにより 1. 3kbの ヒト由来 LDH遺伝子、及びサッカロミセス ·セレビセ由来の TDH3遺伝子のターミネ 一ター配列含む DNA断片を増幅した。また、プラスミド pRS424を増幅铸型として、 配列番号 6および配列番号 7で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとした P CRにより 1. 2kbのサッカロミセス ·セレビセ由来の TRP1遺伝子を含む DNA断片を 増幅した。それぞれの DNA断片を 1. 5%ァガロースゲル電気泳動により分離、常法 に従い精製した。ここで得られた 1. 3kb断片、 1. 2kb断片を混合したものを増幅铸 型とし、配列番号 4および配列番号 7で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセット とした PCR法によって得られた産物を 1. 5%ァガロースゲル電気泳動して、ヒト由来 LDH遺伝子及び TRP1遺伝子が連結された 2. 5kbの DNA断片を常法に従 、調整 した。この 2. 5kbの DNA断片で出芽酵母 NBRC10505株を常法に従いトリプトファ ン非要求性に形質転換した。
[0153] 得られた形質転換細胞がヒト由来 LDH遺伝子を酵母ゲノム上の PDC1プロモータ 一の下流に連結されている細胞であることの確認は、下記のように行った。まず、形 質転換細胞のゲノム DNAを常法に従って調製し、これを増幅铸型とした配列番号 8 および配列番号 9で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとした PCRにより 0 . 7kbの増幅 DNA断片が得られることで確認した。また、形質転換細胞が乳酸生産 能力を持つかどうかは、 SC培地（METHODS IN YEAST GENETICS 200 0 EDITION, CSHL PRESS)で形質転換細胞を培養した培養上澄に乳酸が 含まれていることを下記に示す条件で HPLC法により乳酸量を測定することで確認し た。
[0154] カラム： Shim- Pack SPR- H (島津社製）
移動相： 5mM p トルエンスルホン酸（流速 0. 8mL/min)
反応液： 5mM p トルエンスルホン酸、 20mMビストリス、 0. ImM EDTA- 2Na ( 流速 0. 8mL/ min
検出方法:電気伝導度
温度： 45°C。
[0155] また、 L 乳酸の光学純度測定は以下の条件で HPLC法により測定した。
[0156] カラム： TSK- gel Enantio L1 (東ソ一社製）
移動相： ImM硫酸銅水溶液
： 1. Omレ mm
検出方法： UV254nm
温度：30°C。 [0157] また、 L 乳酸の光学純度は次式で計算される。
[0158] 光学純度（％) = 100 X (L- D) / (L + D)
ここで、 Lは L 乳酸の濃度、 Dは D 乳酸の濃度を表す。
[0159] HPLC分析の結果、 4gZLの L 乳酸が検出され、 D 乳酸は検出限界以下であ つた。以上の検討により、この形質転換体が L—乳酸生産能力を持つことを確認した 。得られた形質転換細胞を酵母 SW— 1株として、続く実施例に用いた。
[0160] 参考例 2 多孔性膜の作製 (その 1)
榭脂として、ポリフッ化ビ-リデン (PVDF)榭脂と、溶媒として、 N, N ジメチルァ セトアミドをそれぞれ用い、これらを 90°Cの温度下に十分に攪拌し、次の組成を有す る原液を得た。
[0161] ポリフッ化ビ-リデン： 13. 0重量0 /0
N, N—ジメチルァセトアミド： 87. 0重量％
次に、上記原液を 25°Cの温度に冷却した後、あら力じめガラス板上に貼り付けて置 いた、密度が 0. 48g/cm3、厚みが 220 μ mのポリエステル繊維製不織布に塗布し 、直ちに次の組成を有する 25°Cの温度の凝固浴中に 5分間浸漬して、多孔質榭脂 層が形成された多孔質基材を得た。
[0162] 水： 30. 0重量％
N, N—ジメチルァセトアミド： 70. 0重量0 /0。
[0163] この多孔質基材をガラス板力 剥がした後、 80°Cの温度の熱水に 3回浸漬して、 N , N—ジメチルァセトアミドを洗い出し、分離膜を得た。
[0164] 多孔質榭脂層表面の 9. 2 ^ πι Χ 10. 4 μ mの範囲内を、倍率 10, 000倍で走査 型電子顕微鏡観察を行った。観察できる細孔すベての直径の平均は、 0. 1 μ mであ つた o
[0165] 次に、上記分離膜について、純水透過係数を評価した。 50 X 10"9mVm2 - s - Pa であった。純水透過係数の測定は、逆浸透膜による 25°Cの精製水を用い、ヘッド高 さ lmで行った。
[0166] また、平均細孔径の標準偏差は、 0. 035 μ m、膜表面粗さは 0. 06 μ mであった 。このようにして作製した多孔性膜は、本発明に好適に用いることができた。 [0167] 参考例 3 多孔性膜の作製 (その 2)
榭脂としてポリフッ化ビ-リデン (PVDF)榭脂と、開孔剤として、分子量が約 20, 00 0のポリエチレングリコール（PEG)と、溶媒として、 N, N—ジメチルァセトアミドと、非 溶媒として純水を、それぞれ用い、これらを 90°Cの温度下に十分に攪拌し、次の組 成を有する原液を得た。
[0168] ポリフッ化ビ-リデン： 13. 0重量0 /0
ポリエチレングリコール： 5. 5重量％
N, N—ジメチルァセトアミド： 78. 0重量％
純水： 3. 5重量％ 。
[0169] 次に、上記原液を 25°Cに冷却した後、密度が 0. 48g/cm3、厚みが 220 μ mの ポリエステル繊維製不織布に塗布し、塗布後、直ちに 25°Cの純水中に 5分間浸漬し 、さらに 80°Cの熱水に 3回浸漬して、 N, N—ジメチルァセトアミドおよびポリエチレン グリコールを洗い出し、分離膜を得た。
[0170] この分離膜の原液を塗布した側における、多孔質榭脂層表面の 9. 2 m X 10. 4
/z mの範囲内を、倍率 10, 000倍で走査型電子顕微鏡観察を行った。観察できる細 孔すべての直径の平均は 0. 02 μ mであった。
[0171] この分離膜にっ 、て、純水透過係数を評価した。純水透過係数は、 2 X 10"9mV m2' s'Paであった。純水透過係数の測定は、逆浸透膜による 25°Cの精製水を用い、 ヘッド高さ lmで行った。
[0172] 平均細孔径の標準偏差は、 0. 0055 μ m、膜表面粗さは、 0. 1 mであった。こ のようにして作製した多孔性膜は本発明に好適に用いることができた。
[0173] 参考例 4 多孔性膜の作製 (その 3)
以下に示す組成の原液を用いたほかは、参考例 3と同様にして、分離膜を得た。
[0174] ポリフッ化ビ-リデン： 13. 0重量0 /0
ポリエチレングリコール： 5. 5重量％
N, N—ジメチルァセトアミド： 81. 5重量0 /0。
[0175] この分離膜の原液を塗布した側における、多孔質榭脂層表面の 9. 2 m X 10. 4
/z mの範囲内を、倍率 10, 000倍で走査型電子顕微鏡観察を行った。観察できる細 孔すべての直径の平均は 0. 19 mであった。
[0176] この分離膜について、純水透過係数を評価したところ、 100 X 10"9mVm2- s -Pa であった。純水透過係数の測定は、逆浸透膜による 25°Cの精製水を用い、ヘッド高 さ lmで行った。
[0177] また、平均細孔径の標準偏差は、 0. 060 μ m、膜表面粗さは、 0. 08 μ mであつ た。このようにして作製した多孔性膜は本発明に好適に用いることができた。
[0178] 参考例 5 多孔性膜の作製 (その 4)
榭脂としてポリフッ化ビ-リデン (PVDF)榭脂と、溶媒として N, N ジメチルァセト アミドをそれぞれ用い、これらを 90°Cの温度下に十分に攪拌し、次の組成を有する 原液を得た。
[0179] ポリフッ化ビ-リデン： 15. 0重量0 /0
N, N—ジメチルァセトアミド： 85. 0重量％
次に、上記原液を 25°Cの温度に冷却した後、あら力じめガラス板上に貼り付けて置 いた、密度が 0. 48g/cm3、厚みが 220 μ mのポリエステル繊維製不織布に塗布し 、直ちに次の組成を有する 25°Cの温度の凝固浴中に 5分間浸漬して、多孔質榭脂 層が形成された多孔質基材を得た。
[0180] 水： 100. 0重量％
この多孔質基材をガラス板力 剥がした後、 80°Cの温度の熱水に 3回浸漬して N, N ジメチルァセトアミドを洗い出し、分離膜を得た。多孔質榭脂層表面の 9. 2 m X IO. 4 mの範囲内を、倍率 10, 000倍で走査型電子顕微鏡観察を行ったところ 、観察できる細孔すベての直径の平均は 0. 008 mであった。次に、上記分離膜に ついて純水透水量を評価したところ、 0. 3 X 10— 9m3Zm2' s 'Paであった。透水量の 測定は、逆浸透膜による 25°Cの精製水を用い、ヘッド高さ lmで行った。また、平均 細孔径の標準偏差は、 0. 002 m、膜表面粗さは、 0. 06 mであった。
[0181] 実施例 1 酵母を用いた連続発酵による L 乳酸の製造 (その 1)
図 1の連続発酵装置と表 1に示す組成の酵母乳酸発酵培地を用い、 L 乳酸の製 造を行った。培地は高圧蒸気滅菌（121°C、 15分)して用いた。分離膜エレメント部 材としては、ステンレス、及び、ポリサルホン樹脂の成型品を用いた。分離膜としては 参考例 2で作製した多孔性膜を用いた。実施例 1における運転条件は、特に断らな い限り、以下のとおりである。
[0182] 反応槽容量 : 2 (L)
膜分離槽容量: 0. 5 (L)
使用分離膜:ポリフッ化ビニリデン濾過膜
膜分離エレメント有効濾過面積： 60平方 cm
温度調整： 30 (°C)
反応槽通気量: 0. 05 (L/min)
膜分離槽通気量: 0. 3 (L/min)
反応槽攪拌速度： 100 (rpm)
pH調整： IN NaOHにより pH5に調整
乳酸発酵培地供給速度： 50〜300mlZhr.の範囲で可変制御
発酵液循環装置による循環液量: 0. 1 (L/min)
膜透過水量制御:膜間差圧による流量制御
(連続発酵開始後〜 100時間： 0. lkPa以上 5kPa以下で制御
100時間〜 200時間： 0. lkPa以上 2kPa以下で制御
200時間〜 300時間： 0. lkPa以上 20kPa以下で制御）。
[0183] 微生物として参考例 1で造成した酵母 SW— 1株を用い、培地として表 1に示す組 成の乳酸発酵培地を用い、生産物である乳酸の濃度の評価には、参考例 1に示した HPLCを用い、グルコース濃度の測定にはグルコーステストヮコー C (和光純薬）を用 いた。
[0184] [表 1] 酵母乳酸発酵培地 グルコース 100 g feast Nitrogen base
w/o amino acid(Diico社) 6.7 g ロイシンを除く
標準 19種アミノ酸 152 mg
ロイシン 760 mg イノシ! ^一ル 152 mg
P-ァミノ安息香酸 16 mg アデニン 40 mg ゥラシル 152 mg
単位（1 Liter)
[0185] まず、 SW— 1株を試験管で 5mlの乳酸発酵培地で一晩振とう培養した (前々々培 養)。得られた培養液を新鮮な乳酸発酵培地 100mlに植菌し、 500ml容坂ロフラス コで 24時間、 30°Cで振とう培養した (前々培養)。前々培養液を、図 1に示す連続発 酵装置の 1. 5Lの乳酸発酵培地に植菌し、反応槽 1を付属の攪拌機 5によって攪拌 し、反応槽 1の通気量の調整、温度調整、 pH調整を行い、発酵液循環ポンプ 10を 稼働させることなぐ 24時間培養を行った (前培養)。前培養完了後直ちに、発酵液 循環ポンプ 10を稼働させ、前培養時の運転条件に加え、膜分離槽 2を通気し、乳酸 発酵培地の連続供給を行！ヽ、膜分離型連続発酵装置の発酵液量を 2Lとなるよう膜 透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵による L—乳酸の製造を行った 。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置 3により水頭差 を膜間差圧として測定し、上記膜透過水量制御条件で変化させることで行った。適 宜、膜透過発酵液中の生産された L 乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定し た。
[0186] 300時間の連続発酵試験を行った結果を表 2に示す。図 1に示す連続発酵装置を 用いた本発明の化学品の製造方法により、安定した L 乳酸の連続発酵による製造 が可能であった。連続発酵の全期間中の膜間差圧は、 2kPa以下で推移した。
[0187] 実施例 2 酵母を用いた連続発酵による L 乳酸の製造 (その 2) 分離膜としては参考例 3で作製した多孔性膜を用い、実施例 1と同様の L 乳酸連 続発酵試験を行った。その結果を表 2に示す。その結果、安定した L 乳酸の連続 発酵による製造が可能であった。連続発酵の全期間中の膜間差圧は、 2kPa以下で 推移した。
[0188] 実施例 3 酵母を用いた連続発酵による L 乳酸の製造 (その 3)
分離膜としては参考例 4で作製した多孔性膜を用 V、、実施例 1と同様の L 乳酸連 続発酵試験を行った。その結果を表 2に示す。その結果、安定した L 乳酸の連続 発酵による製造が可能であった。連続発酵の期間中の膜間差圧は、 2kPa以下で推 移した。
[0189] 実施例 4 酵母を用いた連続発酵による L 乳酸の製造 (その 4)
図 2に示す連続発酵装置と表 1に示す組成の乳酸発酵培地を用い、 L 乳酸の製 造を行った。培地は高圧蒸気滅菌（121°C、 15分)して用いた。分離膜エレメント部 材としては、ステンレス、及びポリサルホン樹脂の成型品を用いた。分離膜としては参 考例 1で作製した多孔性膜を用いた。本実施例における運転条件は、特に断らない 限り、以下のとおりである。
[0190] 反応槽容量 : 2 (L)
使用分離膜:ポリフッ化ビニリデン濾過膜
膜分離エレメント有効濾過面積： 120平方 cm
温度調整： 30 (°C)
発酵反応槽通気量: 0. 05 (L/min)
乳酸発酵培地供給速度： 50〜300mlZhr.の範囲で可変制御
発酵反応槽攪拌速度： 800 (rpm)
pH調整： IN NaOHにより pH5に調整
膜透過水量制御:膜間差圧による流量制御
(連続発酵開始後〜 80時間： 0. lkPa以上 5kPa以下で制御
80時間〜 160時間： 0. lkPa以上 2kPa以下で制御
160時間〜 240時間： 0. lkPa以上 20kPa以下で制御）
滅菌:分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は総て 121°C、 20minの オートクレープにより高圧蒸気滅菌。
[0191] 微生物として参考例 1で造成した酵母 SW— 1株を用い、培地として表 1に示す組 成の乳酸発酵培地を用い、生産物である L 乳酸の濃度の評価には、参考例 1に示 した HPLCを用 ヽ、ダルコース濃度の測定にはダルコーステストヮコ一 C (和光純薬） を用いた。
[0192] まず、 SW— 1株を試験管で 5mlの乳酸発酵培地で一晩振とう培養した (前々々培 養)。得られた培養液を新鮮な乳酸発酵培地 100mlに植菌し、 500ml容坂ロフラス コで 24時間、 30°Cで振とう培養した (前々培養)。前々培養液を、図 2に示した膜分 離型連続発酵装置の 1. 5Lの乳酸発酵培地に植菌し、反応槽 1を付属の攪拌機 5に よって 400rpmで攪拌し、反応槽 1の通気量の調整、温度調整、 pH調整を行い、 24 時間培養を行った (前培養)。前培養完了後直ちに、乳酸発酵培地の連続供給を行 い、膜分離型連続発酵装置の発酵液量を 1. 5Lとなるよう膜透過水量の制御を行い ながら連続培養し、連続発酵による L—乳酸の製造を行った。連続発酵試験を行うと きの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置 3により水頭差を膜間差圧として測定し 、上記膜透過水量制御条件で変化させることで行った。適宜、膜透過発酵液中の生 産された L—乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、該 L 乳酸、及 びグルコース濃度力 算出された投入グルコース力も算出された L—乳酸対糖収率 、 L 乳酸生産速度を表 2に示した。
[0193] 240時間の発酵試験を行った結果、図 2に示す連続発酵装置を用いた本発明の 化学品の製造方法により、安定した L 乳酸の連続発酵による製造が可能であった 。連続発酵の期間中の膜間差圧は、 2kPa以下で推移した。
[0194] 実施例 5 酵母を用いた連続発酵による L 乳酸の製造 (その 5)
分離膜としては参考例 3で作製した多孔性膜を用い、実施例 4と同様の L 乳酸連 続発酵試験を行った。その結果を表 2に示す。その結果、安定した L 乳酸の連続 発酵による製造が可能であった。連続発酵の全期間中の膜間差圧は、 2kPa以下で 推移した。
[0195] 実施例 6 酵母を用いた連続発酵による L 乳酸の製造 (その 6)
分離膜としては参考例 4で作製した多孔性膜を用い、実施例 5と同様の L 乳酸連 続発酵試験を行った。その結果を表 2に示す。その結果、安定した L 乳酸の連続 発酵による製造が可能であった。連続発酵の全期間中の膜間差圧は、 2kPa以下で 推移した。
[0196] 比較例 1 回分発酵による L 乳酸の製造
微生物を用いた発酵形態として最も典型的な回分発酵を行い、その L 乳酸生産 性を評価した。表 1に示す乳酸発酵培地を用い、図 1の膜分離型連続発酵装置の反 応槽 1のみを用いた回分発酵試験を行った。該培地は高圧蒸気滅菌（121°C、 15分 )して用いた。本比較例でも、微生物として参考例 1で造成した酵母 SW— 1株を用い 、生産物である L 乳酸の濃度の評価には、参考例 1に示した HPLCを用いて評価 し、グルコース濃度の測定にはグルコーステストヮコー C (和光純薬)を用いた。比較 例 2の運転条件を以下に示す。
[0197] 反応槽容量 (乳酸発酵培地量）： 1 (L)
温度調整： 30 (°C)
反応槽通気量: 0. 05 (L/min)
反応槽攪拌速度： 100 (rpm)
pH調整： IN NaOHにより pH5に調整。
[0198] まず、 SW— 1株を試験管で 5mlの乳酸発酵培地で一晩振とう培養した (前々培養) 。前々培養液を新鮮な乳酸発酵培地 100mlに植菌し 500ml容坂口フラスコで 24時 間振とう培養した (前培養)。前培養液を膜分離型連続発酵装置の 1. 5Lの乳酸発 酵培地に植菌し、反応槽 1を付属の攪拌機 5で lOOrpmで攪拌し、反応槽 1を通気し た。温度調整、 pH調整を行い、発酵液循環ポンプ 10を稼働させることなぐ回分発 酵培養を行った。この時の菌体増殖量は、 600nmでの吸光度で 14であった。回分 発酵の結果を表 2に示す。
[0199] [表 2] in
生度 L一
Figure imgf000047_0001
1および図 2に示す発酵装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、 L一 乳酸の生産速度が大幅に向上した。
[0201] 比較例 2 酵母を用いた連続発酵による L 乳酸の製造
分離膜としては参考例 5で作製した細孔径が小さぐ純水透過係数が小さい多孔性 膜を用い、膜透過水量制御方法を膜間差圧による流量制御 (連続発酵全期間 0. Ik Pa以上 20kPa以下で制御）し、それ以外は、実施例 1と同様に行った。
[0202] その結果、培養開始後 96時間で、膜間差圧が 20kPaを超え膜の閉塞が発生した ため、連続発酵を停止した。このことから、参考例 5で作製した多孔性膜は、 L 乳酸 の製造に不適であることが明らかになった。
[0203] 比較例 3 酵母を用いた連続発酵による L 乳酸の製造
分離膜としては参考例 5で作製した細孔径が小さぐ純水透過係数が小さい多孔性 膜を用い、膜透過水量制御方法を膜間差圧による流量制御 (連続発酵全期間 0. Ik Pa以上 20kPa以下で制御）し、それ以外は実施例 4と同様に行った。
[0204] その結果、培養開始後 80時間で、膜間差圧が 20kPaを超え膜の閉塞が発生した ため、連続発酵を停止した。このことから、参考例 5で作製した多孔性膜は、 L 乳酸 の製造に不適であることが明らかになった。
[0205] 実施例 7 連続発酵によるエタノールの製造 (その 1)
図 1の連続発酵装置と表 3に示す組成のエタノール発酵培地を用い、エタノールの 製造を行った。該培地は高圧蒸気滅菌（121°C、 15分)して用いた。分離膜としては 参考例 2で作製した多孔性膜を用いた。本実施例における運転条件は、特に断らな い限り、以下のとおりである。
[0206] 反応槽容量 : 2 (L)
膜分離槽容量: 0. 5 (L)
使用分離膜:ポリフッ化ビニリデン濾過膜
膜分離エレメント有効濾過面積： 120平方 cm
温度調整： 30 (°C)
反応槽通気量: 0. 05 (L/min)
膜分離槽通気量: 0. 3 (L/min)
反応槽攪拌速度： 100 (rpm) pH調整： IN NaOHにより pH5に調整
エタノール発酵培地供給速度： 50〜300mlZhr.の範囲で可変制御
発酵液循環装置による循環液量: 0. 1 (L/min)
膜透過水量制御:膜間差圧による流量制御
(連続発酵開始後〜 100時間： 0. lkPa以上 5kPa以下で制御
100時間〜 200時間： 0. lkPa以上 2kPa以下で制御
200時間〜 300時間： 0. lkPa以上 20kPa以下で制御）。
[0207] 微生物として NBRC10505株を用い、培地として表 1に示す組成のエタノール発 酵培地を用い、生産物であるエタノールの濃度の評価には、エタノール濃度は、ガス クロマトグラフ法により定量した。 Shimadzu GC- 2010キヤピラリー GC TC- 1(GL scienc e) 15 meter L. * 0.53 mm I.D., dfl.5 mを用いて、水素炎イオン化検出器により検 出'算出して、評価した。また、グルコース濃度の測定にはグルコーステストヮコー C ( 和光純薬)を用いた。
[0208] [表 3] エタノール発酵培地 グルコース 100 g
Yeast Nitrogen base
w/o amino acid(Diico|土) 6.7 g ロイシンを除く
標準 19種アミノ酸 78 mg ロイシン 380 mg イノシトール 76 mg
P-ァミノ安息香酸 8 mg
アデニン 40 mg ゥラシリレ 76 mg
単位（1/Liter) まず、 NBRC10505株を試験管で 5mlのエタノール発酵培地でー晚振とう培養し た (前々々培養)。得られた培養液を新鮮なエタノール発酵培地 100mlに植菌し、 5 00ml容坂ロフラスコで 24時間、 30°Cで振とう培養した (前々培養)。前々培養液を、 図 1に示した膜分離型連続発酵装置の 1. 5Lのエタノール発酵培地に植菌し、反応 槽 1を付属の攪拌機 5によって lOOrpmで攪拌し、反応槽 1の通気量の調整、温度調 整、 pH調整を行い、発酵液循環ポンプ 10を稼働させることなぐ 24時間培養を行つ た (前培養)。前培養完了後直ちに、発酵液循環ポンプ 10を稼働させ、前培養時の 運転条件に加え、膜分離槽 2を通気し、エタノール発酵培地の連続供給を行い、膜 分離型連続発酵装置の発酵液量を 2Lとなるよう膜透過水量の制御を行いながら連 続培養し、連続発酵によるエタノールの製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜 透過水量の制御は、水頭差制御装置 3により水頭差を膜間差圧として測定し、上記 膜透過水量制御条件で変化させることで行った。適宜、膜透過発酵液中の生産され たエタノール濃度および残存グルコース濃度を測定した結果を表 4に示す。
[0210] 図 1に示す連続発酵装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、安定したェ タノールの連続発酵による製造が可能であった。連続発酵の期間中の膜間差圧は、 2kPa以下で推移した。
[0211] 実施例 8 連続発酵によるエタノールの製造 (その 2)
図 2の連続発酵装置と表 3に示す組成のエタノール発酵培地を用い、エタノールの 製造を行った。該培地は高圧蒸気滅菌（121°C、 15分)して用いた。分離膜エレメン ト部材としては、ステンレス、及びポリサルホン樹脂の成型品を用いた。分離膜として は参考例 2で作製した多孔性膜を用いた。本実施例における運転条件は、特に断ら ない限り、以下のとおりである。
[0212] 反応槽容量 : 2 (L)
使用分離膜:ポリフッ化ビニリデン濾過膜
膜分離エレメント有効濾過面積： 120平方 cm
温度調整： 30 (°C)
発酵反応槽通気量: 0. 05 (L/min)
乳酸発酵培地供給速度： 50〜300mlZhr.の範囲で可変制御
発酵反応槽攪拌速度： 800 (rpm)
pH調整： IN NaOHにより pH5に調整
膜透過水量制御:膜間差圧による流量制御
(連続発酵開始後〜 80時間： 0. lkPa以上 5kPa以下で制御 80時間〜 160時間： 0. lkPa以上 2kPa以下で制御
160時間〜 240時間： 0. lkPa以上 20kPa以下で制御）。
[0213] 滅菌：分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は総て 121°C、 20minの オートクレープにより高圧蒸気滅菌
微生物として酵母 NBRC10505株を用い、培地として表 2に示す組成のエタノー ル発酵培地を用い、生産物であるエタノールの濃度の評価には、実施例 7に示した ガスクロマトグラフを用い、グルコース濃度の測定にはグルコーステストヮコー C (和光 純薬)を用いた。
[0214] まず、 NBRC10505株を試験管で 5mlのエタノール発酵培地でー晚振とう培養し た (前々々培養)。得られた培養液を新鮮なエタノール発酵培地 100mlに植菌し、 5 00ml容坂ロフラスコで 24時間、 30°Cで振とう培養した (前々培養)。前々培養液を、 図 2に示した膜分離型連続発酵装置の 1. 5Lの乳酸発酵培地に植菌し、反応槽 1を 付属の攪拌機 5によって 400rpmで攪拌し、反応槽 1の通気量の調整、温度調整、 p H調整を行い、 24時間培養を行った (前培養)。前培養完了後直ちに、エタノール発 酵培地の連続供給を行い、膜分離型連続発酵装置の発酵液量を 1. 5Lとなるよう膜 透過水量の制御を行!ヽながら連続培養し、連続発酵によるエタノールの製造を行つ た。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置 3により水頭 差を膜間差圧として測定し、上記膜透過水量制御条件で変化させることで行った。 適宜、膜透過発酵液中の生産されたエタノール濃度および残存グルコース濃度を測 定した。また、該エタノール、及びグルコース濃度力も算出された投入グルコースから 算出されたエタノール対糖収率、エタノール生産速度を表 4に示した。
[0215] 図 2に示す連続発酵装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、安定したェ タノールの連続発酵による製造が可能であった。連続発酵の全期間中の膜間差圧 は、 2kPa以下で推移した。
[0216] 比較例 4 回分発酵によるエタノールの製造
微生物を用いた発酵形態として最も典型的な回分発酵を行 ヽ、エタノール生産性 を評価した。表 3に示すエタノール発酵培地を用い、図 1の膜分離型連続発酵装置 の反応槽 1のみを用いた回分発酵試験を行った。該培地は高圧蒸気滅菌（121°C、 15分）して用いた。本比較例でも、微生物として NBRC10505株を用い、生産物で あるエタノールの濃度の評価には、実施例 6に示したガスクロマトグラフィーを用いて 評価し、グルコース濃度の測定にはグルコーステストヮコー C (和光純薬)を用いた。 本比較例の運転条件を以下に示す。
[0217] 反応槽容量 (エタノール発酵培地量）： 1 (L)
温度調整： 30 (°C)
反応槽通気量: 0. 05 (L/min)
反応槽攪拌速度： 100 (rpm)
pH調整： IN NaOHにより pH5に調整。
[0218] まず、 NBRC10505株を試験管で 5mlのエタノール発酵培地でー晚振とう培養し た (前々培養) o前々培養液を新鮮なエタノール発酵培地 100mlに植菌し 500ml容 坂口フラスコで 24時間振とう培養した (前培養)。前培養液を膜分離型連続発酵装置 の 1. 5Lのエタノール発酵培地に植菌し、反応槽 1を付属の攪拌機 5で lOOrpmで攪 拌し、反応槽 1を通気した。温度調整、 pH調整を行い、発酵液循環ポンプ 10を稼働 させることなく、回分発酵培養を行った。この時の菌体増殖量は、 600nmでの吸光 度で 18であった。回分発酵の結果を表 4に示す。
[0219] [表 4]
Figure imgf000052_0001
[0220] 図 1および図 2に示す発酵装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、ェタノ ールの生産速度が大幅に向上した。
[0221] 実施例 9 連続発酵によるピルビン酸の製造 (その 1)
図 1の連続発酵装置と表 5に示す組成のピルビン酸発酵培地を用い、ピルビン酸の 製造を行った。該培地は高圧蒸気滅菌（121°C、 15分)して用いた。分離膜としては 参考例 2で作製した多孔性膜を用いた。本実施例における運転条件は、特に断らな い限り、以下のとおりである。
[0222] 発酵反応槽容量: 2 (L)
使用分離膜:ポリフッ化ビニリデン濾過膜
膜分離エレメント有効濾過面積： 120平方 cm
温度調整： 30 (°C)
発酵反応槽通気量：1. 5 (L/min)
発酵反応槽攪拌速度： 800 (rpm)
pH調整： 4N NaOHにより pH5. 5に調整
滅菌:分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は総て 121°C、 20minの オートクレープにより高圧蒸気滅菌。
[0223] 膜透過水量制御:膜間差圧による流量制御
(連続発酵開始後〜 100時間： 0. lkPa以上 5kPa以下で制御
100時間〜 180時間： 0. lkPa以上 2kPa以下で制御
180時間〜 264時間： 0. lkPa以上 20kPa以下で制御）。
[0224] 微生物としてトルロプシス'グラブラータ P120— 5a株（FERM P— 16745)を用い 、培地として表 5に示す組成のピルビン酸発酵培地を用い、生産物であるピルビン酸 の濃度の評価には、下記に示す条件で HPLC法により測定した。
[0225] カラム： Shim- Pack SPR- H (島津社製）
移動相： 5mM p—トルエンスルホン酸（流速 0. 8mL/min)
反応液： 5mM p—トルエンスルホン酸、 20mMビストリス、 0. ImM EDTA' 2Na (流 MO. 8mL/ min
検出方法:電気伝導度
温度： 45°C。
[0226] また、グルコース濃度の測定にはグルコーステストヮコー C (和光純薬）を用いた。
[0227] [表 5] ピルビン酸発酵培地
ク"ルコース 100 g/L
硫酸アンモニゥム 5 g/L
リン酸二水素 ^ゥ厶 1 g/L
硫酸マグネシウム 7水和物 0.5 g/L
大豆加水分解物 2 g/L
ニコチン酸 8 mg/L
ピリト'キシン-塩酸塩 1 mg/L
ビ才チン 0.05 mg/L
チアミン'塩酸塩 0.05 mg/L
pH 5.5
まず、 P120— 5a株を試験管で 5mlのピルビン酸発酵培地で一晩振とう培養した ( 前々々培養)。得られた培養液を新鮮なピルビン酸発酵培地 100mlに植菌し、 500 ml容坂ロフラスコで 24時間、 30°Cで振とう培養した (前々培養)。前々培養液を、図 1に示した膜分離型連続発酵装置の 1. 5Lのピルビン酸発酵培地に植菌し、発酵反 応槽 1を付属の攪拌機 5によって 800rpmで攪拌し、発酵反応槽 1の通気量の調整、 温度調整、 pH調整を行い、 24時間培養を行った (前培養)。前培養完了後直ちに、 発酵液循環ポンプを稼働させ、前培養時の運転条件に加え、膜分離槽 2を通気し、 ピルビン酸発酵培地の連続供給を行 ヽ、膜分離型連続発酵装置の発酵液量を 2Lと なるよう膜透過水量の制御を行 ヽながら連続培養し、連続発酵によるピルビン酸の製 造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置 3〖こ より水頭差を膜間差圧として測定し、上記膜透過水量制御条件で変化させることで 行った。適宜、膜透過発酵液中の生産されたピルビン酸濃度および残存グルコース 濃度を測定した。 300時間の発酵試験を行った結果を表 6に示す。 [0229] 図 1に示す連続発酵装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、安定したピ ルビン酸の連続発酵による製造が可能であった。連続発酵の期間中の膜間差圧は、 2kPa以下で推移した。
[0230] 実施例 10 連続発酵によるピルビン酸の製造 (その 2)
図 2の連続発酵装置と表 5に示す組成のピルビン酸発酵培地を用い、ピルビン酸の 製造を行った。該培地は高圧蒸気滅菌（121°C、 15分)して用いた。分離膜エレメン ト部材としては、ステンレス、及びポリサルホン樹脂の成型品を用いた。分離膜として は参考例 2で作製した多孔性膜を用いた。本実施例における運転条件は、特に断ら ない限り、以下のとおりである。
[0231] 反応槽容量 : 2 (L)
使用分離膜:ポリフッ化ビニリデン濾過膜
膜分離エレメント有効濾過面積： 120平方 cm
温度調整： 30 (°C)
発酵反応槽通気量： 1 (L/min)
乳酸発酵培地供給速度： 50〜300mlZhr.の範囲で可変制御
発酵反応槽攪拌速度： 800 (rpm)
pH調整： 4N NaOHにより pH5. 5に調整
膜透過水量制御:膜間差圧による流量制御。
[0232] (連続発酵開始後〜 100時間： 0. lkPa以上 5kPa以下で制御
100時間〜 180時間： 0. lkPa以上 2kPa以下で制御
180時間〜 264時間： 0. lkPa以上 20kPa以下で制御）
滅菌:分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は総て 121°C、 20minの オートクレープにより高圧蒸気滅菌。
[0233] 微生物としてトルロプシス'グラブラータ P120— 5a株（FERM P— 16745)を用い 、培地として表 5に示す組成のピルビン酸発酵培地を用い、生産物であるピルビン酸 の濃度の評価には、下記に示す条件で HPLC法により測定した。
[0234] まず、 P120— 5a株を試験管で 5mlのピルビン酸発酵培地で一晩振とう培養した ( 前々々培養)。得られた培養液を新鮮なピルビン酸発酵培地 100mlに植菌し、 500 ml容坂ロフラスコで 24時間、 30°Cで振とう培養した (前々培養)。前々培養液を、図 2に示した膜分離型連続発酵装置の 1. 5Lの乳酸発酵培地に植菌し、反応槽 1を付 属の攪拌機 5によって 800rpmで攪拌し、反応槽 1の通気量の調整、温度調整、 pH 調整を行い、 24時間培養を行った (前培養)。前培養完了後直ちに、ピルビン酸発 酵培地の連続供給を行い、膜分離型連続発酵装置の発酵液量を 1. 5Lとなるよう膜 透過水量の制御を行!ヽながら連続培養し、連続発酵によるピルビン酸の製造を行つ た。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置 3により水頭 差を膜間差圧として測定し、上記膜透過水量制御条件で変化させることで行った。 適宜、膜透過発酵液中の生産されたピルビン酸濃度および残存グルコース濃度を測 定した。また、該ピルビン酸、及びグルコース濃度力も算出された投入グルコースから 算出された乳酸対糖収率、乳酸生産速度を表 6に示した。
[0235] 300時間の発酵試験を行った結果、図 2に示す連続発酵装置を用いた本発明の 化学品の製造方法により、安定したピルビン酸の連続発酵による製造が可能であつ た。連続発酵の全期間中の膜間差圧は、 2kPa以下で推移した。
[0236] 実施例 11 連続発酵によるピルビン酸の製造 (その 3)
図 1の連続発酵装置を用い、微生物として NBRC0005株を用い、その他の条件は すべて実施例 9と同様に行った。連続発酵を行った結果を表 6に示した。 300時間の 発酵試験を行った結果、図 1に示す連続発酵装置を用いた本発明の化学品の製造 方法により、安定したピルビン酸の連続発酵による製造が可能であった。連続発酵の 全期間中の膜間差圧は、 2kPa以下で推移した。
[0237] 実施例 12 連続発酵によるピルビン酸の製造 (その 4)
図 2の連続発酵装置を用い、微生物として NBRC0005株を用い、その他の条件は すべて実施例 10と同様に行った。連続発酵を行った結果を表 6に示した。 300時間 の発酵試験を行った結果、図 2に示す連続発酵装置を用いた本発明の化学品の製 造方法により、安定したピルビン酸の連続発酵による製造が可能であった。連続発酵 の全期間中の膜間差圧は、 2kPa以下で推移した。
[0238] 比較例 5 回分発酵によるピルビン酸の製造 (その 1)
微生物を用いた発酵形態として最も典型的な回分発酵を 2L容のジャーフアーメン ターを用いて行い、ピルビン酸生産性を評価した。培地には表 5に示す培地を用い、 高圧蒸気滅菌処理（121°C、 15分)して用いた。本比較例では、微生物として P120 5a株を用い、生産物であるピルビン酸の濃度の評価には、実施例 9に示した HPL Cを用 V、て評価し、ダルコース濃度の測定にはダルコーステストヮコ一 C (和光純薬） を用いた。本比較例の運転条件を以下に示す。
[0239] 発酵反応槽容量 (ピルビン酸発酵培地量）： 1 (L)
温度調整： 30 (°C)
発酵反応槽通気量： 1 (L/min)
発酵反応槽攪拌速度： 600 (rpm)
pH調整： 4N NaOHにより pH5. 5に調整。
[0240] まず、 P120— 5a株を試験管で 5mlのピルビン酸発酵培地で一晩振とう培養した ( 前々培養)。前々培養液を新鮮なピルビン酸発酵培地 50mlに植菌し 500ml容坂口 フラスコで 24時間振とう培養した (前培養)。前培養液をジャーフアーメンターの 1Lの ピルビン酸発酵培地に植菌し、回分発酵を行った。回分発酵の結果を、表 6に示す。
比較例 6 回分発酵によるピルビン酸の製造 (その 2)
微生物を用いた発酵形態として最も典型的な回分発酵を 2L容のジャーフアーメン ターを用いて行い、ピルビン酸生産性を評価した。本比較例では、微生物として NB RC0005株を用い、その他の条件はすべて比較例 3と同様に行った。回分発酵の結 果を、表 6に示す。
[表 6]
Figure imgf000058_0002
Figure imgf000058_0001
ビン酸の生産速度が大幅に向上した。
[0244] 実施例 13 連続発酵によるコハク酸の連続製造 (その 1)
図 1に示す連続発酵装置を用いたコハク酸の製造を行った。
[0245] コハク酸の製造におけるコハク酸およびグルコースは、特に断らない限り、以下の 方法で測定した。コハク酸は、培養液の遠心上清について、 HPLC (島津 LC10A 、 RIモニター： RID- 10A、カラム：アミネックス HPX- 87H)で分析した。カラム温度は 50°C、 O.OIN H SOでカラムを平衡化した後、サンプルをインジェクションし、 0.01
2 4
N H SOで溶出して分析を行った。グルコースは、グルコースセンサー（BF— 4、王
2 4
子計測機器)を用いて測定した。
[0246] 使用する培地は高圧蒸気滅菌（121°C、 15分)して用いた。分離膜としては参考例 2で作製した多孔性膜を用いた。本実施例における運転条件は、特に断らない限り、 以下のとおりである。
[0247] 反応槽容量 : 2 (L)
膜分離槽容量: 0. 5 (L)
使用分離膜:ポリフッ化ビニリデン濾過膜
膜分離エレメント有効濾過面積： 60平方 cm
温度調整： 39 (°C)
反応槽 CO通気量： 10 (mL/min)
2
膜分離槽 CO通気量：100 (mLZmin)
2
反応槽攪拌速度： 100 (rpm)
pH調整： 2M Na COで pH6.4に調整
2 3
乳酸発酵培地供給速度： 50〜300mlZhr.の範囲で可変制御
発酵液循環装置による循環液量: 0. 1 (L/min)
膜透過水量制御:膜間差圧による流量制御。
[0248] (連続発酵開始後〜 100時間： 0. lkPa以上 5kPa以下で制御
100時間〜 200時間： 0. lkPa以上 2kPa以下で制御
200時間〜 264時間： 0. lkPa以上 20kPa以下で制御）。
[0249] 本実施例ではコハク酸の生産能力のある微生物として、アナエロビォスピリラムサ クシ-シプロデュセンス (Anaerobiospirillum succiniciproducens) ATCC53488株によ るコハク酸の連続製造を行った。 20g/Lグルコース、 10g/Lポリペプトン、 5g/L酵 母エキス、 3g/L K HPO、 lg/L NaCl、 lg/L (NH ) SO、 0.2g/L MgCl、 0.2
2 4 4 2 4 2 g/L CaCl · 2Η Oからなる種培養用培地 lOOmLを、 125mL容三角フラスコに入れ
2 2
加熱滅菌した。嫌気グローブボックス内で、 30mM Na CO lmLと 180mM H SO
2 3 2
0.15mLを加え、さらに、 0.25g/Lシスティン 'HC1、 0.25g/L Na Sからなる還元
4 2
溶液 0.5mLをカ卩えた後、 ATCC53488株を接種し、 39°Cで一晚静置培養した (前々 培養)。図 1に示す連続発酵装置の 1. 5Lのコハク酸発酵培地 (表 7)に、 0.25g/L システィン 'HC1、 0.25g/L Na S - 9H Oからなる還元溶液 5mLを加えた後、前々培
2 2
養液 50mLを植菌し、発酵反応槽 1を付属の攪拌機 5によって 200rpmで攪拌し、発 酵反応槽 1の CO通気量の調整、温度調整、 pH調整を行い、 24時間培養を行った
2
(前培養)。
[表 7]
コハク酸発酵培地
ァクチノハ *シラス
サクシノシ 'エネス用培地
グルコース 100.0 g/L
NaCI 1.0 g/L
CaCI2-2H20 0.2 g/L
NaH2P04-H20 1.2 g/L
Na2HP04 0.3 g/L
K2HP04 一 g/L
MgCI2-6H20 0.2 g/し ビタミン B12 10 g/L ビォチン 200 Ug L 葉酸 200 S/ チアミン 'HCI 500 g L リボフラビン 500 g/L ナイァシン 500 / g/L パントテン酸 500 g L
P—ァミノ安息香酸 500 g/L ビタミン B6 1 jUg/L 酵母エキス 5.0 g/L コーンスティ一プリカ一 10.0 g/L ポリペプトン 一 g/L
NH4CI 一 g/L
FeS04-7H20 ― g/L
養完了後直ちに、コハク酸発酵培地の連続供給を行い、膜分離型連続発酵 装置の発酵液量を 2Lとなるよう膜透過水量の制御を行 ヽながら連続培養し、連続発 酵によるコハク酸の製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、 水頭差制御装置 3により、発酵反応槽水頭差を最大 2m以内、すなわち膜間差圧が 0.1から 20kPa以内となるように適宜水頭差を変化させることで行った。適宜、膜透過 発酵液中の生産されたコハク酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、 該コハク酸、及びグルコース濃度から算出されたコハク酸生産速度およびコハク酸の 生成収率を、表 8に示した。すべての連続発酵の全期間中の膜間差圧は、 2kPa以 下で推移した。
[0252] 実施例 14 連続発酵によるコハク酸の連続製造 (その 2)
図 2に示す連続発酵装置を用いたコハク酸の製造を行った。使用する培地は高圧 蒸気滅菌（121°C、 15分)して用いた。コハク酸およびグルコース濃度の測定は実施 例 13と同様の方法で行った。分離膜として、参考例 2で作製した多孔性膜を用いた。 本実施例における運転条件は、特に断らない限り、以下のとおりである。
[0253] 反応槽容量 : 2 (L)
使用分離膜:ポリフッ化ビニリデン濾過膜
膜分離エレメント有効濾過面積： 120平方 cm
温度調整： 39 (°C)
発酵反応槽 CO通気量： 10 (mL/min)
2
乳酸発酵培地供給速度： 50〜300mlZhrの範囲で可変制御
発酵反応槽攪拌速度： 600 (rpm)
pH調整： 2M Na COで pH6.4に調整
2 3
膜透過水量制御:膜間差圧による流量制御。
[0254] (連続発酵開始後〜 80時間： 0. lkPa以上 5kPa以下で制御
80時間〜 160時間： 0. lkPa以上 2kPa以下で制御
160時間〜 280時間： 0. lkPa以上 20kPa以下で制御）
滅菌:分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は総て 121°C、 20minの オートクレープにより高圧蒸気滅菌。
[0255] 本実施例ではコハク酸の生産能力のある微生物として、アナエロビォスピリラムサ クシ-シプロデュセンス (Anaerobiospirillum succiniciproducens) ATCC53488株によ るコハク酸の連続製造を行った。 20g/Lグルコース、 10g/Lポリペプトン、 5g/L酵 母エキス、 3g/L K HPO、 lg/L NaCl、 lg/L (NH ) SO、 0.2g/L MgCl、 0.2
2 4 4 2 4 2 g/L CaCl · 2Η Oからなる種培養用培地 lOOmLを、 125mL容三角フラスコに入れ
2 2
加熱滅菌した。嫌気グローブボックス内で、 30MmNa CO lmLと 180mMH SO
2 3 2 4
0.15mLを加え、さらに、 0.25g/Lシスティン 'HC1、 0.25g/L Na S力らなる還元溶
2
液 0.5mLをカ卩えた後、 ATCC53488株を接種し、 39°Cで一晚静置培養した（前々培 養)。図 2に示す連続発酵装置の 1. 5Lのコハク酸発酵培地 (表 7)に、 0.25g/Lシス ティン 'HC1、 0.25g/L Na S - 9H Oからなる還元溶液 5mLをカ卩えた後、前々培養
2 2
液 50mLを植菌し、発酵反応槽 1を付属の攪拌機 5によって 600rpmで攪拌し、発酵 反応槽 1の CO通気量の調整、温度調整、 pH調整を行い、 24時間培養を行った（
2
前培養)。
[0256] 前培養完了後直ちに、コハク酸発酵培地の連続供給を行い、膜分離型連続発酵 装置の発酵液量を 1. 5Lとなるよう膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連 続発酵によるコハク酸の製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制 御は、水頭差制御装置 3により、発酵反応槽水頭を最大 2m以内、すなわち膜間差 圧が 0.1から 20kPa以内となるように適宜水頭差を変化させることで行った。適宜、膜 透過発酵液中の生産されたコハク酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。ま た、該コハク酸、及びグルコース濃度力も算出されたコハク酸生産速度およびコハク 酸の生成収率を、表 8に示した。すべての連続発酵の全期間中の膜間差圧は、 2kP a以下で推移した。
[0257] 比較例 7 回分培養によるコハク酸の製造
アナエロビォスピリラムサクシ-シプロデュセンス (Anaerobiospirillum succiniciprod ucens)の回分発酵によるコハク酸製造は、以下のように行った。
[0258] 20g/Lグルコース、 10g/Lポリペプトン、 5g/L酵母エキス、 3g/L K HPO、 lg/
2 4
L NaCl、 lg/L (NH ) SO、 0.2g/L MgCl、 0.2g/L CaCl · 2Η Oからなる種培
4 2 4 2 2 2
養用培地 lOOmLを、 125mL容三角フラスコに入れ加熱滅菌した。嫌気グローブボ ックス内で、 30MmNa CO lmLと 180mMH SO 0.15mLを加え、さらに、 0.25g /Lシスティン 'HC1、 0.25g/L Na Sからなる還元溶液 0.5mLを加えた後、アナエロ
2
ビォスピリラムサクシ-シプロテュセンス (Anaerobiospirillum succiniciproducens) AT CC53488を接種し、 39°Cで一晚静置培養した。表 7に示す発酵培地 1Lを、ミニジャ ーファメンター（ABLE社製、 BMJ型、 2L)にカロえ、加熱滅菌（120°C、 20min)した。
[0259] COガスをスパージヤーから、 lOmL/minで通気し、 3MNa CO溶液 10mLを加え
2 2 3
た後、硫酸溶液で pHを 6.8に調整した。 0.25g/Lシスティン 'HC1、 0.25g/L Na S
2
•9H Oからなる還元溶液 5mLを加えた後、上記の種培養液 50mL接種し、撹拌速
2
度 200rpm、温度は 39°C、 2MNa CO溶液で pH6.4に調整しながら培養を行った
2 3
。その結果を表 8に示す。
[0260] [表 8]
Figure imgf000064_0001
[0261] 図 1および図 2に示す発酵装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、コハク 酸の生産速度が大幅に向上した。
[0262] 実施例 15 連続発酵によるコハク酸の連続製造 (その 3)
図 1に示す連続発酵装置を用いたコハク酸の製造を行った。コハク酸およびダルコ ース濃度の測定は実施例 13と同様の方法で行った。使用する培地は高圧蒸気滅菌 (121°C、 15分)して用いた。分離膜としては参考例 2で作製した多孔性膜を用いた。 本実施例における運転条件は、下記膜透過水量制御以外、実施例 13と同様である
[0263] 膜透過水量制御:膜間差圧による流量制御。
[0264] (連続発酵開始後〜 100時間： 0. lkPa以上 5kPa以下で制御
100時間〜 200時間： 0. lkPa以上 2kPa以下で制御 200時間〜 254時間： 0. lkPa以上 20kPa以下で制御）。
[0265] 本実施例ではコハク酸の生産能力のある微生物として、ァクチノバシラス 'サクシノ ジェネス（Actinobacillus succinogenes) ATCC55618株を用いたコハク酸の連続製 造を行った。表 9に示すァクチノバシラス用コハク酸発酵培地 75mLと MgCO 4.0g
3 を、 lOOmL容シーラム試験管にカ卩え、 COでガス置換した後、加熱滅菌した。あらか
2
じめ、 ATCC55618株の菌体懸濁液 7.5mLを接種し、 37°Cで 24時間培養して種 培養を調製した (前々培養)。
[0266] [表 9]
コハク酸発酵培地
アナエロビ才スピリラム
サクシ二シフ °ロテュセンス用培
地
グルコース 50.0 g/L
NaCI - g/L
CaCI2-2H20 0.2 g/L
NaH2P04-H20 一 g/L
Na2HP04 一 g/L
K2HP04 1.0 g/L
MgCI2-6H20 0.2 g/L ビタミン B12 — jUg/L ビォチン 一 j g/L 葉酸 一 g/L チアミン 'HCI — jU L リボフラビン 一 / g/L ナイァシン 一 μ g/L パントテン酸 一 g/L
P—ァミノ安息香酸 一 g/L ビタミン B6 — U g/L 酵母エキス 5.0 g/L コーンスティープリカ一 一 g/L ポリペプトン 10Ό g/L
NH4CI 0.4 g/L
Figure imgf000066_0001
1に示す連続発酵装置に 1.5Lのコハク酸発酵培地 (表 9)を仕込み、前々培養 液 75mLを植菌した。 発酵反応槽 1の CO通気量を 75mL/min、分離膜槽 CO通
2 2 気量を 150mL/minとし、温度を 39°C、 5.5M NaCOで pHを 6.8に調整しながら連
3
続培養を行う以外は、実施例 13の培養と同様に連続培養を行った。適宜、膜透過発 酵液中の生産されたコハク酸濃度および残存グルコース濃度を測定し、該コハク酸、 及びグルコース濃度から算出されたコハク酸生産速度およびコハク酸の生成収率を
、表 10に示した。すべての連続発酵の全期間中の膜間差圧は、 2kPa以下で推移し た。
[0268] 実施例 16 連続発酵によるコハク酸の連続製造 (その 4)
図 2に示す連続発酵装置を用いたコハク酸の製造を行った。使用する培地は高圧 蒸気滅菌（121°C、 15分)して用いた。コハク酸およびグルコース濃度の測定は実施 例 13と同様の方法で行った。分離膜としては参考例 2で作製した多孔性膜を用いた 。本実施例における運転条件は、下記膜透過水量制御以外、実施例 14と同様であ る。
[0269] 膜透過水量制御:膜間差圧による流量制御。
[0270] (連続発酵開始後〜 100時間： 0. lkPa以上 5kPa以下で制御
100時間〜 200時間： 0. lkPa以上 2kPa以下で制御
200時間〜 280時間： 0. lkPa以上 20kPa以下で制御）。
[0271] 本実施例ではコハク酸の生産能力のある微生物として、ァクチノバシラス 'サクシノ ジェネス（Actinobacillus succinogenes) ATCC55618株を用いたコハク酸の連続製 造を行った。ァクチノバシラス 'サクシノジェネス（Actinobacillus succinogenes)による コハク酸の連続製造では、発酵反応槽 CO通気量を 75mLZminとし、 pH調整を 5.
2
5M Na COで pH6.8に調整する以外は、実施例 14の連続培養と同様に行った。
2 3
[0272] まず、表 9に示すァクチノバシラス用コハク酸発酵培地 75mLと MgCO 4.0gを、 1
3
00mL容シーラム試験管にカ卩え、 COでガス置換した後、加熱滅菌した。あらかじめ
2
、凍結保存していた ATCC55618株の菌体懸濁液 7.5mLを接種し、 37°Cで 24時 間培養して種培養を調製した (前々培養)。図 2に示す連続発酵装置に 1. 5Lのコハ ク酸発酵培地 (表 7)を仕込み、前々培養液 75mLを植菌し、 pHを 6.8に調整しなが ら、 24時間培養を行った (前培養)。前培養が終了後、表 9のコハク酸発酵培地の連 続供給を行い、図 2の膜分離型連続発酵装置の発酵液量を 1. 5Lとなるよう膜透過 水量の制御を行いながら連続発酵によるコハク酸の製造を行った。適宜、膜透過発 酵液中の生産されたコハク酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、該コ ハク酸、及びグルコース濃度力 算出されたコハク酸生産速度およびコハク酸の生 成収率を、表 10に示した。すべての連続発酵の全期間中の膜間差圧は、 2kPa以下 で推移した。
[0273] 比較例 8 回分培養によるコハク酸の製造 (その 2)
ァクチノバシラス ·サクシノジェネス (Actinobacillus succinogenes)を用いた回分発酵 によるコハク酸製造は次のように行った。
[0274] 表 9に示すァクチノパシラス用コハク酸発酵培地 50mLと MgCO 4.0gを、 lOOmL
3
容シーラム試験管にカ卩え、 COでガス置換した後、加熱滅菌した。あら力じめ、凍結
2
保存して 、たァクチノパシラス ·サクシノジェネス (Actinobacillus succinofenes) ATCC 55618の菌体懸濁液 5mLを接種し、 37°Cで 24時間培養して種培養を調製した。表 9に示す発酵培地 1Lを pH6.8に調整後、ミニジャーファメンター (ABLE社製、 BMJ 型、 2L)に加え、加熱滅菌（120°C、 20min)した。 COガスをスパージヤーから 50mL
2
/minで通気し、温度を 39°Cに調整した。上記種培養 5 OmLを接種し、付属の撹拌羽 根を用いて 600rpmで撹拌しながら、 5.5M NaCOで pHを 6.8に調整しながら培養 した。その結果を表 10に示す。
[0275] [表 10]
Figure imgf000068_0001
[0276] 図 1および図 2に示す発酵装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、コハク 酸の生産速度が大幅に向上した。
[0277] 実施例 17 連続発酵によるコハク酸の連続製造 (その 5) 図 1に示す連続発酵装置を用いたコハク酸の製造を行った。コハク酸およびダルコ ース濃度の測定は実施例 13と同様の方法で行った。使用する培地は高圧蒸気滅菌 (121°C、 15分)して用いた。分離膜としては参考例 2で作製した多孔性膜を用いた。 本実施例における運転条件は、下記膜透過水量制御以外、実施例 13と同様である
[0278] 膜透過水量制御:膜間差圧による流量制御。
[0279] (連続発酵開始後〜 80時間： 0. lkPa以上 5kPa以下で制御
80時間〜 140時間： 0. lkPa以上 2kPa以下で制御
140時間〜 200時間： 0. lkPa以上 20kPa以下で制御）。
[0280] 本実施例ではコハク酸の生産能力のある微生物として、大腸菌 B株 (Escherichia co li B)ATCC11303株を用いたコハク酸の連続製造を行った。大腸菌によるコハク酸 製造では、 12g/Lグルコース、 10g/Lポリペプトン、 5g/L酵母エキス、 lg/L K H
2
PO、 lg/L NaCl、 0.2g/L MgCl力 なる種培養用培地 150mLを 200mL容三角
4 2
フラスコに入れ、 pHを 6.8に調整した。 MgCO 7.5gを添カ卩した後、加熱滅菌し、室
3
温まで冷却した後、嫌気グローブボックス内で、 ATCC11303株を接種し、 37°Cで 一晚静置培養した (前々培養)。図 1に示す連続発酵装置に、 12g/Lグルコース、 1 Og/Lポリペプトン、 5g/L酵母エキス、 lg/L K HPO、 lg/L NaCl、 0.2g/L Mg
2 4
CIからなるコハク酸発酵培地 1. 5Lを仕込み、前々培養液 150mLを植菌した。培
2
養温度を 37°Cとした以外は、実施例 13と同様の条件でコハク酸の連続発酵を行つ た。
[0281] 24時間培養の前培養後、表 11に示すコハク酸発酵培地の連続供給を行!ヽ、連続 発酵装置の発酵液量を 2Lとなるよう膜透過水量の制御を行いながら連続培養を行 つた o
[0282] [表 11] コハク酸発酵培地 グルコース 50 g/L
ポリペプトン 1 0 g/し
酵母エキス 5 g/L
リン酸水素二カリウム 1 g/L
塩化ナトリウム 1 g/L
塩化マグネシウム 0. 2 g/L
[0283] 適宜、膜透過発酵液中の生産されたコハク酸濃度および残存グルコース濃度を測 定した。該コハク酸、及びグルコース濃度から算出されたコハク酸生産速度およびコ ハク酸の生成収率を、表 12に示した。すべての連続発酵の全期間中の膜間差圧は 、 2kPa以下で推移した。
[0284] 実施例 18 連続発酵によるコハク酸の連続製造 (その 6)
図 2に示す連続発酵装置を用いたコハク酸の製造を行った。使用する培地は高圧 蒸気滅菌（121°C、 15分)して用いた。コハク酸およびグルコース濃度の測定は実施 例 13と同様の方法で行った。分離膜としては参考例 2で作製した多孔性膜を用いた 。本実施例における運転条件は、下記膜透過水量制御以外、実施例 14と同様であ る。
[0285] 膜透過水量制御:膜間差圧による流量制御
(連続発酵開始後〜 80時間： 0. lkPa以上 5kPa以下で制御
80時間〜 120時間： 0. lkPa以上 2kPa以下で制御
120時間〜 180時間： 0. lkPa以上 20kPa以下で制御）。
[0286] 本実施例ではコハク酸の生産能力のある微生物として大腸菌 B株（Escherichia coli
B)ATCC11303株を用いたコハク酸の連続製造を行った。 12g/Lグルコース、 10 g/Lポリペプトン、 5g/L酵母エキス、 lg/L K HPO、 lg/L NaCl、 0.2g/L MgCl
2 4
力もなる種培養用培地 150mLを 200mL容三角フラスコに入れ、 pHを 6.8に調整し た。 MgCO 7.5gを添カ卩した後、加熱滅菌し、室温まで冷却した後、 ATCC 11303
3
株を接種し、 37°Cで一晚静置培養した (前々培養)。図 2に示す連続発酵装置に、 1 2g/Lグルコース、 10g/Lポリペプトン、 5g/L酵母エキス、 lg/L K HPO、 lg/L
2 4
NaCl、 0.2g/L MgClからなるコハク酸発酵培地 1. 5Lを仕込み、前々培養液 150
2
mLを植菌した。温度を 37°Cとし、 5.5M NaCOで pHを 6.8に調整しながら、 24時
3
間培養を行った (前培養)。前培養が終了後、表 11に示すコハク酸発酵培地の連続 供給を行い、連続発酵装置の発酵液量を 1. 5Lとなるよう膜透過水量の制御を行い ながら連続培養した。コハク酸、及びグルコース濃度から算出されたコハク酸生産速 度およびコハク酸の生成収率を、表 12に示した。すべての連続発酵の全期間中の 膜間差圧は、 2kPa以下で推移した。
[0287] 比較例 9 回分培養によるコハク酸の製造 (その 3)
大腸菌（Escherichia coli)を用いた回分発酵によるコハク酸製造は、次のようにして 行った。
[0288] 12g/Lグルコース、 10g/Lポリペプトン、 5g/L酵母エキス、 lg/L K HPO、 lg/
2 4
L NaCl、 0.2g/L MgCl力もなる種培養用培地 lOOmLを 1250mL容三角フラスコ
2
に入れ、 pHを 6.8に調整した。 MgCO 5gを添加した後、加熱滅菌し、室温まで冷却
3
した後、嫌気グローブボックス内で、大腸菌 B株（Escherichia coli B) ATCC 11303 株を接種し、 37°Cで一晚静置培養した。 12g/Lグルコース、 10g/Lポリペプトン、 5 g/L酵母エキス、 lg/L K HPO、 lg/L NaCl、 0.2g/L MgClからなる発酵培地 1
2 4 2
Lを pH6.8に調整後、ミニジャーファメンター（ABLE社製、 BMJ型、 2L)に加え、カロ 熱滅菌（120°C、 20min)した。 COガスをスパージヤーから 50mL/minで通気し、温
2
度を 37°Cに調整した。上記種培養 lOOmLを接種し、付属の撹拌羽根を用いて 600 rpmで撹拌し、 5.5M NaCOで pHを 6.8に調整しながら培養した。培養液中のダル
3
コース濃度が、 20g/Lを越えないように、 lOOgZLグルコース溶液 200mLを少量ず つ追加しながら培養を行った。その結果を表 12に示す。
[0289] [表 12] 比較例 9 実施例 1 7 実施例 1 8 発酵時間 （hr) 36 200 1 80 投入グルコース （g) 32 732 850 生成コハク酸 （g) 3 72 81 未利用グルコース （g) 0 1 2 40 収率 （g/g) 0.1 0.1 0.1 生産速度 （g/L/hr) 0.09 0.24 0.30
[0290] 図 1および図 2に示す発酵装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、コハク 酸の生産速度が大幅に向上した。
[0291] 実施例 19 連続発酵による 1, 3—プロパンジォールの製造 (その 1)
図 1の連続発酵装置と表 13に示す組成の 1 , 3—プロパンジオール生産培地を用 い、 1, 3—プロパンジオールの製造を行った。
[0292] まず、生産物である 1, 3—プロパンジオールの単離、同定、および測定法について 説明する。
[0293] HPLCによりグリセロールの 1, 3—プロパンジオールへの転換を確認した。分析は 標準的方法及びクロマトグラフィーの技術分野における熟練者に利用可能な材料を 用いて行われた。 1つの適した方法は、 UV(210nm)及び RI検出を用いる Waters Maxima 820 HPLCシステムを使用した。 Shodex SH— 101 IPプレカラム（6m mx50mm)が備えられ、 50°Cで温度制御された Shodex SH— 1011カラム（8mmx 300mm, Waters, Milford, MAから購入）上に、移動相として 0. 01N H SOを
2 4 用い、 0. 5mLZ分の流量で試料を注入した。定量的分析を行う場合、外部標準とし て既知量のトリメチル酢酸を用いて試料を調製した。グルコース (RI検出）、グリセ口 ール、 1, 3—プロパンジオール (RI検出）及びトリメチル酢酸 (UV及び RI検出）の保 持時間は、それぞれおよそ 15分、 20分、 26分及び 35分であった。
[0294] GCZMSにより 1, 3—プロパンジオールの生産を確認した。分析は標準的方法及 び GCZMSの技術分野における熟練者に利用可能な材料を用いて行われた。例え ば、 Hewlett Packard 5971 Series質量選択的検出器（EI)及び HP— INNOWa Xカラム（長さ 30m、内径 0. 25mm,フィルム厚さ 0. 25ミクロン）に連結された Hewle tt Packard 5890 Series IIガスクロマトグラフを用いた。生成した 1, 3—プロパンジ オールの保持時間及び質量スペクトルを基準の 1, 3—プロパンジオール（mZe : 57 , 58)のそれに比較した。
[0295] また、試料の誘導体ィ匕を行った。 1. OmLの試料 (例えば培養上澄み液）に 30 μ L の濃（70%νΖν)過塩素酸を加えた。混合の後、試料を凍結乾燥した。ビス（トリメチ ルシリル）トリフルォロアセトアミド:ピリジンの 1： 1混合物（300 μ L)を凍結乾燥された 材料に加え、激しく混合し、 65°Cにおいて 1時間置いた。遠心により不溶性材料を除 いて試料を透明にした。得られる液体は 2相に分かれ、その上相を分析に用いた。試 料を DB— 5カラム（48m、内径 0. 25mm,フィルム厚さ 0. 25 iu m;J&W Scientifi cから）上でクロマトグラフィーにかけ、培養上澄み液から得た 1, 3—プロパンジォー ル誘導体の保持時間及び質量スペクトルを基準の標準試料から得たそれに比較し た。 TMS—誘導体ィ匕 1, 3—プロノ ンジ才一ノレの質量スぺクトノレは 205、 177、 130 及び 115 AMUの特徴的イオンを含有する。
[0296] 該培地は、高圧蒸気滅菌（121°C、 15分)して用いた。分離膜エレメント部材として は、ステンレス、及びポリサルホン樹脂の成型品を用いた。分離膜としては参考例 2 で作製した多孔性膜を用いた。本実施例における運転条件は、特に断らない限り、 以下のとおりである。
[0297] 発酵反応槽容量: 2 (L)
使用分離膜:ポリフッ化ビニリデン濾過膜
膜分離エレメント有効濾過面積： 120平方 cm
温度調整： 37 (°C)
発酵反応槽通気量: 0. 6 (LZmin)窒素ガス
発酵反応槽攪拌速度： 800 (rpm)
pH調整： 5N NaOHにより pH7. 0に調整
滅菌:分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は総て 121°C、 20minの オートクレープにより高圧蒸気滅菌
膜透過水量制御:膜間差圧による流量制御
(連続発酵開始後〜 100時間： 0. lkPa以上 5kPa以下で制御
100時間〜 200時間： 0. lkPa以上 2kPa以下で制御 200時間〜 320時間： 0. lkPa以上 20kPa以下で制御）。
[0298] 微生物としてクレブシエラ'ニューモ -ァェ ATCC 25955株を用い、培地として表 13に示す組成の 1, 3—プロパンジオール生産培地を用い、生産物である 1, 3—プ 口パンジオールの濃度の評価は上述の HPLC法により測定した。
[0299] また、グルコース濃度の測定にはグルコーステストヮコー C (和光純薬）を用いた。
[0300] [表 13]
1 , 3—プロパンジオール発酵培地
グルコース 10 g/L
グリセロール 40 g/L
安 5.35 QfL
化かリゥム 0.75 g/L
リン酸二水素ナトリウム 1 .38 g/L
酸マゲネシゥムァ水禾ロ物 0.26 g/L
^酸ナ 」ゥム 0.28 g/L
クェン酸 0.42 g/L
酵母エキス 1 g/L
化カルシウム 2水^物 0.29 mg/L
塩化鉄 6水^物 0.025g/L
化マンガン 6水禾ロ物 0.01 g/L
靴亜 0.003g/L
化コノ ルト 6水禾ロ物 0.002g/L
塩化銅 6水 物 0.85mg/L
pH 7.0
[0301] まず、クレブシエラ 'ニューモ -ァェ ATCC 25955株を試験管で 5mlの 1, 3—プロ パンジオール生産培地で一晩振とう培養した (前々々培養)。得られた培養液を新鮮 な 1, 3—プロパンジオール生産培地 50mlに植菌し、 500ml容坂ロフラスコで 24時 間、 30°Cで振とう培養した (前々培養)。前々培養液を、図 1に示した膜分離型連続 発酵装置の 1. 5Lの 1, 3—プロパンジォール生産培地に植菌し、発酵反応槽 1を付 属の攪拌機 5によって 800rpmで攪拌し、発酵反応槽 1の通気量の調整、温度調整 、 pH調整を行い、 24時間培養を行った (前培養)。前培養完了後直ちに、発酵液循 環ポンプを稼働させ、前培養時の運転条件に加え、膜分離槽 2を通気し、 1, 3—プ 口パンジオール生産培地 (グリセロール濃度は lOOgZL)の連続供給を行!、、連続 発酵装置の発酵液量を 1. 5Lとなるよう膜透過水量の制御を行いながら連続培養し 、連続発酵による 1, 3—プロパンジオールの製造を行った。連続発酵試験を行うとき の膜透過水量の制御は、水頭差制御装置 3により水頭差を膜間差圧として測定し、 上記膜透過水量制御条件で変化させることで行った。適宜、膜透過発酵液中の生産 された 1, 3—プロパンジオール濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、該 1, 3—プロパンジオール、及び投入グリセロールから算出された 1, 3—プロパンジォ ール生産速度を表 14に示した。
[0302] 320時間の発酵試験を行った結果、図 1に示す連続発酵装置を用いた本発明の 化学品の製造方法により、安定した 1, 3—プロパンジオールの連続発酵による製造 が可能であった。連続発酵の全期間中の膜間差圧は、 2kPa以下で推移した。
[0303] 実施例 20 連続発酵による 1, 3—プロパンジォールの製造 (その 2)
図 2の連続発酵装置と表 13に示す組成の 1 , 3—プロパンジオール生産培地を用 い、 1, 3—プロパンジオールの製造を行った。
[0304] 培地は高圧蒸気滅菌（121°C、 15分)して用いた。分離膜エレメント部材としては、 ステンレス、及びポリサルホン樹脂の成型品を用いた。分離膜としては参考例 2で作 製した多孔性膜を用いた。本実施例における運転条件は、特に断らない限り、以下 のとおりである。
[0305] 発酵反応槽容量: 2 (L)
使用分離膜:ポリフッ化ビニリデン濾過膜
膜分離エレメント有効濾過面積： 120平方 cm
温度調整： 37 (°C)
発酵反応槽通気量: 0. 6 (LZmin)窒素ガス
発酵反応槽攪拌速度： 800 (rpm)
pH調整： 5N NaOHにより pH7. 0に調整
滅菌:分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は総て 121°C、 20minの オートクレープにより高圧蒸気滅菌 膜透過水量制御:膜間差圧による流量制御。
[0306] (連続発酵開始後〜 100時間： 0. lkPa以上 5kPa以下で制御
100時間〜 200時間： 0. lkPa以上 2kPa以下で制御
200時間〜 264時間： 0. lkPa以上 20kPa以下で制御）。
[0307] 微生物としてクレブシエラ'ニューモ -ァェ ATCC 25955株を用い、培地として表 9に示す組成の 1, 3—プロパンジオール生産培地を用い、生産物である 1, 3—プロ パンジオールの濃度の評価は HPLC法により測定した。また、グルコース濃度の測 定にはグノレコーステストヮコ一 C (和光純薬)を用 、た。
[0308] まず、クレブシエラ 'ニューモ -ァェ ATCC 25955株を試験管で 5mlの 1, 3—プロ パンジオール生産培地で一晩振とう培養した (前々々培養)。得られた培養液を新鮮 な 1, 3—プロパンジオール生産培地 50mlに植菌し、 500ml容坂ロフラスコで 24時 間、 30°Cで振とう培養した (前々培養)。前々培養液を、図 2に示した膜分離型連続 発酵装置の 1. 5Lの 1, 3—プロパンジォール生産培地に植菌し、発酵反応槽 1を付 属の攪拌機 5によって 800rpmで攪拌し、発酵反応槽 1の通気量の調整、温度調整 、 PH調整を行い、 24時間培養を行った (前培養)。前培養完了後直ちに、 1, 3—プ 口パンジオール生産培地 (グリセロール濃度は lOOgZL)の連続供給を行!、、膜一 体型連続発酵装置の発酵液量を 1. 5Lとなるよう膜透過水量の制御を行いながら連 続培養し、連続発酵による 1, 3—プロパンジオールの製造を行った。連続発酵試験 を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置 3により水頭差を膜間差圧として 測定し、上記膜透過水量制御条件で変化させることで行った。適宜、膜透過発酵液 中の生産された 1, 3—プロパンジオール濃度および残存グルコース濃度を測定した 。また、該 1, 3—プロパンジオール、及び投入グリセロール力も算出された 1, 3—プ 口パンジオール生産速度を表 14に示した。 264時間の発酵試験を行った結果、図 2 に示す連続発酵装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、安定した 1, 3— プロパンジオールの連続発酵による製造が可能であった。連続発酵の全期間中の 膜間差圧は、 2kPa以下で推移した。
[0309] 比較例 10 フエドバッチ発酵による 1, 3—プロパンジオールの製造
微生物を用いた発酵形態として最も典型的なフエドバツチ発酵を 2L容のジャーファ ーメンターを用いて行い、 1, 3 プロパンジオール生産性を評価した。該培地は高 圧蒸気滅菌（121°C、 15分)して用いた。本比較例では、微生物としてクレブシエラ' ニューモニァェ ATCC 25955株を用い、生産物である 1, 3 プロパンジオールの 濃度の評価は HPLCを用いて評価し、グノレコース濃度の測定にはグルコーステスト ヮコー C (和光純薬)を用いた。比較例 10の運転条件を以下に示す。
[0310] 発酵反応槽容量（1, 3 プロパンジオール生産培地量）：1. 0 (L)
温度調整： 37 (°C)
発酵反応槽通気量: 0. 4 (LZmin)窒素ガス
発酵反応槽攪拌速度： 300 (rpm)
pH調整： 5N NaOHにより pH7. 0に調整。
[0311] まず、クレブシエラ 'ニューモ -ァェ ATCC 25955株を試験管で 5mlの 1, 3 プロ パンジオール生産培地で一晩振とう培養した (前々培養)。前々培養液を新鮮な 1， 3 プロパンジオール生産培地 50mlに植菌し 500ml容坂ロフラスコで 24時間振とう 培養した（前培養)。前培養液をジャーフアーメンターの 1. 5Lの 1, 3 プロパンジォ ール生産培地に植菌した。 1, 3 プロパンジオール生産培地 (グリセロール濃度は 5 OOgZUを用い、グリセロール濃度を OgZLから lOgZLになるように連続的に供給 し、フエドバツチ発酵を行った。その結果を表 14に示す。
[0312] [表 14]
Figure imgf000077_0001
[0313] 図 1および図 2に示す発酵装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、 1, 3 プロパンジオールの生産速度が大幅に向上した。
[0314] 実施例 21 連続発酵によるィタコン酸の製造 (その 1) 図 1に示す連続発酵装置を用いたィタコン酸の製造を行った。培地には表 15に示 す培地を用い、高圧蒸気滅菌処理（121°C、 15分)して用いた。分離膜エレメント部 材として、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成形品を用いた。分離膜としては参考 例 2で作製した多孔性膜を用いた。本実施例における運転条件は、特に断らない限 り、以下のとおりである。
[0315] 発酵反応槽容量: 2 (L)
使用分離膜:ポリフッ化ビニリデン濾過膜
膜分離エレメント有効濾過面積： 120平方 cm
温度調整： 35 (°C)
発酵反応槽通気量：1. 5 (L/min)
発酵反応槽攪拌速度： 200 (rpm)
滅菌:分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は総て 121°C、 20minの オートクレープにより高圧蒸気滅菌。
[0316] pH調整： 4N NaOHにより pH5に調整
膜透過水量制御:膜分離槽水頭差により流量を制御
(連続発酵開始後〜 100時間： 0. lkPa以上 5kPa以下で制御
100時間〜 200時間： 0. lkPa以上 2kPa以下で制御
200時間〜 300時間： 0. lkPa以上 20kPa以下で制御）。
[0317] 微生物として、ァスペルギルス テレウス（A. terreus)ATCC10020株を用い、培 地として表 11に示す組成のィタコン酸発酵培地を用い、生産物であるィタコン酸の 濃度は、コッベシャール (Koppeshaar)の方法 (共立出版、微生物光学講座第 5卷「 カビの利用工業」 P72— 73、昭和 31年発行)の方法で測定した。また、グルコース濃 度の測定には、グルコーステストヮコー C (和光純薬)を用いた。
[0318] [表 15] ィタコン酸発酵培地 前培養 連続 'バツチ発酵
グルコース 55 70 g/L
コーンスティーフ。リカー 3 2. 0 g/L
石肖酸アンモニゥム 5 3. 0 g/L
硫酸マグネシウム 2 0. 1 g/L
ァ亍'力ノール LG126 ― 0. 1 g/L
(消泡剤）
[0319] まず、ァスペルギルス テレウス ATCC10020株を、試験管で表 15に示す 5mlの 前培養培地で一晩振とう培養した (前々々培養)。得られた培養液を新鮮な前培養 培地 100mlに植菌し、 500ml容坂ロフラスコで 48時間、 35°Cの温度で振とう培養し た (前々培養)。前々培養液を、図 1に示す膜分離型連続発酵装置の 1. 5Lの連続' 回分発酵培地に植菌し、発酵反応槽 1を付属の攪拌機 5によって 200rpmで攪拌し 、発酵反応槽 1の通気量の調整と温度調整を行い、 24時間培養を行った (前培養)。 前培養完了後直ちに、発酵液循環ポンプを稼働させ、前培養時の運転条件に加え 、膜分離槽 2を通気し、ィタコン酸発酵培地の連続供給を行い、膜分離型連続発酵 装置の発酵液量を 2Lとなるように膜透過水量の制御を行 ヽながら連続培養し、連続 発酵によるィタコン酸の製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御 は、水頭差制御装置 3により水頭差を膜間差圧として測定し、上記膜透過水量制御 条件で変化させることで行った。適宜、膜透過発酵液中の生産されたィタコン酸濃度 および残存グルコース濃度を測定した。また、ィタコン酸およびグルコース濃度から 算出された投入グルコース力も算出されたィタコン酸生産速度を、表 16に示した。
[0320] 図 1に示す発酵装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、安定したィタコン 酸の連続発酵による製造が可能であった。連続発酵の全期間中の膜間差圧は、 2k Pa以下で推移した。
[0321] 実施例 22 連続発酵によるィタコン酸の製造 (その 2)
図 2に示す連続発酵装置を用いたィタコン酸の製造を行った。培地には表 15に示 す培地を用い、高圧蒸気滅菌処理（121°C、 15分)して用いた。分離膜エレメント部 材として、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成形品を用いた。分離膜としては参考 例 2で作製した多孔性膜を用いた。本実施例における運転条件は、特に断らない限 り、以下のとおりである。
[0322] 発酵反応槽容量: 2 (L)
使用分離膜: PVDF濾過膜
膜分離エレメント有効濾過面積： 120平方 cm
温度調整： 35 (°C)
発酵反応槽通気量：1. 5 (L/min)
発酵反応槽攪拌速度： 200 (rpm)
滅菌:分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は総て 121°C、 20minの オートクレープにより高圧蒸気滅菌。
[0323] pH調整： 4N NaOHにより pH5に調整
膜透過水量制御:膜分離槽水頭差により流量を制御
(連続発酵開始後〜 100時間： 0. lkPa以上 5kPa以下で制御
100時間〜 200時間： 0. lkPa以上 2kPa以下で制御
200時間〜 300時間： 0. lkPa以上 20kPa以下で制御）。
[0324] 微生物としてァスペルギルス テレウス（A. terreus)ATCC10020株を用い、培地 として表 11に示す組成のィタコン酸発酵培地を用い、生産物であるィタコン酸の濃 度は、実施例 17に示す方法で測定した。また、グルコース濃度の測定には、ダルコ ーステストヮコー C (和光純薬）を用いた。
[0325] まず、ァスペルギルス テレウス ATCC10020株を、試験管で表 15に示す 5mlの 前培養培地で一晩振とう培養した (前々々培養)。得られた培養液を新鮮な前培養 培地 100mlに植菌し、 500ml容坂ロフラスコで 48時間、 35°Cの温度で振とう培養し た (前々培養)。前々培養液を、図 2に示す連続発酵装置の 1. 5Lの連続'回分発酵 培地に植菌し、発酵反応槽 1を付属の攪拌機 5によって 200rpmで攪拌し、発酵反 応槽 1の通気量の調整と温度調整を行い、 24時間培養を行った (前培養)。前培養 完了後直ちに、連続'回分発酵培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵液量 を 1. 5Lとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるィ タコン酸の製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差 制御装置 3により水頭差を膜間差圧として測定し、上記膜透過水量制御条件で変化 させることで行った。適宜、膜透過発酵液中の生産されたィタコン酸濃度および残存 グルコース濃度を測定した。また、ィタコン酸およびグルコース濃度力も算出された投 入グルコース力も算出されたィタコン酸生産速度を、表 16に示した。
[0326] 図 2に示す発酵装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、安定したィタコン 酸の連続発酵による製造が可能であった。連続発酵の全期間中の膜間差圧は、 2k Pa以下で推移した。
[0327] 比較例 11 回分発酵によるィタコン酸の製造
微生物を用いた発酵形態として最も典型的な回分発酵を 2L容のジャーフアーメン ターを用いて行い、ィタコン酸生産性を評価した。培地には表 15に示す培地を用い 、高圧蒸気滅菌処理（121°C、 15分)して用いた。この比較例 11では、微生物として ァスペルギルス テレウス ATCC 10020株を用い、生産物であるィタコン酸の濃度の 評価は、実施例 17に示した方法を用いて評価し、グルコース濃度の測定にはダルコ ーステストヮコ一 C (和光純薬)を用 、た。比較例 11の運転条件を以下に示す。
[0328] 発酵反応槽容量 (ィタコン酸発酵培地量）：1. 5 (L)
温度調整： 35 (°C)
発酵反応槽通気量：1. 5 (L/min)
発酵反応槽攪拌速度： 200 (rpm)
pH調整： 4N NaOHにより pH5に調整。
[0329] まず、 ATCC10020株を試験管で表 1に示す 5mlの前培養培地でー晚振とう培養 した (前々培養) o前々培養液を新鮮な前培養培地 50mlに植菌し 500ml容坂口フラ スコで 48時間振とう培養した (前培養)。前培養液をジャーフアーメンターの 1. 5Lの 表 15に示す連続 ·回分発酵培地に植菌し、回分発酵を行った。回分発酵の結果を、 表 16に示す。
[0330] [表 16] 比較例 1 1 実施例 21 実施例 22 発酵時間 (hr) 80 300 300 投入グルコース (g) 1 05 2090 1 650 生成ィタコン酸 (g) 55 1 020 790 未利用グルコース (g) 1 50 50 収率 (g/g) 0. 53 0. 50 0.49 生産速度 (g/L/hr) 0.46 1 . 7 1 . 7
[0331] 図 1および図 2に示す発酵装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、イタコ ン酸の生産速度が大幅に向上した。
[0332] 実施例 23 連続発酵によるカダベリンの製造 (その 1)
図 1に示す連続発酵装置と表 17に示す組成のカダベリン発酵培地を用い、カダべ リンの製造を行った。
[0333] まず生産物であるカダベリンの評価法について説明する。カダベリンは以下に示す
HPLC法によって評価した。
[0334] 使用カラム： CAPCELL PAK C18 (資生堂）
移動相： 0. 1% (WZW)リン酸水溶液:ァセトニトリル =4. 5 : 5. 5
検出： UV360nm
サンプル前処理：分析サンプル 25 1に内標として、 1, 4ージアミノブタン（0. 03M )を 25 1、炭酸水素ナトリウム（0. 075M)を 150 1および 2, 4—ジ-トロフルォロ ベンゼン（0. 2M)のエタノール溶液を添加混合し、 37°Cの温度で 1時間保温する。 上記の反応溶液 50 1を lmlァセトニトリルに溶解後、 10, OOOrpmで 5分間遠心し た後の上清 10 μ 1を HPLC分析した。
[0335] 該培地は、高圧蒸気滅菌（121°C、 15分)して用いた。分離膜エレメント部材として 、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成形品を用いた。分離膜としては参考例 2で 作製した多孔性膜を用いた。本実施例における運転条件は、特に断らない限り、以 下のとおりである。
[0336] 発酵反応槽容量: 2 (L)
使用分離膜:ポリフッ化ビニリデン濾過膜
膜分離エレメント有効濾過面積： 120平方 cm 温度調整： 30 (°C)
発酵反応槽通気量： 1. 5 (LZmin)空気
発酵反応槽攪拌速度： 800 (rpm)
pH調整： 3M HC1および 3M アンモニア水により pH7. 0に調整
滅菌:分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は総て 121°C、 20minのォ 一トクレーブにより高圧蒸気滅菌
膜透過水量制御:膜間差圧による流量制御。
[0337] (連続発酵開始後〜 100時間： 0. lkPa以上 5kPa以下で制御
100時間〜 200時間： 0. lkPa以上 2kPa以下で制御
200時間〜 320時間： 0. lkPa以上 20kPa以下で制御）。
[0338] カダベリンを生産させる微生物として、特開 2004— 222569号公報に記載のコリネ バタテリゥム'ダルタミカム TR— CAD 1株用い、培地として表 17に示す組成のカダべ リン生産培地を用いた。生産物であるカダベリンの濃度の評価は HPLC法により測定 した。また、グルコース濃度の測定にはグルコーステストヮコー C (和光純薬社製)を 用いた。
[0339] [表 17]
カダベリン発酵培地 ゲルコース 150 g/L
クェン酸 1 g/L
尿素 15 g/L
リン酸二水素カリウム 0.5 g/L
リン酸水素二カリウム 0.5 g/L
硫酸マゲネシゥム 7水和物 0.5 g/L
しスレオニン 0.8 g/L
しメチ才ニン 0.6 g/L
レロイシン 1.5 g/L 硫酸鉄七水和物 6.0 mg/L 硫酸マンガン一水和物 4.2 mg/L ビォチン 1.0 mg/L チアミン 2.0 mg/L
3Mアンモニア水で pH 7.0に調製
[0340] まず、コリネバタテリゥム.ダルタミカム TR— CADI株を、試験管で 5mlのカナマイ シン（25 μ g/ml)を添加したカダベリン発酵培地添加で一晩振とう培養した (前々 々培養)。得られた培養液を、新鮮なカナマイシン（25 μ g/ml)を添加したカダベリ ン生産培地 50mlに植菌し、 500ml容坂ロフラスコで 24時間、 30°Cの温度で、振幅 30cmで、 180rpmの条件下で培養を行った (前々培養)。前々培養液を、図 1に示 す連続発酵装置の 2. OLのカダベリン発酵培地に植菌し、発酵反応槽 1を付属の攪 拌機 5によって 800rpmで攪拌し、発酵反応槽 1の通気量の調整、温度調整、 pH調 整を行い、 24時間培養を行った (前培養)。
[0341] 前培養完了後直ちに、発酵液循環ポンプ 10を稼働させ、前培養時の運転条件に 加え、膜分離槽 2を通気し、カダベリン発酵培地の連続供給を行い、連続発酵装置 の発酵液量を 2Lとなるよう膜透過水量の制御を行 ヽながら連続培養し、連続発酵に よるカダベリンの製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水 頭差制御装置 3により水頭差を膜間差圧として測定し、上記膜透過水量制御条件で 変化させることで行った。適宜、膜透過発酵液中の生産された乳酸濃度および残存 グルコース濃度を測定した。
[0342] 160時間の連続発酵試験を行った結果を表 18に示す。図 1に示す連続発酵装置 を用いた本発明の化学品の製造方法により、安定したカダベリンの連続発酵による 製造が可能であった。連続発酵の期間中の膜間差圧は、 2kPa以下で推移した。
[0343] 実施例 24 連続発酵によるカダベリンの製造 (その 2)
図 2に示す連続発酵装置と表 17に示す組成のカダベリン発酵培地を用い、カダべ リンの製造を行った。培地は、高圧蒸気滅菌（121°C、 15分)して用いた。分離膜ェ レメント部材として、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成形品を用いた。分離膜と しては参考例 2で作製した多孔性膜を用いた。本実施例における運転条件は、特に 断らない限り、以下のとおりである。
[0344] 発酵反応槽容量: 2 (L)
使用分離膜:ポリフッ化ビニリデン濾過膜
膜分離エレメント有効濾過面積： 120平方 cm
温度調整： 30 (°C)
発酵反応槽通気量： 1. 5 (LZmin)空気
発酵反応槽攪拌速度： 800 (rpm)
pH調整： 3M HC1および 3M アンモニア水により pH7. 0に調整
滅菌:分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は総て 121°C、 20minのォ 一トクレーブにより高圧蒸気滅菌
膜透過水量制御:膜間差圧による流量制御。
[0345] (連続発酵開始後〜 100時間： 0. lkPa以上 5kPa以下で制御
100時間〜 200時間： 0. lkPa以上 2kPa以下で制御
200時間〜 264時間： 0. lkPa以上 20kPa以下で制御）。
[0346] 微生物としてコリネバタテリゥム'ダルタミカム TR—CAD1株を用い、培地として表 1 7に示す組成のカダベリン発酵培地を用 V、、生産物であるカダベリンの濃度の評価 は HPLC法により測定した。また、グルコース濃度の測定にはグルコーステストヮコー C (和光純薬社製)を用いた。 [0347] まず、コリネバタテリゥム.ダルタミカム TR— CADI株を、試験管で 5mlのカナマイ シン（25 μ g/ml)を添加したカダベリン生産培地添加で一晩振とう培養した (前々 々培養)。得られた培養液を、新鮮なカナマイシン（25 μ g/ml)を添加したカダベリ ン生産培地 50mlに植菌し、 500ml容坂ロフラスコで 24時間、 30°Cの温度で、振幅 30cmで、 180rpmの条件下で培養を行った（前々培養）。
[0348] 前々培養液を、図 2に示す連続発酵装置の 1. 5Lのカダベリン生産培地に植菌し、 発酵反応槽 1を付属の攪拌機 5によって 800rpmで攪拌し、発酵反応槽 1の通気量 の調整、温度調整および pH調整を行い、 24時間培養を行った (前培養)。前培養完 了後直ちに、カダベリン発酵培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵液量を 1 . 5Lとなるよう膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるカダベリ ンの製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装 置 3により、発酵反応槽水頭を最大 2m以内、すなわち膜間差圧が 20kPa以内となる ように適宜水頭差を変化させることで行った。適宜、膜透過発酵液中の生産された力 ダベリン濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、該カダベリンおよび投入 グルコース力も算出されたカダベリン生産速度を表 18に示した。
[0349] 320時間の連続発酵試験を行った結果を表 18に示す。図 2に示す連続発酵装置 を用いた本発明の化学品の製造方法により、安定したカダベリンの連続発酵による 製造が可能であった。連続発酵の期間中の膜間差圧は、 2kPa以下で推移した。
[0350] 比較例 12 回分発酵によるカダベリンの製造
微生物を用いた発酵形態として最も典型的な回分発酵を 2L容のジャーフアーメン ターを用いて行い、カダベリン生産性を評価した。培地は、高圧蒸気滅菌（121°C、 1 5分)して用いた。本比較例では、微生物としてコリネバクテリウム'ダルタミカム TR— CAD1株を用い、生産物であるカダベリンの濃度の評価は HPLCを用いて評価し、 グルコース濃度の測定にはグルコーステストヮコー C (和光純薬社製)を用いた。比較 例 8の運転条件は、下記のとおりである。
[0351] 発酵反応槽容量 (力ダベリン生産培地量） : 1. O (L)
温度調整： 30 (°C)
発酵反応槽通気量： 1. 5 (LZmin)空気 発酵反応槽攪拌速度： 800 (rpm)
pH調整： 3M HC1および 3M アンモニア水により pH7. 0に調整。
[0352] まず、コリネバタテリゥム.ダルタミカム TR—CAD1株を、試験管で 5mlのカナマイ シン（25 μ g/ml)を添加したカダベリン生産培地添加で一晩振とう培養した (前々 培養)。得られた培養液を、新鮮なカナマイシン（25 μ g/ml)を添加したカダベリン 生産培地 50mlに植菌し、 500ml容坂ロフラスコで 24時間、 30°Cの温度で、振幅 30 cmで、 180rpmの条件下で培養を行った（前培養）。
[0353] 前培養液を、ジャーフアーメンターの 1. 0Lのカダベリン生産培地（グルコース濃度 は lOOgZL)に植菌した。カダベリン生産培地を用い、回分発酵を行った。その結果 を表 18に示す。
[0354] [表 18]
Figure imgf000087_0001
[0355] 図 1および図 2に示す発酵装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、カダ ベリンの生産速度が大幅に向上することを明らかにすることができた。
[0356] 実施例 25 連続発酵による核酸の製造 (その 1)
図 1に示す連続発酵装置を用いた核酸の製造を行った。培地には表 19に示す培 地を用い、高圧蒸気滅菌処理（121°C、 15分)して用いた。分離膜エレメント部材とし て、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成形品を用いた。分離膜としては、参考例 2 で作製した多孔性膜を用いた。本実施例における運転条件は、特に断らない限り、 以下の通りである。
[0357] 発酵反応槽容量: 2 (L)
使用分離膜:ポリフッ化ビニリデン濾過膜 膜分離エレメント有効濾過面積： 120平方 cm
温度調整： 30 (°C)
発酵反応槽通気量： 1000 (mL/min)
発酵反応槽攪拌速度： 800 (rpm)
滅菌:分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は総て 121°C、 20minのォ 一トクレーブにより高圧蒸気滅菌。
[0358] pH調整： 25% アンモニア水溶液により pH6. 8に調整
膜透過水量制御:膜間差圧による流量制御
(連続発酵開始後〜 150時間： 0. lkPa以上 5kPa以下で制御
150時間〜 300時間： 0. lkPa以上 2kPa以下で制御
300時間〜 400時間： 0. lkPa以上 20kPa以下で制御）。
[0359] 原核微生物として、コリネバクテリウム'アンモニアゲネス（Corynebacterium am moniagenes)ATCC21479株を用い、培地として表 19に示す組成の核酸発酵培 地を用いた。発酵液に含まれるグアノシン、およびイノシンは、下記に示す条件で HP LC法により各々の核酸量を測定することで確認した。
[0360] [分析条件]
カラム： Asahipak GS— 220 (7. 6mmID X 500mmL)、緩衝液： 0. 2M NaH
2
PO (pH3. 98)リン酸にて pH調整、温度： 55°C、流速： 1. 5mlZmin、検出： UV2
4
54nm、保持時間（min)：イノシン 16. 1、グアノシン 20. 5。
[0361] また、グルコース濃度の測定には、 "グルコーステストヮコー C" (登録商標）（和光純 薬社製)を用いた。
[0362] [表 19] 核酸発酵培地 前培養 バッチ発酵 連続発酵
グルコース 20 150 150 g/L リン酸二水素カリウム 10 10 g/L リン酸水素カリウム 10 10 g/L 硫酸マグネシウム 10 10 g/L 塩化カルシウム 1 1 g/L 硫酸鉄 10 10 mg/L 硫酸亜鉛 1 1 mg/L チアミン 5 5 mg/L パントテン酸カルシウム 10 10 mg/L シスチン 20 20 mg/L ビォチン 30 30 ug/L 尿素 2 2 g/L ミートエキス 10 10 10 g/L アデニン 300 300 mg/L ヒポキサンチン 100 100 mg/L ペプトン 10 10 1 g/L イーストエキス 10 10 1 g/L 塩化ナトリウム 3 3 3 g/L まず、コリネバクテリウム'アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes )ATCC21479株を、坂口フラスコ中で表 15に示す前培養培地 150mlを用いて 24 時間、 30°Cの温度で振とう培養した (前々培養)。得られた前々培養液を、図 1に示 す連続発酵装置の 1Lの前培養培地に植菌し、発酵反応槽 1を付属の攪拌機 5によ つて 800rpmで攪拌し、発酵反応槽 1の通気量の調整と 30°Cの温度に温度調整を 行い、 24時間培養を行った (前培養)。前培養完了後直ちに、発酵液循環ポンプを 稼働させ、前培養時の運転条件に加え、膜分離槽 2を通気し、連続発酵培地の連続 供給を行い、前培養完了後直ちに、連続発酵培地の連続供給を行い、発酵液循環 ポンプ 11によって発酵反応槽 1と膜分離槽 12の間を循環させ、膜分離型連続発酵 装置の発酵液量を 2Lとなるように膜透過水量の制御を行 ヽながら連続培養すること で連続発酵による核酸の製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制 御は、水頭差制御装置 3により水頭差を膜間差圧として測定し、上記膜透過水量制 御条件で変化させることで行った。適宜、膜透過発酵液中の生産された核酸濃度お よび残存グルコース濃度を測定した。また、核酸およびグルコース濃度から算出され た投入グルコース力も算出された核酸生産速度を、表 20に示した。
[0364] 400時間の発酵試験を行った結果、図 1に示す連続発酵装置を用いた本発明の 化学品の製造方法により、安定した核酸の連続発酵による製造が可能であった。連 続発酵の全期間中の膜間差圧は、 2kPa以下で推移した。
[0365] 実施例 26 連続発酵による核酸の製造 (その 2)
図 2に示す連続発酵装置を用いた核酸の製造を行った。培地には表 19に示す培 地を用い、高圧蒸気滅菌処理（121°C、 15分)して用いた。分離膜エレメント部材とし て、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成形品を用いた。分離膜としては、参考例 2 で作製した多孔性膜を用いた。本実施例における運転条件は、特に断らない限り、 以下の通りである。
[0366] 発酵反応槽容量: 2 (L)
使用分離膜:ポリフッ化ビニリデン濾過膜
膜分離エレメント有効濾過面積： 120平方 cm
温度調整： 30 (°C)
発酵反応槽通気量： 1000 (mL/min)
発酵反応槽攪拌速度： 800 (rpm)
滅菌:分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は総て 121°C、 20minのォ 一トクレーブにより高圧蒸気滅菌。
[0367] pH調整： 25% アンモニア水溶液により pH6. 8に調整
膜透過水量制御:膜間差圧による流量制御
(連続発酵開始後〜 150時間： 0. lkPa以上 5kPa以下で制御
150時間〜 300時間： 0. lkPa以上 2kPa以下で制御
300時間〜 400時間： 0. lkPa以上 20kPa以下で制御）。
[0368] 原核微生物として、コリネバクテリウム'アンモニアゲネス（Corynebacterium am moniagenes)ATCC21479株を用い、培地として表 19に示す組成の核酸発酵培 地を用いた。発酵液に含まれるグアノシン、およびイノシン、グルコースは、実施例 1と 同様の方法により各々の核酸量を測定することで確認した。
[0369] まず、コリネバクテリウム'アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes )ATCC21479株を、坂口フラスコ中で表 19に示す前培養培地 150mlを用いて 24 時間、 30°Cの温度で振とう培養した (前々培養)。得られた前々培養液を、図 2に示 す連続発酵装置の 1Lの前培養培地に植菌し、発酵反応槽 1を付属の攪拌機 5によ つて 800rpmで攪拌し、発酵反応槽 1の通気量の調整と 30°Cの温度に温度調整を 行い、 24時間培養を行った (前培養)。前培養完了後直ちに、連続発酵培地の連続 供給を行い、連続発酵装置の発酵液量を 1. 5Lとなるように膜透過水量の制御を行 いながら連続培養し、連続発酵による核酸の製造を行った。連続発酵試験を行うとき の膜透過水量の制御は、水頭差制御装置 3により水頭差を膜間差圧として測定し、 上記膜透過水量制御条件で変化させることで行った。適宜、膜透過発酵液中の生産 された核酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、核酸およびグルコース 濃度力も算出された投入グルコース力も算出された核酸生産速度を、表 20に示した
[0370] 400時間の発酵試験を行った結果、図 2の連続発酵装置を用いた本発明の化学 品の製造方法により、安定した核酸の連続発酵による製造が可能であった。連続発 酵の全期間中の膜間差圧は、 2kPa以下で推移した。
[0371] 比較例 13 回分発酵による核酸の製造
微生物を用いた発酵形態として最も典型的な回分発酵を 2L容のジャーフアーメン ターを用いて行い、その核酸生産性を評価した。培地には表 19に示す連続発酵培 地を用い、高圧蒸気滅菌処理（121°C、 15分)して用いた。本比較例では、原核微 生物としてコリネバタテリゥム'アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagen es)ATCC21479株を用い、生産物である核酸の濃度の評価は、実施例 21に示し た方法を用いて評価し、グルコース濃度の測定には"グルコーステストヮコー C" (登 録商標）（和光純薬社製)を用いた。本比較例の運転条件を以下に示す。
[0372] 発酵反応槽容量: 2 (L)
温度調整： 30 (°C) 発酵反応槽通気量： 1000 (mL/min)
発酵反応槽攪拌速度： 800 (rpm)
滅菌:分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は総て 121°C、 20minのォ 一トクレーブにより高圧蒸気滅菌
pH調整： 25% アンモニア水溶液により pH6. 8に調整。
[0373] まず、コリネバクテリウム'アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes )ATCC21479株を、坂口フラスコ中で表 19に示す前培養培地 150mlを用いて 24 時間、 30°Cの温度で振とう培養した (前培養)。得られた前培養液をジャーフアーメン ターの 1Lの表 19に示す連続発酵培地に植菌し、回分発酵を行った。発酵開始後、 5%のグルコースを添加して発酵を継続した。 120時間の回分発酵の結果を、表 20 に示す。
[0374] [表 20]
Figure imgf000093_0001
1および図 2【こ示す発酵装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、核酸 の生産速度が大幅に向上することを明らかにすることができた。
[0376] 実施例 27 連続発酵による L—スレオニンの製造 (その 1)
図 1の連続発酵装置と表 21に示す組成の発酵培地を用い、 Lースレオニンの製造 を行った。
[0377] まず、生産物である Lースレオニンの評価方法について説明する。培養液中に含ま れる Lースレオニン量の測定は、次の方法で行った。測定する Lースレオニンを含む 培養液を 25 μ L取り、そこに 150 μ 1の NaHC03 (75mM)及び内標として 25 μ 1の L —メチォニン（2gZL)をカ卩える。上記溶液にさらに 900 1のエタノール及び 150 1 の DNFB (0. 2M)を加え混合する。上記溶液を 37°Cで 1時間静置後、下記条件で HPLC分析を行った。
[0378] カラム： CAPCELLPAK C18 TYPE SG120 (資生堂）
移動相： 0. 1% (WZV) H3P04 :ァセトニトリル = 7 : 3 (流速 1. 2mL/min) 検出方法: UV (360nm)
温度： 23°C 。
[0379] 検量線は、濃度既知の Lースレオ-ンを標品として分析を行い、横軸に Lースレオ ニン濃度、縦軸に Lースレオニン面積 ZL—メチォニン（内標）面積の面積比をプロッ トして作製した。培地は高圧蒸気滅菌（121°C、 15分)して用いた。分離膜としては、 参考例 2で作製した多孔性膜を用いた。
[0380] 本実施例における運転条件は、特に断らない限り、以下の通りである。
[0381] 反応槽容量 : 2 (L)
膜分離槽容量: 0. 5 (L)
使用分離膜:ポリフッ化ビニリデン濾過膜
膜分離エレメント有効濾過面積： 60平方 cm
温度調整： 37 (°C)
反応槽通気量： 1. 5 (L/min)
膜分離槽通気量: l (LZmin)
反応槽攪拌速度: 800 (rpm)
pH調整： 28% アンモニア水溶液により pH7に調整 Lースレオニン発酵培地供給速度： 50〜300mlZhr.の範囲で可変制御 膜透過水量制御:膜間差圧による流量制御
(連続発酵開始後〜 100時間： 0. lkPa以上 5kPa以下で制御
100時間〜 200時間： 0. lkPa以上 2kPa以下で制御）。
[0382] Lースレオニン生産微生物として、プロビデンシァ 'レトゲリのうちプロビデンシァ 'レ トゲリ SGR588— 77株（FERM P— 10528)を用い、培地として表 21に示す組成 の発酵培地を用い、生産物である Lースレオニンの濃度の評価には、上述 HPLCを 用い、グルコース濃度の測定にはグルコーステストヮコー C (和光純薬)を用いた。
[0383] [表 21] 一スレオニン発酵培地 培地成分 発酵培地 前培養培地 回分培養追 加培地 グルコース g/L 1 20 50 750 硫酸アンモニゥム g/L 5 5 ― リン酸二水素カリウム g/L 1 1 5 硫酸マグネシウム■ 7水和物 g/L 0. 4 0. 4 2 硫酸鉄 · 7水和物 PPm 2 2 ― 硫酸マンガン■ 5水和物 PPm 2 2 ―
L一イソロイシン mg/L 1 0 50 200
[0384] まず、 100mlのグルコースブイヨン培地（1%グルコース、 3%ブイヨン（-ッスィ社製 ；) )を投入した 500ml容の三角フラスコに、寒天培地力 搔き取ったプロビデンシァ' レトゲリ SGR588— 77株を植菌した。これを 37°C、 140rpmで撹拌しながら培養を 行った (前々培養)。前々培養液を、図 1に示す連続発酵装置の 1. 5Lの前培養培 地 (表 21)に植菌し、反応槽 1を付属の攪拌機 5によって 800rpmで攪拌し、反応槽 1 の通気量の調整と 37°Cの温度に温度調整を行!ヽ、 24時間培養を行った (前培養)。 前培養完了後直ちに、発酵液循環ポンプを稼働させ、前培養時の運転条件に加え 、膜分離槽 2を通気し、表 17に示す組成の発酵培地の連続供給を行い、連続発酵 装置の発酵液量を 2Lとなるように膜透過水量の制御を行 ヽながら連続培養し、連続 発酵による L—スレオニンの製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の 制御は、水頭差制御装置 3により水頭差を膜間差圧として測定し、上記膜透過水量 制御条件で変化させることで行った。適宜、膜透過発酵液中の生産された Lースレオ ニン濃度および残存グルコース濃度を測定した。発酵反応槽水頭を最大 2m以内、 すなわち膜間差圧が 20kPa以内となるように適宜水頭差を変化させることにより行つ た。適宜、膜透過発酵液中の生産された Lースレオニン濃度および残存グルコース 濃度を測定した。 200時間の連続発酵試験を行った結果を表 22に示す。
[0385] 図 1に示す連続培養装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、安定した L ースレオニンの連続発酵による製造が可能であった。連続発酵の期間中の膜間差圧 は、 2kPa以下で推移した。
[0386] 実施例 28 連続発酵による Lースレオニンの製造 (その 2)
図 2の膜分離型連続発酵装置と表 21に示す組成の発酵培地を用い、 Lースレオ- ンの製造を行った。該培地は高圧蒸気滅菌（121°C、 15分)して用いた。分離膜ェメ レント部材としては、ステンレス、及びポリサルホン樹脂の成型品を用いた。分離膜と しては、参考例 2で作製した多孔性膜を用いた。本実施例における運転条件は、特 に断らない限り、以下の通りである。
[0387] 反応槽容量 : 2 (L)
使用分離膜: PVDF濾過膜
膜分離エレメント有効濾過面積： 120平方 cm
温度調整： 37 (°C)
反応槽通気量： 1. 5 (L/min)
反応槽攪拌速度: 800 (rpm)
pH調整： 28% アンモニア水溶液により pH7に調整
Lースレオニン発酵培地供給速度： 50〜300mlZhr.の範囲で可変制御 膜透過水量制御:膜間差圧による流量制御
(連続発酵開始後〜 100時間： 0. lkPa以上 5kPa以下で制御
100時間〜 200時間： 0. lkPa以上 2kPa以下で制御）
滅菌:分離膜エレメントを含む培養槽、及び使用培地は全て 121°C、 20分のオート クレーブによる高圧蒸気滅菌。 [0388] Lースレオニン生産微生物として、プロビデンシァ 'レトゲリのうちプロビデンシァ 'レ トゲリ SGR588— 77株（FERM P— 10528)を用い、培地として表 21に示す組成 の発酵培地を用い、生産物である Lースレオニンの濃度の評価には、実施例 23に示 した HPLCを用 ヽ、ダルコース濃度の測定にはダルコーステストヮコ一 C (和光純薬） を用いた。
[0389] まず、 100mlのグルコースブイヨン培地（1%グルコース、 3%ブイヨン（-ッスィ社製 ；) )を投入した 500ml容の三角フラスコに、寒天培地力 搔き取ったプロビデンシァ' レトゲリ SGR588— 77株を植菌した。これを 37°C、 140rpmで撹拌しながら培養を 行った (前々培養)。前々培養液を、図 1に示す連続発酵装置の 1. 5Lの前培養培 地 (表 21)に植菌し、反応槽 1を付属の攪拌機 5によって 800rpmで攪拌し、反応槽 1 の通気量の調整、温度調整、 pH調整を行い、 24時間培養を行った (前培養)。前培 養完了後直ちに、表 21に示す組成の発酵培地の連続供給を行い、連続発酵装置 の発酵液量を 1. 5Lとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発 酵による L—スレオニンの製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制 御は、水頭差制御装置 3により水頭差を膜間差圧として測定し、上記膜透過水量制 御条件で変化させることで行った。適宜、膜透過発酵液中の生産された Lースレオ- ン濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、該 L—スレオニン、及びダルコ ース濃度力 算出された投入グルコースあたりの対糖収率、乳酸生産速度を表 18に 示した。
[0390] 200時間の連続発酵試験を行った結果、図 2に示す連続培養装置を用いた本発 明の化学品の製造方法により、安定した Lースレオニンの連続発酵による製造が可 能であった。連続発酵の全期間中の膜間差圧は、 2kPa以下で推移した。
[0391] 比較例 14 回分発酵による Lースレオニンの製造
微生物を用いた発酵形態として最も典型的な回分発酵を 2L容のジャーフアーメン ターを用いて行い、その Lースレオニン生産性を評価した。回分培養開始時の培地 には表 21に示す前培養培地を用いた。これらの培地は高圧蒸気滅菌処理（121°C、 15分）して用いた。本比較例では、微生物としてプロビデンシァ 'レトゲリ SGR588 —77株を用い、発酵液に含まれる L—スレオニン及びグルコースの濃度は、実施例 27に示した方法で行った。本比較例の運転条件を以下に示す。
[0392] 発酵反応槽容量 (Lースレオニン発酵培地量）： 1 (L)
温度調整： 37 (°C)
発酵反応槽通気量： 1 (L/min)
発酵反応槽攪拌速度： 800 (rpm)
pH調整： 28% アンモニア水溶液により pH7に調整。
[0393] まず、 90mlのグルコースブイヨン培地（1%グルコース、 3%ブイヨン（-ッスィ社製） )を投入した 500ml容の三角フラスコに、寒天培地力 搔き取ったプロビデンシァ 'レ トゲリ SGR588— 77株を植菌した。これを 37°C、 140rpmで撹拌しながら培養を行 つた (前培養)。前培養液を 810mlの表 17に示す前培養培地を投入したミニジャー フアーメンターに植菌し、回分発酵を行った。培養途中で追加した培地の組成を表 9 の追加培地に示した。培地の追加は培養開始後 24, 32, 40, 48時間に 50mLづっ 行った。回分発酵の結果を、表 22に示す。
[0394] [表 22]
Figure imgf000098_0001
[0395] 図 1および図 2に示す発酵装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、 Lース レオニンの生産速度が大幅に向上することを明らかにすることができた。
[0396] 実施例 29 乳酸菌を用いた連続発酵による L 乳酸の製造 (その 1)
図 1に示す連続発酵装置を用いた L 乳酸の製造を行つた。培地には表 23に示す L 乳酸菌乳酸発酵培地を用い、高圧蒸気滅菌処理（121°C、 15分)して用いた。 該培地は高圧蒸気滅菌（121°C、 15分)して用いた。分離膜としては参考例 2で作製 した多孔性膜を用いた。本実施例における運転条件は、特に断らない限り、以下のと おりである。 [0397] 発酵反応槽容量: 2 (L)
使用分離膜:ポリフッ化ビニリデン濾過膜
膜分離エレメント有効濾過面積： 120平方 cm
温度調整： 37 (°C)
発酵反応槽通気量： 50 (mL 窒素 Zmin)
発酵反応槽攪拌速度： 600 (rpm)
滅菌:分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は総て 121°C、 20minの オートクレープにより高圧蒸気滅菌。
[0398] pH調整： 8N アンモニア水溶液により pH6. 5に調整
膜透過水量制御:膜間差圧による流量制御
(連続発酵開始後〜 150時間： 0. lkPa以上 5kPa以下で制御
150時間〜 300時間： 0. lkPa以上 2kPa以下で制御
300時間〜 400時間： 0. lkPa以上 20kPa以下で制御）。
[0399] 原核微生物として、ラタトコッカス ラクテイス（Lactococcus lactis)JCM7638株 を用い、培地として表 23に示す組成の乳酸菌乳酸発酵培地を用いた。発酵液に含 まれる L—乳酸は、参考例 1と同様の方法で評価した。また、グルコース濃度の測定 には、ダルコーステストヮコ一 C (和光純薬）を用 、た。
[0400] [表 23] 乳酸菌乳酸発酵培地 グルコース 60 g/L
酵母エキス 5 g/L
ポリペプトン 5 g/L
塩化ナトリウム 5 g/L まず、ラタトコッカス ラクテイス JCM7638株を、試験管で表 23に示す 5mlの窒素 ガスでパージした乳酸発酵培地で 24時間、 37°Cの温度で静置培養した (前々々培 養)。得られた培養液を窒素ガスでパージした新鮮な乳酸発酵培地 50mlに植菌し、 48時間、 37°Cの温度で静置培養した (前々培養)。前々培養液を、図 1に示す連続 発酵装置の窒素ガスでパージした 1. 5Lの乳酸発酵培地に植菌し、発酵反応槽 1を 付属の攪拌機 5によって 600rpmで攪拌し、発酵反応槽 1の通気量の調整と 37°Cの 温度に温度調整を行い、 24時間培養を行った (前培養)。前培養完了後直ちに、乳 酸発酵培地の連続供給を行 ヽ、連続発酵装置の発酵液量を 2Lとなるように膜透過 水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵による L—乳酸の製造を行った。この とき、気体供給装置から窒素ガスを発酵反応槽内に供給し、排出されたガスを回収し て再度発酵反応槽に供給した。すなわち、窒素ガスを含む気体のリサイクル供給を 行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置 3により水 頭差を膜間差圧として測定し、上記膜透過水量制御条件で変化させることで行った 。適宜、膜透過発酵液中の生産された L 乳酸濃度および残存グルコース濃度を測 定した。また、該 L—乳酸、及びグルコース濃度力も算出された投入グルコースから 算出された L 乳酸対糖収率、 L 乳酸生産速度を表 24に示した。
[0402] 400時間の発酵試験を行った結果、連続発酵装置を用いた本発明の化学品の製 造方法により、安定した L 乳酸の連続発酵による製造が可能であった。連続発酵 の全期間中の膜間差圧は、 2kPa以下で推移した。
[0403] 実施例 30 乳酸菌を用いた連続発酵による L 乳酸の製造 (その 2)
図 2に示す連続発酵装置を用いた L 乳酸の製造を行った。培地には表 23に示す 乳酸菌乳酸発酵培地を用い、高圧蒸気滅菌処理（121°C、 15分)して用いた。該培 地は高圧蒸気滅菌（121°C、 15分)して用いた。分離膜としては参考例 2で作製した 多孔性膜を用いた。本実施例における運転条件は、特に断らない限り、以下のとおり である。
[0404] 発酵反応槽容量: 2 (L)
使用分離膜:ポリフッ化ビニリデン濾過膜
膜分離エレメント有効濾過面積： 120平方 cm
温度調整： 37 (°C)
発酵反応槽通気量： 50 (mL 窒素 Zmin) 発酵反応槽攪拌速度： 600 (rpm)
滅菌:分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は総て 121°C、 20minの オートクレープにより高圧蒸気滅菌。
[0405] pH調整： 8N アンモニア水溶液により pH6. 5に調整
透過水量制御:膜間差圧による流量制御
(連続発酵開始後〜 150時間： 0. lkPa以上 5kPa以下で制御
150時間〜 300時間： 0. lkPa以上 2kPa以下で制御
300時間〜 400時間： 0. lkPa以上 20kPa以下で制御）。
[0406] 原核微生物として、ラタトコッカス ラクテイス（Lactococcus lactis)JCM7638株 を用い、前培養までは実施例 29と同様に行った。前培養完了後直ちに、培地の連 続供給を行い、連続発酵装置の発酵液量を 1. 5Lとなるように膜透過水量の制御を 行いながら連続培養し、連続発酵による L 乳酸の製造を行った。このとき、気体供 給装置から窒素ガスを発酵反応槽内に供給し、排出されたガスを回収して再度発酵 反応槽に供給した。すなわち、窒素ガスを含む気体のリサイクル供給を行った。連続 発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置 3により水頭差を膜間 差圧として測定し、上記膜透過水量制御条件で変化させることで行った。適宜、膜透 過発酵液中の生産された L 乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。また 、該 L 乳酸、及びグルコース濃度力 算出された投入グルコース力 算出された L —乳酸対糖収率、 L—乳酸生産速度を表 24に示した。
[0407] 400時間の発酵試験を行った結果、図 2に示す連続発酵装置を用いた本発明の 化学品の製造方法により、安定した L 乳酸の連続発酵による製造が可能であった 。連続発酵の全期間中の膜間差圧は、 2kPa以下で推移した。
[0408] 比較例 15 回分発酵による L 乳酸の製造
微生物を用いた発酵形態として最も典型的な回分発酵を 2L容のジャーフアーメン ターを用いて行い、その L—乳酸生産性を評価した。培地には表 23に示す培地を用 い、高圧蒸気滅菌処理（121°C、 15分)して用いた。この本比較例では、原核微生物 としてラタトコッカス ラクテイス JCM7638株を用い、生産物である L 乳酸の濃度 の評価は、参考例 1に示した方法を用いて評価し、グルコース濃度の測定にはダル コーステストヮコー c (和光純薬)を用いた。本比較例の運転条件を以下に示す。
[0409] 発酵反応槽容量： 1 (L)
温度調整： 37 (°C)
発酵反応槽通気量： 50 (mL一窒素 Zmin)
発酵反応槽攪拌速度： 200 (rpm)
pH調整： 8N アンモニア水溶液により pH6. 5に調整。
[0410] まず、ラタトコッカス ラクテイス JCM7638株を、試験管で表 23に示す 5mlの窒素 ガスでパージした乳酸発酵培地で 24時間、 37°Cで静置培養した (前々培養)。得ら れた培養液を窒素ガスでパージした新鮮な乳酸発酵培地 50mlに植菌し、 48時間、 37°Cの温度で静置培養した (前培養)。前培養液をジャーフアーメンターの 1Lの表 2 3に示す連続 ·回分発酵培地に植菌し、回分発酵を行った。回分発酵の結果を、表 2 4に示す。
[0411] [表 24]
Figure imgf000102_0001
[0412] 図 1および図 2に示す発酵装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、 L一 乳酸の生産速度が大幅に向上することを明らかにすることができた。
[0413] 参考例 6 バシラス'ラエボラタティカス JCM2513の染色体 DNAの調製
バシラス'ラエボラクティカス JCM2513を、 GYP培地（特開 2003— 088392号公 報に記載の GYP培地） 100mlに接種し、温度 30°Cの温度で 24時間培養して培養 物を得た。得られた培養物を 3000rpmで 15分間、遠心分離処理し湿潤菌体 0. 5g を得た後、該湿潤菌体から、斎藤、三浦の方法 (Biochem. Biophys. Acta., 72, 619 ( 1963) )により染色体 DNAを得た。次いで、この染色体 DNA60 /Z gおよび制限酵素 Sau3AI、 3ユニットを 10mMトリス—塩酸緩衝液（50mM NaCl、 10mM MgSOお よび ImMジチオスレィトール含有 (pH 7. 4) )に各々混合し、温度 37°Cで 30分間 反応させた。反応終了液を常法により、フ ノール抽出処理し、エタノール沈澱処理 して Sau3AIで消化されたバシラス ·ラエボラタティカス JCM2513の染色体 DNA断 片 50 gを得た。
[0414] 参考例 7 プラスミドベクター DNAを利用したバシラス'ラエボラタティカス JCM25 13の遺伝子ライブラリーの作製
ェシエリヒア'コリ（Escherichia coli)で自律複製可能なプラスミドベクタ一 DNA ( PUC19) 20 μ gおよび制限酵素 BamHI200ユニットを、 50mMトリス—塩酸緩衝液 (lOOmMNaClおよび 10mM硫酸マグネシウム含有（pH7. 4) )に混合し、温度 37 °Cで 2時間反応させて消化液を得、該消化液を常法によりフエノール抽出し、更にェ タノール沈澱処理を行った。
[0415] その後、プラスミドベクター由来の DNAフラグメントが再結合することを防止するた め、バクテリアルアルカリホスファターゼ処理により、 DNA断片の脱リン酸ィ匕を行い、 常法によりフエノール抽出処理し、更にエタノール沈澱処理を行った。
[0416] この BamHIで消化された pUC19を 1 μ g、参考例 6で得られた Sau3AIで消化され たバシラス'ラエボラタティカス JCM2513の染色体 DNA断片 1 μ g、および 2ュ-ッ トの T4DNAリガーゼ（宝酒造 (株）製）を、 66mM塩化マグネシウム、 10mMジチォ スレイトールおよび lOmMATPを含有する 66mMトリス—塩酸緩衝液（pH7. 5)に 添加し、温度 16°Cで 16時間反応させ、 DNAを連結させた。次いで、得られた DNA 混合物で、常法によりェシエリヒア'コリ JM109を形質転換し、これを 50 g/mlのァ ンピシリンナトリウムを含む LB寒天培地上にまき、約 20, 000個のコロニーを得、遺 伝子ライブラリ一とした。約 20, 000個のコロニーより、糸且換え DNAの回収を行なつ た。回収の方法は、上記に示した斎藤、三浦の方法に従った。
[0417] 参考例 8 D—乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のスクリーニング用宿主の作製
バシラス ·ラエボラタティカス JCM2513株の D - LDH遺伝子のスクリ一-ングを、 機能相補によって行った。その原理の詳細は、「（DOMINIQUE, G., Appl Environ Mi crobiol, United States (1995) 61 266- 272)」に記載されている。すなわち、エツシエリ シァ'コリの D—乳酸デヒドロゲナーゼ酵素活性およびピルビン酸ギ酸リアーゼ酵素 活性を欠失した株を作製する必要がある。キリルらの方法 (Kirill, A., PNAS, United S tates (2000) 97 6640-6645)によって、エツシエリシァ'コリの D—乳酸デヒドロゲナー ゼ遺伝子 (ldhA)およびピルビン酸ギ酸リアーゼ遺伝子 (pflBおよび pflD)を破壊欠 失した株を作製した。このようにして作製した株を、ェシエリヒア'コリ TM33株 (E. c oli A ldhA Δ ρίΙΒ :： Kmr A pflD : : Cmr)と命名し、 D—乳酸デヒドロゲナーゼ遺 伝子のスクリ一ユング用宿主とした。
[0418] 参考例 9 D—乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のスクリーニング
ェシエリヒア'コリ TM33株を、 50 μ gZmlのカナマイシン硫酸塩および 15 μ gZ mlのクロラムフエ-コールを含む LB培地 100mlに接種し、温度 37°Cで 24時間培養 し、培養物を得た。このようにして得られた培養物を、 3, OOOrpmで 15分間遠心分 離処理し、湿潤菌体 0. 8gを得た。得られた湿潤菌体を 10%グリセロール溶液 10ml で 3度洗浄した後、 10%グリセロール溶液 0. 1mlにけん濁しコンビテントセルとした。 このコンビテントセルに、参考例 8で得られたバシラス'ラエボラタティカス JCM2513 株の遺伝子ライブラリーを 1 μ 1加え、電気穿孔法の常法に従い導入した株を 50 g Zmlのアンピシリンナトリウムを含む M9GP寒天培地（M9培地 + 0. 4%グルコース + 0. 2%ペプトン)上にまき、嫌気条件下で生育可能であった株を数株得た。
[0419] 参考例 10 D—乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含有する DNAの塩基配列の解析 上記で得られた組換え DNAを含有するェシエリヒア'コリ TM33ZPBL2から、常 法に従！、プラスミドを調製し、得られた組換え DNAを用い塩基配列の決定を行った 。塩基配列の決定は、 Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (アプライド バイオケミカル社製)を用い Sangerの方法に従って行った。得られた D—乳酸デヒド ロゲナーゼ遺伝子を含む DNAの塩基配列は、 2, 995塩基対あった。この配列につ V、て Genetyx (ソフトウェア開発株式会社製）を用いてオープン 'リーディング 'フレー ム検索を行い、 1, 011塩基対の D—乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の DNA配列（配 列番号 10)を仮決定した。
[0420] 参考例 11 D—乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子発現ベクターの作製
バシラス'ラエボラタティカスから、 D— LDH遺伝子をクローユングした。 D— LDH 遺伝子は、全て PCR法によりクローユングを行い、同様の方法で発現ベクターに導 入している。クローニング方法を以下に示す。
[0421] バシラス ·ラエボラタティカスを培養し遠心回収後、 UltraClean Microbial DNA Isolat ion Kit (MO BIO社製)を用いてゲノム DNAの抽出を行った。詳細な操作方法は、付 属のプロトコールに従った。得られたゲノム DNAを続く PCRの铸型とした。上記で得 られた DNAを铸型として、それぞれ PCRにより D— LDH遺伝子のクローユングを行 つた。 PCR増幅反応には、 Taqの 50倍の正確性を持つとされる KOD— Plus— poly merase (東洋紡社製）を用いた。反応バッファーおよび dNTPmixなどは、付属のも のを使用した。 D— LDH遺伝子増幅用プライマー（配列番号 11、 12)は、 5末端側 には Xhol認識配列、 3末端側には Notl認識配列がそれぞれ付加されるようにして作 製した。
[0422] 各 PCR増幅断片を精製し末端を T4 Polynucleotide Kinase (TAKARA社製）に よりリン酸ィ匕後、 PUC118ベクター (制限酵素 Hindiで切断し、切断面を脱リン酸ィ匕 処理したもの）にライゲーシヨンした。ライゲーシヨンは、 DNA Ligation Kit Ver. 2 ( TAKARA社製)を用いて行った。ェシエリヒア'コリ DH5 aに形質転換し、プラスミド D NAを回収することにより、 D— LDH遺伝子がサブクローユングされたプラスミドが得 られた。この各 D— LDH遺伝子が挿入された pUC 118ベクターを制限酵素 Xholお よび Notlで切断し、得られた各 DNA断片を酵母発現用ベクター pTRS 11 (図 5)の XholZNotl切断部位に導入した。このようにして作製した D— LDH遺伝子発現べ クタ一を PTM63と示す。
[0423] 参考例 12 D— LDH遺伝子発現ベクターの酵母への導入
参考例 11のようにして得られた pTM63を酵母サッカロマイセス ·セレピシェ NBR C10505株に形質転換した。开質転換は、 YEASTMAKER Yeast Transformation Sy stem (CLONTECH社製)を用いた酢酸リチウム法により行った。詳細は、付属のプロト コールに従った。宿主とするサッカロマイセス 'セレピシェ NBRC10505株はゥラシ ル合成能を欠損した株であり、 PTM63の持つ URA3遺伝子の働きにより、ゥラシル 非添加培地上で PTM63の導入された形質転換体の選択が可能である。
[0424] このようにして得られた形質転換体への D— LDH遺伝子発現ベクター導入の確認 は、ゥラシル非添加の液体培地で培養した形質転換株から、ゲノム DNA抽出キット Genとるくん（TAKARA社製）によりプラスミド DNAを含むゲノム DNAを抽出し、これ を铸型として PreMix Taq (TAKARA社製）を用いた PCRにより行った。プライマー には、 D— LDH遺伝子をクローユングした際に用いたプライマーを使用した。その結 果、全ての形質転換体において、 D— LDH遺伝子が導入されていることが確認され た。
[0425] pTM63が導入されたサッカロマイセス'セレビシェ NBRC10505株を以下、 NB
RC10505ZpTM63株と示す。
[0426] 実施例 31 連続発酵による D 乳酸の製造 (その 1)
図 1に示す連続発酵装置と表 25に示す組成の D 乳酸生産培地を用い、 D 乳 酸の製造を行った。培地は、高圧蒸気滅菌（121°C、 15分)して用いた。分離膜エレ メント部材には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成形品を用いた。分離膜として は、参考例 2で作製した多孔性膜を用いた。本実施例における運転条件は、特に断 らない限り、以下の通りである。
[0427] 発酵反応槽容量 : 2. O (L)
使用分離膜: PVDF濾過膜
膜分離エレメント有効濾過面積： 120平方 cm
温度調整： 30 (°C)
発酵反応槽通気量: 0. 2 (LZmin)空気
発酵反応槽攪拌速度： 800 (rpm)
pH調整： 5N NaOHにより pH5. 0に調整
滅菌:分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は総て 121°C、 20minのォ 一トクレーブにより高圧蒸気滅菌
膜透過水量制御:膜間差圧による流量制御
(連続発酵開始後〜 100時間： 0. lkPa以上 5kPa以下で制御
100〜200以上時間： 2kPa以下で制御
200〜320時間： 0. lkPa以上 20kPa以下で制御）。
[0428] 微生物として、 NBRC10505ZpTM63株を用い、培地として表 25に示す組成の D 乳酸生産培地を用 、、生産物である D 乳酸の濃度の評価は参考例 1と同様の HPLC法により測定した。また、グルコース濃度の測定には、グルコーステストヮコ C (和光純薬社製)を用いた。
[表 25] 酵母乳酸発酵培地 グルコース 100 g
Yeast Nitrogen base
w/o amino acid(Diico†土) 6.7 g ロイシンを除く
標準 19種アミノ酸 152 mg ロイシン 760 mg イノシトール 152 mg
P-ァミノ安息香酸 16 mg アデニン 40 mg
単位 1/Liter)
[0430] まず、 NBRC10505ZpTM63株を、試験管で 5mlの D—乳酸生産培地でー晚振 とう培養した (前々々培養)。得られた培養液を、新鮮な D—乳酸生産培地 50mlに植 菌し、 500ml容坂ロフラスコで 24時間、 30°Cの温度で振とう培養した (前々培養)。 前々培養液を、図 1に示す連続発酵装置の 2. OLの D—乳酸生産培地に植菌し、発 酵反応槽 1を付属の攪拌機 5によって 800rpmで攪拌し、発酵反応槽 1の通気量の 調整、温度調整、 pH調整を行い、 24時間培養を行った (前培養)。
[0431] 前培養完了後直ちに、発酵液循環ポンプ 10を稼働させ、前培養時の運転条件に 加え、膜分離槽 2を通気し、 D—乳酸生産培地の連続供給を行い、連続発酵装置の 発酵液量を 2Lとなるよう膜透過水量の制御を行 ヽながら連続培養し、連続発酵によ るカダベリンの製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭 差制御装置 3により水頭差を膜間差圧として測定し、上記膜透過水量制御条件で変 ィ匕させることで行った。適宜、膜透過発酵液中の生産された乳酸濃度および残存グ ルコース濃度を測定した。 320時間の連続発酵試験を行った結果を表 26に示す。
[0432] 膜分離型連続発酵装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、安定した D— 乳酸の連続発酵による製造が可能であった。連続発酵の期間中の膜間差圧は、 2k Pa以下で推移した。 [0433] 実施例 32 連続発酵による D 乳酸の製造 (その 2)
図 2に示す発酵装置と表 25に示す組成の D 乳酸生産培地を用 、、 D-乳酸の製 造を行った。培地は高圧蒸気滅菌（121°C、 15分)して用いた。分離膜エレメント部 材には、ステンレス、及びポリサルホン樹脂の成形品を用いた。分離膜としては、参 考例 2で作製した多孔性膜を用いた。本実施例における運転条件は、特に断らない 限り、以下の通りである。
[0434] 発酵反応槽容量： 1. 5 (L)
使用分離膜:ポリフッ化ビニリデン濾過膜
膜分離エレメント有効濾過面積： 120平方 cm
温度調整： 30 (°C)
発酵反応槽通気量: 0. 2 (LZmin)空気
発酵反応槽攪拌速度： 800 (rpm)
pH調整： 5N NaOHにより pH5. 0に調整
滅菌:分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は総て 121°C、 20minのォ 一トクレーブにより高圧蒸気滅菌
膜透過水量制御:膜間差圧による流量制御。
[0435] (連続発酵開始後〜 90時間： 0. lkPa以上 5kPa以下で制御
90〜180時間： 0. lkPa以上 2kPa以下で制御
180〜264時間： 0. lkPa以上 20kPa以下で制御）。
[0436] 微生物として、 NBRC10505ZpTM63株を用い、培地として表 25に示す組成の D 乳酸生産培地を用 、、生産物である D 乳酸の濃度の評価は参考例 1と同様の HPLC法により測定した。また、グルコース濃度の測定には、グルコーステストヮコー C (和光純薬社製)を用いた。
[0437] まず、 NBRC10505ZpTM63株を、試験管で 5mlの D 乳酸生産培地でー晚振 とう培養した (前々々培養)。得られた培養液を、新鮮な D 乳酸生産培地 50mlに植 菌し、 500ml容坂ロフラスコで 24時間、 30°Cの温度で振とう培養した (前々培養)。
[0438] 前々培養液を、図 2に示す連続発酵装置の 1. 5Lの D 乳酸生産培地に植菌し、 発酵反応槽 1を付属の攪拌機 5によって 800rpmで攪拌し、発酵反応槽 1の通気量 の調整、温度調整および pH調整を行い、 24時間培養を行った (前培養)。前培養完 了後直ちに、 D—乳酸生産培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵液量を 1. 5Lとなるよう膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵による D—乳酸 の製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置 3により水頭差を膜間差圧として測定し、上記膜透過水量制御条件で変化させること で行った。適宜、膜透過発酵液中の生産された D—乳酸濃度および残存グルコース 濃度を測定した。また、該 D—乳酸および投入グルコース力 算出された D—乳酸生 産速度を表 26に示した。
[0439] 264時間の発酵試験を行った結果、図 2に示す連続発酵装置を用いた本発明の 化学品の製造方法により、安定した D—乳酸の連続発酵による製造が可能であった 。連続発酵の全期間中の膜間差圧は、 2kPa以下で推移した。
[0440] 比較例 16 回分発酵による D—乳酸の製造
微生物を用いた発酵形態として最も典型的な回分発酵を 2L容のジャーフアーメン ターを用いて行い、その D—乳酸生産性を評価した。培地は、高圧蒸気滅菌（121 。C、 15分）して用いた。本比較例では、微生物として NBRC10505ZPTM63株を 用い、生産物である D—乳酸の濃度の評価は HPLCを用いて評価し、グルコース濃 度の測定にはグルコーステストヮコー C (和光純薬社製)を用いた。本比較例の運転 条件は、下記のとおりである。
[0441] 発酵反応槽容量 (D—乳酸生産培地量） : 1. O (L)
温度調整： 30 (°C)
発酵反応槽通気量: 0. 2 (LZmin)空気
発酵反応槽攪拌速度： 300 (rpm)
pH調整： 5N NaOHにより pH5. 0に調整。
[0442] まず、 NBRC10505ZPTM63株を試験管で 5mlの D—乳酸生産培地でー晚振と う培養した (前々培養)。前々培養液を新鮮な D—乳酸生産培地 50mlに植菌し 500 ml容坂ロフラスコで 24時間、 30°Cの温度で振とう培養した (前培養)。前培養液をジ ヤーフアーメンターの 1. 5Lの D—乳酸生産培地に植菌した。 D—乳酸生産培地を用 い、回分発酵を行った。その結果を表 26に示す。 [0443] [表 26]
Figure imgf000110_0001
[0444] 図 1および図 2に示す発酵装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、 D— 乳酸の生産速度が大幅に向上することを明らかにすることができた。
[0445] 参考例 13 多孔性膜の作製 (その 5)
重量平均分子量 41. 7万のフッ化ビニリデンホモポリマーと γ -ブチ口ラタトンとを、 それぞれ 38重量％と 62重量％の割合で 170°Cの温度で溶解し原液を作製した。こ の原液を γ -プチ口ラタトンを中空部形成液体として随拌させながら口金から吐出し、 温度 20°Cの γ -ブチ口ラタトン 80重量％水溶液力 なる冷却浴中で固化して中空糸 膜を作製した。
[0446] 次いで、重量平均分子量 28. 4万のフッ化ビ-リデンホモポリマーを 14重量％、セ ルロースアセテートプロピオネート（イーストマンケミカル社、 CAP482— 0. 5)を 1重 量0 /0、 Ν-メチル -2-ピロリドンを 77重量0 /0、ポリオキシエチレンヤシ油脂肪酸ソルビタ ン（三洋化成株式会社、商品名ィォネット T—20C)を 5重量％、水を 3重量％の割合 で 95°Cの温度で混合溶解して原液を調整した。この原液を中空糸膜表面に均一に 塗布し、すぐに水浴中で凝固させた中空糸膜を製作した。得られた中空糸膜は被処 理水側表面の平均孔径が 0. 05 mであった。次に、上記分離膜について純水透 水量を評価したところ、 5. 5 X 10— 9m3Zm2' s'Paであった。透水量の測定は、逆浸 透膜による 25°Cの精製水を用い、ヘッド高さ lmで行った。また、平均細孔径の標準 偏差は 0. 006 μ mであった。
[0447] 実施例 33 中空糸膜を用いた連続発酵による L—乳酸の製造 (その 1)
分離膜として参考例 13で作製した多孔性膜を使用して作製した有効濾過面積が 1 20平方 cmの図 4に示す分離膜エレメントを用 ヽ、実施例 1と同様の L -乳酸連続発 酵試験を行った。その結果を比較例 1の結果とともに表 27に示す。安定した L 乳酸 の連続発酵による製造が可能であった。連続発酵の全期間中の膜間差圧は、 2kPa 以下で推移した。
[0448] 実施例 34 中空糸膜を用いた連続発酵による L—乳酸の製造 (その 2)
分離膜として参考例 13で作製した多孔性膜を使用して作製した有効濾過面積が 1 20平方 cmの図 4に示す分離膜エレメントを用 ヽ、実施例 4と同様の L -乳酸連続発 酵試験を行った。その結果を比較例 1とともに表 27に示す。安定した L—乳酸の連続 発酵による製造が可能であることが確認できた。連続発酵の全期間中の膜間差圧は 、 2kPa以下で推移した。
[0449] [表 27]
Figure imgf000111_0001
産業上の利用可能性 本発明は、簡便な操作方法で、長時間にわたり安定して高生産性を維持する連続 発酵法による化学品の製造方法である。本発明によれば、簡便な操作条件で、長時 間にわたり安定して高生産性を維持する連続発酵が可能となり、広く発酵工業にお
V、て、発酵生産物である化学品を低コストで安定に生産することが可能となる。

Claims

請求の範囲
[1] 微生物もしくは培養細胞の培養液を、分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収し、さ らに、未濾過液を培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を培養液に追加する 連続発酵において、分離膜として、平均細孔径が 0.01 μ m以上 1 μ m未満の多孔性 膜を用い、膜間差圧を 0.1から 20kPaの範囲で濾過処理する化学品の製造方法。
[2] 多孔性膜の純水透過係数が、 2 X 10— 9m3/m2/s/pa以上 6 X lO'Wm s/ pa以下である請求項 1に記載の化学品の製造方法。
[3] 多孔性膜の平均細孔径が、 0.01 μ m以上 0.2 m未満であり、かつ、多孔性膜の細 孔径の標準偏差が 0.1 m以下である請求項 1に記載の化学品の製造方法。
[4] 多孔性膜の膜表面粗さが 0.1 m以下の多孔性膜である請求項 1に記載の化学品 の製造方法。
[5] 多孔性膜が、多孔質榭脂層を含む多孔性膜である請求項 1に記載の化学品の製造 方法。
[6] 多孔質榭脂層が、有機高分子力もなる多孔質榭脂層である請求項 5に記載の化学 品の製造方法。
[7] 有機高分子膜の材質が、ポリフッ化ビ-リデンである請求項 5に記載の化学品の製 造方法。
[8] 微生物または培養細胞の培養液および発酵原料が、糖類を含む請求項 1に記載の 化学品の製造方法。
[9] 化学 PF口が、有機酸である請求項 1に記載の化学品の製造方法。
[10] 化学 PF口が、 L 乳酸である請求項 1記載の化学品の製造方法。
[11] 化学 PF口が、 D 乳酸である請求項 1記載の化学品の製造方法。
[12] 化学 PF口が、ピルビン酸である請求項 1記載の化学品の製造方法。
[13] 化学 PF口が、コハク酸である請求項 1記載の化学品の製造方法。
[14] 化学 PF口が、ィタコン酸である請求項 1記載の化学品の製造方法。
[15] 化学 PF口が、カダベリンである請求項 1に記載の化学品の製造方法。
[16] 化学 PF口が、アルコールである請求項 1に記載の化学品の製造方法。
[17] 化学 PF口が、エタノールである請求項 1に記載の化学品の製造方法。
[18] 化学品が、 1, 3—プロパンジオールである請求項 1に記載の化学品の製造方法。
[19] 化学品が、核酸である請求項 1に記載の化学品の製造方法。
[20] 化学品が、イノシンである請求項 1に記載の化学品の製造方法。
[21] 化学品が、アミノ酸である請求項 1に記載の化学品の製造方法。
[22] 化学品が、 L-スレオニンである請求項 1に記載の化学品の製造方法。
[23] 微生物もしくは培養細胞の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収 するとともに未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を 前記の発酵培養液に追加する連続発酵による化学品の製造装置であって、微生物 もしくは培養細胞を発酵培養させるための発酵反応槽と、該発酵反応槽に発酵培養 液循環手段を介して接続され内部に分離膜を備えた発酵培養液を濾過するための 膜分離槽と、分離膜の膜間差圧を 0.1から 20kPaの範囲に制御する手段力もなり、 該分離膜が平均細孔径 0.01 μ m以上 1 μ m未満の多孔性膜である連続発酵装置。
[24] 微生物もしくは培養細胞の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収す るとともに未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を前 記の発酵培養液に追加する連続発酵による化学品の製造装置であって、微生物もし くは培養細胞を発酵させるための発酵反応槽と、その発酵反応槽内部に配設され分 離膜を備えた発酵培養液を濾過するための分離膜エレメントと、該分離膜エレメント に接続され濾過された発酵生産物を排出するための手段と、該分離膜の膜間差圧を 0.1から 20kPaの範囲に制御するための手段力もなり、該分離膜が平均細孔径 0.01 μ m以上 1 μ m未満の細孔を有する多孔性膜である連続発酵装置。
[25] 多孔性膜の純水透過係数が、 2 X 10— 9m3/m2/s/pa以上 6 X lO'Wm s/ pa以下である請求項 23または 24に記載の連続発酵装置。
[26] 多孔性膜の平均細孔径が、 0.01 μ m以上 0.2 m未満であり、かつ、多孔性膜の細 孔径の標準偏差が 0.1 m以下である請求項 23または 24に記載の連続発酵装置。
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AU2007218753A AU2007218753B2 (en) 2006-02-24 2007-02-16 Method of producing chemical product and continuous fermentation apparatus
BRPI0707027-6A BRPI0707027B1 (pt) 2006-02-24 2007-02-16 Método de fabricação de um produto químico e aparelho de fermentação contínua
ES07714383T ES2728376T3 (es) 2006-02-24 2007-02-16 Procedimiento de producción de un producto químico y aparato de fermentación continua
EP07714383.2A EP1988170B8 (en) 2006-02-24 2007-02-16 Method of producing chemical product and continuous fermentation apparatus
US12/280,197 US9587253B2 (en) 2006-02-24 2007-02-16 Method of producing chemical product with continuous fermentation and filtering
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Cited By (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009065966A (ja) * 2007-08-22 2009-04-02 Toray Ind Inc 連続発酵による化学品の製造方法
WO2009072593A1 (ja) 2007-12-07 2009-06-11 Toray Industries, Inc. 乳酸脱水素酵素発現カセット、形質転換酵母および乳酸の製造方法
JP2009142210A (ja) * 2007-12-14 2009-07-02 Toray Ind Inc 連続発酵による乳酸の製造方法
WO2009099044A1 (ja) * 2008-02-04 2009-08-13 Toray Industries, Inc. 連続発酵による乳酸の製造方法
JP2010022321A (ja) * 2008-07-23 2010-02-04 Toray Ind Inc 連続培養による化学品の製造方法
WO2010038613A1 (ja) 2008-09-30 2010-04-08 東レ株式会社 化学品の製造方法および連続培養装置
WO2010074222A1 (ja) * 2008-12-26 2010-07-01 東レ株式会社 乳酸およびポリ乳酸の製造方法
WO2010140602A1 (ja) 2009-06-03 2010-12-09 東レ株式会社 Ｄ－乳酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびｄ－乳酸の製造方法
WO2011111451A1 (ja) 2010-03-10 2011-09-15 東レ株式会社 精製糖水溶液の製造方法および化学品の製造方法
WO2011162009A1 (ja) 2010-06-24 2011-12-29 東レ株式会社 精製糖水溶液の製造方法
JP2012050372A (ja) * 2010-08-31 2012-03-15 Toray Ind Inc コリネ型細菌による化学品の製造方法
WO2012036003A1 (ja) 2010-09-14 2012-03-22 東レ株式会社 連続発酵による化学品の製造方法
WO2012077742A1 (ja) 2010-12-09 2012-06-14 東レ株式会社 連続発酵による化学品の製造方法
WO2012115084A1 (ja) 2011-02-22 2012-08-30 東レ株式会社 ジオール組成物およびポリエステル
WO2012133477A1 (ja) 2011-03-29 2012-10-04 東レ株式会社 糖液の製造方法
WO2013105651A1 (ja) 2012-01-13 2013-07-18 東レ株式会社 化学品の製造方法
WO2013105652A1 (ja) 2012-01-13 2013-07-18 東レ株式会社 化学品の製造方法
WO2013105653A1 (ja) 2012-01-13 2013-07-18 東レ株式会社 化学品の製造方法
WO2013146920A1 (ja) 2012-03-30 2013-10-03 東レ株式会社 連続発酵による化学品の製造方法および連続発酵装置
WO2013187385A1 (ja) 2012-06-12 2013-12-19 東レ株式会社 糖液の製造方法
US8765405B2 (en) 2008-12-09 2014-07-01 Toray Industries, Inc. Method for producing sugar liquid
WO2015005410A1 (ja) 2013-07-12 2015-01-15 東レ株式会社 セルロース含有バイオマスからのアルコールの製造方法
WO2015159812A1 (ja) * 2014-04-14 2015-10-22 東レ株式会社 連続発酵による化学品の製造方法
US9217165B2 (en) 2011-04-28 2015-12-22 Toray Industries, Inc. Mutant strain of lactic acid producing yeast and process for producing lactic acid
RU2574783C2 (ru) * 2008-12-26 2016-02-10 Торэй Индастриз, Инк. Способ получения молочной кислоты, способ получения лактида и способы получения полимолочной кислоты
WO2016043289A1 (ja) * 2014-09-19 2016-03-24 旭硝子株式会社 有機酸の製造方法
WO2016117023A1 (ja) * 2015-01-20 2016-07-28 三菱化学エンジニアリング株式会社 酸素含有気体のマイクロナノバブルを供給する装置及び溶存二酸化炭素を除去する装置を備えた生物反応装置及びこの生物反応装置を用いた生物反応方法
WO2017154955A1 (ja) 2016-03-09 2017-09-14 東レ株式会社 グルコース組成物、微生物発酵原料および化学品の製造方法
WO2017159764A1 (ja) * 2016-03-17 2017-09-21 東レ株式会社 化学品の製造方法および微生物の培養方法
WO2018147289A1 (ja) 2017-02-07 2018-08-16 東レ株式会社 連続発酵によるアルコールの製造方法およびそれに用いる連続発酵装置
JP2018183133A (ja) * 2017-11-09 2018-11-22 株式会社村田製作所 有核細胞の濾過用フィルターおよびそれを用いた濾過方法
WO2019004478A1 (ja) 2017-06-30 2019-01-03 東レ株式会社 連続発酵による化学品の製造方法および製造装置
WO2019054469A1 (ja) * 2017-09-15 2019-03-21 東レ株式会社 エタノールの製造方法およびエタノール発酵液
WO2019230861A1 (ja) 2018-05-31 2019-12-05 東レ株式会社 揮発性の化学品の製造方法および発酵装置
US10519416B2 (en) 2016-03-18 2019-12-31 Murata Manufacturing Co., Ltd. Filter for filtration of nucleated cells and filtration method using the same
EP3716274A1 (en) 2019-03-29 2020-09-30 Ajinomoto Co., Inc. Control device, control method, computer program, and method for producing organic compound
US10858624B2 (en) 2017-04-26 2020-12-08 Murata Manufacturing Co., Ltd. Filter for filtering nucleated cells and filtering method using the same
TWI748376B (zh) * 2009-06-04 2021-12-01 美商奇諾麥提卡公司 分離發酵液成分之方法
US11344848B2 (en) 2015-09-04 2022-05-31 Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd. Porous film and method for producing same

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2404508A1 (en) * 2010-07-09 2012-01-11 LoHaS Products GmbH Method for producing a liquid with reduced saccharide content
BRPI1004963A2 (pt) * 2010-08-19 2015-03-24 Companhia Refinadora Da Amazônia Sistema e processo de correção de acidez a volume constante de meios fermentativos para a produção de ácidos orgânicos
US8999681B2 (en) * 2010-12-08 2015-04-07 Toray Industries, Inc. Method for producing cadaverine
WO2012077741A1 (ja) * 2010-12-08 2012-06-14 東レ株式会社 カダベリンの製造方法
US20130330792A1 (en) * 2010-12-27 2013-12-12 Toray Industries, Inc. Method for producing chemicals by continuous fermentation
US8802404B2 (en) * 2011-04-06 2014-08-12 University Of New Hampshire Vinyl acid monomer recovery
KR101286158B1 (ko) * 2011-08-24 2013-07-15 씨제이제일제당 (주) 발효액에서 1,4-디아미노부탄의 분리 및 정제하는 방법
EP2751255B1 (de) * 2011-09-01 2020-10-21 GICON Grossmann Ingenieur Consult GmbH Verfahren und vorrichtung zur gezielten einspeisung von gasen oder gasgemischen in eine flüssigkeit, suspension oder emulsion in einem photobioreaktor
ITNA20120046A1 (it) * 2012-08-02 2014-02-03 No Self S R L Uso di acidi nucleici di sistemi biologici parassiti, patogeni e infestanti per l'inibizione e/o controllo degli stessi sistemi
JP2015077119A (ja) * 2013-10-15 2015-04-23 カンウォン ナショナル ユニバーシティ， ユニバーシティ−インダストリー コーペレーション ファンデーション アクチノバシラススクシノゲネスを用いたコハク酸連続生産工程
CN106367326B (zh) * 2016-07-28 2018-10-30 南京工业大学 一种固定化细胞连续生产萃取戊二胺的装置
CA3071542A1 (en) * 2017-07-31 2019-02-07 Synata Bio, Inc. System and method for concentrating suspended solids prior to removal
CN107446813B (zh) * 2017-08-22 2023-10-31 江西省科学院微生物研究所 一种连续转化生产2-pe的装置及其连续转化生产2-pe的方法
CN107617251A (zh) * 2017-10-19 2018-01-23 苏州苏震生物工程有限公司 一种用于1,3‑丙二醇和2,3‑丁二醇发酵液预处理的设备及工艺
CN108300661A (zh) * 2018-02-13 2018-07-20 京东方科技集团股份有限公司 培养装置和培养设备
CN109609392B (zh) * 2018-12-24 2022-04-19 上海智城分析仪器制造有限公司 一种用于酵母菌的虹吸导管补料摇床培养方法
WO2020165873A1 (en) * 2019-02-15 2020-08-20 Oncosimis Biotech Private Limited Method and system for enhanced continuous production, secretion and separation of recombinant polypeptides from bacteria
KR102700388B1 (ko) * 2019-02-24 2024-08-30 온코시미스 바이오테크 프라이빗 리미티드 박테리아에 의한 재조합 glp-1 펩타이드의 연속 생성 방법
CN110129385A (zh) * 2019-03-18 2019-08-16 卢松 一种提高菌株产酸效率的方法
CN110982863B (zh) * 2019-12-31 2023-02-03 广州舒国生物科技有限公司 一种产呈味核苷酸二钠的微生物发酵方法
CN112410216A (zh) * 2020-10-21 2021-02-26 英诺维尔智能科技（苏州）有限公司 一种氮气和氧气动态调节反应器内溶氧量的方法
CN112646844A (zh) * 2020-12-25 2021-04-13 天津科技大学 一种赖氨酸循环发酵方法和应用
WO2023212400A1 (en) * 2022-04-29 2023-11-02 Manus Bio Inc. Fermentation processes and systems
GR1010735B (el) * 2023-05-12 2024-07-25 Εθνικο Κεντρο Ερευνας Και Τεχνολογικης Αναπτυξης (Ε.Κ.Ε.Τ.Α.), Βιοτεχνολογικη μεθοδος για τον καθαρισμο διαλυματων γαλακτικου οξεος απο χημικες προσμιξεις με γενετικα τροποποιημενους μικροοργανισμους και βιοαντιδραστηρες μεμβρανων

Citations (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5847485A (ja) 1981-08-18 1983-03-19 デ−・エル・エム・ドクトル・ミユラ−・アクチエンゲゼルシャフト 微生物を培養する方法及びその装置
JPS62138184A (ja) 1985-12-12 1987-06-20 Takeshi Kobayashi 連続型微生物培養装置
JPS63248396A (ja) * 1987-04-06 1988-10-14 Nok Corp ジヒドロオキソイソホロンの製造方法
JPH0595778A (ja) * 1991-10-07 1993-04-20 Agency Of Ind Science & Technol 撹拌機を装備した多孔質分離膜一体型培養器
JPH0698758A (ja) 1992-09-22 1994-04-12 Agency Of Ind Science & Technol 培養方法及び培養装置
JPH0669367B2 (ja) 1988-12-27 1994-09-07 雪印乳業株式会社 乳酸菌の培養方法
JPH07185270A (ja) 1993-12-24 1995-07-25 Kurita Water Ind Ltd 浸漬膜装置
JPH07185271A (ja) 1993-12-24 1995-07-25 Kurita Water Ind Ltd 浸漬膜装置
JPH10150996A (ja) 1996-11-21 1998-06-09 Ajinomoto Co Inc 連続発酵によるｌ−グルタミン酸の製造法
JPH10174594A (ja) 1996-12-17 1998-06-30 Ngk Insulators Ltd 微生物によるグリコール酸の生産方法
JPH10323543A (ja) * 1997-05-22 1998-12-08 Arakawa Chem Ind Co Ltd 微生物反応における生成物の分離方法
JPH11113587A (ja) * 1997-10-14 1999-04-27 Ube Ind Ltd アルコール発酵によるアルコールの製造方法および装置
JPH11137286A (ja) 1997-11-11 1999-05-25 Musashino Chemical Laboratory Ltd 乳酸の発酵方法
JPH11215980A (ja) 1998-02-02 1999-08-10 Kurita Water Ind Ltd 菌体含有液の処理方法
JP2000094000A (ja) 1998-09-21 2000-04-04 Kajima Corp 浸漬型膜利用メタン発酵システム
JP2000167555A (ja) 1998-09-29 2000-06-20 Nittetu Chemical Engineering Ltd 浸漬膜の洗浄方法
JP2000317273A (ja) 1999-05-07 2000-11-21 Kurita Water Ind Ltd 膜分離方法
JP2001211878A (ja) 2000-02-04 2001-08-07 National Federation Of Dairy Cooperative Associations ヨーグルトスターター乳酸菌の高濃度培養方法、及び得られた高濃度培養液を用いたヨーグルトの製造方法
JP2002511243A (ja) 1998-04-14 2002-04-16 デーエスエム・ナムローゼ・フェンノートシャップ 膜ろ過
WO2002064240A1 (fr) 2001-02-16 2002-08-22 Toray Industries, Inc. Film de separation, element de film de separation, module de film de separation, dispositif de traitement d'eaux usees et residuaires, et procede de fabrication de film de separation
JP2003053164A (ja) * 2001-08-20 2003-02-25 Kuraray Co Ltd 病原性原生動物の除去方法およびこれに用いられる分離膜
JP2003135941A (ja) 2001-08-23 2003-05-13 National Institute Of Advanced Industrial & Technology エタノール分離膜、エタノール分離膜を有するエタノール製造装置及びエタノール分離膜を用いるエタノール製造方法
JP2003135939A (ja) 2001-10-31 2003-05-13 Toray Ind Inc 分離膜およびその製造方法
JP2003144869A (ja) 2001-11-13 2003-05-20 Toray Ind Inc 分離膜およびその製造方法
JP2005028339A (ja) * 2003-07-11 2005-02-03 Daicel Chem Ind Ltd 洗車排水処理装置
JP2005111326A (ja) * 2003-10-06 2005-04-28 Toray Ind Inc 液体分離膜およびその使用方法
JP2005333886A (ja) 2004-05-27 2005-12-08 Showa Denko Kk 微生物によるコハク酸の製造方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2564147B2 (ja) 1987-10-09 1996-12-18 株式会社中埜酢店 高濃度菌体酢酸醗酵法
US5256294A (en) 1990-09-17 1993-10-26 Genentech, Inc. Tangential flow filtration process and apparatus
US5503750A (en) 1993-10-04 1996-04-02 Russo, Jr.; Lawrence J. Membrane-based process for the recovery of lactic acid by fermentation of carbohydrate substrates containing sugars
JPH10118461A (ja) * 1996-10-16 1998-05-12 Kao Corp 発酵生産物の回収方法
US6544424B1 (en) 1999-12-03 2003-04-08 Refined Technology Company Fluid filtration system
US6607669B2 (en) 2000-06-23 2003-08-19 Scilog, Inc. Method and apparatus for enhancing filtration yields in tangential flow filtration
ES2324704T3 (es) 2001-10-04 2009-08-13 Toray Industries, Inc. Metodo de produccion de una membrana de fibra hueca.
DK1720972T3 (da) 2004-03-05 2014-04-14 Dsm Ip Assets Bv Fremgangsmåde til celledyrkning ved hjælp af fortløbende perfusion og vekslende tangentialt flow
JP5130811B2 (ja) * 2006-07-19 2013-01-30 東レ株式会社 連続発酵による１，３−プロパンジオールの製造方法

Patent Citations (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5847485A (ja) 1981-08-18 1983-03-19 デ−・エル・エム・ドクトル・ミユラ−・アクチエンゲゼルシャフト 微生物を培養する方法及びその装置
JPS62138184A (ja) 1985-12-12 1987-06-20 Takeshi Kobayashi 連続型微生物培養装置
JPS63248396A (ja) * 1987-04-06 1988-10-14 Nok Corp ジヒドロオキソイソホロンの製造方法
JPH0669367B2 (ja) 1988-12-27 1994-09-07 雪印乳業株式会社 乳酸菌の培養方法
JPH0595778A (ja) * 1991-10-07 1993-04-20 Agency Of Ind Science & Technol 撹拌機を装備した多孔質分離膜一体型培養器
JPH0698758A (ja) 1992-09-22 1994-04-12 Agency Of Ind Science & Technol 培養方法及び培養装置
JPH07185270A (ja) 1993-12-24 1995-07-25 Kurita Water Ind Ltd 浸漬膜装置
JPH07185271A (ja) 1993-12-24 1995-07-25 Kurita Water Ind Ltd 浸漬膜装置
JPH10150996A (ja) 1996-11-21 1998-06-09 Ajinomoto Co Inc 連続発酵によるｌ−グルタミン酸の製造法
JPH10174594A (ja) 1996-12-17 1998-06-30 Ngk Insulators Ltd 微生物によるグリコール酸の生産方法
JPH10323543A (ja) * 1997-05-22 1998-12-08 Arakawa Chem Ind Co Ltd 微生物反応における生成物の分離方法
JPH11113587A (ja) * 1997-10-14 1999-04-27 Ube Ind Ltd アルコール発酵によるアルコールの製造方法および装置
JPH11137286A (ja) 1997-11-11 1999-05-25 Musashino Chemical Laboratory Ltd 乳酸の発酵方法
JPH11215980A (ja) 1998-02-02 1999-08-10 Kurita Water Ind Ltd 菌体含有液の処理方法
JP2002511243A (ja) 1998-04-14 2002-04-16 デーエスエム・ナムローゼ・フェンノートシャップ 膜ろ過
JP2000094000A (ja) 1998-09-21 2000-04-04 Kajima Corp 浸漬型膜利用メタン発酵システム
JP2000167555A (ja) 1998-09-29 2000-06-20 Nittetu Chemical Engineering Ltd 浸漬膜の洗浄方法
JP2000317273A (ja) 1999-05-07 2000-11-21 Kurita Water Ind Ltd 膜分離方法
JP2001211878A (ja) 2000-02-04 2001-08-07 National Federation Of Dairy Cooperative Associations ヨーグルトスターター乳酸菌の高濃度培養方法、及び得られた高濃度培養液を用いたヨーグルトの製造方法
WO2002064240A1 (fr) 2001-02-16 2002-08-22 Toray Industries, Inc. Film de separation, element de film de separation, module de film de separation, dispositif de traitement d'eaux usees et residuaires, et procede de fabrication de film de separation
JP2003053164A (ja) * 2001-08-20 2003-02-25 Kuraray Co Ltd 病原性原生動物の除去方法およびこれに用いられる分離膜
JP2003135941A (ja) 2001-08-23 2003-05-13 National Institute Of Advanced Industrial & Technology エタノール分離膜、エタノール分離膜を有するエタノール製造装置及びエタノール分離膜を用いるエタノール製造方法
JP2003135939A (ja) 2001-10-31 2003-05-13 Toray Ind Inc 分離膜およびその製造方法
JP2003144869A (ja) 2001-11-13 2003-05-20 Toray Ind Inc 分離膜およびその製造方法
JP2005028339A (ja) * 2003-07-11 2005-02-03 Daicel Chem Ind Ltd 洗車排水処理装置
JP2005111326A (ja) * 2003-10-06 2005-04-28 Toray Ind Inc 液体分離膜およびその使用方法
JP2005333886A (ja) 2004-05-27 2005-12-08 Showa Denko Kk 微生物によるコハク酸の製造方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"METHODS IN YEAST GENETICS", 2000, CSHL PRESS
TAKESHI KOBAYASHI ET AL., CHEMICAL ENGINEER, vol. 12, 1988, pages 49
TOSHIHIKO HIRAO, APPL. MICROBIOL. BIOTECHNOL., vol. 32, 1989, pages 269 - 273

Cited By (84)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009065966A (ja) * 2007-08-22 2009-04-02 Toray Ind Inc 連続発酵による化学品の製造方法
AU2008332348B2 (en) * 2007-12-07 2014-06-26 Toray Industries, Inc. Expression cassette for lactase dehydrogenase, transformed yeast and method of producing lactic acid
WO2009072593A1 (ja) 2007-12-07 2009-06-11 Toray Industries, Inc. 乳酸脱水素酵素発現カセット、形質転換酵母および乳酸の製造方法
CN101939426B (zh) * 2007-12-07 2014-01-08 东丽株式会社 乳酸脱氢酶表达盒、转化酵母和乳酸的制造方法
US8859260B2 (en) 2007-12-07 2014-10-14 Toray Industries, Inc. Expression cassette for lactase dehydrogenase, transformed yeast and method of producing lactic acid
JP5532919B2 (ja) * 2007-12-07 2014-06-25 東レ株式会社 乳酸脱水素酵素発現カセット、形質転換酵母および乳酸の製造方法
JP2009142210A (ja) * 2007-12-14 2009-07-02 Toray Ind Inc 連続発酵による乳酸の製造方法
WO2009099044A1 (ja) * 2008-02-04 2009-08-13 Toray Industries, Inc. 連続発酵による乳酸の製造方法
CN101939439A (zh) * 2008-02-04 2011-01-05 东丽株式会社 通过连续发酵实施的乳酸的制造方法
CN101939439B (zh) * 2008-02-04 2014-08-06 东丽株式会社 通过连续发酵实施的乳酸的制造方法
US8551745B2 (en) 2008-02-04 2013-10-08 Toray Industries, Inc. Method of producing lactic acid by continuous fermentation
JP5992135B2 (ja) * 2008-02-04 2016-09-14 東レ株式会社 連続発酵による乳酸の製造方法
JP2010022321A (ja) * 2008-07-23 2010-02-04 Toray Ind Inc 連続培養による化学品の製造方法
US10428358B2 (en) 2008-09-30 2019-10-01 Toray Industries, Inc. Method of producing a chemical product
RU2513694C2 (ru) * 2008-09-30 2014-04-20 Торэй Индастриз, Инк. Способ получения химического продукта и аппарат для непрерывной ферментации
EP2330209A4 (en) * 2008-09-30 2015-04-01 Toray Industries METHOD FOR PRODUCING A CONTINUOUS CHEMICAL CULTURE SYSTEM
CN106011187A (zh) * 2008-09-30 2016-10-12 东丽株式会社 化学品的制造方法和连续培养装置
AU2009299152B2 (en) * 2008-09-30 2015-07-16 Toray Industries, Inc. Method for producing chemical and continuous culture system
WO2010038613A1 (ja) 2008-09-30 2010-04-08 東レ株式会社 化学品の製造方法および連続培養装置
JP5881135B2 (ja) * 2008-09-30 2016-03-09 東レ株式会社 化学品の製造方法および連続培養装置
EP2330209A1 (en) * 2008-09-30 2011-06-08 Toray Industries, Inc. Method for producing chemical and continuous culture system
EP2840150A1 (en) 2008-12-09 2015-02-25 Toray Industries, Inc. Method for producing sugar liquid
US10093747B2 (en) 2008-12-09 2018-10-09 Toray Industries, Inc. Method for production sugar liquid
US8765405B2 (en) 2008-12-09 2014-07-01 Toray Industries, Inc. Method for producing sugar liquid
US10683254B2 (en) 2008-12-26 2020-06-16 Toray Industries, Inc. Method for producing lactic acid and method for producing polylactic acid
US11597694B2 (en) 2008-12-26 2023-03-07 Toray Industries, Inc. Method for producing lactic acid and method for producing polylactic acid
WO2010074222A1 (ja) * 2008-12-26 2010-07-01 東レ株式会社 乳酸およびポリ乳酸の製造方法
RU2650802C1 (ru) * 2008-12-26 2018-04-17 Торэй Индастриз, Инк. Композиция молочной кислоты и ее применение
RU2574783C2 (ru) * 2008-12-26 2016-02-10 Торэй Индастриз, Инк. Способ получения молочной кислоты, способ получения лактида и способы получения полимолочной кислоты
EP3147275A1 (en) 2008-12-26 2017-03-29 Toray Industries, Inc. Method for producing lactic acid and method for producing polylactic acid
CN102264911B (zh) * 2008-12-26 2015-11-25 东丽株式会社 乳酸及聚乳酸的制造方法
WO2010140602A1 (ja) 2009-06-03 2010-12-09 東レ株式会社 Ｄ－乳酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびｄ－乳酸の製造方法
US8822195B2 (en) 2009-06-03 2014-09-02 Toray Industries, Inc. Polypeptide having D-lactate dehydrogenase activity, polynucleotide encoding the polypeptide, and process for production of D-lactic acid
TWI748376B (zh) * 2009-06-04 2021-12-01 美商奇諾麥提卡公司 分離發酵液成分之方法
WO2011111451A1 (ja) 2010-03-10 2011-09-15 東レ株式会社 精製糖水溶液の製造方法および化学品の製造方法
WO2011162009A1 (ja) 2010-06-24 2011-12-29 東レ株式会社 精製糖水溶液の製造方法
JP2012050372A (ja) * 2010-08-31 2012-03-15 Toray Ind Inc コリネ型細菌による化学品の製造方法
WO2012036003A1 (ja) 2010-09-14 2012-03-22 東レ株式会社 連続発酵による化学品の製造方法
US9365876B2 (en) 2010-12-09 2016-06-14 Toray Industries, Inc. Method for producing chemical by continuous fermentation
WO2012077742A1 (ja) 2010-12-09 2012-06-14 東レ株式会社 連続発酵による化学品の製造方法
WO2012115084A1 (ja) 2011-02-22 2012-08-30 東レ株式会社 ジオール組成物およびポリエステル
US10696785B2 (en) 2011-02-22 2020-06-30 Toray Industries, Inc. Diol composition and polyester
US8986459B2 (en) 2011-03-29 2015-03-24 Toray Industries, Inc. Method for manufacturing a sugar solution by adding a polymer to the starting solution before filtration
WO2012133477A1 (ja) 2011-03-29 2012-10-04 東レ株式会社 糖液の製造方法
US9217165B2 (en) 2011-04-28 2015-12-22 Toray Industries, Inc. Mutant strain of lactic acid producing yeast and process for producing lactic acid
WO2013105652A1 (ja) 2012-01-13 2013-07-18 東レ株式会社 化学品の製造方法
WO2013105653A1 (ja) 2012-01-13 2013-07-18 東レ株式会社 化学品の製造方法
JPWO2013105653A1 (ja) * 2012-01-13 2015-05-11 東レ株式会社 化学品の製造方法
WO2013105651A1 (ja) 2012-01-13 2013-07-18 東レ株式会社 化学品の製造方法
CN104039970A (zh) * 2012-01-13 2014-09-10 东丽株式会社 化学品的制造方法
JPWO2013105652A1 (ja) * 2012-01-13 2015-05-11 東レ株式会社 化学品の製造方法
US10378029B2 (en) 2012-01-13 2019-08-13 Toray Industries, Inc. Method of producing chemical substance
JPWO2013105651A1 (ja) * 2012-01-13 2015-05-11 東レ株式会社 化学品の製造方法
CN107043791A (zh) * 2012-01-13 2017-08-15 东丽株式会社 化学品的制造方法
JP2017195909A (ja) * 2012-01-13 2017-11-02 東レ株式会社 化学品の製造方法
WO2013146920A1 (ja) 2012-03-30 2013-10-03 東レ株式会社 連続発酵による化学品の製造方法および連続発酵装置
US9644221B2 (en) 2012-03-30 2017-05-09 Toray Industries, Inc. Method of producing chemical by continuous fermentation and continuous fermentation apparatus
US9670516B2 (en) 2012-06-12 2017-06-06 Toray Industries, Inc. Method of producing sugar liquid
WO2013187385A1 (ja) 2012-06-12 2013-12-19 東レ株式会社 糖液の製造方法
US10093948B2 (en) 2013-07-12 2018-10-09 Toray Industries, Inc. Method of producing alcohol from cellulose-containing biomass
WO2015005410A1 (ja) 2013-07-12 2015-01-15 東レ株式会社 セルロース含有バイオマスからのアルコールの製造方法
US10927389B2 (en) 2014-04-14 2021-02-23 Toray Industries, Inc. Method of producing chemical substance by continuous fermentation
AU2015247075B2 (en) * 2014-04-14 2019-02-28 Toray Industries, Inc. Method for producing chemical substance by continuous fermentation
WO2015159812A1 (ja) * 2014-04-14 2015-10-22 東レ株式会社 連続発酵による化学品の製造方法
EP3133164A4 (en) * 2014-04-14 2018-01-03 Toray Industries, Inc. Method for producing chemical substance by continuous fermentation
WO2016043289A1 (ja) * 2014-09-19 2016-03-24 旭硝子株式会社 有機酸の製造方法
JPWO2016117023A1 (ja) * 2015-01-20 2017-10-26 三菱ケミカルエンジニアリング株式会社 酸素含有気体のマイクロナノバブルを供給する装置及び溶存二酸化炭素を除去する装置を備えた生物反応装置及びこの生物反応装置を用いた生物反応方法
WO2016117023A1 (ja) * 2015-01-20 2016-07-28 三菱化学エンジニアリング株式会社 酸素含有気体のマイクロナノバブルを供給する装置及び溶存二酸化炭素を除去する装置を備えた生物反応装置及びこの生物反応装置を用いた生物反応方法
US11344848B2 (en) 2015-09-04 2022-05-31 Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd. Porous film and method for producing same
WO2017154955A1 (ja) 2016-03-09 2017-09-14 東レ株式会社 グルコース組成物、微生物発酵原料および化学品の製造方法
WO2017159764A1 (ja) * 2016-03-17 2017-09-21 東レ株式会社 化学品の製造方法および微生物の培養方法
JPWO2017159764A1 (ja) * 2016-03-17 2019-01-17 東レ株式会社 化学品の製造方法および微生物の培養方法
US10519416B2 (en) 2016-03-18 2019-12-31 Murata Manufacturing Co., Ltd. Filter for filtration of nucleated cells and filtration method using the same
US11485951B2 (en) 2016-03-18 2022-11-01 Murata Manufacturing Co., Ltd. Filter for filtration of nucleated cells and filtration method using the same
WO2018147289A1 (ja) 2017-02-07 2018-08-16 東レ株式会社 連続発酵によるアルコールの製造方法およびそれに用いる連続発酵装置
US12018277B2 (en) 2017-04-26 2024-06-25 Murata Manufacturing Co., Ltd. Filter for filtering nucleated cells and filtering method using the same
US10858624B2 (en) 2017-04-26 2020-12-08 Murata Manufacturing Co., Ltd. Filter for filtering nucleated cells and filtering method using the same
JPWO2019004478A1 (ja) * 2017-06-30 2020-04-23 東レ株式会社 連続発酵による化学品の製造方法および製造装置
WO2019004478A1 (ja) 2017-06-30 2019-01-03 東レ株式会社 連続発酵による化学品の製造方法および製造装置
JP7070416B2 (ja) 2017-06-30 2022-05-18 東レ株式会社 連続発酵による化学品の製造方法および製造装置
WO2019054469A1 (ja) * 2017-09-15 2019-03-21 東レ株式会社 エタノールの製造方法およびエタノール発酵液
JP2018183133A (ja) * 2017-11-09 2018-11-22 株式会社村田製作所 有核細胞の濾過用フィルターおよびそれを用いた濾過方法
WO2019230861A1 (ja) 2018-05-31 2019-12-05 東レ株式会社 揮発性の化学品の製造方法および発酵装置
EP3716274A1 (en) 2019-03-29 2020-09-30 Ajinomoto Co., Inc. Control device, control method, computer program, and method for producing organic compound

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