CN101553572A - 化学品的制备方法和连续发酵装置 - Google Patents

Abstract

本发明是化学品的制备方法，该方法在用分离膜过滤微生物或培养细胞的培养液，从滤液中回收生产物，再将未滤过液保持于或回流到培养液中，并且向培养液中追加发酵原料的连续发酵中，使用平均细孔径为0.01μm以上至不到1μm的多孔性膜作为分离膜，在膜间差压为0.1至20kPa的范围内进行过滤处理。通过本发明，可以通过稳定地以低成本发酵使化学品的生产效率显著提高。

Description

化学品的制备方法和连续发酵装置

技术领域

本发明涉及化学品的制备方法和连续发酵装置。

背景技术

伴随微生物或培养细胞的培养的物质生产方法-发酵法大致可分类为(1)分批发酵法(Batch发酵法)和流加发酵法(Fed-Batch发酵法)，以及(2)连续发酵法。

分批和流加发酵法具有设备简单，培养在短时间内结束，被杂菌污染的机会少的优点。但是，随着时间过程，培养液中的生产物浓度变高，由于浸透压或者生产物抑制等影响，生产性和收率渐渐降低。因此难以经长时间稳定地维持高收率和高生产性。

连续发酵法具有由于回避了目的物质在发酵槽内以高浓度累积而可以经长时间维持高收率和高生产性的特征。就L-谷氨酸或L-赖氨酸的发酵而言，已经公开了连续培养法(非专利文献1)。但是，这些例子中，由于在向培养液中连续供给原料的同时，抽取含有微生物或细胞的培养液，培养液中的微生物或细胞被稀释，因此限制了生产效率的提高。

在连续发酵法中，现已提出了通过用分离膜过滤微生物或培养细胞，从滤液中回收生产物，与此同时使过滤的微生物或培养细胞保持于或回流到培养液中，从而维持培养液中的微生物或细胞的高浓度的方法。

例如，现已公开了在采用陶瓷膜的连续发酵装置中，连续发酵的技术(专利文献1、专利文献2、专利文献3)。但是，公开的技术存在着过滤流量和过滤效率由于陶瓷膜的堵塞而降低的问题，为了防止堵塞，进行了反向清洗等。

现已公开了使用分离膜的琥珀酸的制备方法(专利文献4)。该技术中，在膜分离中采用了高过滤压(约200kPa)。高过滤压不仅在成本上不利，而且在过滤处理中微生物或细胞由于压力而受到物理损伤，因此在微生物或细胞连续地返回到培养液的连续地发酵法中并不合适。

现有的连续培养是通过以一定速度向发酵槽供给新鲜培养基，将与其等量的培养液排出到槽外，从而将发酵槽内的液量总是保持一定的培养法。分批培养中最初基质浓度一旦被消耗，则培养终止，而连续培养理论上可以维持无限培养。即，理论上可以无限发酵。

另一方面，在上述现有的连续培养中，微生物与培养液一同排出到槽外，难以维持发酵槽内的微生物的高浓度。这其中，如果在进行发酵生产时，进行发酵的微生物能够保持在高浓度，则可以使每发酵容积的发酵生产效率提高。因此，需要使微生物保持于或者回流到发酵槽内。作为使微生物保持于或者回流到发酵槽内的方法，可以列举通过重力、例如离心分离来固液分离排出的培养液，将作为沉淀物的微生物返回到发酵槽的方法，通过过滤分离作为固体成分的微生物，只将培养液上清排出到槽外的方法。但是，通过离心分离进行的方法动力耗费高，因此并不现实。通过过滤进行的方法由于为了进行前述过滤需要高压力，基本是实验室水平上的研究。

这样一来，现有的连续发酵法中存在各种各样的问题，因此难以产业上应用。

换言之，在连续发酵法中，通过用分离膜过滤微生物或细胞，从滤液中回收生产物，与此同时使过滤的微生物或细胞回流到培养液中，使培养液中的微生物或细胞浓度提高，并且维持高浓度，获得高的物质生产性，依然是困难的，因此希望技术革新。

专利文献1：特开平5-95778号公报

专利文献2：特开昭62-138184号公报

专利文献3：特开平10-174594号公报

专利文献4：特开2005-333886号公报

非专利文献1：Toshihiko Hirao等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.，32，269-273(1989)

发明的公开

本发明是化学品的制备方法，该方法在用分离膜过滤微生物或培养细胞的培养液，从滤液中回收生产物，再将未滤过液保持于或回流到培养液中，并且向培养液中追加发酵原料的连续发酵中，使用平均细孔径为0.01μm以上至不到1μm的多孔性膜作为分离膜，在膜间差压为0.1至20kPa的范围内进行过滤处理。

本发明优选多孔性膜的纯水渗透系数在2×10^-9m³/m²/s/pa以上至6×10^-7m³/m²/s/pa以下的化学品的制备方法。

本发明优选多孔性膜的平均细孔径在0.01μm以上至不到0.2μm且多孔性膜的细孔径的标准偏差为0.1μm以下。

本发明优选多孔性膜的膜表面粗糙度为0.1μm以下的多孔性膜的化学品的制备方法。

本发明优选多孔性膜为含有多孔质树脂层的多孔性膜的化学品的制备方法。

本发明的连续发酵装置是通过用分离膜过滤微生物或培养细胞的发酵培养液、从滤液中回收生产物的同时将未滤过液保持于或回流到前述的发酵培养液中、且向前述的发酵培养液中追加发酵原料的连续发酵的化学品的制备装置，其包含以下部件：用于发酵培养微生物或培养细胞的发酵反应槽、通过发酵培养液循环部件与该发酵反应槽连接的内部配备有分离膜的用于过滤发酵培养液的膜分离槽、和将分离膜的膜间差压控制在0.1至20kPa范围内的部件，其中该分离膜为平均细孔径在0.01μm以上至不到1μm的多孔性膜。

另外，本发明的其它的连续发酵装置是通过用分离膜过滤微生物或培养细胞的发酵培养液、从滤液中回收生产物的同时将未滤过液保持于或回流到前述的发酵培养液中、且向前述的发酵培养液中追加发酵原料的连续发酵产生的化学品的制备装置，其包含以下部件：用于发酵微生物或培养细胞的发酵反应槽、具备配设于该发酵反应槽内部的装有分离膜的用于过滤发酵培养液的分离膜元件、与该分离膜元件连接的用于排出滤过的发酵生产物的部件、和用于将该分离膜的膜间差压控制在0.1至20kPa的范围的部件，其中所述该分离膜为具有平均细孔径在0.01μm以上至不到1μm的细孔的多孔性膜。

附图的简要说明

【图1】图1是用于说明可以在本发明中使用的膜分离型连续发酵装置的例子的概略侧面图。

【图2】图2是用于说明可以在本发明中使用的其它膜分离型连续发酵装置的例子的概略侧面图。

【图3】图3是用于说明可以在本发明中使用的分离膜元件的例子的概略斜视图。

【图4】图4是用于说明可以在本发明中使用的其它分离膜元件的例子的截面说明图。

【图5】图5是表示酵母用表达载体pTRS11的物理图谱的图。

符号的说明

1发酵反应槽

2分离膜元件

3水头差控制装置

4气体供给装置

5搅拌机

6水平传感器

7培养基供给泵

8pH调整溶液供给泵

9pH传感器控制装置

10温度调节器

11发酵液循环泵

12膜分离槽

13支持板

14流路部件

15分离膜

16凹部

17集水管

18分离膜束

19上部树脂密封层

20下部树脂密封层

21支持框

22集水管

用于实施发明的最佳方案

本发明是化学品的制备方法，该方法在用分离膜过滤微生物或培养细胞的培养液，从滤液中回收生产物，再将未滤过液保持于或回流到培养液中，并且向培养液中追加发酵原料的连续发酵中，使用平均细孔径为0.01μm以上至不到1μm的多孔性膜作为分离膜，在膜间差压为0.1至20kPa的范围内进行过滤处理。

就本发明中可以作为分离膜使用的多孔性膜进行说明。

就本发明中可以作为分离膜使用的多孔性膜的构成进行说明。本发明中的多孔性膜优选具有相应于被处理水的水质和用途的分离性能和透水性能。

多孔性膜，从阻止性能和透水性能和分离性能、例如、耐污性方面出发，优选含有多孔质树脂层的多孔性膜。

含有多孔质树脂层的多孔性膜，优选在多孔质基材的表面具有作为分离功能层作用的多孔质树脂层。多孔质基材通过支持多孔质树脂层而给予分离膜强度。

可以在本发明中使用的多孔性膜，优选在多孔质基材的表面上具有多孔质树脂层的情形时，多孔质树脂层可以浸透于多孔质基材中，也可以不浸透于多孔质基材中，根据用途进行选择。

多孔质基材的平均厚度优选在50μm以上3000μm以下。

多孔质基材的材质包括有机材料和/或无机材料等，理想的是使用有机纤维。优选的多孔质基材为由使用纤维素纤维、三乙酸纤维素纤维、聚酯纤维、聚丙烯纤维和聚乙烯纤维等有机纤维形成的织布或无纺布，更优选的是可以使用比较容易控制密度且价格便宜容易制备的无纺布。

多孔质树脂层可以合适地使用有机高分子膜。作为有机高分子膜的材质，可以列举，例如、聚乙烯系树脂、聚丙烯系树脂、聚氯乙烯系树脂、聚偏1，1-二氟乙烯系树脂、聚砜系树脂、聚醚砜系树脂、聚丙烯腈系树脂、纤维素系树脂和三乙酸纤维素系树脂等。有机高分子膜可以是以这些树脂作为主要成分的树脂的混合物。这其中，所谓主要成分是指其成分含有50重量％以上、优选60重量％以上。有机高分子膜的材质优选通过溶液容易制膜，在物理的耐久性和耐药性上优异的聚氯乙烯系树脂、聚偏1，1-二氟乙烯系树脂、聚砜系树脂、聚醚砜系树脂和聚丙烯腈系树脂，最优选可使用聚偏1，1-二氟乙烯系树脂或以其作为主要成分的树脂。

其中，作为聚偏1，1-二氟乙烯系树脂，优选可以使用1，1-二氟乙烯的均聚物。而且，聚偏1，1-二氟乙烯系树脂优选还可以使用1，1-二氟乙烯和可以共聚的乙烯系单体的共聚体。作为可以与1，1-二氟乙烯共聚的乙烯系单体，可以列举四氟乙烯、六氟丙烯和三氯氟乙烯等。

本发明中使用的多孔性膜的平均细孔径在0.01μm以上至不到1μm十分重要。多孔性膜的平均细孔径如果在0.01μm以上至不到1μm，难以发生由于发酵中使用的微生物而导致的堵塞，而且过滤性能具有长期间稳定持续的性能。另外，多孔性膜的平均细孔径如果在0.01μm以上至不到1μm，可以使微生物或者培养细胞不渗漏的高排除率和高透水性并存，长时间保持透水性，可以保持更高的精度和再现性来实施。

由于若孔接近生物或培养细胞的大小，这些生物或培养细胞会直接堵塞孔的情况，因此多孔性膜的平均细孔径不到1μm。为了防止微生物或培养细胞的漏出、即排除率降低的麻烦的发生，多孔性膜的平均细孔径优选与微生物或培养细胞的大小相比较不过大的平均细孔径。微生物或培养细胞中，使用细胞小的细菌等时，作为平均细孔径优选0.4μm以下，如果不到0.2μm，可以更合适地实施。

而且，存在生产以微生物或培养细胞作为目的的化学品以外的物质例如蛋白质、多糖类等容易凝集的物质的情况，进而，存在由于培养液中的微生物或培养细胞的一部分死亡而生成细胞的破碎物的情况，为了回避由于这些物质而造成的多孔性膜的堵塞，平均细孔径合适的是在0.1μm以下。

一般而言，多孔性膜的平均细孔径，优选在0.4μm以下，更优选不到0.2μm，或者0.1μm以下。

由于平均细孔径如果过小，多孔性膜的透水性能降低，膜即使不被污染，也无法有效运转，因此在本发明中的多孔性膜的平均细孔径在0.01μm以上。多孔性膜的平均细孔径优选在0.02μm以上，更合适的是0.04μm以上。

其中，平均细孔径，可以通过在倍率10,000倍的扫描电子显微镜观察中，测定能够在9.2μm×10.4μm的范围内观察的所有细孔的直径，进行平均而求出。或者，平均细孔径还可以通过使用扫描电子显微镜以10,000倍的倍率拍摄膜表面，随意选择10个以上、优选20个以上的细孔，测定这些细孔的直径，算术平均后求出。细孔不是圆形时，可以通过用画像处理装置等，求出具有与细孔具有的面积等面积的圆(等价圆)，以等价圆直径作为细孔的直径的方法求出。

本发明中使用的多孔性膜的平均细孔径的标准偏差σ优选在0.1μm以下。平均细孔径的标准偏差越小越好。平均细孔径的标准偏差σ通过以可以在上述9.2μm×10.4μm的范围内观察的细孔数作为N，测定的各个直径作为Xk，以X(ave)作为细孔平均直径的下述(式1)计算。

[数1]

$\mathrm{\σ}=\sqrt{\frac{\underset{k=1}{\overset{N}{\mathrm{\Σ}}}{(X_k-X\left(\mathrm{ave}\right))}^2}{N}}$ ....(式1)

可以在本发明中使用的多孔性膜中，培养液的渗透性是十分重要的性能之一。作为多孔性膜的渗透性的指标，可以使用使用前的多孔性膜的纯水渗透系数。本发明中，多孔性膜的纯水渗透系数，在采用反渗透膜用25℃温度的纯化水，以头高度1m测定透水量进行计算时，优选在2×10^{- 9}m³/m²/s/pa以上，纯水渗透系数如果在2×10^-9m³/m²/s/pa以上6×10^{- 7}m³/m²/s/pa以下，能够获得实用上充分的渗透水量。

可以在本发明中使用的多孔性膜中，表面粗糙度是相对于表面的垂直方向的高度的平均值。膜表面粗糙度是用于通过由搅拌或循环泵产生的液流所获得的膜面清洗效果而使附着于分离膜表面的微生物或培养细胞容易剥离的一个因子。多孔性膜的表面粗糙度优选为0.1μm以下。表面粗糙度如果在0.1μm以下，附着于膜的微生物或培养细胞容易剥离。

而且，通过使用优选多孔性膜的膜表面粗糙度在0.1μm以下，平均细孔径为0.01μm以上至不到1μm径和多孔性膜的纯水渗透系数为2×10^{- 9}m³/m²/s/pa以上的膜，清楚了不需要过度的膜面清洗所需要动力的运转更为容易。通过使多孔性膜的表面粗糙度为0.1μm以下，可以使微生物或培养细胞的过滤中，在膜表面上发生的剪切力降低，微生物的破坏受到抑制，多孔性膜的堵塞也被抑制，因此可以更容易地使长期稳定的过滤成为可能。通过使多孔性膜的表面粗糙度为0.1μm以下，可以以更低的膜间差压实施连续发酵，即使膜发生堵塞时，与以高的膜间差压运转的情形相比，清洗恢复性良好，因此优选。通过抑制堵塞，使稳定的连续发酵成为可能，因此优选多孔性膜的表面粗糙度越小越好。

其中，膜表面粗糙度是用下述的原子力显微镜装置(AFM)，在下述的条件下测定的。

装置  原子力显微镜装置(Digital Instruments(株)制Nanoscope IIIa)

条件

探针        SiN悬臂(Digital Instruments(株)制)

            扫描模式接触模式(气中测定)

            水中轻敲模式(水中测定)

扫描范围    10μm、25μm四周(气中测定)

            5μm、10μm四周(水中测定)

扫描分辨率  512×512

试样调制    测定时膜样本为在常温下浸渍于乙醇中15分钟后，浸渍于RO水中24小时清洗后、风干使用。

膜表面粗糙度d_rough是根据用上述原子力显微镜装置(AFM)获得的各点的Z轴方向的高度，用下述的(式2)计算出的。

【数2】

$d_{\mathrm{rough}}=\underset{m=1}{\overset{N}{\mathrm{\Σ}}}\frac{|Z_n-\stackrel{\‾}{Z}|}{N}$ ....(式2)

d_rough：平均表面粗糙度(μm)

Z_n：Z轴方向的高度(μm)

Z：扫描范围的平均高度(μm)

可以在本发明中使用的多孔性膜的形状优选为平膜。多孔性膜的形状为平膜时，其平均厚度根据用途进行选择。多孔性膜的形状为平膜时的平均厚度优选在20μm以上5000μm以下，更优选在50μm以上2000μm以下。

可以在本发明中使用的多孔性膜的形状优选为中空纤维膜。多孔性膜为中空纤维膜时，中空纤维的内径优选为200μm以上5000μm以下，膜厚优选在20μm以上2000μm以下。而且，可以在中空纤维的内部含有有机纤维或无机纤维形成筒状的织物或编物。

通过例示说明可以在本发明中使用的多孔性膜的制成方法的概要。

首先，对多孔性膜中平膜的制作方法的概要进行说明。

在多孔质基材的表面上形成含有树脂和溶剂的原液的被膜，与此同时使该原液浸渍于多孔质基材中。然后，通过只使具有被膜的多孔质基材的被膜侧表面与含有非溶剂的凝固浴接触而使树脂凝固，并在多孔质基材的表面形成多孔质树脂层。

通过将树脂溶解于溶剂中来调整原液。原液的温度，从制膜性的观点来看，通常优选在5～120℃的范围内选择。溶剂是溶解树脂的、通过作用于树脂促进它们形成多孔质树脂层的溶剂。作为溶剂，可以使用N-甲基吡咯烷酮(NMP)、N，N-二甲基乙酰胺(DMAc)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、N-甲基-2-吡咯烷酮、甲乙酮、四氢呋喃、四甲基尿素、磷酸三甲酯、环己酮、异佛尔酮、γ-丁内酯、甲基异戊基酮、邻苯二甲酸二甲酯、丙二醇甲基醚、碳酸异丙烯酯、双丙酮醇、甘油三乙酸酯、丙酮和甲乙酮等。其中，可以优选使用树脂的溶解性高的N-甲基吡咯烷酮(NMP)、N，N-二甲基乙酰胺(DMAc)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)。可以单独使用它们，也可以联合使用2种以上。

例如，可以在溶剂中添加溶剂以外的聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、甘油等成分。溶剂中还可以添加非溶剂。非溶剂是不溶解树脂的液体。非溶剂以通过控制树脂的凝固速度来控制细孔的大小的方式作用。作为非溶剂，可以使用水、或甲醇和乙醇等醇类。其中，作为非溶剂，从价格方面考虑，优选水或甲醇。溶剂以外的成分和非溶剂还可以是混合物。

还可以在原液中添加开孔剂。开孔剂是在浸渍于凝固浴中时被抽取的，具有使树脂层形成为多孔质的作用。通过添加开孔剂，可以控制平均细孔径的大小。开孔剂优选在凝固浴中溶解性高的。作为开孔剂，可以使用，例如氯化钙或碳酸钙等无机盐。而且，作为开孔剂，可以使用聚乙二醇或聚丙烯乙二醇等聚氧化烯类、聚乙烯醇、聚乙烯醛缩丁醇和聚丙烯酸等水溶性高分子化合物、甘油。

然后，对多孔性膜中的中空纤维膜的制备方法的概要进行说明。

中空纤维膜，可以通过以下方式进行制备，即由双管式金属嘴外侧的管吐出由树脂和溶剂构成的原液，同时从双管式金属嘴内侧的管吐出中空部形成用流体，在冷却浴中冷却固化。

原液，可以通过以下方式进行调整，即，使在上述平膜的制成方法中所述的树脂以20重量％以上60重量％以下的浓度溶解于上述平膜制成方法中所述的溶剂中。而且，可以使用通常气体或液体作为中空部形成用流体。而且，还可以在获得的中空纤维膜的外表面上涂覆(层压)新的多孔性树脂层。为了使中空纤维膜的性质例如亲水疏水性、细孔径等变化成所希望的性质，可以进行层压。被层压的新多孔性树脂层，可以通过使树脂溶解于溶剂中的原液与含有非溶剂的凝固浴接触，使树脂凝固来制备。这种树脂的材质可以优选使用，例如，与上述有机高分子膜的材质相同的材质。而且，对层压的方法没有特别的限定，可以将中空纤维膜浸渍于原液中，也可以在中空纤维膜的表面上涂布原液，层压后，还可以通过取出所付着的原液的一部分，或用气刀吹掉来调整层压量。

可以在本发明中使用的多孔性膜，还可以通过使用树脂等材料粘着、密封中空纤维膜的中空部，设置于支持体上而形成分离膜元件。

可以在本发明中使用的多孔性膜，还可以通过使之与支持体组合而形成分离膜元件。使用支持板作为支持体，在该支持板的至少一面配备可以在本发明中使用的多孔性膜的分离膜元件，是具有可以在本发明中使用的多孔性膜的分离膜元件的合适的形态之一。为了增大透水量，在支持板的两面配备多孔性膜是分离膜元件的优选方式。

本发明的化学品的制备方法在0.1至20kPa的范围内的膜间差压进行过滤处理。为了过滤发酵培养液，若在比20kPa更高的膜间差压下进行过滤处理，则需要用于增加压力的动力，制备化学品时的经济效果则下降。通过施加比20kPa更高的膜间差压，微生物或者培养细胞被破碎的情形会发生，导致生产化学品的能力下降。本发明的化学品的制备方法，在滤过压即膜间差压为0.1至20kPa的范围，通过水头差而获得膜间差压，因此不需要将发酵槽内特意保持在加压状态，生产化学品的能力不降低。而且，还可以列举由于不需要将发酵槽内特意保持在加压状态，因此可形成在发酵槽内部设置多孔性膜的方案，具有发酵装置紧凑的优点。本发明的化学品的制备方法中，优选膜间差压在0.1至2kPa的范围内进行过滤处理。

本发明的化学品的制备方法使用发酵原料。作为本发明中使用的发酵原料，可以是促进所培养的微生物的生长，使目的发酵产物-化学品良好生产的原料。

本发明中使用的发酵原料可以是合适地含有碳源、氮源、无机盐类、和根据需要含有氨基酸、维生素等有机微量营养素的常规的液体培养基。作为碳源，可以使用葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、乳糖等糖类、含有这些糖类的淀粉糖化液、甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜、高级糖蜜(High TestMollases)、醋酸等有机酸、乙醇等醇类、甘油等。作为氮源，可以使用氨气、氨水、铵盐类、尿素、硝酸盐类、其它可辅助使用的有机氮源、例如油渣饼类、大豆加水分解液、酪蛋白分解物、其它氨基酸、维生素类、玉米浆、酵母或酵母提取物、肉膏、蛋白胨等肽类、各种发酵菌体和其加水分解物等。作为无机盐类，可以适当添加磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐、锰盐等。

当本发明中使用的微生物的生长需要特定的营养素时，将该营养物作为制品或含有其的天然物质添加。而且，根据需要使用消泡剂。本发明中，所谓培养液，是指微生物或培养细胞在发酵原料中增殖所获得的液体。追加的发酵原料的组成可以根据培养开始时的发酵原料组成适当变化以便目的化学品的生产性变高。

本发明中，培养液中的糖类浓度优选保持在5g/l以下。培养液中的糖类浓度优选保持在5g/l以下的理由是，使由于培养液的取出而导致的糖类的流失达到最小限度。

微生物的培养，通常在pH4-8、温度20-40℃的范围内进行。培养液的pH，用无机酸或者有机酸、碱性物质、进而用尿素、碳酸钙、氨气等，通常调节为pH4-8范围内的预先设定的值。如果需要提高氧的供给速度，可以采用在空气中添加氧将氧浓度保持在21％以上，或者加压培养，提高搅拌速度，提高通气量等手段。

本发明的化学品的制备方法中，还可以在培养初期进行分批培养或流加(Fed-Batch)培养，微生物浓度提高后，开始连续培养(取出)。本发明的化学品的制备方法中，还可以在微生物浓度提高后，接种高浓度的菌体，在培养开始的同时进行连续培养。本发明的化学品的制备方法中，可以从适当的时期开始进行原料培养液的供给和培养物的取出。原料培养液供给和培养物的取出的开始时期不需要一定相同。而且，原料培养液的供给和培养物的取出可以是连续的，也可以是间歇的。

向原料培养液中添加菌体增殖所必需的营养素，以使菌体增殖连续进行为好。培养液中的微生物或培养细胞的浓度，在培养液的环境为对于微生物或培养细胞的增殖不合适而死亡的比率并不变高的范围内，为了获得效率好的生产性而优选以高状态维持。培养液中的微生物或培养细胞的浓度，作为其中一例，通过将干燥重量维持在5g/L以上可获得良好的生产效率。

本发明的化学品的制备方法中，根据需要，可以从发酵槽内取出微生物或培养细胞。例如，发酵槽内的微生物或培养细胞浓度过高的话，分离膜的堵塞就会容易发生，因此通过取出，可以回避堵塞。而且，存在由于发酵槽内的微生物或培养细胞浓度而导致化学品的生产性能发生变化的情况，还可以以生产性能作为指标，通过取出微生物或培养细胞而维持生产性能。

在本发明的化学品的制备方法中，使具有发酵生产能力的新鲜菌体增殖的同时而进行的连续培养操作只要是使菌体增殖的同时生成生产物的连续培养法即可，对发酵槽数目不限。本发明的化学品的制备方法中，连续培养操作通常在单一的发酵槽中进行，故在培养管理上来说优选。从发酵槽的容量小等理由出发，还可以使用多个发酵槽。此时，即使用配管并联或串联连接多个发酵槽，进行连续培养，也获得了发酵生产物的高生产性。

对可以在本发明的化学品的制备方法中使用的微生物或者培养细胞进行说明。对本发明的化学品的制备方法中使用的微生物或培养细胞没有限制。本发明中使用的微生物和培养细胞，可以列举，例如可以在发酵工业中常使用的面包酵母等酵母、大肠杆菌、棒状杆菌型细菌等细菌、丝状真菌、放线菌、动物细胞、昆虫细胞等。使用的微生物或细胞，可以是从自然环境中分离的，而且，也可以是通过突变或基因重组而改变了部分性质的。

作为由本发明的化学品的制备方法制备的化学品，只要是上述微生物或细胞在培养液中生产的物质即可，并没有限制。由本发明的化学品的制备方法制备的化学品，可以列举醇、有机酸、氨基酸、核酸等在发酵工业中可大量生产的物质。例如，作为醇，可以列举乙醇、1，3-丙二醇、1，4-丁二醇、甘油等，作为有机酸，可以列举醋酸、乳酸、丙酮酸、琥珀酸、苹果酸、衣康酸、柠檬酸，如果是核酸，可以列举次黄苷、鸟苷等核苷、次黄苷酸、鸟苷酸等核苷酸、以及尸胺等二胺化合物。而且，本发明，还可以用于生产酶、抗生素、重组蛋白质等物质。

接着，对于可以在本发明的化学品的制备方法使用的微生物或者培养细胞，边列举具体的化学品边进行说明。

本发明的化学品的制备方法中，作为可以在L-乳酸的生产中使用的微生物或者培养细胞，只要是可以生产L-乳酸的微生物即可，并没有限制。本发明的化学品的制备方法中，作为可以在L-乳酸的生产中使用的微生物或者培养细胞，优选可以使用乳酸菌。这其中，所谓乳酸菌，可以定义为：相对于消耗的葡萄糖，产生对糖收率50％以上的乳酸的原核微生物。作为优选的乳酸菌，可以列举，例如，属于乳杆菌属(Genus Lactobacillus)、片球菌属(Genus Pediococcus)、四体球菌属(Genus Tetragenococcus)、食杆菌属(Genus Carnobacterium)、徘徊球菌属(Genus Vagococcus)、明串珠菌属(Genus Leuconostoc)、酒球菌属(Genus Oenococcus)、奇异菌属(Genus Atopobium)、链球菌属(Genus Streptococcus)、肠球菌属(Genus Enterococcus)、乳球菌属(Genus Lactococcus)、和芽孢杆菌属(Genus Bacillus)的乳酸菌。这些乳酸菌中，选择乳酸的对糖收率高的乳酸菌，可优选用于乳酸的生产。

本发明的化学品的制备方法中，进一步地，选择乳酸中L-乳酸的对糖收率高的乳酸菌，可优选用于乳酸的生产。所谓L-乳酸，是乳酸的光学异构体的一种，可与其对映体D-乳酸明确区分。作为L-乳酸的对糖收率高的乳酸菌，可以列举例如、果汁乳杆菌(Lactobacillus yamanashiensis)、动物乳杆菌(Lactobacillus animalis)、敏捷乳杆菌(Lactobacillus agilis)、鸟类乳杆菌(Lactobacillus aviaries)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbruekii)、类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、瘤胃乳杆菌(Lactobacillusruminis)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、沙氏乳杆菌(Lactobacillussharpeae)、糊精片球菌(Pediococcus dextrinicus)、和乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)等，可以选择它们用于L-乳酸的生产。

用本发明的化学品的制备方法制备L-乳酸时，可使用人为赋予或增强了乳酸生产能力的微生物或培养细胞。例如，可以使用通过导入L-乳酸脱氢酶基因(以下，有时称为L-LDH)而赋予或增强了L-乳酸生产能力的微生物或培养细胞。作为赋予或增强L-乳酸生产能力的方法，还可以使用通过以往已知的药剂突变而进行的方法。更优选可以列举，微生物通过整合L-LDH而L-乳酸生产能力增强的重组微生物。

用本发明的化学品的制备方法制备L-乳酸时，作为重组微生物的宿主，原核细胞，优选大肠杆菌、乳酸菌，和真核细胞，优选酵母等，尤为优选酵母。酵母中优选属于酵母属(Genus Saccharomyces)的酵母，更优选酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

作为本发明中使用的L-LDH，只要是编码具有将还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和丙酮酸转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)和L-乳酸的活性的蛋白质即可，并没有限制。例如，可以使用L-乳酸的对糖收率高的乳酸菌来源的L-LDH。可以合适地使用哺乳类来源的L-LDH。这其中可使用人类(Homo sapiens)来源、和蛙来源的L-LDH。蛙中优选使用属于负子蟾科(Pipidae)的蛙来源的L-LDH，在属于负子蟾科的蛙中，可优选使用非洲爪蟾(Xenopus laevis)来源的L-LDH。

本发明中可使用的人或蛙来源的L-LDH中包括由于遗传的多态性、诱发突变等而造成的突变型的基因。所谓遗传的多态性，是由于基因上的自然突变而导致的基因的碱基序列一部分发生变化。而且，所谓诱发突变，是指在基因中人工导入突变。诱发突变，有例如，使用部位特异的突变导入用试剂盒(Mutan-K(takara bio社制))的方法、采用随机突变导入用试剂盒(BD Diversify PCR Random Mutagenesis(CLONTECH社制))的方法等。而且，本发明中使用的人或蛙来源的L-LDH，只要是编码具有将NADH和丙酮酸转化为NAD⁺和L-乳酸的活性的蛋白质，也可以在碱基序列的一部中存在缺失或插入。

用本发明的化学品的制备方法制备L-乳酸时，制备的过滤、分离发酵液中所含的L-乳酸的分离、纯化可以通过组合以往已知的浓缩、蒸馏和晶析等方法来进行。例如，可以列举通过将过滤、分离发酵液的pH调整到1以下，然后用二乙醚或乙酸乙酯等提取的方法，吸附于离子交换树脂，清洗后洗脱的方法，在酸催化剂的存在下使之与醇反应，作为酯蒸馏的方法，以及结晶为钙盐或锂盐的方法等。优选，可用蒸馏操作处理使过滤、分离发酵液的水分蒸发的浓缩L-乳酸溶液。其中，蒸馏时，优选一边供给水分一边蒸馏以便蒸馏原液的水分浓度固定。L-乳酸水溶液在蒸馏后，通过加热蒸发浓缩水分，可以获得目的浓度的纯化L-乳酸。当获得含有乙醇或醋酸等低沸点成分的L-乳酸水溶液作为蒸馏液时，在L-乳酸浓缩过程中除去低沸点成分为优选的方式。蒸馏操作后，对于蒸馏液，根据需要，用离子交换树脂、活性碳和色谱分离等去除杂质，还可以获得更高纯度的L-乳酸。

用本发明的化学品的制备方法制备D-乳酸时，作为可以在D-乳酸生产中使用的微生物或者培养细胞，只要是可以生产D-乳酸的微生物即可，并没有限制。可以在D-乳酸生产中使用的微生物或者培养细胞，例如，野生型株中，可以列举具有合成D-乳酸能力的属于乳杆菌属(Lactobacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)和片球菌属(Pediococcus)的微生物。

本发明的化学品的制备方法中制备D-乳酸时，优选野生型株的D-乳酸脱氢酶(以下，有时也称为D-LDH)的酶活性增强。作为使酶活性增强的方法，还可以使用通过以往已知的药剂突变的方法。更优选，可以列举，微生物通过整合编码D-乳酸脱氢酶的基因，而使其D-乳酸脱氢酶的酶活性得以增强的重组微生物。

本发明的化学品的制备方法中制备D-乳酸时，作为重组微生物的宿主，原核细胞的话，优选大肠杆菌、乳酸菌，且真核细胞的话，优选酵母等，尤为优选酵母。

本发明的化学品的制备方法中制备D-乳酸时，编码D-乳酸脱氢酶的基因优选为来源于植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、和乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、和左乳酸芽孢杆菌(Bacillus laevolacticus)的基因，更优选为来源于左乳酸芽孢杆菌(Bacillus laevolacticus)的基因。

本发明的化学品的制备方法中制备D-乳酸时，过滤、分离发酵液中所包含的D-乳酸的分离、纯化可以通过组合以往已知的浓缩、蒸馏和晶析等方法来进行。例如，可以列举通过将过滤、分离发酵液的pH调整到1以下，然后用二乙醚或乙酸乙酯等提取的方法；吸附于离子交换树脂，清洗后洗脱的方法；在酸催化剂的存在下使之与醇反应，作为酯蒸馏的方法；以及结晶为钙盐或锂盐的方法等。本发明的化学品的制备方法中制备D-乳酸时，优选地，可用蒸馏操作处理使过滤、分离发酵液的水分蒸发的浓缩D-乳酸溶液。其中，蒸馏时，优选一边供给水分一边蒸馏以便蒸馏原液的水分浓度固定。D-乳酸水溶液在蒸馏后，通过加热蒸发水分而浓缩，可以获得目的浓度的纯化D-乳酸。获得含有低沸点成分(乙醇、醋酸等)的D-乳酸水溶液作为馏出液时，在D-乳酸浓缩过程中除去低沸点成分为优选的方式。蒸馏操作后，对于馏出液，根据需要，用离子交换树脂、活性碳和色谱分离等除去杂质，还可以获得更高纯度的D-乳酸。

用本发明的化学品的制备方法制备乙醇时，作为可以在乙醇生产中使用的微生物或者培养细胞，只要是可以生产丙酮酸的微生物或者培养细胞即可，并没有限制。作为可以在乙醇生产中使用的微生物或者培养细胞，可以使用例如，属于酵母属(Genus Saccharomyces)、克鲁维酵母属(GenusKluyveromyces)、裂殖酵母菌属(Genus Schizosaccharomyces)的酵母。这其中可合适地使用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。而且，还可以优选使用属于乳杆菌属(Genus Lactobacillus)、发酵单胞菌属(Genus  Zymomonas)的细菌。这其中，可合适地使用短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)。

本发明中可以在乙醇的生产中使用的微生物或者培养细胞可以是人为地提高了乙醇生产能力的微生物或者培养细胞。本发明中可以在乙醇的生产中使用的微生物或者培养细胞，具体地也可以是，由于突变或基因重组而导致部分性质改变的微生物或者培养细胞。作为部分性质改变的微生物或者培养细胞的一例，可以列举整合了属于根霉属霉菌的葡糖淀粉酶基因而获得了生淀粉的同化能力的酵母(微生物，3：555-564(1987))。而且，由本发明的制备方法制备的过滤、分离发酵液中所含的乙醇的分离、纯化，可合适地使用例如，通过蒸馏法进行的纯化法，或使用NF、RO膜、或者沸石制的分离膜的浓缩、纯化法。

用本发明的化学品的制备方法制备丙酮酸时，作为可以在丙酮酸的生产中使用的微生物或者培养细胞，只要是可以生产丙酮酸的微生物或者培养细胞即可，并没有限制。作为可以在丙酮酸的生产中使用的微生物或者培养细胞，可优选使用属于假单胞菌属(Genus Pseudomonas)、棒杆菌属(Genus Corynebacterium)、埃希氏菌属(Genus Escherichia)、不动杆菌属(Genus Acinetobacter)的细菌。更优选可以使用荧光假单胞菌(Pseudomonas fuluorescens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、大肠杆菌(Escherichia coli)等细菌。还可以使用这些细菌由于突变或基因重组而导致部分性质发生改变的细菌。例如，还可优选使用突变或缺失了通过氧化磷酸化而直接参与ATP生产的ATPase基因的细菌。而且，还可以优选使用霉菌、酵母等。例如，可以使用属于酵母属(GenusSaccharomyces)、球拟酵母属(Genus Torulopsis)、假丝酵母属(GenusCandida)、裂褶菌属(Genus Schizophyllum)的霉菌、酵母。更优选，可以使用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、Saccharomyces copsis、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、解脂假丝酵母(Candida lipolytica)、光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)、裂褶菌(Schizophyllum commune)等霉菌、酵母制备丙酮酸。

用本发明的化学品的制备方法制备丙酮酸时，过滤、分离发酵液中所含的丙酮酸的分离、纯化，可以通过使用阴离子交换柱的方法进行。例如，可合适地使用特开平6-345683中公开的采用弱碱性离子交换体的纯化法。

用本发明的化学品的制备方法制备琥珀酸时，作为可以在琥珀酸的生产中使用的微生物或者培养细胞，只要是可以生产琥珀酸的微生物即可，并没有特别限定。作为可以在琥珀酸的生产中使用的微生物或者培养细胞，可合适地使用属于厌氧螺菌(Anaerobiospirillum)属或放线杆菌(Actinobacillus)属的细菌。具体的而言，可以列举美国专利第5143833号说明书中记载的产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)或由James B.Mckinlay公开的琥珀酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes)(Appl.Microbiol.Biotechnol.，71，6651-6656(2005)。而且，还可以使用棒杆菌(Corynebacterium)属或短杆菌(Brevibacterium)属等棒状杆菌型细菌(Coryneform bacterium)和大肠杆菌(Escherichia)等。棒状杆菌型细菌中，合适的是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、和乳发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)等。

而且，作为微生物，可以使用琥珀酸的生产能力由于基因重组得到改善的微生物，由此也可使琥珀酸的生产性提高。作为这种微生物，可以使用例如特开2005-27533号公报中记载的缺失了乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase)的黄色短杆菌MJ233AB-41(FERM BP-1498)、非专利文献1中记载的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、美国专利第5770435号说明书中记载的丙酮酸甲酸裂解酶(pyruvate formate lyase)和乳酸脱氢酶的缺失株-大肠杆菌AFP111株等。

用本发明的化学品的制备方法制备琥珀酸时，琥珀酸的分离、纯化，可以使用常规的琥珀酸纯化法。例如，可合适地使用特开2005-333886号公报中公开的组合了水分解电渗析处理和减压浓缩、晶析的纯化法。

用本发明的化学品的制备方法制备衣康酸时，作为可以在衣康酸的生产中使用的微生物或者培养细胞，只要是可以生产衣康酸的微生物即可，并没有限制。作为可以在衣康酸的生产中使用的微生物或者培养细胞，优选可使用霉菌或者酵母。更优选可以列举采用属于曲霉属(GenusAspergillus)、或者黑粉菌属(Genus Ustilago)的霉菌和属于假丝酵母属(Genus Candida)、红酵母属(Genus Rhodotorula)的酵母进行衣康酸的生产。这其中，在衣康酸的生产中优选使用土曲霉(Aspergillus terreus)、解乌头酸曲霉(Aspergillus itaconicus)、玉米黑粉菌(Ustilago maydis)、狗牙根黑粉菌(Ustilago cynodontis)、和拉宾黑粉菌(Ustilagorabenhorstina)的霉菌、或者南极假丝酵母(Candia antarctica)。

用本发明的化学品的制备方法制备衣康酸时，衣康酸的分离、纯化优选可以采用超滤或电渗析进行。例如，可合适地使用特公昭-50958号公报中公开的通过采用超滤和盐型阳离子交换树脂膜的电渗析进行的纯化法。

用本发明的化学品的制备方法制备1，3-丙二醇时，作为可以在1，3-丙二醇的生产中使用的微生物或者培养细胞，只要是可以生产1，3-丙二醇的微生物即可，并没有特别的限定。作为可以在1，3-丙二醇的生产中使用的微生物或者培养细胞，可以列举，例如，野生型株中，具有由甘油合成1，3-丙二醇的能力的属于克雷伯氏菌(Klebsiella)属、梭菌(Clostridium)属、乳杆菌(Lactobacillus)属的微生物。

用本发明的化学品的制备方法制备1，3-丙二醇时，微生物优选含有(a)编码具有甘油脱水酶活性的多肽的至少一个基因；(b)编码甘油脱水酶再活性化因子的至少一个基因；和(c)编码具有将3-羟基丙醛转换成1，3-丙二醇的非特异的催化剂活性的至少一个基因。本发明中，更优选可以列举，微生物为重组微生物且可以生产1，3-丙二醇。

用本发明的化学品的制备方法制备1，3-丙二醇时，具有由甘油合成1，3-丙二醇的能力的微生物，优选为选自于克雷伯氏菌属(Klebsiella)、梭菌属(Clostridium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、柠檬酸细菌属(Citrobacter)、肠杆菌属(Enterobacter)、气杆菌属(Aerobacter)、曲霉属(Aspergillus)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母菌属(Schizosaccharomyces)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、毛霉属(Mucor)、球拟酵母属(Torulopsis)、甲基细菌属(Methylobacter)、沙门氏菌属(Salmonella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、气杆菌属(Aerobacter)、链霉菌属(Streptomyces)、埃希氏菌属(Eschericia)和假单胞菌属(Pseudomonas)中的重组微生物，更优选为大肠杆菌。

用本发明的化学品的制备方法制备1，3-丙二醇时，重组微生物优选为已进行改良，使得可以由葡萄糖有效地生产1，3-丙二醇。重组微生物，优选为含有例如(a)编码具有甘油-3-磷酸脱氢酶活性的多肽的至少一个基因；和(b)编码具有甘油-3-磷酸酶活性的多肽的至少一个基因的重组微生物。进而，更优选含有甘油脱水酶再活性化因子是由从dha调节子中分离的orfX和orfZ编码的基因的重组微生物。进而，更优选地，重组微生物为缺失了甘油激酶活性和/或甘油脱氢酶活性和/或磷酸丙糖异构酶活性的重组微生物。

用本发明的化学品的制备方法制备1，3-丙二醇时，过滤、分离发酵液中所含的1，3-丙二醇的分离、纯化，可以通过浓缩、晶析进行。例如，可以合适地使用特开平-35785号公报中公开的采用减压浓缩、晶析的纯化法。

用本发明的化学品的制备方法制备尸胺时，作为可以在尸胺的生产中使用的微生物或者培养细胞，只要是可以生产尸胺的微生物即可，并没有限制。作为可以在尸胺的生产中使用的微生物或者培养细胞，例如优选微生物为赖氨酸脱羧酶和/或赖氨酸尸胺反向转运蛋白的酶活性增强的微生物。更优选地，微生物可以列举整合了编码赖氨酸脱羧酶和/或赖氨酸尸胺反向转运蛋白的基因的重组微生物。更优选地，重组微生物可以列举整合了1或2种以上的编码赖氨酸脱羧酶的基因的微生物。

用本发明的化学品的制备方法制备尸胺时，作为重组微生物，优选大肠杆菌和棒状杆菌型细菌，更优选为，具有赖氨酸脱羧酶活性且具有高丝氨酸营养要求性或S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸耐性中的至少任一种特征的棒状杆菌型细菌。更优选缺失高丝氨酸脱氢酶活性。更优选由于基因插入突变的发生而导致缺失高丝氨酸脱氢酶活性。本发明中，棒状杆菌型细菌的属优选为选自于棒杆菌属和短杆菌属中的至少一个属。更优选为谷氨酸棒杆菌(Corynebacuterium gulutamicum)。

用本发明的化学品的制备方法制备尸胺时，过滤、分离发酵液中所含的尸胺的分离、纯化，可以通过组合了浓缩、蒸馏和晶析等以往已知的方法进行。例如，可合适地使用特开2004-222569号公报中公开的采用晶析的纯化法。本发明中，可以通过连续培养时可使用的酸制成各种聚合物原料，在需要良好纯度的聚合物原料用途中，优选使用通过晶析进行的纯化方法。如果是用盐酸维持培养液的pH，则可以从其滤过液中通过晶析步骤回收尸胺二盐酸盐。更优选，可以列举在连续培养时用二羧酸维持培养液的pH，通过晶析步骤从其滤过液中回收尸胺二羧酸盐。更优选，该二羧酸是官能团只有2个羧基的脂肪族和/或芳香族的二羧酸。更优选，作为这种二羧酸，可以列举己二酸、癸二酸、1，12-十二烷二羧酸、琥珀酸、间苯二酸或对苯二酸中的任一。

用本发明的化学品的制备方法制备核酸时，作为可以在核酸的生产中使用的微生物或者培养细胞，只要是可以生产核酸的微生物即可，并没有限制。可以在核酸的生产中使用的微生物或者培养细胞，可以是从自然界分离的原来核酸的生产能力就高的微生物或者培养细胞，也可以是人为地提高了生产能力的原核微生物。具体地，可以是由于突变或基因重组而导致部分性质被改变的微生物或者培养细胞。

这其中，对于部分性质的改变进行说明。为了有效生产核酸，需要生物合成核酸并累积，释放到生物体外。因此，通过增强参与核酸的生物合成途径的酶、降低参与核酸的分解途径的酶活性，以及改变与核酸释放到生物体外相关的蛋白质、或者生物体膜组成等等、改变微生物或者培养细胞的性质，可有效制备生产核酸的微生物或者培养细胞。

具体而言，在部分性质中，于生产次黄苷的情形时，理想的是不具有腺苷酸琥珀酸合成酶活性或微弱。而且，理想的是不具有次黄苷酸脱氢酶活性或微弱。而且，理想的是不具有核苷酶活性，或微弱。在生产鸟苷时，理想的是不具有腺苷酸琥珀酸合成酶活性或微弱。而且，理想的是不具有鸟苷酸还原酶活性，或微弱。而且，理想的是不具有核苷酶活性，或微弱。而且，理想的是不具有核苷酸酶活性，或微弱。在生产尿苷时，理想的是不具有尿苷磷酸化酶活性，或微弱。在生产胞苷时，理想的是不具有胞苷脱氨酶活性，或微弱。理想的是不具有高丝氨酸脱氢酶活性，或微弱。

用本发明的化学品的制备方法制备核酸时，在其微生物或者培养细胞中，更优选可使用棒状杆菌型细菌和枯草杆菌。例如，在生产次黄苷时，作为棒状杆菌型细菌，可以列举属于棒杆菌属(Genus Corynebacterium)的细菌。棒杆菌属中，优选是用谷氨酸棒杆菌、产氨棒杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)、Corynebacterium guanofaciens、和Corynebacteriumpetrophilium。而且，作为枯草杆菌，可以列举属于芽孢杆菌属(GenusBacillus)的细菌。芽孢杆菌属中，可优选使用枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus liqueniformis)、和短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)。而且，在生产鸟苷时，作为棒状杆菌型细菌，可以列举属于棒杆菌属(Genus Corynebacterium)的细菌。棒杆菌属中，优选谷氨酸棒杆菌，作为枯草杆菌，可以列举例如，属于芽孢杆菌属(Genus Bacillus)的细菌。芽孢杆菌属中，可优选使用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus liqueniformis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。而且，在生产尿苷时，可使用枯草杆菌，枯草杆菌中，可优选使用属于芽孢杆菌属(Genus Bacillus)的细菌。芽孢杆菌属中，可优选使用枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。在生产胞苷时可使用枯草杆菌，枯草杆菌中，可优选使用属于芽孢杆菌属(Genus Bacillus)的细菌。芽孢杆菌属中，可优选使用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

用本发明的化学品的制备方法制备核酸时，过滤、分离发酵液中所含的核酸的分离、纯化，优选通过组合了离子交换树脂处理法、浓缩冷却晶析法、膜分离法和其它方法进行。为了除去杂质，可以使用常规方法的活性碳吸附法和重结晶法进行纯化。

用本发明的化学品的制备方法制备氨基酸时，作为可以在氨基酸的制备中使用的微生物或者培养细胞，只要是可以生产氨基酸的微生物即可，并没有限制。可以在氨基酸的制备中使用的微生物或者培养细胞，可以是从自然界中分离的原来氨基酸生产能力高的微生物或培养细胞，也可以是人为地提高了生产能力的微生物或者培养细胞。

用本发明的化学品的制备方法制备氨基酸时，氨基酸优选可以列举L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-色氨酸、L-异亮氨酸、L-谷氨酰胺、L-精氨酸、L-丙氨酸、L-组氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-天冬氨酸、L-酪氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、缬氨酸、亮氨酸。

接着，一边列举具体的氨基酸，一边对可以在氨基酸的生产中使用的微生物或者培养细胞进行说明。

用本发明的化学品的制备方法制备L-苏氨酸时，可以在L-苏氨酸的制备中使用的微生物或者培养细胞，可以使用属于埃希氏菌属(GenusEscherichia)、普罗威登斯菌属(Genus Providencia)、棒杆菌属(GenusCorynebacterium)、短杆菌属(Genus Brevibaeterium)或沙雷氏菌属(Genus Serratia)中任一属的细菌。这其中，特别优选的细菌是大肠杆菌(Escherichia coli)、雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)、乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、或粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)。

用本发明的化学品的制备方法制备L-赖氨酸时，可以在L-赖氨酸的制备中使用的微生物或者培养细胞，优选谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌或乳发酵短杆菌。

用本发明的化学品的制备方法制备L-谷氨酸时，可以在L-谷氨酸的制备中使用的微生物或者培养细胞，优选谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌或乳发酵短杆菌。

用本发明的化学品的制备方法制备L-色氨酸时，可以在L-色氨酸的制备中使用的微生物或者培养细胞，优选谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、乳发酵短杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)或大肠杆菌。

用本发明的化学品的制备方法制备L-异亮氨酸时，可以在L-异亮氨酸的制备中使用的微生物或者培养细胞，优选谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、乳发酵短杆菌或粘质沙雷氏菌。

用本发明的化学品的制备方法制备L-谷氨酰胺时，可以在L-谷氨酰胺的制备中使用的微生物或者培养细胞，优选谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、乳发酵短杆菌或里加黄杆菌(Flavobacterium rigense)。

用本发明的化学品的制备方法制备L-精氨酸时，可以在L-精氨酸的制备中使用的微生物或者培养细胞，优选谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、粘质沙雷氏菌、大肠杆菌或枯草芽孢杆菌。

用本发明的化学品的制备方法制备L-丙氨酸时，可以在L-丙氨酸的制备中使用的微生物或者培养细胞，优选黄色短杆菌或氧化节杆菌(Arthrobacter oxydans)。

用本发明的化学品的制备方法制备L-组氨酸时，可以在L-组氨酸的制备中使用的微生物或者培养细胞，优选谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)、粘质沙雷氏菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)。

用本发明的化学品的制备方法制备L-脯氨酸时，可以在L-脯氨酸的制备中使用的微生物或者培养细胞，优选谷氨酸棒杆菌、Kurthiacatenaforma、粘质沙雷氏菌或大肠杆菌。

用本发明的化学品的制备方法制备L-苯丙氨酸时，可以在L-苯丙氨酸的制备中使用的微生物或者培养细胞，优选谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、乳发酵短杆菌或大肠杆菌。

用本发明的化学品的制备方法制备L-天冬氨酸时，可以在L-天冬氨酸的制备中使用的微生物或者培养细胞，优选黄色短杆菌、巨大芽胞杆菌(Bacillus megatherium)、大肠杆菌或荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)。

用本发明的化学品的制备方法制备L-酪氨酸时，可以在L-酪氨酸的制备中使用的微生物或者培养细胞，优选谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、乳发酵短杆菌或大肠杆菌。

用本发明的化学品的制备方法制备甲硫氨酸时，可以在甲硫氨酸的生产中使用的微生物或者培养细胞，优选谷氨酸棒杆菌。

用本发明的化学品的制备方法制备丝氨酸时，可以在丝氨酸的制备中使用的微生物或者培养细胞，优选谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、乳发酵短杆菌或氧化节杆菌。

用本发明的化学品的制备方法制备缬氨酸时，可以在缬氨酸的制备中使用的微生物或者培养细胞，优选乳发酵短杆菌、粘质沙雷氏菌或肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)。

用本发明的化学品的制备方法制备亮氨酸时，可以在亮氨酸的制备中使用的微生物或者培养细胞，优选谷氨酸棒杆菌、乳发酵短杆菌或粘质沙雷氏菌。

用本发明的化学品的制备方法制备氨基酸时，可以在氨基酸的制备中使用的微生物或者培养细胞也可以是相对于例示的微生物或者培养细胞而言，人为地提高了生产能力的微生物或者培养细胞。可以在氨基酸的制备中使用的微生物或者培养细胞也可以是由于突变或基因重组而导致部分性质发生改变的微生物或培养细胞。作为部分性质发生改变的可以在氨基酸的制备中使用的微生物或者培养细胞的一例，有特开H2-219582中记载的L-苏氨酸生产性提高了的雷氏普罗威登斯菌，和特表平3-500486中记载的L-丙氨酸生产性提高了的谷氨酸棒杆菌等。

按照本发明的化学品的制备方法进行连续发酵时，与现有的分批发酵相比较，获得了高的体积生产速度，使得以极高效率进行发酵生产成为可能。这其中，连续培养中的生产速度用下式(3)计算。

【数3】

发酵生产速度(g/L/小时)＝取出液中的生产物浓度(g/L)×发酵液取出速度(L/小时)÷装置的运行液量(L)……(式3)

而且，分批培养中的发酵生产速度，通过将消耗掉所有原料碳源时的生产物量(g)除以碳源的消耗所需要的时间(小时)和该时间点的培养液量(L)求出。

接着，对于本发明的连续发酵装置进行说明。本发明的连续发酵装置，可在乙醇、1，3-丙二醇、1，4-丁二醇、甘油等醇、醋酸、乳酸、丙酮酸、琥珀酸、苹果酸、衣康酸、柠檬酸等有机酸、L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-色氨酸、L-异亮氨酸、L-谷氨酰胺、L-精氨酸、L-丙氨酸、L-组氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-天冬氨酸、L-酪氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、缬氨酸、亮氨酸等氨基酸、次黄苷、鸟苷等核酸、尸胺等二胺化合物、酶、抗生素、重组蛋白质的生产中使用。

本发明的连续发酵装置，是通过用分离膜过滤微生物或培养细胞的发酵培养液、从滤液中回收生产物，与此同时将未滤过液保持于或回流到前述的发酵培养液中、并在前述的发酵培养液中追加发酵原料的连续发酵进行的化学品的制备装置。

本发明的连续发酵装置具有用于使微生物或培养细胞发酵培养的发酵反应槽。

本发明的连续发酵装置的一个方案是，包含通过发酵培养液循环部件与发酵反应槽连接的、在内部设有分离膜用于过滤发酵培养的膜分离槽，和将分离膜的膜间差压控制在0.1至20kPa的范围内的部件，该分离膜为平均细孔径0.01μm以上至不到1μm的多孔性膜。

本发明的连续发酵装置的其它方案，包含配设于发酵反应槽内部的具备分离膜的用于过滤发酵培养液的分离膜元件和与该分离膜元件连接的用于排出滤过的发酵生产物的部件，和将该分离膜的膜间差压控制在0.1至20kPa的范围的部件，该分离膜为具有平均细孔径0.01μm以上至不到1μm的细孔的多孔性膜。

本发明的连续发酵装置优选为多孔性膜的纯水渗透系数在2×10^-9m³/m²/s/pa以上6×10^-7m³/m²/s/pa以下。

本发明的连续发酵装置，优选为多孔性膜的平均细孔径在0.01μm以上不到0.2μm，且多孔性膜的细孔径的标准偏差在0.1μm以下。

本发明的连续发酵装置优选为多孔性膜的膜表面粗糙度为0.1μm以下的多孔性膜。

本发明的连续发酵装置优选地为多孔性膜是含有多孔质树脂层的多孔性膜。本发明的连续发酵装置更优选地为多孔质树脂层是包含有机高分子的多孔质树脂层。本发明的连续发酵装置更优选地为，有机高分子膜的材质为聚偏1，1-二氟乙烯。

接着，对本发明的化学品的制备方法中可以使用的连续发酵装置，用图进行说明。

图1是用于说明本发明的化学品的制备方法中可以使用的膜分离型连续发酵装置的例子的概要侧面图。图1是分离膜元件设置于发酵反应槽的外部的代表例。

图1中，膜分离型连续发酵装置基本由发酵反应槽1和膜分离层12和水头差控制装置3构成。这其中，多孔性膜整合在分离膜元件2中。作为这种多孔性膜，合适地使用例如国际公开第2002/064240号小册子中公开的分离膜、和分离膜元件。而且，膜分离槽12通过发酵液循环泵11与发酵反应槽1连接。

图1中，用培养基供给泵7向发酵反应槽1中投入培养基，根据需要，用搅拌机5搅拌发酵反应槽1内的发酵液，而且根据需要，可以用气体供给装置4提供需要的气体。此时，可以回收再循环所提供的气体，之后再由气体供给装置4提供。而且根据需要，用pH传感器控制装置9和pH调整溶液供给泵8调整发酵液的pH，而且根据需要，通过用温度调节器10调节发酵液的温度，可以进行生产性高的发酵生产。进而，装置内的发酵液，通过发酵液循环泵11在发酵反应槽1和膜分离槽12之间循环。含有发酵生产物的发酵液，通过分离膜元件2过滤分离成微生物和发酵生产物，可以从装置系统中取出。而且，过滤分离的微生物，由于停留于装置系统内，可以维持微生物在装置系统内的高浓度，使高生产性的发酵生产成为可能。这其中，通过分离膜元件2进行的过滤分离是通过与膜分离槽12的水面的水头差压进行的，因此不需要特别的动力。根据需要，通过水平传感器6和水头差压控制装置3可以适当调节分离膜元件2的过滤、分离速度和装置系统内的发酵液量。根据需要，通过气体供给装置4可以给膜分离槽12内提供所需气体。此时，可以回收再循环所提供的气体，之后再由气体供给装置4提供。通过分离膜元件2进行的过滤、分离还可以根据需要，通过用泵等进行的吸引过滤或者在装置系统内加压进行过滤、分离。而且，培养槽中连续发酵时培养微生物或培养细胞，根据需要，可以提供给发酵槽内。培养槽中连续发酵时培养微生物或培养细胞，根据需要通过提供给发酵槽内，通常可以使通过新鲜的化学品生产能力高的微生物或培养细胞进行的连续发酵成为可能，可以进行长时间维持高生产性能的连续发酵。

接下来，图2是用于说明可以在本发明中使用的其它膜分离型连续发酵装置的例子的概要侧面图。本发明的化学品的制备方法中可以使用的连续发酵装置中，分离膜元件设置于发酵反应槽的内部的代表例示于图2的概要图中。

图2中膜分离型连续发酵装置，基本由发酵反应槽1和水头差控制装置3构成。多孔性膜整合在发酵反应槽1内的分离膜元件2。作为这种多孔性膜，可以使用例如国际公开第2002/064240号小册子中公开的分离膜和分离膜元件。对于分离膜元件，另外再进行详述。

接下来，对于图2的通过膜分离型连续发酵装置进行的连续发酵的方案进行说明。

用培养基供给泵7，给发酵反应槽1连续或间歇地投入培养基。培养基在投入前可以根据需要进行加热杀菌、加热灭菌或者使用过滤器的灭菌处理。发酵生产时，根据需要，用发酵反应槽1内的搅拌机5搅拌发酵反应槽1内的发酵液。发酵生产时，根据需要，用气体供给装置4，可以向发酵反应槽1内提供所需要的气体。发酵生产时，根据需要，可以用pH传感器控制装置9和pH调整溶液供给泵8调整发酵反应槽1内的发酵液的pH，根据需要，通过用温度调节器10调节发酵反应槽1内的发酵液的温度，可以进行生产性高的发酵生产。这其中，通过仪器检测和控制装置进行的发酵液的物理化学条件的调节中，例示了pH和温度，但根据需要，可以通过溶解氧或ORP的控制，用在线化学传感器等分析装置测定发酵液中的化学品的浓度，进行以发酵液中的化学品的浓度作为指标的对物理化学条件的控制。而且，培养基的连续的或间歇的投入，优选，用上述仪器检测装置，以发酵液的物理化学环境的测定值作为指标，适当调节培养基投入量和速度。

图2中，发酵液被设置于发酵反应槽1内的分离膜元件2过滤、分离成微生物和发酵生产物，发酵生产物从装置系统中被取出。而且，由于过滤、分离的微生物停留于装置系统内，从而可以维持装置系统内的微生物的高浓度，使得生产性高的发酵生产成为可能。其中，通过分离膜元件2进行的过滤、分离是通过与发酵反应槽1的水面的水头差压进行的，因此不需要特别的动力。而且，根据需要，通过水平传感器6和水头差压控制装置3可以适当调节分离膜元件2的过滤、分离速度和发酵反应槽1内的发酵液量。在用上述分离膜元件进行的过滤、分离中，根据需要，通过用泵等进行的吸引过滤或者在装置系统内加压进行过滤、分离。而且，培养槽中连续发酵时培养微生物或培养细胞，根据需要，可以提供给发酵槽内。培养槽中连续发酵时培养微生物或培养细胞，根据需要通过提供给发酵槽内，通常可以使通过新鲜的化学品生产能力高的微生物或培养细胞进行的连续发酵成为可能，可以进行长时间维持高生产性能的连续发酵。

对于本发明的化学品的制备方法中可以使用的连续发酵装置中优选使用的分离膜元件进行说明。

对于图3中所示的分离膜元件进行说明。本发明的化学品的制备方法中使用的连续发酵装置中，优选可以使用国际公开第2002/064240号小册子中公开的分离膜和分离膜元件。分离膜元件为在具有刚性的支持板13的两面上，将流路部件14和前述的分离膜15按如图3中所示的这样的顺序配置构成。支持板13在两面具有凹部16。分离膜15过滤发酵液。流路部件14是用于使经分离膜15过滤的透过水有效流向支持板13的部件。流向支持板13的透过水通过支持板13的凹部16，通过集水管17被取出到发酵培养槽外部。作为用于取出透过水的动力，可使用通过水头差压、泵、液体或气体等进行的吸引过滤、或者在装置系统内加压等方法。

接下来，对于图4中所示的分离膜元件进行说明。分离膜元件，如图4中所示，主要由由中空纤维膜构成的分离膜束18和上部树脂密封层19、下部树脂密封层20构成。分离膜束被上部树脂密封层19、和下部树脂密封层20粘着固定成束状。通过下部树脂密封层的粘着固定化密封中空纤维膜的中空部，形成防止发酵培养液漏出的结构。另一方面，上部树脂密封层19不密封中空纤维膜的内孔，形成透过水流向集水管22的结构。该分离膜元件可通过支持框21设置于连续发酵装置内。经分离膜束18过滤的透过水通过中空纤维膜的中空部，通过集水管22被取出到发酵培养槽外部。作为用于取出透过水的动力，可以使用通过水头差压、泵、液体或气体等进行的吸引过滤、或者在装置系统内加压等方法。

构成本发明的化学品的制备方法中可以使用的连续发酵装置的分离膜元件的构件优选为对高压蒸气灭菌操作有耐性的构件。若发酵装置内可以灭菌，则可以回避连续发酵时不想要的微生物所导致的污染的危险，使更稳定的连续发酵成为可能。构成分离膜元件的构件优选对高压蒸气灭菌操作的条件，即121℃15分钟有耐性。分离膜元件构件可以优选地选择例如不锈钢、铝等金属、聚酰胺系树脂、氟系树脂、聚碳酸酯系树脂、聚缩醛系树脂、聚对苯二甲酸丁二醇酯系树脂、PVDF、改性聚亚苯基醚系树脂、聚砜系树脂等树脂。

本发明的化学品的制备方法中使用的连续发酵装置中，分离膜元件可设置于发酵槽外，也可设置于发酵槽内。设置于发酵槽外时，可以设置另一膜分离槽，在其内部设置分离膜元件，可以一面使发酵液在发酵槽和膜分离槽之间循环，一面通过分离膜元件连续过滤发酵液。

本发明的化学品的制备方法中使用的连续发酵装置中，理想的是膜分离槽可以高压蒸气灭菌。膜分离槽若可以高压蒸气灭菌，则容易回避由于杂菌而导致的污染。

实施例

以下，为了对本发明进行更为详细的说明，选定L-乳酸、D-乳酸、乙醇、丙酮酸、琥珀酸、1，3-丙二醇、衣康酸、尸胺、核酸、和氨基酸作为上述化学品，通过具有生产各个化学品能力的微生物或者培养细胞进行的用图1和图2的概要图中所示的装置的连续发酵的具体实施方案，列举实施例进行说明。

参考例1  具有L-乳酸生产能力的酵母株的制备

按如下方式制备具有L-乳酸生产能力的酵母株。通过将人来源LDH基因连接到酵母基因组上的PDC1启动子的下游，制备出具有L-乳酸生产能力的酵母株。聚合酶链反应(PCR)中，使用La-Taq(宝酒造)、或者KOD-Plus-聚合酶(东洋纺)，按照附带的操作说明进行。

培养回收人乳腺癌细胞系(MCF-7)后，用TRIZOL试剂(Invitrogen)提取总RNA，通过以获得的总RNA作为模板，使用SuperScript ChoiceSystem(Invitrogen)的逆转录反应进行cDNA的合成。这些操作的详细内容按照各自附带的操作规程进行。接下来以获得的cDNA作为PCR的扩增模板。

以通过上述操作获得的cDNA作为扩增模板，以序列编号1和序列编号2表示的寡核苷酸作为引物组，通过KOD-Plus-聚合酶进行PCR，实施L-ldh基因的克隆。纯化各PCR扩增片段，用T4多核苷酸激酶(TAKARA社制)使末端磷酸化后，连接入pUC118载体(用限制性酶HincII切割，对切割面进行脱磷酸化处理而获得)中。用DNA Ligation Kit Ver.2(TAKARA社制)进行连接。用连接质粒产物转化大肠杆菌DH5α，通过回收质粒DNA，获得亚克隆了各种L-ldh基因(序列编号3)的质粒。用限制性酶XhoI和NotI消化获得的插入了L-ldh基因的pUC118质粒，将获得的各DNA片段插入到酵母表达用载体pTRS11(图5)的XhoI/NotI切割部位处。这样一来就获得了人来源L-ldh基因表达质粒pL-ldh5(L-ldh基因)。并且，人来源的L-ldh基因表达载体，即上述pL-ldh5，以质粒单独地以保藏号FERM AP-20421保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(茨城县筑波市东1-1-1中央第6)(保藏日：2005年2月21日)。

以含有人来源LDH基因的质粒pL-ldh5作为扩增模板，通过以序列编号4和序列编号5表示的寡核苷酸作为引物组的PCR扩增出1.3kb的含有人来源LDH基因和酿酒酵母来源的TDH3基因的终止子序列的DNA片段。而且，以质粒pRS424作为扩增模板，通过以序列编号6和序列编号7表示的寡核苷酸作为引物组的PCR扩增出1.2kb的含有酿酒酵母来源的TRP1基因的DNA片段。通过1.5％琼脂糖凝胶电泳分离各个DNA片段，按照常规方法纯化。其中，对于以获得的1.3kb片段和1.2kb片段的混合物作为扩增模板，通过以序列编号4和序列编号7表示的寡核苷酸作为引物组的PCR法所获得的产物，进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，按照常规方法制备了连接人来源LDH基因和TRP1基因的2.5kb的DNA片段。用该2.5kb的DNA片段按照常规方法色氨酸非需求性地转化出芽酵母NBRC10505株。

如下述方式对获得的转化细胞为人来源LDH基因连接于酵母基因组上的PDC1启动子下游的细胞进行确认。首先，按照常规方法制备转化细胞的基因组DNA，通过以其作为扩增模板，以序列编号8和序列编号9表示的寡核苷酸作为引物组的PCR，获得了0.7kb的扩增DNA片段，从而进行确认。而且，转化细胞是否具有乳酸生产能力，通过在下述所示的条件下用HPLC法测定乳酸量确认用SC培养基(METHODS IN YEASTGENETICS 2000版，CSHL PRESS)培养转化细胞的培养上清中含有乳酸。

柱：Shim-Pack SPR-H(岛津社制)

流动相：5mM对甲苯磺酸(流速0.8mL/分钟)

反应液：5mM对甲苯磺酸、20mM Bis-Tris、0.1mM EDTA二钠(流速0.8mL/分钟)

检测方法：导电率

温度：45℃。

而且，L-乳酸的光学纯度测定在以下条件下用HPLC法进行。

柱：TSK-gel Enantio L1(东曹公司制)

流动相：1mM硫酸铜水溶液

流速：1.0ml/分钟

检测方法：UV254nm

温度：30℃。

而且，L-乳酸的光学纯度用下式计算。

光学纯度(％)＝100×(L-D)/(L+D)

其中，L表示L-乳酸的浓度，D表示D-乳酸的浓度。

HPLC分析的结果是，检测到4g/L的L-乳酸，D-乳酸在检测限界以下。通过以上研究，确认了该转化体具有L-乳酸生产能力。将获得的转化细胞称作酵母SW-1株，继续在实施例中使用。

参考例2  多孔性膜的制作(其中一种)

分别使用聚偏1，1-二氟乙烯(PVDF)树脂作为树脂，并使用N，N-二甲基乙酰胺作为溶剂，90℃的温度下将它们充分搅拌，获得了具有以下组成的原液。

聚偏1，1-二氟乙烯：13.0重量％

N，N-二甲基乙酰胺：87.0重量％

接着，将上述原液冷却到25℃的温度后，涂布在预先通过贴附置于玻璃板上的密度为0.48g/cm³、厚度为220μm的聚酯纤维制无纺布上，立即浸渍于具有以下组成的25℃温度的凝固浴中5分钟，获得形成了多孔质树脂层的多孔质基材。

水：30.0重量％

N，N-二甲基乙酰胺：70.0重量％。

将该多孔质基材从玻璃板剥离后，浸渍于80℃温度的热水中3次，洗出N，N-二甲基乙酰胺，获得了分离膜。

以倍率10,000倍进行对多孔质树脂层表面的9.2μm×10.4μm的范围内的扫描电子显微镜观察。可观察到的所有细孔的直径的平均值为0.1μm。

接着，对于上述分离膜，评价纯水渗透系数。系数为50×10^-9m³/m²·s·Pa。纯水渗透系数的测定是通过反渗透膜，使用25℃的纯化水在头高度为1m进行的。

而且，平均细孔径的标准偏差为0.035μm，膜表面粗糙度为0.06μm。这样制备的多孔性膜可合适地用于本发明中。

参考例3  多孔性膜的制作(其中之2)

分别使用聚偏1，1-二氟乙烯(PVDF)树脂作为树脂，分子量为约20,000的聚乙二醇(PEG)作为开孔剂，N，N-二甲基乙酰胺作为溶剂，纯水作为非溶剂，90℃的温度下将它们充分搅拌，获得了具有以下组成的原液。

聚偏1，1-二氟乙烯：13.0重量％

聚乙二醇：5.5重量％

N，N-二甲基乙酰胺：78.0重量％

纯水：3.5重量％。

接着，将上述原液冷却到25℃后，涂布在密度为0.48g/cm³、厚度为220μm的聚酯纤维制无纺布上，涂布后，立即浸渍于25℃的纯水中5分钟，再浸渍于80℃的热水中3次，洗出N，N-二甲基乙酰胺和聚乙二醇，获得了分离膜。

在这种分离膜的涂布了原液的一侧，以倍率10,000倍进行对多孔质树脂层表面的9.2μm×10.4μm的范围内的扫描电子显微镜观察。可观察到的所有细孔的直径的平均值为0.02μm。

对于上述分离膜，评价纯水渗透系数。纯水渗透系数为2×10^-9m³/m²·s·Pa。纯水渗透系数的测定是通过反渗透膜，使用25℃的纯化水在头高度为1m进行的。

平均细孔径的标准偏差为0.0055μm，膜表面粗糙度为0.1μm。这样制备的多孔性膜可合适地用于本发明中。

参考例4  多孔性膜的制作(其中之3)

除了使用以下所示的组成的原液之外，其余与参考例3同样，获得了分离膜。

聚偏1，1-二氟乙烯：13.0重量％

聚乙二醇：5.5重量％

N，N-二甲基乙酰胺：81.5重量％。

在这种分离膜的涂布了原液的一侧、以倍率10,000倍进行对多孔质树脂层表面的9.2μm×10.4μm的范围内的扫描电子显微镜观察。可观察到的所有细孔的直径的平均值为0.19μm。

对于上述分离膜，评价纯水渗透系数，其结果为100×10^-9m³/m²·s·Pa。纯水渗透系数的测定是通过反渗透膜，使用25℃的纯化水在头高度为1m进行的。

而且，平均细孔径的标准偏差为0.060μm、膜表面粗糙度为0.08μm。这样制备的多孔性膜可合适地用于本发明中。

参考例5  多孔性膜的制作(其中之4)

分别使用聚偏1，1-二氟乙烯(PVDF)树脂作为树脂，并使用N，N-二甲基乙酰胺作为溶剂，90℃的温度下将它们充分搅拌，获得了具有以下组成的原液。

聚偏1，1-二氟乙烯：15.0重量％

N，N-二甲基乙酰胺：85.0重量％

接着，将上述原液冷却到25℃的温度后，涂布在预先通过贴附置于玻璃板上的密度为0.48g/cm³、厚度为220μm的聚酯纤维制无纺布上，立即浸渍于具有以下组成的25℃温度的凝固浴中5分钟，获得形成了多孔质树脂层的多孔质基材。

水：100.0重量％

将该多孔质基材从玻璃板剥离后，浸渍于80℃温度的热水中3次，洗出N，N-二甲基乙酰胺，获得了分离膜。以倍率10,000倍进行对多孔质树脂层表面的9.2μm×10.4μm的范围内的扫描电子显微镜观察，其结果是可观察到的所有细孔的直径的平均值为0.008μm。接着，对上述分离膜进行纯水透水量的评价，其结果是0.3×10^-9m³/m²·s·Pa。透水量的测定是通过反渗透膜，使用25℃的纯化水在头高度为1m进行的。而且，平均细孔径的标准偏差为0.002μm、膜表面粗糙度为0.06μm。

实施例1  使用酵母通过连续发酵制备L-乳酸(其中之1)

使用图1的连续发酵装置和表1中所示的组成的酵母乳酸发酵培养基，进行L-乳酸的制备。培养基用高压蒸气灭菌(121℃、15分钟)后再使用。作为分离膜元件构件，使用不锈钢和聚砜树脂的成型品。作为分离膜，使用参考例2中制备的多孔性膜。实施例1中的运转条件，只要没有特别预先通知，则为以下条件。

反应槽容量：2(L)

膜分离槽容量：0.5(L)

使用分离膜：聚偏1，1-二氟乙烯过滤膜

膜分离元件有效过滤面积：60cm²

温度调整：30(℃)

反应槽通气量：0.05(L/分钟)

膜分离槽通气量：0.3(L/分钟)

反应槽搅拌速度：100(转/分钟)

pH调整：用1N NaOH调整到pH5

乳酸发酵培养基供给速度：在50～300ml/小时的范围的可变控制

根据发酵液循环装置的循环液量：0.1(L/分钟)

膜渗透水量控制：通过膜间差压进行流量控制

(连续发酵开始后～100小时：控制在0.1kPa以上5kPa以下

100小时～200小时：控制在0.1kPa以上2kPa以下

200小时～300小时：控制在0.1kPa以上20kPa以下)。

作为微生物，使用参考例1中制备的酵母SW-1株，使用表1中所示的组成的乳酸发酵培养基作为培养基，生产物即乳酸的浓度的评价中，使用参考例1中所示的HPLC，葡萄糖浓度的测定中使用Glucose-Test WakoC(和光纯药)。

【表1】

酵母乳酸发酵培养基

单位(/升)

首先，在试管中用5ml的乳酸发酵培养基振荡培养SW-1株过夜(预先培养)。将获得的培养液接种于100ml新鲜的乳酸发酵培养基中，在容量为500ml的坂口摇瓶中于30℃振荡培养24小时(预先培养)。将预先培养液接种于图1中所示的连续发酵装置中的1.5L乳酸发酵培养基中，用附带的搅拌机5搅拌反应槽1，进行反应槽1的通气量的调整、温度调整、pH调整，不使发酵液循环泵10运作地进行24小时培养(前培养)。前培养结束后，立即使发酵液循环泵10运作，除了前培养时的运转条件之外，给膜分离槽2通气，进行乳酸发酵培养基的连续供给，一边进行膜渗透水量的控制使得膜分离型连续发酵装置的发酵液量达到2L，一边进行连续培养，通过连续发酵进行L-乳酸的制备。进行连续发酵试验时的膜渗透水量的控制，通过用水头差控制装置3测定水头差作为膜间差压，在上述膜渗透水量控制条件下使之变化来进行。适当地测定膜透过发酵液中生产的L-乳酸浓度和残存葡萄糖浓度。

进行300小时的连续发酵试验的结果示于表2。通过使用图1中所示的连续发酵装置的本发明的化学品的制备方法，可以通过连续发酵稳定地制备L-乳酸。连续发酵所有期间中的膜间差压以2kPa以下进行变化。

实施例2  通过使用酵母的连续发酵制备L-乳酸(其中之2)

使用参考例3制备的多孔性膜作为分离膜，进行与实施例1同样的L-乳酸连续发酵试验。其结果示于表2。其结果是，可以通过连续发酵稳定地制备L-乳酸。连续发酵所有期间中的膜间差压以2kPa以下进行变化。

实施例3  通过使用酵母的连续发酵制备L-乳酸(其中之3)

使用参考例4制备的多孔性膜作为分离膜，进行与实施例1同样的L-乳酸连续发酵试验。其结果示于表2。其结果是，可以通过连续发酵稳定地制备L-乳酸。连续发酵期间的膜间差压以2kPa以下进行变化。

实施例4通过使用酵母的连续发酵制备L-乳酸(其中之4)

使用图2中所示的连续发酵装置和表1中所示的组成的乳酸发酵培养基，进行L-乳酸的制备。培养基在高压蒸气灭菌(121℃、15分钟)后再使用。作为分离膜元件构件，使用不锈钢和聚砜树脂的成型品。使用参考例1制备的多孔性膜作为分离膜。本实施例中的运转条件，只要没有特别预先通知，则为如下条件。

反应槽容量：2(L)

使用分离膜：聚偏1，1-二氟乙烯过滤膜

膜分离元件有效过滤面积：120cm²

温度调整：30(℃)

发酵反应槽通气量：0.05(L/分钟)

乳酸发酵培养基供给速度：50～300ml/小时的范围内可变控制

发酵反应槽搅拌速度：800(转/分钟)

pH调整：用1N NaOH调整到pH5

膜渗透水量控制：通过膜间差压进行流量控制

(连续发酵开始后～80小时：控制在0.1kPa以上5kPa以下

80小时～160小时：控制在0.1kPa以上2kPa以下

160小时～240小时：控制在0.1kPa以上20kPa以下)

灭菌：含有分离膜元件的培养槽和使用培养基均用121℃、20分钟的高压灭菌釜进行高压蒸气灭菌。

使用参考例1制成的酵母SW-1株作为微生物、使用表1中所示的组成的乳酸发酵培养基作为培养基，在生成物即L-乳酸的浓度的评价中，使用参考例1中所示的HPLC，在葡萄糖浓度的测定中，使用Glucose-TestWako C(和光纯药)。

首先，在试管中用5ml的乳酸发酵培养基振荡培养SW-1株过夜(预先培养)。将获得的培养液接种于100ml新鲜的乳酸发酵培养基中，于容量为500ml的坂口摇瓶中30℃振荡培养24小时(预先培养)。将预先培养液接种于图2中所示的膜分离型连续发酵装置的1.5L乳酸发酵培养基中，用附带的搅拌机5以400转/分钟搅拌反应槽1、进行反应槽1的通气量的调整、温度调整、pH调整，进行24小时培养(前培养)。前培养完了后立即进行乳酸发酵培养基的连续供给，一边进行膜渗透水量的控制使得膜分离型连续发酵装置的发酵液量达到1.5L，一边进行连续培养，通过连续发酵进行L-乳酸的制备。进行连续发酵试验时的膜渗透水量的控制，通过用水头差控制装置3测定水头差作为膜间差压，在上述膜渗透水量控制条件下使之变化来进行。适当地，测定膜透过发酵液中生产的L-乳酸浓度和残存葡萄糖浓度。而且，根据由该L-乳酸和葡萄糖浓度计算出的投入葡萄糖而计算出的L-乳酸对糖收率、L-乳酸生产速度示于表2。

进行了240小时的发酵试验，其结果是，通过使用图2中所示的连续发酵装置的本发明的化学品的制备方法，可以通过连续发酵稳定地制备L-乳酸。连续发酵期间的膜间差压以2kPa以下进行变化。

实施例5  通过使用酵母的连续发酵制备L-乳酸(其中之5)

使用参考例3制备的多孔性膜作为分离膜、进行与实施例4同样的L-乳酸连续发酵试验。其结果示于表2。其结果是，可以通过连续发酵稳定地制备L-乳酸。连续发酵所有期间中的膜间差压以2kPa以下进行变化。

实施例6  通过使用酵母的连续发酵制备L-乳酸(其中之6)

使用参考例4制备的多孔性膜作为分离膜、进行与实施例5同样的L-乳酸连续发酵试验。其结果示于表2。其结果是，可以通过连续发酵稳定地制备L-乳酸。连续发酵所有期间中的膜间差压以2kPa以下进行变化。

比较例1  通过分批发酵制备L-乳酸

作为采用微生物的发酵方案，进行最典型的分批发酵、评价其L-乳酸的生产性。使用表1中所示的乳酸发酵培养基、进行只采用图1的膜分离型连续发酵装置的反应槽1的分批发酵试验。该培养基在高压蒸气灭菌(121℃、15分钟)后再使用。本比较例中，使用参考例1制成的酵母SW-1株作为微生物，在生成物即L-乳酸的浓度的评价中，使用参考例1中所示的HPLC进行评价，在葡萄糖浓度的测定中，使用Glucose-Test Wako C(和光纯药)。比较例2的运转条件如下所示。

反应槽容量(乳酸发酵培养基量)：1(L)

温度调整：30(℃)

反应槽通气量：0.05(L/分钟)

反应槽搅拌速度：100(转/分钟)

pH调整：用1N NaOH调整到pH5。

首先，在试管中用5ml的乳酸发酵培养基振荡培养SW-1株过夜(预先培养)。将预先培养液接种于100ml新鲜的乳酸发酵培养基中，在容量为500ml的坂口摇瓶中振荡培养24小时(前培养)。将前培养液接种于膜分离型连续发酵装置的1.5L乳酸发酵培养基中，用附带的搅拌机5以100转/分钟搅拌反应槽1，给反应槽1通气。进行温度调整、pH调整，不使发酵液循环泵10运作地进行分批发酵培养。此时的菌体增殖量在600nm处的吸光度为14。分批发酵的结果示于表2。

【表2】

	比较例1	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4	实施例5	实施例6
								发酵时间(小时)	72	300	300	300	300	300	300
总的投入葡萄糖(g)	100	2620	2720	2750	2120	2070	2110
								总的生产L-乳酸(g)	26	1580	1525	1540	1350	1305	1350
未利用的葡萄糖(g)	0	60	75	90	40	30	35

L-乳酸对糖收率(g/g)	0.26	0.62	0.58	0.58	0.65	0.64	0.65
								L-乳酸生产速度(g/L/小时)	0.36	2.6	2.5	2.5	3.0	2.9	3.0

通过使用图1和图2中所示的发酵装置的本发明的化学品的制备方法，L-乳酸的生产速度大幅上升。

比较例2  通过使用酵母的连续发酵制备L-乳酸

作为分离膜，采用参考例5制备的细孔径小且纯水渗透系数小的多孔性膜，膜渗透水量控制方法，通过膜间差压进行流量控制(连续发酵全期间控制在0.1kPa以上20kPa以下)，除此之外，与实施例1同样进行。

其结果是，培养开始后96小时时，由于膜间差压超过20kPa发生了膜的堵塞，因此停止了连续发酵。因此，清楚了参考例5制备的多孔性膜不适于L-乳酸的制备。

比较例3  通过使用酵母的连续发酵制备L-乳酸

作为分离膜，采用参考例5制备的细孔径小且纯水渗透系数小的多孔性膜，膜渗透水量控制方法，通过膜间差压进行流量控制(连续发酵全期间控制在0.1kPa以上20kPa以下)，除此之外，与实施例4同样进行。

其结果是，培养开始后80小时时，由于膜间差压超过20kPa发生了膜的堵塞，因此停止了连续发酵。因此，清楚了参考例5制备的多孔性膜不适于L-乳酸的制备。

实施例7  通过连续发酵制备乙醇(其中之1)

使用图1的连续发酵装置和表3中所示的组成的乙醇发酵培养基进行乙醇的制备。该培养基在高压蒸气灭菌(121℃、15分钟)后再使用。作为分离膜，使用参考例2中制备的多孔性膜。本实施例1中的运转条件，只要没有特别预先通知，则为以下条件。

反应槽容量：2(L)

膜分离槽容量：0.5(L)

使用分离膜：聚偏1，1-二氟乙烯过滤膜

膜分离元件有效过滤面积：120cm²

温度调整：30(℃)

反应槽通气量：0.05(L/分钟)

膜分离槽通气量：0.3(L/分钟)

反应槽搅拌速度：100(转/分钟)

pH调整：用1N NaOH调整到pH5

乙醇发酵培养基供给速度：在50～300ml/小时的范围内可变控制

取决于发酵液循环装置的循环液量：0.1(L/分钟)

膜渗透水量控制：通过膜间差压进行流量控制

(连续发酵开始后～100小时：控制在0.1kPa以上5kPa以下

100小时～200小时：控制在0.1kPa以上2kPa 以下

200小时～300小时：控制在0.1kPa以上20kPa以下)。

作为微生物，使用NBRC10505株，使用表1中所示的组成的乙醇发酵培养基作为培养基，生产物即乙醇的浓度的评价中，通过气相色谱法定量乙醇浓度。使用Shimadzu GC-2010毛细管GC TC-1(GL science)15m L.*0.53mm I.D.，df1.5μm，通过氢火焰离子化检测器检测并计算，再评价。而且，在葡萄糖浓度的测定中，使用Glucose-Test Wako C(和光纯药)。

【表3】乙醇发酵培养基

                                                  

葡萄糖                                100g

酵母氮源一无氨基酸(Difco公司)         6.7g

去除亮氨酸的19种标准氨基酸            78mg

亮氨酸                                380mg

肌醇                                  76mg

对氨基苯甲酸                          8mg

腺嘌呤                                40mg

尿嘧啶                                76mg

                                                   

                                      单位(/升)

首先，在试管中用5ml的乙醇发酵培养基振荡培养NBRC10505株过夜(预先培养)。将获得的培养液接种于100ml新鲜的乙醇发酵培养基中，在容量为500ml的坂口摇瓶中于30℃振荡培养24小时(预先培养)。将预先培养液接种于图1中所示的膜分离型连续发酵装置的1.5L乙醇发酵培养基中，用附带的搅拌机5以100转/分钟搅拌反应槽1、进行反应槽1的通气量的调整、温度调整、pH调整、不使发酵液循环泵10运作地进行24小时培养(前培养)。前培养结束后，立即使发酵液循环泵10运作，除了前培养时的运转条件之外，给膜分离槽2通气，进行乙醇发酵培养基的连续供给，一边进行膜渗透水量的控制使得膜分离型连续发酵装置的发酵液量达到2L，一边进行连续培养，通过连续发酵进行乙醇的制备。进行连续发酵试验时的膜渗透水量的控制，通过用水头差控制装置3测定水头差作为膜间差压，在上述膜渗透水量控制条件下使之变化来进行。适当地，测定膜透过发酵液中生产的乙醇浓度和残存葡萄糖浓度，其结果示于表4。

通过使用图1中所示的连续发酵装置的本发明的化学品的制备方法，可以通过连续发酵稳定地制备乙醇。连续发酵期间的膜间差压以2kPa以下进行变化。

实施例8  通过连续发酵进行的乙醇的制备(其中之2)

使用图2的连续发酵装置和表3中所示的组成的乙醇发酵培养基，进行乙醇的制备。该培养基在高压蒸气灭菌(121℃、15分钟)后再使用。作为分离膜元件构件，使用不锈钢和聚砜树脂的成型品。作为分离膜，使用参考例2中制备的多孔性膜。本实施例中的运转条件，只要没有特别预先通知，则为以下条件。

反应槽容量：2(L)

使用分离膜：聚偏1，1-二氟乙烯过滤膜

膜分离元件有效过滤面积：120cm²

温度调整：30(℃)

发酵反应槽通气量：0.05(L/分钟)

乳酸发酵培养基供给速度：在50～300ml/小时的范围内可变控制

发酵反应槽搅拌速度：800(转/分钟)

pH调整：用1N NaOH调整到pH5

膜渗透水量控制：通过膜间差压进行流量控制

(连续发酵开始后～80小时：控制在0.1kPa以上5kPa以下

80小时～160小时：控制在0.1kPa以上2kPa以下

160小时～240小时：控制在0.1kPa以上20kPa以下)。

灭菌：含有分离膜元件的培养槽和使用培养基均用121℃、20分钟的高压灭菌釜进行高压蒸气灭菌

作为微生物，使用NBRC10505株，作为培养基，使用表2中所示的组成的乙醇发酵培养基，生产物即乙醇的浓度的评价中，使用实施例7中所示的气相色谱，在葡萄糖浓度的测定中，使用Glucose-Test Wako C(和光纯药)。

首先，在试管中用5ml的乙醇发酵培养基振荡培养NBRC10505株过夜(预先培养)。将获得的培养液接种于100ml新鲜的乙醇发酵培养基中，在容量为500ml的坂口摇瓶中于30℃振荡培养24小时(预先培养)。将预先培养液接种于图2中所示的膜分离型连续发酵装置的1.5L乳酸发酵培养基中，用附带的搅拌机5以400转/分钟搅拌反应槽1、进行反应槽1的通气量的调整、温度调整、pH调整、进行24小时培养(前培养)。前培养结束后，立即进行乙醇发酵培养基的连续供给，一边进行膜渗透水量的控制使得膜分离型连续发酵装置的发酵液量达到1.5L，一边进行连续培养，通过连续发酵进行乙醇的制备。进行连续发酵试验时的膜渗透水量的控制，通过用水头差控制装置3测定水头差作为膜间差压，在上述膜渗透水量控制条件下使之变化来进行。适当地，测定膜透过发酵液中生产的乙醇浓度和残存葡萄糖浓度。而且，根据由该乙醇和葡萄糖浓度计算出的投入葡萄糖而计算出的乙醇对糖收率、乙醇生产速度示于表4。

通过使用图2中所示的连续发酵装置的本发明的化学品的制备方法，可以通过连续发酵稳定地制备乙醇。连续发酵所有期间中的膜间差压以2kPa以下进行变化。

比较例4  通过分批发酵进行乙醇的制备

作为采用微生物的发酵方案，进行最典型的分批发酵，评价乙醇生产性。使用表3中所示的乙醇发酵培养基，进行只采用图1的膜分离型连续发酵装置的反应槽1的分批发酵试验。该培养基在高压蒸气灭菌(121℃、15分钟)后再使用。本比较例中，作为微生物，使用NBRC10505株，生产物即乙醇的浓度的评价中，使用实施例6中所示的气相色谱法进行评价，在葡萄糖浓度的测定中，使用Glucose-Test Wako C(和光纯药)。本比较例的运转条件如下所示。

反应槽容量(乙醇发酵培养基量)：1(L)

温度调整：30(℃)

反应槽通气量：0.05(L/分钟)

反应槽搅拌速度：100(转/分钟)

pH调整：用1N NaOH调整到pH5。

首先，在试管中用5ml的乙醇发酵培养基振荡培养NBRC10505株过夜(预先培养)。将预先培养液接种于100ml新鲜的乙醇发酵培养基中，在容量为500ml的坂口摇瓶中振荡培养24小时(前培养)。将前培养液接种于膜分离型连续发酵装置的1.5L乙醇发酵培养基中，用附带的搅拌机5以100转/分钟搅拌反应槽1，给反应槽1通气。进行温度调整、pH调整，不使发酵液循环泵10运作地进行分批发酵培养。此时的菌体增殖量在600nm处的吸光度为18。分批发酵的结果示于表4。

【表4】

	比较例4	实施例7	实施例8
				发酵时间(小时)	28	300	300
总的投入葡萄糖(g)	100	6320	4750
				总的生产乙醇(g)	47	2900	2120
未利用的葡萄糖(g)	0	50	35
				乙醇对糖收率(g/g)	0.47	0.46	0.45
乙醇生产速度(g/L/小时)	1.7	4.8	4.7

通过使用图1和图2中所示的发酵装置的本发明的化学品的制备方法，乙醇的生产速度大幅上升。

实施例9  通过连续发酵进行丙酮酸的制备(其中之1)

使用图1的连续发酵装置和表5中所示的组成的丙酮酸发酵培养基，进行丙酮酸的制备。该培养基在高压蒸气灭菌(121℃、15分钟)后再使用。作为分离膜，使用参考例2中制备的多孔性膜。本实施例中的运转条件，只要没有特别预先通知，则为以下条件。

发酵反应槽容量：2(L)

使用分离膜：聚偏1，1-二氟乙烯过滤膜

膜分离元件有效过滤面积：120cm²

温度调整：30(℃)

发酵反应槽通气量：1.5(L/分钟)

发酵反应槽搅拌速度：800(转/分钟)

pH调整：用4N NaOH调整到pH5.5

灭菌：含有分离膜元件的培养槽和使用培养基均用121℃、20分钟的高压灭菌釜进行高压蒸气灭菌。

膜渗透水量控制：通过膜间差压进行流量控制

(连续发酵开始后～100小时：控制在0.1kPa以上5kPa以下

100小时～180小时：控制在0.1kPa以上2kPa以下

180小时～264小时：控制在0.1kPa以上20kPa以下)。

作为微生物，使用光滑球拟酵母P120-5a株(FERM P-16745)，、作为培养基，使用表5中所示的组成的丙酮酸发酵培养基，在生产物即丙酮酸的浓度的评价中，在下述所示条件下用HPLC测定。

柱：Shim-Pack SPR-H(岛津社制)

流动相：5mM对甲苯磺酸(流速0.8mL/分钟)

反应液：5mM对甲苯磺酸、20mM Bis-Tris、0.1mM EDTA二钠(流速0.8mL/分钟)

检测方法：导电率

温度：45℃。

而且，在葡萄糖浓度的测定中，使用Glucose-Test Wako C(和光纯药)。

【表5】

丙酮酸发酵培养基

                                              

葡萄糖                       100g/L

硫酸铵                       5g/L

磷酸二氢钾                   1g/L

七水合硫酸镁                 0.5g/L

大豆加水分解物               2g/L

烟酸                         8mg/L

吡哆素盐酸盐                 1mg/L

生物素                       0.05mg/L

硫胺素盐酸盐                 0.05mg/L

                             pH 5.5

                                              

                             单位(/升)

首先，在试管中用5ml的丙酮酸发酵培养基振荡培养P120-5a株过夜(预先培养)。将预先培养液接种于100ml新鲜的丙酮酸发酵培养基中在容量为500ml的坂口摇瓶中，于30℃振荡培养24小时(预先培养)。将预先培养液接种于图1中所示的膜分离型连续发酵装置的1.5L丙酮酸发酵培养基，用附带的搅拌机5以800转/分钟搅拌发酵反应槽1、进行发酵反应槽1的通气量的调整、温度调整、pH调整、进行24小时培养(前培养)。前培养结束后，立即使发酵液循环泵运作，除了前培养时的运转条件之外，再给膜分离槽2通气，进行丙酮酸发酵培养基的连续供给，一边进行膜渗透水量的控制使得膜分离型连续发酵装置的发酵液量达到2L，一边进行连续培养，通过连续发酵进行丙酮酸的制备。通过用水头差控制装置3测定水头差作为膜间差压，在上述膜渗透水量控制条件下使之变化来进行连续发酵试验时的膜渗透水量的控制。适当地，测定膜透过发酵液中生产的丙酮酸浓度和残存葡萄糖浓度。进行300小时的发酵试验，其结果示于表6中。

通过使用图1中所示的连续发酵装置的本发明的化学品的制备方法，可以通过连续发酵稳定地制备丙酮酸。连续发酵期间的膜间差压以2kPa以下进行变化。

实施例10  通过连续发酵进行丙酮酸的制备(其中之2)

使用图2的连续发酵装置和表5中所示的组成的丙酮酸发酵培养基，进行丙酮酸的制备。该培养基在高压蒸气灭菌(121℃、15分钟)后再使用。作为分离膜元件构件，使用不锈钢和聚砜树脂的成型品。作为分离膜，使用参考例2中制备的多孔性膜。本实施例中的运转条件，只要没有特别预先通知，则为以下条件。

反应槽容量：2(L)

使用分离膜：聚偏1，1-二氟乙烯过滤膜

膜分离元件有效过滤面积：120cm²

温度调整：30(℃)

发酵反应槽通气量：1(L/分钟)

乳酸发酵培养基供给速度：在50～300ml/小时的范围内可变控制

发酵反应槽搅拌速度：800(转/分钟)

pH调整：用4N NaOH调整到pH5.5

膜渗透水量控制：通过膜间差压进行流量控制。

(连续发酵开始后～100小时：控制在0.1kPa以上5kPa以下

100小时～180小时：控制在0.1kPa以上2kPa以下

180小时～264小时：控制在0.1kPa以上20kPa以下)

灭菌：含有分离膜元件的培养槽和使用培养基均用121℃、20分钟的高压灭菌釜进行高压蒸气灭菌。

作为微生物，使用光滑球拟酵母P120-5a株(FERM P-16745)，作为培养基，使用表5中所示的组成的丙酮酸发酵培养基，生产物即丙酮酸的浓度的评价中，在下述所示条件下用HPLC测定。

首先，在试管中用5ml的丙酮酸发酵培养基振荡培养P120-5a株过夜(预先培养)。将得到的预先培养液接种于100ml新鲜的丙酮酸发酵培养基中，在容量为500ml的坂口摇瓶中于30℃振荡培养24小时(预先培养)。将预先培养液接种于图2中所示的膜分离型连续发酵装置的1.5L乳酸发酵培养基中，用附带的搅拌机5以800转/分钟搅拌反应槽1进行反应槽1的通气量的调整、温度调整、pH调整、进行24小时培养(前培养)。前培养结束后，立即进行丙酮酸发酵培养基的连续供给，一边进行膜渗透水量的控制使得膜分离型连续发酵装置的发酵液量达到1.5L，一边进行连续培养，通过连续发酵进行丙酮酸的制备。通过用水头差控制装置3测定水头差作为膜间差压，在上述膜渗透水量控制条件下使之变化来进行连续发酵试验时的膜渗透水量的控制。适当地，测定膜透过发酵液中生产的丙酮酸浓度和残存葡萄糖浓度。而且，根据由该丙酮酸和葡萄糖浓度计算出的投入葡萄糖而算出的乳酸对糖收率、乳酸生产速度示于表6。

进行300小时的发酵试验，其结果是通过使用图2中所示的连续发酵装置的本发明的化学品的制备方法，可以通过连续发酵稳定地制备丙酮酸。连续发酵所有期间中的膜间差压以2kPa以下进行变化。

实施例11  通过连续发酵进行丙酮酸的制备(其中之3)

使用图1的连续发酵装置，作为微生物，使用NBRC0005株，其它条件均与实施例9同样进行。进行连续发酵的结果示于图6。进行了300小时的发酵试验，其结果是通过使用图1中所示的连续发酵装置的本发明的化学品的制备方法，可以通过连续发酵稳定地制备丙酮酸。连续发酵所有期间中的膜间差压以2kPa以下进行变化。

实施例12  通过连续发酵进行丙酮酸的制备(其中之4)

使用图2的连续发酵装置，使用NBRC0005株作为微生物，其它条件均与实施例10同样进行。进行连续发酵的结果示于图6。进行了300小时的发酵试验，其结果是通过使用图2中所示的连续发酵装置的本发明的化学品的制备方法，可以通过连续发酵稳定地制备丙酮酸。连续发酵所有期间中的膜间差压以2kPa以下进行变化。

比较例5  通过分批发酵进行丙酮酸的制备(其中之1)

作为使用微生物的发酵方案，使用容量为2L的小型发酵罐进行最典型的分批发酵，评价丙酮酸生产性。使用表5中所示的培养基作为培养基，高压蒸气灭菌处理(121℃、15分钟)后再使用。本比较例中，作为微生物，使用P120-5a株，在生产物即丙酮酸的浓度的评价中，使用实施例9中所示的HPLC进行评价，在葡萄糖浓度的测定中，使用Glucose-Test WakoC(和光纯药)。本比较例的运转条件如下所示。

发酵反应槽容量(丙酮酸发酵培养基量)：1(L)

温度调整：30(℃)

发酵反应槽通气量：1(L/分钟)

发酵反应槽搅拌速度：600(转/分钟)

pH调整：用4N NaOH调整到pH5.5。

首先，在试管中用5ml的丙酮酸发酵培养基振荡培养P120-5a株过夜(预先培养)。将预先培养液接种于50ml新鲜的丙酮酸发酵培养基中，在容量为500ml的坂口摇瓶中振荡培养24小时(前培养)。将前培养液接种于小型发酵罐的1L丙酮酸发酵培养基中，进行分批发酵。分批发酵的结果示于表6。

比较例6  通过分批发酵进行丙酮酸的制备(其中之2)

作为使用微生物的发酵方案，使用容量为2L的小型发酵罐进行最典型的分批发酵，评价丙酮酸生产性。本比较例中，作为微生物，使用NBRC0005株，其它条件均与比较例3同样进行。分批发酵的结果示于图6。

【表6】

	比较例3	实施例9	实施例10	比较例4	实施例11	实施例12
							发酵时间(小时)	72	264	264	45	264	264
总的投入葡萄糖(g)	100	3410	2806	100	3440	2660
							总的生产丙酮酸钠(g)	70	1790	1237	58	1580	1110
未利用的葡萄糖(g)	0	320	419	0		190
							丙酮酸钠对糖收率(g/g)	0.70	0.58	0.52	0.58	0.49	0.45
丙酮酸钠生产速度(g/L/小时)	1.0	3.4	3.1	1.28	3.0	2.8

通过使用图1和图2中所示的发酵装置的本发明的化学品的制备方法，丙酮酸的生产速度大幅上升。

实施例13  通过连续发酵进行琥珀酸的连续制备(其中之1)

使用图1中所示的连续发酵这种进行琥珀酸的制备。

琥珀酸的制备中琥珀酸和葡萄糖，只要没有特别预先通知，用以下方法测定。对于培养液的离心上清，用HPLC(岛津LC10A、RI监控器：RID-10A、柱：Aminex HPX-87H)分析琥珀酸。柱温度为50℃，用0.01NH₂SO₄平衡柱后，注入样品，用0.01N H₂SO₄洗脱后进行分析。用葡萄糖传感器(BF-4、王子测量机)测定葡萄糖。

使用的培养基在高压蒸气灭菌(121℃、15分钟)后再使用。作为分离膜，使用参考例2中制备的多孔性膜。本实施例中的运转条件，只要没有特别预先通知，则为以下条件。

反应槽容量：2(L)

膜分离槽容量：0.5(L)

使用分离膜：聚偏1，1-二氟乙烯过滤膜

膜分离元件有效过滤面积：60cm²

温度调整：39(℃)

反应槽CO₂通气量：10(mL/分钟)

膜分离槽CO₂通气量：100(mL/分钟)

反应槽搅拌速度：100(转/分钟)

pH调整：用2M Na₂CO₃调整成pH6.4

乳酸发酵培养基供给速度：在50～300ml/小时的范围内可变控制

取决于发酵液循环装置的循环液量：0.1(L/分钟)

膜渗透水量控制：通过膜间差压进行流量控制。

(连续发酵开始后～100小时：控制在0.1kPa以上5kPa以下

100小时～200小时：控制在0.1kPa以上2kPa以下

200小时～264小时：控制在0.1kPa以上20kPa以下)。

通过产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillumsucciniciproducens)ATCC53488株作为本实施例中具有琥珀酸生产能力的微生物进行琥珀酸的连续制备。在容量为125mL的三角摇瓶中装入100mL包含20g/L葡萄糖、10g/L聚胨、5g/L酵母提取物、3g/L K₂HPO₄、1g/LNaCl、1g/L(NH₄)₂SO₄、0.2g/L MgCl₂、0.2g/L CaCl₂·2H₂O的种培养用培养基，再加热灭菌。在厌气无氧隔离罩(glovebox)内，加入1mL的30mM Na₂CO₃和0.15mL的180mM H₂SO₄，再加入0.5mL由0.25g/L半胱氨酸·HCl、0.25g/L Na₂S构成的还原溶液后，接种ATCC53488株，于39℃静置培养一晚(预先培养)。在图1中所示的连续发酵装置的1.5L琥珀酸发酵培养基(表7)中加入5mL的由0.25g/L半胱氨酸·HCl、0.25g/LNa₂S·9H₂O构成的还原溶液后，接种50mL预先培养液，用附带的搅拌机5以200转/分钟搅拌发酵反应槽1，进行发酵反应槽1的CO₂通气量的调整、温度调整、pH调整，进行24小时培养(前培养)。

【表7】

琥珀酸发酵培养基

前培养结束后，立即进行琥珀酸发酵培养基的连续供给，一边进行膜渗透水量的控制使得膜分离型连续发酵装置的发酵液量达到2L，一边进行连续培养，通过连续发酵进行琥珀酸的制备。进行连续发酵试验时的膜渗透水量的控制，通过用水头差控制装置3使发酵反应槽水头差在最大2m以内适当变化，即膜间差压为0.1至20kPa以内进行。适当地，测定膜透过发酵液中所生产的琥珀酸浓度和残存葡萄糖浓度。而且，由该琥珀酸和葡萄糖浓度计算出的琥珀酸生成速度和琥珀酸的生产收率示于表8。所有的连续发酵所有期间中的膜间差压以2kPa以下进行变化。

实施例14  通过连续发酵进行琥珀酸的连续制备(其中之2)

使用图2中所示的连续发酵装置进行琥珀酸的制备。使用的培养基在高压蒸气灭菌(121℃、15分钟)后再使用。琥珀酸和葡萄糖浓度的测定用与实施例13同样的方法进行。作为分离膜，使用参考例2中制备的多孔性膜。本实施例中的运转条件，只要没有特别预先通知，则为以下条件。

反应槽容量：2(L)

使用分离膜：聚偏1，1-二氟乙烯过滤膜

膜分离元件有效过滤面积：120cm²

温度调整：39(℃)

发酵反应槽CO₂通气量：10(mL/分钟)

乳酸发酵培养基供给速度：在50～300ml/小时的范围内可变控制

发酵反应槽搅拌速度：600(转/分钟)

pH调整：用2M Na₂CO₃调整成pH6.4

膜渗透水量控制：通过膜间差压进行流量控制。

(连续发酵开始后～80小时：控制在0.1kPa以上5kPa以下

80小时～160小时：控制在0.1kPa以上2kPa以下

160小时～280小时：控制在0.1kPa以上20kPa以下)

灭菌：含有分离膜元件的培养槽和使用培养基均用121℃、20分钟的高压灭菌釜进行高压蒸气灭菌。

通过产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillumsucciniciproducens)ATCC53488株作为本实施例中具有琥珀酸生产能力的微生物进行琥珀酸的连续制备。在容量为125mL的三角摇瓶中装入100mL包含20g/L葡萄糖、10g/L聚胨、5g/L酵母提取物、3g/L K₂HPO₄、1g/LNaCl、1g/L(NH₄)₂SO₄、0.2g/L MgCl₂、0.2g/L CaCl₂·2H₂O的种培养用培养基，再加热灭菌。在厌气无氧隔离罩内，加入1mL的30mM Na₂CO₃和0.15mL的180mM H₂SO₄，再加入0.5mL由0.25g/L半胱氨酸·HCl、0.25g/L Na₂S构成的还原溶液后，接种ATCC53488株，于39℃静置培养一晚(预先培养)。在图2中所示的连续发酵装置的1.5L琥珀酸发酵培养基(表7)中加入5mL的包含0.25g/L半胱氨酸·HCl、0.25g/L Na₂S·9H₂O的还原溶液后，接种50mL预先培养液，用附带的搅拌机5以600转/分钟搅拌发酵反应槽1、进行发酵反应槽1的CO₂通气量的调整、温度调整、pH调整，进行24小时培养(前培养)。

前培养结束后，立即进行琥珀酸发酵培养基的连续供给，一边进行膜渗透水量的控制使得膜分离型连续发酵装置的发酵液量达到1.5L，一边进行连续培养，通过连续发酵进行琥珀酸的制备。进行连续发酵试验时的膜渗透水量的控制，通过用水头差控制装置3使发酵反应槽水头差在最大2m以内适当变化，即膜间差压为0.1至20kPa以内进行。适当地，测定膜透过发酵液中所生产的琥珀酸浓度和残存葡萄糖浓度。而且，由该琥珀酸和葡萄糖浓度计算出的琥珀酸生产速度和琥珀酸的生成收率示于表8。所有的连续发酵所有期间中的膜间差压以2kPa以下进行变化。

比较例7  通过分批培养进行琥珀酸的制备

通过产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)的分批发酵进行的琥珀酸制备按如下方式进行。

在容量为125mL的三角摇瓶中装入100mL包含20g/L葡萄糖、10g/L聚胨、5g/L酵母提取物、3g/L K₂HPO₄、1g/L NaCl、1g/L(NH₄)₂SO₄、0.2g/LMgCl₂、0.2g/L CaCl₂·2H₂O的种培养用培养基，再加热灭菌。在厌气无氧隔离罩内，加入1mL的30mM Na₂CO₃和0.15mL的180mMH₂SO₄，再加入0.5mL由0.25g/L半胱氨酸·HCl、0.25g/L Na₂S构成的还原溶液后，接种产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillumsucciniciproducens)ATCC53488，于39℃静置培养一晚。微小型发酵罐(ABLE社制、BMJ型、2L)中添加1L表7中所示的发酵培养基，加热灭菌(120℃、20分钟)。

用喷雾器以10mL/分钟通气CO₂气体，加入10mL 3M Na₂CO₃溶液后、用硫酸溶液将pH调整到6.8。加入5mL的由0.25g/L半胱氨酸·HCl、0.25g/L Na₂S·9H₂O构成的还原溶液后，接种50mL上述种培养液，搅拌速度200转/分钟、温度为39℃，一边用2M Na₂CO₃溶液调整至pH6.4，一边进行培养。其结果示于表8。

【表8】

	比较例7	实施例13	实施例14
				发酵时间(小时)	39	264	280
投入葡萄糖(g)	49	1090	1689
				生成琥珀酸(g)	38	871	1394
未利用的葡萄糖(g)	1	15	29
				收率(g/g)	0.775	0.81	0.84
生产速度(g/L/小时)	0.97	2.2	3.3

通过使用图1和图2中所示的发酵装置的本发明的化学品的制备方法，琥珀酸的生产速度大幅上升。

实施例15  通过连续发酵进行琥珀酸的连续制备(其中之3)

使用图1中所示的连续发酵装置进行琥珀酸的制备。琥珀酸和葡萄糖浓度的测定用与实施例13同样的方法进行。使用的培养基在高压蒸气灭菌(121℃、15分钟)后再使用。作为分离膜，使用参考例2中制备的多孔性膜。本实施例中的运转条件除下述膜渗透水量控制以外，与实施例13同样。

膜渗透水量控制：通过膜间差压进行流量控制。

(连续发酵开始后～100小时：控制在0.1kPa以上5kPa以下

100小时～200小时：控制在0.1kPa以上2kPa以下

200小时～254小时：控制在0.1kPa以上20kPa以下)。

进行使用琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)ATCC55618株作为本实施例中具有琥珀酸生产能力的微生物的琥珀酸的连续制备。在容量为100mL的橡胶试管中加入75mL表9中所示的放线杆菌用琥珀酸发酵培养基和4.0g MgCO₃，用CO₂气体置换后，加热灭菌。预先，接种7.5mLATCC55618株的菌体悬浮液，于37℃培养24小时，制备种培养(预先培养)。

【表9】

琥珀酸发酵培养基

在图1中所示的连续发酵装置中装入1.5L的琥珀酸发酵培养基(表9)，接种75mL预先培养液。发酵反应槽1的CO₂通气量为75mL/分钟，分离膜槽CO₂通气量为150mL/分钟，温度为39℃，一边用5.5M NaCO₃将pH调整成6.8一边进行连续培养之外，进行与实施例13的培养相同的连续培养。适当测定膜透过发酵液中所生产的琥珀酸浓度和残存葡萄糖浓度，根据该琥珀酸和葡萄糖浓度计算出的琥珀酸生产速度和琥珀酸的生成收率示于表10中。所有的连续发酵所有期间中的膜间差压以2kPa以下进行变化。

实施例16  通过连续发酵进行琥珀酸的连续制备(其中之4)

使用图2中所示的连续发酵装置进行琥珀酸的制备。使用的培养基在高压蒸气灭菌(121℃、15分钟)后再使用。琥珀酸和葡萄糖浓度的测定按与实施例13同样的方法进行。作为分离膜，使用参考例2中制备的多孔性膜。本实施例中的运转条件，除下述膜渗透水量控制以外，与实施例14相同。

膜渗透水量控制：通过膜间差压进行流量控制。

(连续发酵开始后～100小时：控制在0.1kPa以上5kPa以下

100小时～200小时：控制在0.1kPa以上2kPa以下

200小时～280小时：控制在0.1kPa以上20kPa以下)。

使用琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)ATCC55618株作为本实施例中具有琥珀酸生产能力的微生物进行琥珀酸的连续制备。在通过琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)进行的琥珀酸的连续制备中，发酵反应槽CO₂通气量为75mL/分钟，用5.5M Na₂CO₃将pH调整成pH6.8之外，与实施例14的连续培养同样进行。

首先，在容量为100mL的橡胶试管中加入75mL表9中所示的放线杆菌用琥珀酸发酵培养基和4.0g MgCO₃，用CO₂气体置换后，加热灭菌。预先，接种7.5mL一直被冷冻保存的ATCC55618株的菌体悬浮液，于37℃培养24小时，制备种培养(预先培养)。在图2中所示的连续发酵装置中装入1.5L的琥珀酸发酵培养基(表7)，接种75mL预先培养液，一边将pH调整成6.8，一边进行24小时培养(前培养)。前培养终止后，进行表9的琥珀酸发酵培养基的连续供给，一边进行膜渗透水量的控制使得图2的膜分离型连续发酵装置的发酵液量达到1.5L，一边进行连续培养，通过连续发酵进行琥珀酸的制备。适当地测定膜透过发酵液中所生产的琥珀酸浓度和残存葡萄糖浓度。而且，由该琥珀酸和葡萄糖浓度计算出的琥珀酸生产速度和琥珀酸的生成收率示于表10。所有的连续发酵所有期间中的膜间差压以2kPa以下进行变化。

比较例8  通过分批培养进行琥珀酸的制备(其中之2)

通过使用琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)的分批发酵的琥珀酸制备如下述方式进行。

在容量为100mL的橡胶试管中加入50mL表9中所示的放线杆菌用琥珀酸发酵培养基和4.0g MgCO₃，用CO₂气体置换后，加热灭菌。预先，接种5mL一直被冷冻保存的琥珀酸放线杆菌(Actinobacillussuccinofenes)ATCC55618的菌体悬浮液，于37℃培养24小时，制备种培养。将表9中所示的发酵培养基1L调整至pH6.8后，添加到微小型发酵罐(ABLE社制、BMJ型、2L)中，加热灭菌(120℃、20分钟)。用喷雾器50mL/分钟通气CO₂气体，温度调整成39℃。接种50mL上述种培养，一边使用附带的搅拌叶片以600转/分钟搅拌，一边用5.5M NaCO₃将pH调整至6.8边进行培养。其结果示于表10。

【表10】

	比较例8	实施例15	实施例16
				发酵时间(小时)	49	254	280
投入葡萄糖(g)	100	1637	2182
				生成琥珀酸(g)	72	1193	1520
未利用的葡萄糖(g)	4	25	11
				收率(g/g)	0.75	0.74	0.70
生产速度(g/L/小时)	1.12	3.13	3.62

通过使用图1和图2中所示的发酵装置的本发明的化学品的制备方法，琥珀酸的生产速度大幅上升。

实施例17  通过连续发酵进行琥珀酸的连续制备(其中之5)

使用图1中所示的连续发酵装置进行琥珀酸的制备。琥珀酸和葡萄糖浓度的测定按与实施例13同样的方法进行。使用的培养基在高压蒸气灭菌(121℃、15分钟)后再使用。作为分离膜，使用参考例2中制备的多孔性膜。本实施例中的运转条件，除下述膜渗透水量控制以外，与实施例13相同。

膜渗透水量控制：通过膜间差压进行流量控制。

(连续发酵开始后～80小时：控制在0.1kPa以上5kPa以下

80小时～140小时：控制在0.1kPa以上2kPa以下

140小时～200小时：控制在0.1kPa以上20kPa以下)。

使用大肠杆菌B株(Escherichia coli B)ATCC11303株作为本实施例中具有琥珀酸生产能力的微生物，进行琥珀酸的连续制备。在用大肠杆菌进行的琥珀酸制备中，在容量为200mL的三角摇瓶中装入150mL包含12g/L葡萄糖、10g/L聚胨、5g/L酵母提取物、1g/L K₂HPO₄、1g/L NaCl、0.2g/LMgCl₂的种培养用培养基，将pH调整至6.8。添加7.5g MgCO₃后，加热灭菌，冷却至室温后，在厌气无氧隔离罩内，接种ATCC11303株，于37℃静置培养过夜(预先培养)。在图1中所示的连续发酵装置中装入1.5L包含12g/L葡萄糖、10g/L聚胨、5g/L酵母提取物、1g/L K₂HPO₄、1g/LNaCl、0.2g/L MgCl₂的琥珀酸发酵培养基，接种150mL预先培养液。除了培养温度为37℃之外，在与实施例13同样的条件下进行琥珀酸的连续发酵。

24小时培养的前培养后，进行表11中所示的琥珀酸发酵培养基的连续供给，一边控制膜渗透水量以使连续发酵装置的发酵液量达到2L，一边进行连续培养。

【表11】

琥珀酸发酵培养基

                                     

葡萄糖                50g/L

聚胨                  10g/L

酵母提取物            5g/L

磷酸氢二钾            1g/L

氯化钠                1g/L

氯化镁                0.2g/L

                                      

适当地测定膜透过发酵液中所生产的琥珀酸浓度和残存葡萄糖浓度。由该琥珀酸和葡萄糖浓度计算出的琥珀酸生产速度和琥珀酸的生成收率示于表12中。所有的连续发酵所有期间中的膜间差压以2kPa以下进行变化。

实施例18  通过连续发酵进行琥珀酸的连续制备(其中之6)

使用图2中所示的连续发酵装置进行琥珀酸的制备。使用的培养基在高压蒸气灭菌(121℃、15分钟)后再使用。琥珀酸和葡萄糖浓度的测定按与实施例13同样的方法进行。作为分离膜，使用参考例2中制备的多孔性膜。本实施例中的运转条件，除下述膜渗透水量控制以外，与实施例14相同。

膜渗透水量控制：通过膜间差压进行流量控制

(连续发酵开始后～80小时：控制在0.1kPa以上5kPa以下

80小时～120小时：控制在0.1kPa以上2kPa以下

120小时～180小时：控制在0.1kPa以上20kPa以下)。

使用大肠杆菌B株(Escherichia coli B)ATCC11303株作为本实施例中具有琥珀酸生产能力的微生物，进行琥珀酸的连续制备。在容量为200mL的三角摇瓶中装入150mL包含12g/L葡萄糖、10g/L聚胨、5g/L酵母提取物、1g/L K₂HPO₄、1g/L NaCl、0.2g/L MgCl₂的种培养用培养基，将pH调整至6.8。添加7.5g MgCO₃后，加热灭菌，冷却至室温后，接种ATCC11303株，于37℃静置培养过夜(预先培养)。在图2中所示的连续发酵装置中装入1.5L包含12g/L葡萄糖、10g/L聚胨、5g/L酵母提取物、1g/L K₂HPO₄、1g/L NaCl、0.2g/L MgCl₂构成的琥珀酸发酵培养基，接种150mL预先培养液。温度为37℃，一边用5.5M NaCO₃将pH调整成6.8一边进行24小时培养(前培养)。前培养终止后，进行表11中所示的琥珀酸发酵培养基的连续供给，一边进行膜渗透水量的控制使得连续发酵装置的发酵液量达到1.5L，一边进行连续培养。由该琥珀酸和葡萄糖浓度计算出的琥珀酸生产速度和琥珀酸的生成收率示于表12中。所有的连续发酵所有期间中的膜间差压以2kPa以下进行变化。

比较例9  通过分批培养进行琥珀酸的制备(其中之3)

通过使用大肠杆菌(Escherichia coli)的分批发酵进行的琥珀酸制备按如下方式进行。

在容量为1250mL的三角摇瓶中装入100mL包含12g/L葡萄糖、10g/L聚胨、5g/L酵母提取物、1g/L K₂HPO₄、1g/L NaCl、0.2g/L MgCl₂的种培养用培养基，将pH调整至6.8。添加5g MgCO₃后，加热灭菌，冷却至室温后，在厌气无氧隔离罩内接种大肠杆菌B株(Escherichia coli B)ATCC11303株，于37℃静置培养过夜。将1L包含12g/L葡萄糖、10g/L聚胨、5g/L酵母提取物、1g/L K₂HPO₄、1g/L NaCl、0.2g/L MgCl₂的发酵培养基调整至pH6.8后，加入到微小型发酵罐(ABLE社制、BMJ型、2L)中，加热灭菌(120℃、20分钟)。用喷雾器50mL/分钟通气CO₂气体，将温度调整成37℃。接种100mL上述种培养，用附带的搅拌叶片以600转/分钟搅拌，一边用5.5M NaCO₃将pH调整至6.8边进行培养。向培养液中一边一点点少量追加200mL 100g/L葡萄糖溶液以使培养液中的葡萄糖浓度不超过20g/L，一边进行培养。其结果示于表12中。

【表12】

	比较例9	实施例17	实施例18
				发酵时间(小时)	36	200	180
投入葡萄糖(g)	32	732	850
				生成琥珀酸(g)	3	72	81
未利用的葡萄糖(g)	0	12	40
				收率(g/g)	0.1	0.1	0.1
生产速度(g/L/小时)	0.09	0.24	0.30

通过使用图1和图2中所示的发酵装置的本发明的化学品的制备方法，琥珀酸的生产速度大幅上升。

实施例19  通过连续发酵进行1，3-丙二醇的制备(其中之1)

使用图1的连续发酵装置和表13中所示的组成的1，3-丙二醇生产培养基，进行1，3-丙二醇的制备。

首先，对生产物即1，3-丙二醇的分离、鉴定和测定法进行说明。

通过HPLC确认甘油向1，3-丙二醇的转换。分析用标准的方法和色谱法技术领域中熟练人员可以利用的材料进行。其中1种应用的方法是使用采用了UV(210nm)和RI检测的Waters Maxima 820HPLC系统。配备了Shodex SH-1011P预柱(6mm×50mm)，在温度控制在50℃的Shodex SH-1011柱(8mm×300mm、从Waters，Milford，MA购入)上，使用0.01NH₂SO₄作为流动相，以0.5mL/分钟的流量注入样品。进行定量分析时，使用已知量的三甲基醋酸作为外部标准来调制样品。葡萄糖(RI检测)、甘油、1，3-丙二醇(RI检测)和三甲基醋酸(UV和RI检测)的保留时间分别大概为15分钟、20分钟、26分钟和35分钟。

用GC/MS确认1，3-丙二醇的生产。分析用标准的方法和GC/MS的技术领域中熟练人员可以利用的材料进行。例如，使用连接于HewlettPackard 5971 Series质量选择的检测器(EI)和HP-INNOWax柱(长度30m、内径0.25mm、膜厚度0.25微米)的Hewlett Packard 5890Series II气相色谱。生成的1，3-丙二醇的保留时间和质谱与基准的1，3-丙二醇(m/e：57，58)的保留时间和质谱进行比较。

并且，进行样品的衍生化。1.0mL的样品(例如培养上清液)中加入30μL的浓(70％v/v)高氯酸。混合后，将样品冷冻干燥。向冷冻干燥的材料中添加二(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺∶吡啶的1∶1混合物(300μL)，强烈混合，于65℃放置1小时。通过离心除去不溶性材料使样品透明。将得到的液体分为2相，将其上相用于分析。将样品上样于DB-5柱(48m、内径0.25mm、膜厚度0.25μm；J&W Scientific制)，通过色谱法，将从培养上清液获得的1，3-丙二醇衍生物的保留时间和质谱与基准的标准样品获得的保留时间和质谱进行比较。TMS衍生的1，3-丙二醇的质谱含有205、177、130和115AMU的特征离子。

该培养基经高压蒸气灭菌(121℃、15分钟)后再使用。作为分离膜元件构件，使用不锈钢和聚砜树脂的成型品。作为分离膜，使用参考例2中制备的多孔性膜。本实施例中的运转条件，只要没有特别预先通知，则为以下条件。

发酵反应槽容量：2(L)

使用分离膜：聚偏1，1-二氟乙烯过滤膜

膜分离元件有效过滤面积：120cm²

温度调整：37(℃)

发酵反应槽通气量：0.6(L/分钟)氮气

发酵反应槽搅拌速度：800(转/分钟)

pH调整：用5N NaOH调整至pH7.0

灭菌：含有分离膜元件的培养槽和使用培养基均用121℃、20分钟的高压灭菌釜进行高压蒸气灭菌

膜渗透水量控制：通过膜间差压进行流量控制

(连续发酵开始后～100小时：控制在0.1kPa以上5kPa以下

100小时～200小时：控制在0.1kPa以上2kPa以下

200小时320小时：控制在0.1kPa以上20kPa以下)。

作为微生物，使用肺炎克雷伯氏菌ATCC 25955株，作为培养基，使用表13中所示的组成的1，3-丙二醇生产培养基，生产物即1，3-丙二醇的浓度的评价通过上述HPLC法进行测定。

而且，在葡萄糖浓度的测定中，使用Glucose-Test Wako C(和光纯药)。

【表13】

1，3-丙二醇发酵培养基

                                           

葡萄糖                  10g/L

甘油                    40g/L

硫酸铵                  5.35g/L

氯化钾                  0.75g/L

磷酸二氢钠              1.38g/L

七水合硫酸镁            0.26g/L

硫酸钠                  0.28g/L

柠檬酸                  0.42g/L

酵母提取物              1g/L

二水合氯化钙            0.29mg/L

六水合氯化铁            0.025g/L

六水合氯化锰            0.01g/L

氯化锌                  0.003g/L

六水合氯化钴            0.002g/L

六水合氯化铜            0.85mg/L

                        pH 7.0

                                       

首先，在试管中用5ml的1，3-丙二醇生产培养基振荡培养肺炎克雷伯氏菌ATCC 25955株过夜(预先培养)。将获得的培养液接种于50ml新鲜的1，3-丙二醇生产培养基中，在容量为500ml的坂口摇瓶中于30℃振荡培养24小时(预先培养)。将预先培养液接种于图1中所示的膜分离型连续发酵装置的1.5L 1，3-丙二醇生产培养基中，用附带的搅拌机5以800转/分钟搅拌发酵反应槽1，进行发酵反应槽1的通气量的调整、温度调整、pH调整，进行24小时培养(前培养)。前培养结束后，立即使发酵液循环泵运作，除了前培养时的运转条件之外，还对膜分离槽2通气，进行1，3-丙二醇生产培养基(甘油浓度为100g/L)的连续供给，一边进行膜渗透水量的控制使得连续发酵装置的发酵液量达到1.5L，一边进行连续培养，通过连续发酵进行1，3-丙二醇的制备。进行连续发酵试验时的膜渗透水量的控制，通过用水头差控制装置3测定水头差作为膜间差压，在上述膜渗透水量控制条件下使之变化来进行。适当地测定膜透过发酵液中所生产的1，3-丙二醇浓度和残存葡萄糖浓度。而且，根据该1，3-丙二醇和投入甘油计算出的1，3-丙二醇生产速度示于表14中。

进行了320小时的发酵试验，其结果是，通过使用图1中所示的连续发酵装置的本发明的化学品的制备方法，可以通过连续发酵稳定地制备1，3-丙二醇。连续发酵所有期间中的膜间差压以2kPa以下进行变化。

实施例20  通过连续发酵进行1，3-丙二醇的制备(其中之2)

使用图2的连续发酵装置和表13中所示的组成的1，3-丙二醇生产培养基，进行1，3-丙二醇的制备。

培养基在高压蒸气灭菌(121℃、15分钟)后再使用。作为分离膜元件构件，使用不锈钢和聚砜树脂的成型品。作为分离膜，使用参考例2中制备的多孔性膜。本实施例中的运转条件，只要没有特别预先通知，则为以下条件。

发酵反应槽容量：2(L)

使用分离膜：聚偏1，1-二氟乙烯过滤膜

膜分离元件有效过滤面积：120cm²

温度调整：37(℃)

发酵反应槽通气量：0.6(L/分钟)氮气

发酵反应槽搅拌速度：800(转/分钟)

pH调整：用5N NaOH调整至pH7.0

灭菌：含有分离膜元件的培养槽和使用培养基均用121℃、20分钟的高压灭菌釜进行高压蒸气灭菌

膜渗透水量控制：通过膜间差压进行流量控制。

(连续发酵开始后～100小时：控制在0.1kPa以上5kPa以下

100小时～200小时：控制在0.1kPa以上2kPa以下

200小时～264小时：控制在0.1kPa以上20kPa以下)。

作为微生物，使用肺炎克雷伯氏菌ATCC 25955株，作为培养基，使用表9中所示的组成的1，3-丙二醇生产培养基，用HPLC法测定来进行生成物即1，3-丙二醇的浓度的评价。而且，在葡萄糖浓度的测定中，使用Glucose-Test Wako C(和光纯药)。

首先，在试管中用5ml的1，3-丙二醇生产培养基振荡培养肺炎克雷伯氏菌ATCC 25955株过夜(预先培养)。将获得的培养液接种于50ml新鲜的1，3-丙二醇生产培养基中，在容量为500ml的坂口摇瓶中于30℃振荡培养24小时(预先培养)。将预先培养液接种于图2中所示的膜分离型连续发酵装置的1.5L的1，3-丙二醇生产培养基中，用附带的搅拌机5以800转/分钟搅拌发酵反应槽1，进行发酵反应槽1的通气量的调整、温度调整、pH调整，进行24小时培养(前培养)。前培养结束后，立即进行1，3-丙二醇生产培养基(甘油浓度为100g/L)的连续供给，一边进行膜渗透水量的控制使得膜一体型连续发酵装置的发酵液量达到1.5L，一边进行连续培养，通过连续发酵进行1，3-丙二醇的制备。进行连续发酵试验时的膜渗透水量的控制，通过用水头差控制装置3测定水头差作为膜间差压，在上述膜渗透水量控制条件下使之变化来进行。适当地测定膜透过发酵液中所生产的1，3-丙二醇浓度和残存葡萄糖浓度。而且，根据该1，3-丙二醇和投入甘油计算出的1，3-丙二醇生产速度示于表14中。进行了264个小时的发酵试验，其结果是，通过使用图2中所示的连续发酵装置的本发明的化学品的制备方法，可以通过连续发酵稳定地制备1，3-丙二醇。连续发酵所有期间中的膜间差压以2kPa以下进行变化。

比较例10  通过流加发酵进行1，3-丙二醇的制备

作为使用微生物的发酵方案，用容量为2L的小型发酵罐进行最典型的流加发酵，评价1，3-丙二醇生产性。该培养基在高压蒸气灭菌(121℃、15分钟)后再使用。本比较例中，作为微生物，使用肺炎克雷伯氏菌ATCC25955株，用HPLC评价生产物即1，3-丙二醇的浓度，在葡萄糖浓度的测定中，使用Glucose-Test Wako C(和光纯药)。比较例10的运转条件如下所示。

发酵反应槽容量(1，3-丙二醇生产培养基量)：1.0(L)

温度调整：37(℃)

发酵反应槽通气量：0.4(L/分钟)氮气

发酵反应槽搅拌速度：300(转/分钟)

pH调整：用5N NaOH调整至pH7.0。

首先，在试管中用5ml的1，3-丙二醇生产培养基振荡培养肺炎克雷伯氏菌ATCC 25955株过夜(预先培养)。将预先培养液接种于50ml新鲜的1，3-丙二醇生产培养基中，在容量为500ml的坂口摇瓶中振荡培养24小时(前培养)。将前培养液接种于小型发酵罐的1.5L的1，3-丙二醇生产培养基中。用1，3-丙二醇生产培养基(甘油浓度为500g/L)，连续供给使得甘油浓度达到0g/L至10g/L，一边进行流加发酵。其结果示于表14。

【表14】

	比较例10	实施例19	实施例20
				发酵时间(小时)	42	320	264
投入甘油(g)	200	1620	1320
				产生的1，3-丙二醇(g)	53	391	313
未利用的甘油(g)	5	55	50
				1，3-丙二醇收率(g/g)	0.27	0.25	0.25
1，3-丙二醇生产速度(g/升/小时)	1.26	2.50	3.33

通过使用图1和图2中所示的发酵装置的本发明的化学品的制备方法，1，3-丙二醇的生产速度大幅上升。

实施例21通过连续发酵进行的衣康酸的制备(其中之1)

使用图1中所示的连续发酵装置进行衣康酸的制备。使用表15中所示的培养基作为培养基，高压蒸气灭菌处理(121℃、15分钟)后再使用。作为分离膜元件构件，使用不锈钢和聚砜树脂的成形品。作为分离膜，使用参考例2中制备的多孔性膜。本实施例中的运转条件，只要没有特别预先通知，则为以下条件。

发酵反应槽容量：2(L)

使用分离膜：聚偏1，1-二氟乙烯过滤膜

膜分离元件有效过滤面积：120cm²

温度调整：35(℃)

发酵反应槽通气量：1.5(L/分钟)

发酵反应槽搅拌速度：200(转/分钟)

灭菌：含有分离膜元件的培养槽和使用培养基均用121℃、20分钟的高压灭菌釜进行高压蒸气灭菌。

pH调整：用4N NaOH调整至pH5

膜渗透水量控制：通过膜分离槽水头差控制流量

(连续发酵开始后～100小时：控制在0.1kPa以上5kPa以下

100小时～200小时：控制在0.1kPa以上2kPa以下

200小时～300小时：控制在0.1kPa以上20kPa以下)。

作为微生物，使用土曲霉(A.terreus)ATCC10020株，作为培养基，使用表11中所示的组成的衣康酸发酵培养基，生产物即衣康酸的浓度用Koppeshaar的方法(共立出版、微生物光学讲座第5卷“カビの利用工業”p72-73、昭和31年发行)测定。而且，葡萄糖浓度的测定中使用Glucose-Test Wako C(和光纯药)。

【表15】

衣康酸发酵培养基

                  前培养    连续分批发酵

                                                    

葡萄糖            55        70         g/L

玉米浆            3         2.0        g/L

硝酸铵            5         3.0        g/L

硫酸镁            2         0.1        g/L

Adecanol LG126    -         0.1        g/L

(消泡剂)

                                                    

首先，在试管中用5ml的表15中所示的前培养培养基振荡培养土曲霉ATCC10020株过夜(预先培养)。获得的培养液接种于100ml新鲜的前培养培养基中，在容量为500ml的坂口摇瓶中于35℃的温度振荡培养48小时(预先培养)。将预先培养液接种于图1中所示的膜分离型连续发酵装置的1.5L的连续分批发酵培养基中，用附带的搅拌机5以200转/分钟搅拌发酵反应槽1，进行发酵反应槽1的通气量的调整和温度调整，进行24小时培养(前培养)。前培养结束后，立即使发酵液循环泵运作，除了前培养时的运转条件之外，给膜分离槽2通气，进行衣康酸发酵培养基的连续供给，一边进行膜渗透水量的控制使得膜分离型连续发酵装置的发酵液量达到2L，一边进行连续培养，通过连续发酵进行衣康酸的制备。进行连续发酵试验时的膜渗透水量的控制，通过用水头差控制装置3测定水头差作为膜间差压，在上述膜渗透水量控制条件下使之变化来进行。适当地测定膜透过发酵液中所生产的衣康酸浓度和残存葡萄糖浓度。而且，根据由衣康酸和葡萄糖浓度计算出的投入葡萄糖而计算出的衣康酸生产速度示于表16中。

通过使用图1中所示的发酵装置的本发明的化学品的制备方法，可以通过连续发酵稳定地制备衣康酸。连续发酵所有期间中的膜间差以2kPa以下进行变化。

实施例22  通过连续发酵进行衣康酸的制备(其中之2)

进行使用图2中所示的连续发酵装置的衣康酸的制备。使用表15中所示的培养基作为培养基，高压蒸气灭菌处理(121℃、15分钟)后再使用。作为分离膜元件构件，使用不锈钢和聚砜树脂的成形品。作为分离膜，使用参考例2中制备的多孔性膜。本实施例中的运转条件，只要没有特别预先通知，则为以下条件。

发酵反应槽容量：2(L)

使用分离膜：PVDF过滤膜

膜分离元件有效过滤面积：120cm²

温度调整：35(℃)

发酵反应槽通气量：1.5(L/分钟)

发酵反应槽搅拌速度：200(转/分钟)

灭菌：含有分离膜元件的培养槽和使用培养基均用121℃、20分钟的高压灭菌釜进行高压蒸气灭菌。

pH调整：用4N NaOH调整至pH5

膜渗透水量控制：通过膜分离槽水头差控制流量

(连续发酵开始后～100小时：控制在0.1kPa以上5kPa以下

100小时～200小时：控制在0.1kPa以上2kPa以下

200小时～300小时：控制在0.1kPa以上20kPa以下)。

作为微生物，使用土曲霉(A.terreus)ATCC10020株，作为培养基，使用表11中所示的组成的衣康酸发酵培养基，生产物即衣康酸的浓度用实施例17中所示的方法测定。而且，在葡萄糖浓度的测定中使用Glucose-TestWako C(和光纯药)。

首先，在试管中用5ml的表15中所示的前培养培养基振荡培养土曲霉ATCC10020株过夜(预先培养)。将获得的培养液接种于100ml新鲜的前培养培养基中，在容量为500ml的坂口摇瓶中于35℃的温度振荡培养48小时(预先培养)。将预先培养液接种于图2中所示的连续发酵装置的1.5L的连续分批发酵培养基中，用附带的搅拌机5以200转/分钟搅拌发酵反应槽1，进行发酵反应槽1的通气量的调整和温度调整，进行24小时培养(前培养)。前培养结束后，立即进行连续分批发酵培养基的连续供给，一边进行膜渗透水量的控制使得连续发酵装置的发酵液量达到1.5L，一边进行连续培养，通过连续发酵进行衣康酸的制备。进行连续发酵试验时的膜渗透水量的控制，通过用水头差控制装置3测定水头差作为膜间差压，在上述膜渗透水量控制条件下使之变化来进行。适当地测定膜透过发酵液中所生产的衣康酸浓度和残存葡萄糖浓度。而且，根据由衣康酸和葡萄糖浓度计算出的投入葡萄糖而计算出的衣康酸生产速度示于表16中。

通过使用图2中所示的发酵装置的本发明的化学品的制备方法，可以通过连续发酵稳定地制备衣康酸。连续发酵所有期间中的膜间差压以2kPa以下进行变化。

比较例11  通过分批发酵进行衣康酸的制备

作为使用微生物的发酵方案，使用容量为2L的小型发酵罐进行最典型的分批发酵，评价衣康酸生产性。使用表15中所示培养基作为培养基，高压蒸气灭菌处理(121℃、15分钟)后再使用。该比较例11中，使用土曲霉ATCC10020株作为微生物，生产物即衣康酸的浓度的评价用实施例17中所示的方法评价，在葡萄糖浓度的测定中，使用Glucose-Test Wako C(和光纯药)。比较例11的运转条件如下所示。

发酵反应槽容量(衣康酸发酵培养基量)：1.5(L)

温度调整：35(℃)

发酵反应槽通气量：1.5(L/分钟)

发酵反应槽搅拌速度：200(转/分钟)

pH调整：用4N NaOH调整至pH5。

首先，在试管中用5ml的表1中所示的前培养培养基振荡培养土曲霉ATCC10020株过夜(预先培养)。将预先培养液接种于50ml新鲜的前培养培养基中，在容量为500ml的坂口摇瓶中振荡培养48小时(前培养)。将前培养液接种于小型发酵罐的1.5L的表15所示连续分批发酵培养基中、进行分批发酵。分批发酵的结果示于表16中。

【表16】

	比较例11	实施例21	实施例22
				发酵时间(小时)投入葡萄糖(g)生成衣康酸(g)未利用的葡萄糖(g)收率(g/g)生产速度(g/L/小时)	801055510.530.46	30020901020500.501.7	3001650790500.491.7

通过使用图1和图2中所示的发酵装置的本发明的化学品的制备方法，衣康酸的生产速度大幅上升。

实施例23  通过连续发酵进行尸胺的制备(其中之1)

使用图1中所示的连续发酵装置和表17中所示组成的尸胺发酵培养基，进行尸胺的制备。

首先，对生产物即尸胺的评价法进行说明。尸胺用下述HPLC法评价。

使用柱：CAPCELL PAK C18(资生堂)

流动相：0.1％(w/w)磷酸水溶液∶乙腈＝4.5∶5.5

检测：UV360nm

样品前处理：在25μ1分析样品中作为内标添加混合25μl 1，4-二氨基丁烷(0.03M)，150μl碳酸氢钠(0.075M)和2，4-二硝基氟苯(0.2M)的乙醇溶液，保持在37℃1小时。在1ml乙腈中溶解50μl上述反应溶液后，对以10,000转/分钟离心5分钟后的10μl上清进行HPLC分析。

该培养基经高压蒸气灭菌(121℃、15分钟)后再使用。作为分离膜元件构件，使用不锈钢和聚砜树脂的成形品。作为分离膜，使用参考例2中制备的多孔性膜。本实施例1中的运转条件，只要没有特别预先通知，则为以下条件。

发酵反应槽容量：2(L)

使用分离膜：聚偏1，1-二氟乙烯过滤膜

膜分离元件有效过滤面积：120cm²

温度调整：30(℃)

发酵反应槽通气量：1.5(L/分钟)空气

发酵反应槽搅拌速度：800(转/分钟)

pH调整：用3M HCl和3M氨水调整成pH7.0

灭菌：含有分离膜元件的培养槽和使用培养基均用121℃、20分钟的高压灭菌釜进行高压蒸气灭菌

膜渗透水量控制：通过膜间差压进行流量控制。

(连续发酵开始后～100小时：控制在0.1kPa以上5kPa以下

100小时～200小时：控制在0.1kPa以上2kPa以下

200小时～320小时：控制在0.1kPa以上20kPa以下)。

作为使之生产尸胺的微生物，使用特开2004-222569号公报中记载的谷氨酸棒杆菌TR-CAD1株，作为培养基，使用表17中所示的组成的尸胺生产培养基。生产物即尸胺的浓度的评价用HPLC法测定。而且，葡萄糖浓度的测定中使用Glucose-Test Wako C(和光纯药社制)。

【表17】

尸胺发酵培养基

                                     

葡萄糖              150g/L

柠檬酸              1g/L

尿素                15g/L

磷酸二氢钾          0.5g/L

磷酸氢二钾          0.5g/L

七水合硫酸镁        0.5g/L

L-苏氨酸            0.8g/L

L-甲硫氨酸          0.6g/L

L-亮氨酸            1.5g/L

七水合硫酸铁        6.0mg/L

一水合硫酸锰        4.2mg/L

生物素              1.0mg/L

硫胺素              2.0mg/L

用3M氨水调节至pH 7.0

                                 

首先，在试管中用5ml的添加了卡那霉素(25μg/ml)的尸胺发酵培养基添加振荡培养谷氨酸棒杆菌TR-CAD1株过夜(预先培养)。将获得的培养液接种于50ml添加了新鲜的卡那霉素(25μg/ml)的尸胺生产培养基中，在容量为500ml的坂口摇瓶中于30℃，30cm的振幅，180转/分钟的条件下培养24小时(预先培养)。将预先培养液接种于图1中所示的连续发酵装置的2.0L尸胺发酵培养基中，用附带的搅拌机5以800转/分钟搅拌发酵反应槽1，进行发酵反应槽1的通气量的调整、温度调整、pH调整、进行24小时培养(前培养)。

前培养结束后，立即使发酵液循环泵10运作，除了前培养时的运转条件之外，给膜分离槽2通气，进行尸胺发酵培养基的连续供给，一边进行膜渗透水量的控制使得连续发酵装置的发酵液量达到2L，一边进行连续培养，通过连续发酵进行尸胺的制备。进行连续发酵试验时的膜渗透水量的控制，通过用水头差控制装置3测定水头差作为膜间差压，在上述膜渗透水量控制条件下使之变化来进行。适当地测定膜透过发酵液中所生产的乳酸浓度和残存葡萄糖浓度。

进行了160小时的连续发酵试验的结果示于表18中。通过使用图1中所示的连续发酵装置的本发明的化学品的制备方法，通过连续发酵可以稳定地制备尸胺。连续发酵期间的膜间差压以2kPa以下进行变化。

实施例24  通过连续发酵进行尸胺的制备(其中之2)

使用图2中所示的连续发酵装置和表17中所示的组成的尸胺发酵培养基，进行尸胺的制备。培养基经高压蒸气灭菌(121℃、15分钟)后再使用。作为分离膜元件构件，使用不锈钢和聚砜树脂的成形品。作为分离膜，使用参考例2中制备的多孔性膜。本实施例中的运转条件，只要没有特别预先通知，则为以下条件。

发酵反应槽容量：2(L)

使用分离膜：聚偏1，1-二氟乙烯过滤膜

膜分离元件有效过滤面积：120cm²

温度调整：30(℃)

发酵反应槽通气量：1.5(L/分钟)空气

发酵反应槽搅拌速度：800(转/分钟)

pH调整：用3M HCl和3M氨水调整成pH7.0

灭菌：含有分离膜元件的培养槽和使用培养基均用121℃、20分钟的高压灭菌釜进行高压蒸气灭菌

膜渗透水量控制：通过膜间差压进行流量控制。

(连续发酵开始后～100小时：控制在0.1kPa以上5kPa以下

100小时～200小时：控制在0.1kPa以上2kPa以下

200小时～264小时：控制在0.1kPa以上20kPa以下)。

作为微生物，使用谷氨酸棒杆菌TR-CAD1株，作为培养基，使用表17中所示的组成的尸胺发酵培养基，生产物即尸胺的浓度的评价用HPLC法测定。而且，在葡萄糖浓度的测定中使用Glucose-Test Wako C(和光纯药社制)。

首先，在试管中用5ml的添加了卡那霉素(25μg/ml)的尸胺生产培养基添加振荡培养谷氨酸棒杆菌TR-CAD1株过夜(预先培养)。将获得的培养液接种于50ml添加了新鲜的卡那霉素(25μg/ml)的尸胺生产培养基中、在容量为500ml的坂口摇瓶中于30℃，30cm的振幅，180转/分钟的条件下培养24小时(预先培养)。

将预先培养液接种于图2中所示的连续发酵装置的1.5L尸胺生产培养基中、用附带的搅拌机5以800转/分钟搅拌发酵反应槽1，进行发酵反应槽1的通气量的调整、温度调整和pH调整，进行24小时培养(前培养)。前培养结束后，立即进行尸胺发酵培养基的连续供给，一边进行膜渗透水量的控制使得连续发酵装置的发酵液量达到1.5L，一边进行连续培养，通过连续发酵进行尸胺的制备。进行连续发酵试验时的膜渗透水量的控制，通过用水头差控制装置3使发酵反应槽水头差在最大2m以内适当变化，即膜间差压为20kPa以内进行。适当地测定膜透过发酵液中所生产的尸胺浓度和残存葡萄糖浓度。而且，由该尸胺和投入葡萄糖计算出的尸胺生产速度示于表18中。

进行了320小时的连续发酵试验的结果示于表18中。通过使用图2中所示的连续发酵装置的本发明的化学品的制备方法，通过连续发酵可以稳定地制备尸胺。连续发酵期间的膜间差压以2kPa以下进行变化。

比较例12  通过分批发酵进行尸胺的制备

作为使用微生物的发酵方案，使用容量为2L的小型发酵罐进行最典型的分批发酵，评价尸胺生产性。培养基经高压蒸气灭菌(121℃、15分钟)后再使用。本比较例中，使用谷氨酸棒杆菌TR-CAD1株作为微生物，生产物即尸胺的浓度的评价用HPLC进行评价，在葡萄糖浓度的测定中使用Glucose-Test Wako C(和光纯药社制)。比较例8的运转条件如下所述。

发酵反应槽容量(尸胺生产培养基量)：1.0(L)

温度调整：30(℃)

发酵反应槽通气量：1.5(L/分钟)空气

发酵反应槽搅拌速度：800(转/分钟)

pH调整：用3M HCl和3M氨水调整成pH7.0。

首先，在试管中用5ml的添加了卡那霉素(25μg/ml)的尸胺生产培养基添加振荡培养谷氨酸棒杆菌TR-CAD1株过夜(预先培养)。将获得的培养液接种于50ml添加了新鲜的卡那霉素(25μg/ml)的尸胺生产培养基中、在容量为500ml的坂口摇瓶中于30℃，30cm的振幅，180转/分钟的条件下培养24小时(前培养)。

将前培养液接种于小型发酵罐的1.0L尸胺生产培养基(葡萄糖浓度为100g/L)中。使用尸胺生产培养基进行分批发酵。其结果示于表18中。

【表18】

	比较例12	实施例23	实施例24
				发酵时间(小时)	30	160	144
投入葡萄糖(g)	100	2460	2210
				产生的尸胺(g)	2.6	60.4	56.2
未利用的葡萄糖(g)	0	45	50
				尸胺收率(g/g)	2.6	2.5	2.5
尸胺生产速度(g/升/小时)	0.087	0.200	0.260

可以明确，通过使用图1和图2中所示的发酵装置的本发明的化学品的制备方法，尸胺的生产速度大幅上升。

实施例25  通过连续发酵进行核酸的制备(其中之1)

进行使用图1中所示的连续发酵装置的核酸的制备。使用表19中所示的培养基作为培养基，高压蒸气灭菌处理(121℃、15分钟)后再使用。作为分离膜元件构件，使用不锈钢和聚砜树脂的成形品。使用参考例2中制备的多孔性膜作为分离膜。本实施例中的运转条件，只要没有特别预先通知，如下所示。

发酵反应槽容量：2(L)

使用分离膜：聚偏1，1-二氟乙烯过滤膜

膜分离元件有效过滤面积：120cm²

温度调整：30(℃)

发酵反应槽通气量：1000(mL/分钟)

发酵反应槽搅拌速度：800(转/分钟)

灭菌：含有分离膜元件的培养槽和使用培养基均用121℃、20分钟的高压灭菌釜进行高压蒸气灭菌。

pH调整：用25％氨水溶液调整到pH6.8

膜渗透水量控制：通过膜间差压进行流量控制

(连续发酵开始后～150小时：控制在0.1kPa以上5kPa以下

150小时～300小时：控制在0.1kPa以上2kPa以下

300小时～400小时：控制在0.1kPa以上20kPa以下)。

作为原核微生物，使用产氨棒杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)ATCC21479株，作为培养基，使用表19中所示的组成的核酸发酵培养基。发酵液中所含鸟苷和次黄苷，通过在下述条件下用HPLC法测定各核酸量来确认。

[分析条件]

柱：Asahipak GS-220(7.6mmID×500mmL)、缓冲液：0.2MNaH₂PO₄(pH3.98)用磷酸进行pH调整、温度：55℃、流速：1.5ml/分钟、检测：UV254nm、保留时间(分钟)：次黄苷16.1、鸟苷20.5。

而且，葡萄糖浓度的测定中使用“Glucose-Test Wako C”(注册商标)(和光纯药社制)。

【表19】核酸发酵培养基

首先，在坂口摇瓶中用150ml表15中所示的前培养培养基，于30℃振荡培养产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)ATCC21479株24小时(预先培养)。将获得的预先培养液接种于图1中所示的连续发酵装置的1L前培养培养基中，用附带的搅拌机5以800转/分钟搅拌发酵反应槽1，进行发酵反应槽1的通气量的调整和将温度调整成30℃，进行24小时培养(前培养)。前培养结束后，立即使发酵液循环泵运作，除了前培养时的运转条件，给膜分离槽2通气，进行连续发酵培养基的连续供给，前培养结束后，立即进行连续发酵培养基的连续供给，通过发酵液循环泵11使之在发酵反应槽1和膜分离槽12之间循环，通过一边进行膜渗透水量的控制使得膜分离型连续发酵装置的发酵液量达到2L，一边进行连续培养，从而通过连续发酵进行核酸的制备。进行连续发酵试验时的膜渗透水量的控制，通过用水头差控制装置3测定水头差作为膜间差压，在上述膜渗透水量控制条件下使之变化来进行。适当地测定膜透过发酵液中所生产的核酸浓度和残存葡萄糖浓度。而且，根据由核酸和葡萄糖浓度计算出的投入葡萄糖而计算出的核酸生产速度示于表20。

进行了400个小时的发酵试验，其结果是，通过使用图1中所示的连续发酵装置的本发明的化学品的制备方法，可以通过连续发酵稳定地制备核酸。连续发酵所有期间中的膜间差压以2kPa以下进行变化。

实施例26  通过连续发酵进行的核酸的制备(其中之2)

进行使用图2中所示的连续发酵装置的核酸的制备。使用表19中所示的培养基作为培养基，高压蒸气灭菌处理(121℃、15分钟)后再使用。作为分离膜元件构件，使用不锈钢和聚砜树脂的成形品。使用参考例2中制备的多孔性膜作为分离膜。本实施例中的运转条件，只要没有特别预先通知，如下所示。

发酵反应槽容量：2(L)

使用分离膜：聚偏1，1-二氟乙烯过滤膜

膜分离元件有效过滤面积：120cm²

温度调整：30(℃)

发酵反应槽通气量：1000(mL/分钟)

发酵反应槽搅拌速度：800(转/分钟)

灭菌：含有分离膜元件的培养槽和使用培养基均用121℃、20分钟的高压灭菌釜进行高压蒸气灭菌。

pH调整：用25％氨水溶液调整到pH6.8

膜渗透水量控制：通过膜间差压进行流量控制

(连续发酵开始后～150小时：控制在0.1kPa以上5kPa以下

150小时～300小时：控制在0.1kPa以上2kPa以下

300小时～400小时：控制在0.1kPa以上20kPa以下)。

作为原核微生物，使用产氨棒杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)ATCC21479株，作为培养基，使用表19中所示的组成的核酸发酵培养基。发酵液中所含鸟苷和次黄苷、葡萄糖，通过用实施例1相同的方法测定各核酸量来确认。

首先，在坂口摇瓶中用150ml表19中所示的前培养培养基，于30℃振荡培养产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)ATCC21479株24小时(预先培养)。将获得的预先培养液接种于图2中所示的连续发酵装置的1L前培养培养基中，用附带的搅拌机5以800转/分钟搅拌发酵反应槽1，进行发酵反应槽1的通气量的调整和将温度调整成30℃，进行24小时培养(前培养)。前培养结束后，立即进行连续发酵培养基的连续供给，一边进行膜渗透水量的控制使得连续发酵装置的发酵液量达到1.5L，一边进行连续培养，通过连续发酵进行核酸的制备。进行连续发酵试验时的膜渗透水量的控制，通过用水头差控制装置3测定水头差作为膜间差压，在上述膜渗透水量控制条件下使之变化来进行。适当地测定膜透过发酵液中所生产的核酸浓度和残存葡萄糖浓度。而且，根据由核酸和葡萄糖浓度计算出的投入葡萄糖而计算出的核酸生产速度示于表20中。

进行了400个小时的发酵试验，其结果是，通过使用图2中所示的连续发酵装置的本发明的化学品的制备方法，可以通过连续发酵稳定地制备核酸。连续发酵所有期间中的膜间差压以2kPa以下进行变化。

比较例13  通过分批发酵进行核酸的制备

作为使用微生物的发酵方案，使用容量为2L的小型发酵罐进行最典型的分批发酵，评价其核酸生产性。使用表19中所示的连续发酵培养基作为培养基，高压蒸气灭菌处理(121℃、15分钟)后再使用。本比较例中，作为原核微生物，使用产氨棒杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)ATCC21479株，生产物即核酸的浓度的评价采用实施例21中所示的方法进行，葡萄糖浓度的测定中使用“Glucose-Test Wako C”(注册商标)(和光纯药社制)。本比较例的运转条件如下所示。

发酵反应槽容量：2(L)

温度调整：30(℃)

发酵反应槽通气量：1000(mL/分钟)

发酵反应槽搅拌速度：800(转/分钟)

灭菌：含有分离膜元件的培养槽和使用培养基均用121℃、20分钟的高压灭菌釜进行高压蒸气灭菌

pH调整：用25％氨水溶液调整到pH6.8。

首先，在坂口摇瓶中用150ml表19中所示的前培养培养基，于30℃振荡培养产氨棒杆菌(Corynebacterium  ammoniagenes)ATCC21479株24小时(前培养)。将获得的前培养液接种于小型发酵罐的1L表19中所示的连续发酵培养基中，进行分批发酵。发酵开始后，添加5％的葡萄糖后继续发酵。120小时的分批发酵的结果示于表20中。

【表20】

可以明确，通过使用图1和图2中所示的发酵装置的本发明的化学品的制备方法，核酸的生产速度大幅上升。

实施例27  通过连续发酵进行L-苏氨酸的制备(其中之1)

使用图1的连续发酵装置和表21中所示的组成的发酵培养基，进行L-苏氨酸的制备。

首先，就生产物即L-苏氨酸的评价方法进行说明。培养液中所含L-苏氨酸量的测定用以下方法进行。取25μL含有测定的L-苏氨酸的培养液，向其中加入150μl的NaHCO₃(75mM)和作为内标的25μl的L-甲硫氨酸(2g/L)。在上述溶液中再加入并混合900μl的乙醇和150μl的DNFB(0.2M)。上述溶液于37℃静置1小时后，在下述条件下进行HPLC分析。

柱：CAPCELLPAK C18 TYPE SG120(资生堂)

流动相：0.1％(w/v)H₃PO₄∶乙腈＝7∶3(流速1.2mL/分钟)

检测方法：UV(360nm)

温度：23℃。

校正曲线，通过以浓度已知的L-苏氨酸作为标准品进行分析，横轴上绘制L-苏氨酸浓度，在纵轴上绘制L-苏氨酸面积/L-甲硫氨酸(内标)面积的面积比进行作图。培养基在高压蒸气灭菌(121℃、15分钟)后再使用。使用参考例2中制备的多孔性膜作为分离膜。

本实施例中的运转条件，只要没有特别预先通知，如下所示。

反应槽容量：2(L)

膜分离槽容量：0.5(L)

使用分离膜：聚偏1，1-二氟乙烯过滤膜

膜分离元件有效过滤面积：60cm²

温度调整：37(℃)

反应槽通气量：1.5(L/分钟)

膜分离槽通气量：1(L/分钟)

反应槽搅拌速度：800(转/分钟)

pH调整：用28％的氨水溶液调整到pH7

L-苏氨酸发酵培养基供给速度：在50～300ml/小、时的范围内可变控制

膜渗透水量控制：通过膜间差压进行流量控制

(连续发酵开始后～100小时：控制在0.1kPa以上5kPa以下

100小时～200小时：控制在0.1kPa以上2kPa以下)。

作为L-苏氨酸生产微生物，使用雷氏普罗威登斯菌中的雷氏普罗威登斯菌SGR588-77株(FERM P-10528)，使用表21中所示的组成的发酵培养基作为培养基，在生产物即L-苏氨酸的浓度的评价中使用上述HPLC，在葡萄糖浓度的测定中，使用Glucose-Test Wako C(和光纯药)。

【表21】

L-苏氨酸发酵培养基

首先，在投入了100ml的葡萄糖肉汤培养基(1％葡萄糖、3％肉汤(Nissui公司制))的容量为500ml的三角摇瓶中接种从琼脂培养基中挑取的雷氏普罗威登斯菌SGR588-77株。将其于37℃，一边以140转/分钟搅拌，一边进行培养(预先培养)。将预先培养液接种于图1中所示的连续发酵装置的1.5L前培养培养基(表21)中，用附带的搅拌机5以800转/分钟搅拌反应槽1，进行发酵反应槽1的通气量的调整和将温度调整成37℃，进行24小时培养(前培养)。前培养结束后，立即使发酵液循环泵运作，除了前培养时的运转条件外，还给膜分离槽2通气，进行表17中所示的组成的发酵培养基的连续供给，一边进行膜渗透水量的控制使得连续发酵装置的发酵液量达到2L，一边进行连续培养，通过连续发酵进行L-苏氨酸的制备。进行连续发酵试验时的膜渗透水量的控制，通过用水头差控制装置3测定水头差作为膜间差压，在上述膜渗透水量控制条件下使之变化来进行。适当地测定膜透过发酵液中所生产的L-苏氨酸浓度和残存葡萄糖浓度。通过使发酵反应槽水头差适当变化使发酵反应槽水头在最大2m以内，即膜间差压为20kPa以内来进行。适当地测定膜透过发酵液中所生产的L-苏氨酸浓度和残存葡萄糖浓度。进行了200小时的连续发酵试验的结果示于表22中。

通过使用图1中所示连续培养装置的本发明的化学品的制备方法，可以通过连续发酵稳定地制备L-苏氨酸。连续发酵期间的膜间差压以2kPa以下进行变化。

实施例28  通过连续发酵进行L-苏氨酸的制备(其中之2)

使用图2的膜分离型连续发酵装置和表21中所示的组成的发酵培养基，进行L-苏氨酸的制备。该培养基在高压蒸气灭菌(121℃、15分钟)后再使用。作为分离膜元件构件，使用不锈钢和聚砜树脂的成型品。使用参考例2中制备的多孔性膜作为分离膜。本实施例中的运转条件，只要没有特别预先通知，如下所示。

反应槽容量：2(L)

使用分离膜：PVDF过滤膜

膜分离元件有效过滤面积：120cm²

温度调整：37(℃)

反应槽通气量：1.5(L/分钟)

反应槽搅拌速度：800(转/分钟)

pH调整：用28％的氨水溶液调整到pH7

L-苏氨酸发酵培养基供给速度：在50～300ml/小时的范围内可变控制

膜渗透水量控制：通过膜间差压进行流量控制

(连续发酵开始后～100小时：控制在0.1kPa以上5kPa以下

100小时～200小时：控制在0.1kPa以上2kPa以下)

灭菌：含有分离膜元件的培养槽和使用培养基均用121℃、20分的高压灭菌釜进行高压蒸气灭菌。

作为L-苏氨酸生产微生物，使用雷氏普罗威登斯菌中的雷氏普罗威登斯菌SGR588-77株(FERM P-10528)，作为培养基，使用表21中所示的组成的发酵培养基，在生产物即L-苏氨酸的浓度的评价中，使用实施例23中所示的HPLC，在葡萄糖浓度的测定中，使用Glucose-Test Wako C(和光纯药)。

首先，在投入了100ml的葡萄糖肉汤培养基(1％葡萄糖、3％肉汤(Nissui公司制))的容量为500ml的三角摇瓶中接种从琼脂培养基中挑取的雷氏普罗威登斯菌SGR588-77株。将其于37℃，一边以140转/分钟搅拌，一边进行培养(预先培养)。将预先培养液接种于图1中所示的连续发酵装置的1.5L前培养培养基(表21)中，用附带的搅拌机5以800转/分钟搅拌反应槽1，进行反应槽1的通气量的调整、温度调整、pH调整、进行24小时培养(前培养)。前培养结束后，立即进行表21中所示的组成的发酵培养基的连续供给，一边进行膜渗透水量的控制使得连续发酵装置的发酵液量达到1.5L，一边进行连续培养，通过连续发酵进行L-苏氨酸的制备。进行连续发酵试验时的膜渗透水量的控制，通过用水头差控制装置3测定水头差作为膜间差压，在上述膜渗透水量控制条件下使之变化来进行。适当地测定膜透过发酵液中所生产的L-苏氨酸浓度和残存葡萄糖浓度。而且，相当于根据该L-苏氨酸和葡萄糖浓度计算出的投入葡萄糖的对糖收率、乳酸生产速度示于表18中。

进行了200个小时的连续发酵试验的结果是，通过采用图2中所示的连续培养装置的本发明的化学品的制备方法，可以通过连续发酵稳定地制备L-苏氨酸。连续发酵所有期间中的膜间差压以2kPa以下进行变化。

比较例14  通过分批发酵进行L-苏氨酸的制备

作为使用微生物的发酵方案，使用容量为2L的小型发酵罐进行最典型的分批发酵，评价其L-苏氨酸生产性。使用表21中所示的前培养培养基作为分批培养开始时的培养基。这些培养基在高压蒸气灭菌处理(121℃、15分钟)后再使用。本比较例中，作为微生物，使用雷氏普罗威登斯菌SGR588-77株，发酵液中所含L-苏氨酸和葡萄糖的浓度用实施例27中所示的方法进行。本比较例的运转条件如下所示。

发酵反应槽容量(L-苏氨酸发酵培养基量)：1(L)

温度调整：37(℃)

发酵反应槽通气量：1(L/分钟)

发酵反应槽搅拌速度：800(转/分钟)

pH调整：用28％的氨水溶液调整到pH7。

首先，在投入了90ml的葡萄糖肉汤培养基(1％葡萄糖、3％肉汤(Nissui公司制))的容量为500ml的三角摇瓶中接种从琼脂培养基中挑取的雷氏普罗威登斯菌SGR588-77株。将其于37℃，一边以140转/分钟搅拌，一边进行培养(前培养)。前培养液接种于投入了810ml的表17中所示的前培养培养基的微小型发酵罐中，进行分批发酵。培养过程中追加的培养基的组成示于表9的追加培养基中。培养基的追加在培养开始后24，32，40，48小时每次50mL进行。分批发酵的结果示于表22中。

【表22】

	比较例14	实施例27	实施例28
				发酵时间(小时)	55	200	200
投入葡萄糖(g)	195	2350	2290
				生成L-苏氨酸(g)	67.3	766	727
未利用的葡萄糖(g)	0	98	87
				收率(g/g)	0.345	0.34	0.33
生产速度(g/L/小时)	1.11	1.9	2.5

可以明确的是，通过使用图1和图2中所示的发酵装置的本发明的化学品的制备方法，L-苏氨酸的生产速度大幅上升。

实施例29  通过使用乳酸菌的连续发酵进行L-乳酸的制备(其中之1)

使用图1中所示的连续发酵装置进行L-乳酸的制备。使用表23中所示的L-乳酸菌乳酸发酵培养基作为培养基，高压蒸气灭菌处理(121℃、15分钟)后再使用。该培养基在高压蒸气灭菌(121℃、15分钟)后再使用。作为分离膜，使用参考例2中制备的多孔性膜。本实施例中的运转条件，只要没有特别预先通知，则为以下条件。

发酵反应槽容量：2(L)

使用分离膜：聚偏1，1-二氟乙烯过滤膜

膜分离元件有效过滤面积：120cm²

温度调整：37(℃)

发酵反应槽通气量：50(mL-氮/分钟)

发酵反应槽搅拌速度：600(转/分钟)

灭菌：含有分离膜元件的培养槽和使用培养基均用121℃、20分钟的高压灭菌釜进行高压蒸气灭菌。

pH调整：用8N氨水溶液调整至pH6.5

膜渗透水量控制：通过膜间差压进行流量控制

(连续发酵开始后～150小时：控制在0.1kPa以上5kPa以下

150小时～300小时：控制在0.1kPa以上2kPa以下

300小时～400小时：控制在0.1kPa以上20kPa以下)。

作为原核微生物，使用乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)JCM7638株，使用表23中所示的组成的乳酸菌乳酸发酵培养基作为培养基。发酵液中所含L-乳酸，用与参考例1同样的方法评价。而且，在葡萄糖浓度的测定中使用Glucose-Test Wako C(和光纯药)。

【表23】

乳酸菌乳酸发酵培养基

                                      

葡萄糖        60   g/L

酵母提取物    5    g/L

聚胨          5    g/L

氯化钠        5    g/L

                                    

首先，在试管中用表23中所示的5ml经氮气吹气的乳酸发酵培养基于37℃静置培养乳酸乳球菌JCM7638株24小时(预先培养)。将获得的培养液接种于经氮气吹气的50ml新鲜的乳酸发酵培养基中，于37℃静置培养48小时(预先培养)。将预先培养液接种于图1中所示的连续发酵装置的经氮气吹气的1.5L乳酸发酵培养基中，用附带的搅拌机5以600转/分钟搅拌发酵反应槽1，进行发酵反应槽1的通气量的调整和将温度调整成37℃，进行24小时培养(前培养)。前培养完了后立即进行乳酸发酵培养基的连续供给、一边进行膜渗透水量的控制使得连续发酵装置的发酵液量达到2L，一边进行连续培养、通过连续发酵进行L-乳酸的制备。此时，气体供给装置将氮气提供给发酵反应槽内，再回收排出的气体，再次提供给发酵反应槽。即，进行含有氮气的气体的循环供给。进行连续发酵试验时的膜渗透水量的控制，通过用水头差控制装置3测定水头差作为膜间差压，在上述膜渗透水量控制条件下使之变化来进行。适当的，测定膜透过发酵液中生产的L-乳酸浓度和残存葡萄糖浓度。而且，根据由该L-乳酸和葡萄糖浓度计算出的投入葡萄糖而计算的L-乳酸对糖收率、L-乳酸生产速度示于表24中。

进行了400个小时的发酵试验，其结果是，通过使用连续发酵装置的本发明的化学品的制备方法，可以通过连续发酵稳定地制备L-乳酸。连续发酵所有期间中的膜间差压以2kPa以下进行变化。

实施例30  通过使用乳酸菌的连续发酵进行L-乳酸的制备(其中之2)

使用图2中所示的连续发酵装置进行L-乳酸的制备。使用表23中所示的乳酸菌乳酸发酵培养基作为培养基，高压蒸气灭菌处理(121℃、15分钟)后再使用。该培养基在高压蒸气灭菌(121℃、15分钟)后再使用。作为分离膜，使用参考例2中制备的多孔性膜。本实施例中的运转条件，只要没有特别预先通知，则为以下条件。

发酵反应槽容量：2(L)

使用分离膜：聚偏1，1-二氟乙烯过滤膜

膜分离元件有效过滤面积：120cm²

温度调整：37(℃)

发酵反应槽通气量：50(mL-氮/分钟)

发酵反应槽搅拌速度：600(转/分钟)

灭菌：含有分离膜元件的培养槽和使用培养基均用121℃、20分钟的高压灭菌釜进行高压蒸气灭菌。

pH调整：用8N氨水溶液调整至pH6.5

透过水量控制：通过膜间差压进行流量控制

(连续发酵开始后～150小时：控制在0.1kPa以上5kPa以下

150小时～300小时：控制在0.1kPa以上2kPa以下

300小时～400小时：控制在0.1kPa以上20kPa以下)。

作为原核微生物，使用乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)JCM7638株，直到前培养都与实施例29同样进行。前培养结束后，立即进行培养基的连续供给，一边进行膜渗透水量的控制使得连续发酵装置的发酵液量达到1.5L，一边进行连续培养、通过连续发酵进行进行L-乳酸的制备。此时，气体供给装置将氮气提供给发酵反应槽内，再回收排出的气体，再次提供给发酵反应槽。即，进行含有氮气的气体的再循环供给。进行连续发酵试验时的膜渗透水量的控制，通过用水头差控制装置3测定水头差作为膜间差压，在上述膜渗透水量控制条件下使之变化来进行。适当地，测定膜透过发酵液中生产的L-乳酸浓度和残存葡萄糖浓度。而且，根据由该L-乳酸和葡萄糖浓度计算出的投入葡萄糖而计算的L-乳酸对糖收率、L-乳酸生产速度示于表24中。

进行了400个小时的发酵试验，其结果是，通过使用图2中所示的连续发酵装置的本发明的化学品的制备方法，可以通过连续发酵稳定地制备L-乳酸。连续发酵所有期间中的膜间差压以2kPa以下进行变化。

比较例15  通过分批发酵进行L-乳酸的制备

作为使用微生物的发酵方案，使用容量为2L的小型发酵罐进行最典型的分批发酵，评价该L-乳酸的生产性。使用表23中所示的培养基作为培养基，高压蒸气灭菌处理(121℃、15分钟)后再使用。本比较例中，作为原核微生物，使用乳酸乳球菌JCM7638株，生产物即L-乳酸的浓度的评价用参考例1中所示的方法评价，在葡萄糖浓度的测定中，使用Glucose-Test Wako C(和光纯药)。本比较例的运转条件如下所示。

发酵反应槽容量：1(L)

温度调整：37(℃)

发酵反应槽通气量：50(mL-氮/分钟)

发酵反应槽搅拌速度：200(转/分钟)

pH调整：用8N氨水溶液调整至pH6.5。

首先，在试管中用表23中所示的5ml经氮气吹气的乳酸发酵培养基于37℃静置培养乳酸乳球菌JCM7638株24小时(预先培养)。将获得的培养液接种于经氮气吹气的50ml新鲜的乳酸发酵培养基中，于37℃静置培养48小时(前培养)。将前培养液接种于小型发酵罐的1L的表23中所示的连续分批发酵培养基中，进行分批发酵。分批发酵的结果示于表24中。

【表24】

	比较例15	实施例29	实施例30
				发酵时间(小时)	40	400	400
投入葡萄糖(g)	90	4460	3550
				生成L-乳酸(g)	83	3920	3060
未利用的葡萄糖(g)	0	60	70
				收率(g/g)	0.92	0.89	0.88
生产速度(g/L/小时)	2.1	4.9	5.1

可以明确，通过使用图1和图2中所示的发酵装置的本发明的化学品的制备方法，L-乳酸的生产速度大幅上升。

参考例6左乳酸芽孢杆菌JCM2513的染色体DNA的制备

在100ml GYP培养基(特开2003-088392号公报中记载的GYP培养基)中接种左乳酸芽孢杆菌JCM2513，于30℃培养24小时后，获得培养物。对获得的培养物以3000转/分钟离心分离处理15分钟，获得了0.5g湿润菌体后，从该湿润菌体中，通过齐藤、三浦的方法(Biochem.Biophys.Acta.，72，619(1963))获得了染色体DNA。然后，将60μg该染色体DNA和3个单位的限制性酶Sau3AI与10mM Tris-盐酸缓冲液(含有50mM NaCl、10mM MgSO₄和1mM二硫苏糖醇(pH 7.4))混合，于37℃反应30分钟。用常规方法对反应终止液进行苯酚提取处理，乙醇沉淀处理后，用Sau3AI消化，获得了50μg左乳酸芽孢杆菌JCM2513的染色体DNA片段。

参考例7  利用质粒载体DNA制备左乳酸芽孢杆菌JCM2513的基因文库

将20μg可以在大肠杆菌(Escherichia coli)中自我复制的质粒载体DNA(pUC19)和200个单位的限制性酶BamHI在50mM Tris-盐酸缓冲液(含有100mM NaCl和10mM硫酸镁(pH7.4))中混合，于37℃反应2小时，获得消化液，通过常规方法苯酚提取该消化液，再进行乙醇沉淀处理。

然后，为了防止质粒载体来源的DNA片段再连接，通过细菌碱性磷酸酶处理，进行DNA片段的脱磷酸化，用常规方法进行苯酚提取处理，再进行乙醇沉淀处理。

在含有66mM氯化镁、10mM二硫苏糖醇和10mM ATP的66mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.5)中添加1μg这种经BamHI消化的pUC19，1μg参考例6中获得的经Sau3AI消化的左乳酸芽孢杆菌JCM2513的染色体DNA片段、和2个单位的T4DNA连接酶(宝酒造(株)制)，于16℃反应16小时，使DNA连接。然后，用获得的DNA混合物，通过常规方法转化大肠杆菌JM109，将其接种于含有50μg/ml氨苄青霉素钠的LB琼脂培养基上，获得了约20,000个菌落，作为基因文库。从约20,000个菌落中回收重组DNA。回收的方法按上述中所示的齐藤、三浦的方法进行。

参考例8  D-乳酸脱氢酶基因的筛选用宿主的制备

左乳酸芽孢杆菌JCM2513株的D-LDH基因的筛选通过功能互补进行。其原理的详细内容记载于“(DOMINIQUE，G.，Appl Environ Microbiol，美国(1995)61  266-272)”中。即，需要制备大肠杆菌的D-乳酸脱氢酶酶活性和丙酮酸甲酸裂解酶酶活性的菌株。用Kirill等人的方法(Kirill，A.，PNAS，美国(2000)976640-6645)，制备破坏缺失大肠杆菌的D-乳酸脱氢酶基因(ldhA)和丙酮酸甲酸裂解酶基因(pflB和pflD)的菌株。这样制备的菌株命名为大肠杆菌TM33株(E.coli ΔldhA ΔpflB::Km^r ΔpflD::Cm^r)，作为D-乳酸脱氢酶基因的筛选用宿主。

参考例9  D-乳酸脱氢酶基因的筛选

将大肠杆菌TM33株接种于100ml含有50μg/ml的卡那霉素硫酸盐和15μg/ml的氯霉素的LB培养基中，于37℃培养24小时，获得培养物。这样获得的培养物于3,000转/分钟离心分离处理15分钟，获得了0.8g湿润菌体。用10ml 10％甘油溶液清洗3次获得的湿润菌体后，悬浮于0.1ml 10％甘油溶液中，形成感受态细胞。向该感受态细胞中，加入1μl参考例8获得的左乳酸芽孢杆菌JCM2513株的基因文库，将按照电穿孔法的常规方法导入的菌株接种于含有50μg/ml氨苄青霉素钠的M9GP琼脂培养基(M9培养基+0.4％葡萄糖+0.2％蛋白胨)上，获得了数株可以在厌气条件下生长的菌株。

参考例10  含有D-乳酸脱氢酶基因的DNA的碱基序列分析

从上述获得的含有重组DNA的大肠杆菌TM33/pBL2中，按照常规方法制备质粒，用获得的重组DNA进行碱基序列的测定。碱基序列的测定用Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biochemical公司制)按照Sanger的方法进行。获得的含有D-乳酸脱氢酶基因的DNA的碱基序列为2,995个碱基对。对于该序列，用Genetyx(软件开发株式会社制)进行可读框检索，预测1,011个碱基对的D-乳酸脱氢酶基因的DNA序列(序列编号10)。

参考例11  D-乳酸脱氢酶基因表达载体的制备

从左乳酸芽孢杆菌中克隆D-LDH基因。D-LDH基因均用PCR法进行克隆，用同样的方法导入于表达载体。克隆方法如下所示。

培养左乳酸芽孢杆菌，离心回收后，用UltraClean Microbial DNAIsolation Kit(MO BIO社制)提取基因组DNA。详细的操作方法按照附带的规程进行。获得的基因组DNA继续作为PCR的模板。以上述获得的DNA作为模板，分别通过PCR进行D-LDH基因的克隆。PCR扩增反应中，使用了具有Taq的50倍正确性的KOD-Plus-聚合酶(东洋纺社制)。反应缓冲液和dNTP混合物等使用了附带的。D-LDH基因扩增用引物(序列编号11、12)制备成在5末端侧添加XhoI识别序列，在3末端侧添加NotI识别序列。

纯化各PCR扩增片段，通过T4多核苷酸激酶(TAKARA社制)磷酸化末端后，连接到pUC118载体(用限制性酶HincII切割，对切割面进行脱磷酸化处理而获得)中。用DNA Ligation Kit Ver.2(TAKARA社制)进行连接。转化大肠杆菌DH5α，通过回收质粒DNA，获得亚克隆了D-LDH基因的质粒。用限制性酶XhoI和NotI切割插入了各D-LDH基因的pUC118载体，在酵母表达用载体pTRS11(图5)的XhoI/NotI切割部位导入获得的各DNA片段。这样制备的D-LDH基因表达载体表示为pTM63。

参考例12  D-LDH基因表达载体向酵母的导入

用按参考例11的方式获得的pTM63转化酵母中的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NBRC10505株。转化通过使用YEASTMAKERYeast Transformation System(CLONTECH社制)的醋酸锂法进行。详细步骤按附带的规程进行。作为宿主的酿酒酵母NBRC10505株是缺失尿嘧啶合成能力的菌株，通过pTM63具有的URA3基因的作用，在不添加尿嘧啶的培养基上可以选择导入了pTM63的转化体。

D-LDH基因表达载体向这样获得的转化体的导入的确认通过以下方式进行，即从在不添加尿嘧啶的液体培养基上培养的转化株中，用基因组DNA提取试剂盒Dr.GenPrecipitation Carrier(TAKARA社制)提取含有质粒DNA的基因组DNA，以其作为模板，用PreMix Taq(TAKARA社制)进行PCR。作为引物，使用克隆D-LDH基因时使用的引物。其结果是，确认了在所有转化体中，导入了D-LDH基因。

以下将导入了pTM63的酿酒酵母NBRC10505株表示为NBRC 10505/pTM63株。

实施例31  通过连续发酵进行D-乳酸的制备(其中之1)

使用图1中所示的连续发酵装置和表25中所示的组成的D-乳酸生产培养基，进行D-乳酸的制备。培养基经高压蒸气灭菌(121℃、15分钟)后再使用。使用不锈钢和聚砜树脂的成形品作为分离膜元件构件。使用参考例2中制备的多孔性膜作为分离膜。本实施例中的运转条件，只要没有特别预先通知，如下所示。

发酵反应槽容量：2.0(L)

使用分离膜：PVDF过滤膜

膜分离元件有效过滤面积：120cm²

温度调整：30(℃)

发酵反应槽通气量：0.2(L/分钟)空气

发酵反应槽搅拌速度：800(转/分钟)

pH调整：用5N NaOH调整成pH5.0

灭菌：含有分离膜元件的培养槽和使用培养基均用121℃、20分钟的高压灭菌釜进行高压蒸气灭菌

膜渗透水量控制：通过膜间差压进行流量控制

(连续发酵开始后～100小时：控制在0.1kPa以上5kPa以下

100～200以上小时：控制在2kPa以下

200～320小时：控制在0.1kPa以上20kPa以下)。

作为微生物，使用NBRC10505/pTM63株，作为培养基，使用表25中所示的组成的D-乳酸生产培养基，生产物即D-乳酸的浓度的评价与参考例1同样用HPLC法测定。而且，在葡萄糖浓度的测定中，使用Glucose-Test Wako C(和光纯药社制)。

【表25】

酵母乳酸发酵培养基

                                                 

葡萄糖                            100g

酵母氮源-无氨基酸(Difco公司)      6.7g

去除亮氨酸的19种标准氨基酸        152mg

亮氨酸                            760mg

肌醇            152mg

对氨基苯甲酸    16mg

腺嘌呤          40mg

                单位(升)

                                        

首先，在试管中用5ml的D-乳酸生产培养基振荡培养NBRC10505/pTM63株过夜(预先培养)。将获得的培养液接种于50ml新鲜的D-乳酸生产培养基中，在容量为500ml的坂口摇瓶中于30℃的温度振荡培养24小时(预先培养)。将预先培养液接种于图1中所示的连续发酵装置的2.0L的D-乳酸生产培养基中，用附带的搅拌机5以800转/分钟搅拌发酵反应槽1，进行发酵反应槽1的通气量的调整、温度调整、pH调整，进行24小时培养(前培养)。

前培养结束后，立即使发酵液循环泵10运作，除了前培养时的运转条件之外，对膜分离槽2通气，进行D-乳酸生产培养基的连续供给，一边进行膜渗透水量的控制使得连续发酵装置的发酵液量达到2L，一边进行连续培养、通过连续发酵进行尸胺的制备。进行连续发酵试验时的膜渗透水量的控制，通过用水头差控制装置3测定水头差作为膜间差压，在上述膜渗透水量控制条件下使之变化来进行。适当地，测定膜透过发酵液中所生产的乳酸浓度和残存葡萄糖浓度。进行了320小时的连续发酵试验的结果示于表26中。

通过使用膜分离型连续发酵装置的本发明的化学品的制备方法，可以通过连续发酵稳定地制备D-乳酸。连续发酵期间的膜间差压以2kPa以下进行变化。

实施例32  通过连续发酵进行D-乳酸的制备(其中之2)

使用图2中所示的发酵装置和表25中所示的组成的D-乳酸生产培养基，进行D-乳酸的制备。培养基在高压蒸气灭菌(121℃、15分钟)后再使用。使用不锈钢和聚砜树脂的成形品作为分离膜元件构件。使用参考例2中制备的多孔性膜作为分离膜。本实施例中的运转条件，只要没有特别预先通知，如下所示。

发酵反应槽容量：1.5(L)

使用分离膜：聚偏1，1-二氟乙烯过滤膜

膜分离元件有效过滤面积：120cm²

温度调整：30(℃)

发酵反应槽通气量：0.2(L/分钟)空气

发酵反应槽搅拌速度：800(转/分钟)

pH调整：用5N NaOH调整成pH5.0

灭菌：含有分离膜元件的培养槽和使用培养基均用121℃、20分钟的高压灭菌釜进行高压蒸气灭菌

膜渗透水量控制：通过膜间差压进行流量控制。

(连续发酵开始后～90小时：控制在0.1kPa以上5kPa以下

90～180小时：控制在0.1kPa以上2kPa以下

180～264小时：控制在0.1kPa以上20kPa以下)。

作为微生物，使用NBRC10505/pTM63株，作为培养基，使用表25中所示的组成的D-乳酸生产培养基，生产物即D-乳酸的浓度的评价用与参考例1同样的HPLC法测定。而且，在葡萄糖浓度的测定中使用Glucose-Test Wako C(和光纯药社制)。

首先，在试管中用5ml的D-乳酸生产培养基振荡培养NBRC10505/pTM63株过夜(预先培养)。将获得的培养液接种于50ml新鲜的D-乳酸生产培养基中，在容量为500ml的坂口摇瓶中于30℃的温度振荡培养24小时(预先培养)。

将预先培养液接种于图2中所示的连续发酵装置的1.5L的D-乳酸生产培养基中，用附带的搅拌机5以800转/分钟搅拌发酵反应槽1，进行发酵反应槽1通气量的调整、温度调整和pH调整，进行24小时培养(前培养)。前培养结束后，立即进行D-乳酸生产培养基的连续供给，一边进行膜渗透水量的控制使得连续发酵装置的发酵液量达到1.5L，一边进行连续培养，通过连续发酵进行D-乳酸的制备。进行连续发酵试验时的膜渗透水量的控制，通过用水头差控制装置3测定水头差作为膜间差压，在上述膜渗透水量控制条件下使之变化来进行。适当地，测定膜透过发酵液中所生产的D-乳酸浓度和残存葡萄糖浓度。而且，由该D-乳酸和投入葡萄糖计算出的D-乳酸生产速度示于表26中。

进行了264个小时的发酵试验的结果是，通过使用图2中所示的连续发酵装置的本发明的化学品的制备方法，可以通过连续发酵稳定地制备D-乳酸。连续发酵所有期间中的膜间差压以2kPa以下进行变化。

比较例16  通过分批发酵进行的D-乳酸的制备

作为使用微生物的发酵方案，使用容量为2L的小型发酵罐进行最典型的分批发酵，评价其D-乳酸生产性。培养基经高压蒸气灭菌(121℃、15分钟)后再使用。本比较例中，作为微生物，使用NBRC10505/pTM63株，生产物即D-乳酸的浓度的评价用HPLC进行，在葡萄糖浓度的测定中使用Glucose-Test Wako C(和光纯药社制)。本比较例的运转条件如下所述。

发酵反应槽容量(D-乳酸生产培养基量)：1.0(L)

温度调整：30(℃)

发酵反应槽通气量：0.2(L/分钟)空气

发酵反应槽搅拌速度：300(转/分钟)

pH调整：用5N NaOH调整成pH5.0。

首先，在试管中用5ml的D-乳酸生产培养基振荡培养NBRC10505/pTM63株过夜(预先培养)。将预先培养液接种于50ml新鲜的D-乳酸生产培养基中，在容量为500ml的坂口摇瓶中于30℃振荡培养24小时(前培养)。将前培养液接种于小型发酵罐的1.5L的D-乳酸生产培养基中。使用D-乳酸生产培养基，进行分批发酵。其结果示于表26中。

【表26】

	比较例16	实施例31	实施例32
				发酵时间(小时)	75	320	268
投入葡萄糖(g)	100	2790	2340
				产生的D-乳酸(g)	18.8	533	442

未利用的葡萄糖(g)	0	55	50
				D-乳酸收率(g/g)	18.8	19.5	19.3
D-乳酸生产速度(g/升/小时)	0.25	0.93	1.10

可以明确通过使用图1和图2中所示的发酵装置的本发明的化学品的制备方法，D-乳酸的生产速度大幅上升。

参考例13  多孔性膜的制作(其中之5)

重量平均分子量为41.7万的1，1-二氟乙烯均聚物和γ-丁内酯，按照依次为38重量％和62重量％的比例在170℃的温度溶解，制备原液。一边搅拌γ-丁内酯作为中空部形成液体，一边金属嘴吐出原液，温度为20℃的γ-丁内酯80重量％水溶液所构成的冷却浴中固化，制备中空纤维膜。

然后，按14重量％的重量平均分子量为28.4万的1，1-二氟乙烯均聚物，1重量％的乙酸丙酸纤维素(EASTMAN CHEMICAL公司、CAP482-0.5)，77重量％的N-甲基-2-吡咯烷酮，5重量％的失水山梨醇聚氧乙烯醚椰油脂肪酸酯(三洋化成株式会社、商品名IONET T-20C)，3重量％的水的比例于95℃的温度混合溶解，从而制备原液。将该原液均匀涂布于中空纤维膜表面，立即使之在水浴中凝固，制备中空纤维膜。获得的中空纤维膜的被处理水侧表面的平均孔径为0.05μm。接着，对于上述分离膜，评价纯水透水量，结果为5.5×10^-9m³/m²·s·Pa。透水量的测定，通过反渗透膜使用25℃的纯化水，在头高度为1m处进行。而且，平均细孔径的标准偏差为0.006μm。

实施例33  通过使用中空纤维膜的连续发酵进行L-乳酸的制备(其中之1)

作为分离膜，使用参考例13制备的多孔性膜制备的有效过滤面积为120cm²的图4中所示的分离膜元件，进行与实施例1同样的L-乳酸连续发酵试验。其结果与比较例1的结果一起示于表27中。可以通过连续发酵稳定地制备L-乳酸。连续发酵所有期间中的膜间差压以2kPa以下进行变化。

实施例34  通过使用中空纤维膜的连续发酵进行L-乳酸的制备(其中之2)

作为分离膜，使用参考例13制备的多孔性膜制备的有效过滤面积为120cm²的图4中所示的分离膜元件，进行与实施例4同样的L-乳酸连续发酵试验。其结果与比较例1的结果一起示于表27中。可以确认可以通过连续发酵稳定地制备L-乳酸。连续发酵所有期间中的膜间差压以2kPa以下进行变化。

【表27】

	比较例1	实施例33	实施例34
				发酵时间(小时)	72	300	300
总的投入葡萄糖(g)	100	3210	2600
				总的生产L-乳酸(g)	26	1980	1570
未利用的葡萄糖(g)	0	70	60
				L-乳酸对糖收率(g/g)	0.26	0.63	0.62
L-乳酸生产速度(g/升/小时)	0.36	3.3	3.5

工业上利用的可能性

本发明是一种操作简便，长时间稳定，维持高生产性的通过连续发酵法制备化学品的方法。通过本发明，就可以在简便的操作条件下，长时间稳定且维持高生产性地连续发酵，在广大的发酵工业中，可以以低成本稳定地生产作为发酵生产物的化学品。

序列表

<110>东丽株式会社

<120>化学品的制备方法和连续发酵装置

<130>06082

<160>12

<170>PatentIn版本3.1

<210>1

<211>26

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>1

ctcgagatgg caactctaaa ggatca                                        26

<210>2

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>2

gcggccgctt aaaattgcag ctcctttt                                       28

<210>3

<211>999

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>3

atggcaactc taaaggatca gctgatttat aatcttctaa aggaagaaca gaccccccag    60

aataagatta cagttgttgg ggttggtgct gttggcatgg cctgtgccat cagtatctta    120

atgaaggact tggcagatga acttgctctt gttgatgtca tcgaagacaa attgaaggga    180

gagatgatgg atctccaaca tggcagcctt ttccttagaa caccaaagat tgtctctggc    240

aaagactata atgtaactgc aaactccaag ctggtcatta tcacggctgg ggcacgtcag    300

caagagggag aaagccgtct taatttggtc cagcgtaacg tgaacatatt taaattcatc    360

attcctaatg ttgtaaaata cagcccgaac tgcaagttgc ttattgtttc aaatccagtg    420

gatatcttga cctacgtggc ttggaagata agtggttttc ccaaaaaccg tgttattgga    480

agtggttgca atctggattc agcccgattc cgttacctga tgggggaaag gctgggagtt    540

cacccattaa gctgtcatgg gtgggtcctt ggggaacatg gagattccag tgtgcctgta    600

tggagtggaa tgaatgttgc tggtgtctct ctgaagactc tgcacccaga tttagggact    660

gataaagata aggaacagtg gaaagaggtt cacaagcagg tggttgagag tgcttatgag    720

gtgatcaaac tcaaaggcta cacatcctgg gctattggac tctctgtagc agatttggca    780

gagagtataa tgaagaatct taggcgggtg cacccagttt ccaccatgat taagggtctt    840

tacggaataa aggatgatgt cttccttagt gttccttgca ttttgggaca gaatggaatc    900

tcagaccttg tgaaggtgac tctgacttct gaggaagagg cccgtttgaa gaagagtgca    960

gatacacttt gggggatcca aaaggagctg caattttaa                           999

<210>4

<211>80

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>4

tctcaattat tattttctac tcataacctc acgcaaaata acacagtcaa atcaatcaaa    60

atggcaactc taaaggatca                                                80

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>5

aggcgtatca cgaggccctt                                                20

<210>6

<211>60

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>6

gaattaattc ttgaagacga aagggcctcg tgatacgcct agattgtact gagagtgcac    60

<210>7

<211>80

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>7

tatttttcgt tacataaaaa tgcttataaa actttaacta ataattagag attaaatcgc    60

ctgtgcggta tttcacaccg                                                80

<210>8

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>8

caaatatcgt ttgaatattt ttccg                                          25

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>9

aatccagatt gcaaccactt                                                20

<210>10

<211>1011

<212>DNA

<213>Bacillus laevolacticus

<400>10

atgaaattct tgatgtatgg agtacaagat catgagagag caacgatcga gaattgggca    60

aatcaacatc aggtggagat cgcaacaacc tcagatttcc tctcagaaga tacagtcgct    120

caatcgaaag gctttgacgg tatctgcatt caacagccga ttgcactcgg aggcccgaat    180

ttatacactc aattaaaaaa caacggtatc aaacagattg ctacacgaac agccggttac    240

gacatgattg atttgaacga agccgagaaa aacagtttgt tggtgaccaa tgttccagca    300

tactcccctt acgcagtcgc cgagctcgcg gtcactcagg cgatgcagct cgtccgccat    360

attcctgaat tcaataaacg tgttgcaggc aaagattttc gctggtcagg ccttatttcc    420

agagaaatcc gatcattaac ggtcggcata gtcggcaccg gccgcatcgg tgcaacggcc    480

gcacagctct tcaaaggact aggggcaaaa atcattggtt ttgatcaata tcccaacgat    540

cggctaaacg gtatccttga ctatcggcct tcacttgaag acgtgcttaa ggaagctgat    600

atcatttctc ttcacacgcc gctttttgat tcgactcggc acatgatcaa taaaagcaca    660

ttaaaactga tgaaaaatag tgcctatcta atcaatgttg ccagaggcgg cttaattaaa    720

actgaagatc tgattgaagc acttgaaaac ggcgaaattg ccggtgcagc gttagatacc    780

tttgaaaatg aactcatgat taataaagat ctgagtaagc agccgctcaa tgatccgctt    840

ctttcgaaac ttctcgatat ggaacaagtg ctgctcacac cgcatgtcgg cttctttact    900

gagaccgcca ttcaaaacat tgttgaaggt gccttagaca gtgttgtcga ggttttgaag    960

acaggaacaa gcaaaaatct tgttcaagca caaccgctat cggcaaaata a             1011

<210>11

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>11

ctcgagatga aattcttgat gtatggagta                30

<210>12

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>12

gcggccgctt attttgccga tagcggttgt                30

Claims (26)

1.化学品的制备方法，该方法在用分离膜过滤微生物或培养细胞的培养液，从滤液中回收生产物，再将未滤过液保持于或回流到培养液中，并且向培养液中追加发酵原料的连续发酵中，使用平均细孔径为0.01μm以上至不到1μm的多孔性膜作为分离膜，在膜间差压为0.1至20kPa的范围内进行过滤处理。

2.根据权利要求1所述的化学品的制备方法，其中所述多孔性膜的纯水渗透系数为2×10^-9m³/m²/s/pa以上6×10^-7m³/m²/s/pa以下。

3.根据权利要求1所述的化学品的制备方法，其中所述多孔性膜的平均细孔径为0.01μm以上至不到0.2μm，且多孔性膜的细孔径的标准偏差在0.1μm以下。

4.根据权利要求1所述的化学品的制备方法，其中所述多孔性膜的膜表面粗糙度在0.1μm以下。

5.根据权利要求1所述的化学品的制备方法，其中所述多孔性膜为含有多孔质树脂层的多孔性膜。

6.根据权利要求5所述的化学品的制备方法，其中所述多孔质树脂层为包含有机高分子的多孔质树脂层。

7.根据权利要求5所述的化学品的制备方法，其中所述有机高分子膜的材质为聚偏1，1-二氟乙烯。

8.根据权利要求1所述的化学品的制备方法，其中所述微生物或培养细胞的培养液和发酵原料包含糖类。

9.根据权利要求1所述的化学品的制备方法，其中所述化学品是有机酸。

10.根据权利要求1所述的化学品的制备方法，其中所述化学品是L-乳酸。

11、根据权利要求1所述的化学品的制备方法，其中所述化学品是D-乳酸。

12、根据权利要求1所述的化学品的制备方法，其中所述化学品是丙酮酸。

13、根据权利要求1所述的化学品的制备方法，其中所述化学品是琥珀酸。

14、根据权利要求1所述的化学品的制备方法，其中所述化学品是衣康酸。

15、根据权利要求1所述的化学品的制备方法，其中所述化学品是尸胺。

16、根据权利要求1所述的化学品的制备方法，其中所述化学品是醇。

17、根据权利要求1所述的化学品的制备方法，其中所述化学品是乙醇。

18、根据权利要求1所述的化学品的制备方法，其中所述化学品是1，3-丙二醇。

19、根据权利要求1所述的化学品的制备方法，其中所述化学品是核酸。

20、根据权利要求1所述的化学品的制备方法，其中所述化学品是次黄苷。

21、根据权利要求1所述的化学品的制备方法，其中所述化学品是氨基酸。

22、根据权利要求1所述的化学品的制备方法，其中所述化学品是L-苏氨酸。

23、连续发酵装置，该装置是通过用分离膜过滤微生物或培养细胞的发酵培养液、从滤液中回收生产物的同时将未滤过液保持于或回流到所述的发酵培养液中、且向所述的发酵培养液中追加发酵原料的连续发酵的化学品的制备装置，其包含以下部件：用于发酵培养微生物或培养细胞的发酵反应槽、通过发酵培养液循环部件与该发酵反应槽连接的内部设有分离膜的用于过滤发酵培养液的膜分离槽、和将分离膜的膜间差压控制在0.1至20kPa范围内的部件，其中该分离膜为平均细孔径在0.01μm以上至不到1μm的多孔性膜。

24、连续发酵装置，该装置是通过用分离膜过滤微生物或培养细胞的发酵培养液、从滤液中回收生产物的同时将未滤过液保持于或回流到所述的发酵培养液中、且向所述的发酵培养液中追加发酵原料的连续发酵的化学品的制备装置，其包含以下部件：用于发酵微生物或培养细胞的发酵反应槽、具备配设于该发酵反应槽内部的分离膜的用于过滤发酵培养液的分离膜元件、和与该分离膜元件连接的用于排出滤过的发酵生产物的部件、和用于将该分离膜的膜间差压控制在0.1至20kPa的范围的部件，其中所述该分离膜为具有平均细孔径在0.01μm以上至不到1μm的细孔的多孔性膜。

25、权利要求23或24所述的连续发酵装置，其中所述多孔性膜的纯水渗透系数在2×10^-9m³/m²/s/pa以上6×10^-7m³/m²/s/pa以下。

26、权利要求23或24所述的连续发酵装置，其中所述多孔性膜的平均细孔径在0.01μm以上至不到0.2μm，且多孔性膜的细孔径的标准偏差为0.1μm以下。

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