CN102171349A - 化学品的制造方法和连续培养装置 - Google Patents

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Abstract

化学品的制造方法，其为了以不影响培养槽内的培养条件的方式控制膜分离槽内的培养液流速，而且为了抑制微生物或培养细胞的沉淀，提高化学品的生产效率，培养培养槽中的微生物或培养细胞，将培养液从培养槽输送到膜分离槽，通过分离膜过滤，从透过液中回收作为化学品的发酵生产物，同时使未经过滤的未过滤培养液以与膜分离槽上游侧的培养液汇合的方式回流，在该方法中由培养槽送液的培养液的一部分根据膜分离槽的培养液流入侧压力，绕过膜分离槽。

Description

化学品的制造方法和连续培养装置
技术领域
本发明涉及通过微生物或培养细胞的培养制造化学品的方法。更详细的是涉及可以以高生产性制造所期望的化学品的化学品的制造方法以及培养装置，该制造方法通过一边进行培养，一边用分离膜从微生物或培养细胞的培养液中有效过滤含有培养所生产的发酵生产物(化学品)的液体，然后回收发酵生产物。
背景技术
伴随微生物或培养细胞的培养的物质生产方法，可以大致分为(1)分批培养法(Batch培养法)和补料分批培养法(Fed-Batch培养法)，以及(2)连续培养法。
上述(1)的分批培养法和补料分批培养法的设备简单、培养在短时间内结束，因此具有杂菌污染导致的损害少的优点，一直以来就作为使用微生物或培养细胞的物质生产方法来使用。但是，这些方法，由于随时间经过，培养液中的发酵生产物浓度变高，渗透压上升或生产物自身引起的发酵受到抑制等原因导致生产性和收率降低。因此，采用这些培养方法，难以长时间稳定地维持发酵生产物高生产性和高收率。
另一方面，上述(2)的连续培养法由于避免了培养槽内发酵生产物高浓度蓄积，因此具有能够长时间维持高收率和高生产性这样的特征。
例如，对于L-谷氨酸(参照专利文献1)和L-赖氨酸(参照非专利文献1)的发酵，公开了连续培养法。然而，这些例子中，尽管向培养液进行了营养素等原料的连续供给，然而由于取出含有微生物或培养细胞的培养液而稀释了培养液中的微生物或培养细胞，因此限制了生产效率的提高。
因此，提出了以下方法，即在连续培养法中，用分离膜过滤微生物或培养细胞，从透过液中回收发酵生产物，同时使被过滤的微生物或培养细胞保持在或回流到培养槽内，将培养液中的微生物和细胞维持在高浓度。
例如，提出了通过利用分离膜的连续培养装置，进行连续培养的技术(参照专利文献2)。本提案中，通过使用具有用于培养微生物或培养细胞的槽，和用于从培养液中对目的发酵生产物与微生物、培养细胞进行膜分离的槽的连续培养装置，可以以比分批培养法、补料分批培养法更高的生产速度生产各种化学品。
这里，在使用分离膜的连续培养装置中，由于使膜分离槽内的培养液流速提高不容易引起膜的堵塞，因此人们认为可以使分离膜透过液量增加来进一步提高生产速度。但是，在专利文献2中，由于无法单独控制由培养槽送出的送液量和向膜分离槽的流量，因此供给到膜分离槽的培养液的流量依赖于由培养槽送液的培养液的流量。因此，为了使膜分离槽内的培养液流速发生变化，就必须使由培养槽送出的送液量发生变化，结果，培养槽中的液体混合状态会变化，培养条件发生大变化。此外，随时间经过，膜发生堵塞，微生物或培养细胞的浓度上升等原因导致膜分离槽内压力上升时，为了使膜分离自身最适化，优选降低供给到膜分离槽的培养液的流量。但是，一旦使供给到膜分离槽的培养液的流量发生变化，则培养槽中的培养条件就会发生大的变化。因此，不能简单地使供给到膜分离槽的培养液的流量发生变化。此外，要是为了最适当地控制膜分离槽内的压力而减少由培养槽送出的培养液量，就会发生送液管内的培养液流速降低，微生物或培养细胞沉淀在送液管配管内，生产效率降低这样的问题。另一方面，如果膜分离槽内的压力过高，就会有由膜分离槽中向外移动的培养液中的微生物由于压力变动而被破坏这样的担心。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：特开平10-150996号公报
专利文献2：国际公开第07/097260号小册子
非专利文献
非专利文献1：Toshihiko Hirao等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.，32，269-273(1989)
发明内容
发明要解决的问题
本发明鉴于这样的状况，提供化学品的制造方法以及能够适于这种方法的培养装置，这种制造方法能够不影响培养槽内的培养条件地控制膜分离槽内的培养液流速，而且还可以抑制微生物或培养细胞的沉淀，提高化学品的生产效率。
用于解决问题的手段
本发明人以利用分离膜的连续培养装置中的生产速度的提高以及发酵培养的稳定化为目的，进行了积极的研究，结果发现，通过以下的(1)～(14)任一项的构成，能够一边控制膜分离槽内的培养液流速，一边保持培养槽内的培养条件(培养液的滞留时间等)，可以进行化学品的有效制造，从而完成本发明。
(1)使由培养槽送液的培养液的一部分，根据膜分离槽的培养液流入侧压力，绕过膜分离槽的化学品的制造方法，该方法是在培养槽中培养微生物或培养细胞，由培养槽向膜分离槽输送培养液，再用分离膜过滤，从透过液中回收作为化学品的发酵生产物，同时使未经过滤的未过滤培养液以与膜分离槽上游侧的培养液汇合的方式回流。
(2)前述(1)中所述的化学品的制造方法，其以膜分离槽的培养液流入侧的计示压力为1MPa以下那样，控制绕过膜分离槽的培养液的流量。
(3)前述(1)或(2)所述的化学品的制造方法，其使未过滤培养液的一部分以与培养槽内的培养液汇合的方式回流，同时使未过滤培养液的其余部分以与培养槽至膜分离槽之间的培养液汇合的方式回流。
(4)前述(3)所述的化学品的制造方法，其相互独立地控制以与培养槽至膜分离槽之间的培养液汇合方式回流的未过滤培养液的流量，和以与培养槽内的培养液汇合方式回流的未过滤培养液的流量。
(5)前述(3)或(4)中所述的化学品的制造方法，以与培养槽内的培养液汇合方式回流的未过滤培养液的流量相对于以与培养槽至膜分离槽之间的培养液汇合方式回流的未过滤培养液的流量之比在1以下。
(6)前述(1)～(5)任一项所述的化学品的制造方法，由培养槽向膜分离槽输送的培养液的线流速、以由膜分离槽向该膜分离槽上游侧的培养液汇合的方式回流的未过滤培养液的线流速、以及绕过膜分离槽的培养液的线流速都在2.5cm/秒以上。
(7)前述(1)～(6)任一项所述的化学品的制造方法，调节流入膜分离槽的培养液量和/或自分离膜的透过液量，以便自分离膜的透过液量相对于流入膜分离槽的培养液量的回收率为10.0％以下。
(8)前述(1)～(7)任一项所述的化学品的制造方法，培养槽中培养液体积与膜分离槽中培养液体积之比为4以上100以下。
(9)具备膜分离槽的旁通管、膜分离槽的培养液流入侧压力的检测装置、和设置在旁通管的流量控制装置的连续培养装置，该连续培养装置具备用于培养微生物或培养细胞的培养槽，具备用于回收来自培养槽的培养液中生产的发酵生产物的分离膜的膜分离槽，连接培养槽与膜分离槽并在将培养液输送到前述膜分离槽的同时使未经分离膜过滤的未过滤培养液以与膜分离槽上游侧的培养液汇合的方式回流的循环管，和设置在循环管的培养液送液装置。
(10)前述(9)中所述的连续培养装置，所述流量控制装置是由检测装置的结果联动而运转的。
(11)前述(9)或(10)中所述的连续培养装置，其具备循环管的线流速检测装置，流量控制装置和/或前述培养液送液装置是根据该线流速检测装置的结果而运转的。
(12)前述(9)～(11)任一项所述的连续培养装置，所述膜分离槽安装在具有与前述培养液送液装置不同的送液装置、且与培养槽独立的循环回路内。
(13)前述(9)～(12)任一项所述的连续培养装置，循环管在浸渍于培养槽中存留的培养液中的位置开口。
(14)前述(9)～(13)任一项所述的连续培养装置，培养槽体积与膜分离槽体积之比在4以上100以下。
发明效果
根据本发明，可以使由培养槽送液的培养液的一部分根据膜分离槽的培养液流入侧压力，绕过膜分离槽，也就是说，可以独立控制向膜分离槽供给的培养液的流量，和由培养槽送出的培养液的流量。其结果是，可以不改变培养条件地适当改变膜分离槽内的培养液流速，而不容易引起膜的堵塞，可以增加分离膜透过液量，从而提高生产速度。此外，如果，随时间经过发生膜的堵塞，微生物或培养细胞的浓度上升，则膜分离槽内的压力上升，培养槽中的培养条件也基本不发生变化，在将培养液输送到膜分离槽的同时回流未经分离膜过滤的未过滤培养液回流的循环管中，可以一边维持微生物或培养细胞难以沉淀的流速，一边控制供给到膜分离槽的培养液的流量，以及在膜分离槽内作用的压力，其结果是可以防止膜分离槽的破损，防止培养液中的微生物或培养细胞的压力变化导致的破坏。而且，在膜分离槽内产生麻烦时，可以一边继续培养，一边完全停止培养液向膜分离槽的供给，修正膜分离槽内的麻烦，进行膜分离槽的交换或转换。
此外，本发明中，通过一边使由培养槽送液的培养液的一部分根据膜分离槽的培养液流入侧的压力绕开膜分离槽，一边将该膜分离槽中透过液的回收率控制在10％以下，可以进一步防止膜的堵塞，可以长期进行连续培养。
如上所述，按照本发明，可以同时提高连续培养产生的发酵生产物(也就是说所期望的化学品)的生产效率和对糖收率，而且通过将膜分离槽中的回收率控制在10％以下，还可以长期进行连续培养。
附图的简要说明
[图1]是用于说明本发明中的连续培养装置的一个实施方案的概要模式图。
[图2]是用于说明本发明中的连续培养装置的其它实施方案的概要模式图。
[图3]是用于说明本发明中使用的分离膜元件的一个实施方案的概要展开图。
[图4]是用于说明本发明中使用的分离膜元件的其它实施方案的概要斜视图。
[图5]是表示参考例中使用的酵母用表达载体pTRS11的物理图谱的图。
[图6]实施例2中获得的循环管内的培养液线流速和沉淀在该管内的菌体累积量的图。
[图7]是用于说明本发明中的连续培养装置的另外的实施方案的概要模式图。
[图8]是用于说明本发明中的连续培养装置的另外的实施方案的概要模式图。
[图9]是用于说明比较例中使用的连续培养装置的方案的概要模式图。
[图10]是表示实施例1中获得的乳酸浓度、酵母浊度的图。
[图11]是表示比较例1中获得的乳酸浓度、酵母浊度的图。
[图12]是表示比较例1中获得的膜分离槽的培养液流入侧的压力的图。
[图13]是用于说明比较例中使用的连续培养装置的方案的概要模式图。
[图14]是用于说明本发明中的连续培养装置的其它实施方案的概要模式图。
[图15]是用于说明比较例中使用的连续培养装置的方案的概要模式图。
[图16]是用于说明本发明中的连续培养装置的其它实施方案的概要模式图。
[图17]是表示实施例6～9中获得的膜间差压的推移的图。
[图18]是表示实施例10中获得的尸胺浓度、棒杆菌浊度的图。
[图19]是表示比较例5中获得的尸胺浓度、棒杆菌浊度的图。
[图20]是表示比较例5中获得的膜分离槽的培养液流入侧的压力的图。
[图21]是表示实施例11中获得的L-赖氨酸浓度、棒杆菌浊度的图。
[图22]是表示比较例6中获得的L-赖氨酸浓度、棒杆菌浊度的图。
[图23]是表示比较例6中获得的膜分离槽的培养液流入侧的压力的图。
用于实施发明的最佳方式
本发明的方法是化学品的制造方法，其在培养槽中培养微生物或培养细胞，将培养液由培养槽连续输送到膜分离槽，用分离膜过滤，从透过液中回收作为化学品的发酵生产物，同时使未经过滤的未过滤培养液回流使之与膜分离槽的上游侧的培养液汇合，此时由培养槽送液的培养液的一部分，根据膜分离槽的培养液流入侧压力，绕开膜分离槽。
这样的本发明在例如图1所示的培养装置进行。图1是本发明的一个实施方案中的这种培养装置的概要模式图。
图1中所示的培养装置由进行微生物或培养细胞的培养的培养槽1，和具备用于过滤培养液的分离膜3的膜分离槽2构成。膜分离槽2设置在培养反应槽的外部，通过送液管17和送液管15(循环管)与培养槽1连接。
培养槽1具有能够连续培养微生物或培养细胞的功能，只要可以连接循环管，其可以是任意结构，可以使用以往一直用于培养微生物或培养细胞的罐式发酵器等。
培养槽1按如下方式构成，其与培养基供给泵6连接，并配备搅拌机7，通过培养基供给泵6将培养基投入到培养槽1中，根据需要，可以用搅拌机7搅拌培养槽1内的培养液。并且，还连接气体供给装置8，根据需要，通过该气体供给装置8供给需要的气体。此时，还优选例如，在培养槽1的液面上空间(headspace)与气体供给装置8之间连接配管，按液面上空间、配管、气体供给装置8的顺序流动供给气体，从而能够回收和再循环供给的气体，再由气体供给装置8进行供给。
此外，在培养槽1中根据需要设置pH传感器·控制装置9和pH调节液供给泵10，以便能够调节培养液的pH。当然，为了通过培养时提供酸和碱两方来控制培养液的pH，优选有多个pH调节液供给泵。而且，根据需要，还设置温度调节器11以便能够调节培养液温度从而进行高生产性的化学品的生产。而且，作为通过仪器检测和控制装置进行的培养液的物理化学条件的调节，例示了pH和温度的调节，但根据需要，还可以进行溶解氧和ORP的控制，而且还可以再用在线化学传感器等分析装置测定培养液中的微生物浓度，控制以其作为指标的物理化学条件。而且，以上述仪器检测和控制装置获得的培养液的物理化学环境的测定值作为指标，可以适当调节培养基投入量和速度。
在膜分离槽2内部可以设置分离膜3，膜分离槽2与培养槽1同样，只要可以连接循环管，其形状等不限。分离膜3如果可以从微生物或培养细胞的培养液中只别滤过微生物或培养细胞，无论是无机还是有机材料的分离膜都可以，但优选具有适于被处理液的性状和用途的分离性能和透过性能的后述的多孔性膜，而且优选能耐灭菌操作(例如在120℃30分钟)的膜。而且，泵4与分离膜3连接，以便在该分离膜的原液侧和透过侧之间能够产生膜间差压。
而且，优选，膜分离槽2和培养槽1具有培养槽中的培养液与膜分离槽中的培养液的培养液容积比达到4以上100以下。也就是说，优选地，被设计成，在膜分离槽2和培养槽1各槽中，一般添加贮留它们容积的约80％的培养液，培养槽体积与膜分离槽体积之比达到4以上100以下。通过这种结构，可以在实现装置的紧凑化的同时，延长培养液的培养槽滞留时间，实现适当的培养条件，并且可以减少动力费用，提高化学品的生产速度，以及实现容易的装置运转管理。
在循环管(送液管17和送液管15)中，设置由膜分离槽2的培养液流入侧，绕过膜分离槽，与膜分离槽的培养液流出侧连接的旁通管26，这种结构使得能够由培养槽1输送的培养液的一部分不供给到膜分离槽2，使之绕过该膜分离槽2，而与送液管15的未过滤培养液汇合。另外，在本实施方案中，旁通管26的一端与送液管17连接，另一端与送液管15连接，但旁通管26也可以从膜分离槽2的培养液流入侧出发，绕过膜分离槽2，与培养槽1或与培养槽1和膜分离槽2的培养液流入侧之间连接。也就是说，为了绕过膜分离层2的这一部分的培养液直接回流到培养槽1，也可以将旁通管26的一端(上游侧)与送液管17连接，另一端(下游侧)与培养槽1连接。此外，还可以将旁通管26的两端与送液管17连接，以便绕过膜分离层2的该部分培养液直接与培养槽1供给的送液管17中的培养液汇合。
在膜分离槽2的旁通管26内具有流量控制装置25。通过这种流量控制装置，可以控制向膜分离槽2供给的培养液流量。该流量控制装置可以是阀，也可以是泵，但从成本方面考虑优选阀。当选择阀作为前述流量控制装置时，通过开阀可以减少流向膜分离槽2的培养液量。此外，相反，通过闭阀，可以使所有流过送液管17的培养液流向膜分离槽2。尽管阀的结构不限，但由于在蒸汽灭菌时，培养液等在结构上残留少，因此优选使用隔膜阀(diaphragm valve)、蝶阀。此外，在选择泵作为流量控制装置25时，通过按培养液与流向膜分离槽2的培养液同方向流动那样送液，增多泵送液量，可以减少流向膜分离槽2的培养液量，相反，通过停止泵送液，可以使流过送液管17的培养液全部流向膜分离槽2。
向膜分离槽2供给的培养液的流量基本上根据膜分离槽的培养液流入侧压力来控制。为此，在图1所示的装置中设置压力计29。用压力计29测定膜分离槽的培养液流入侧压力，当测定值高于所希望的值时，使流量控制装置25运作起来，使由培养槽1输送的培养液的一部分绕过膜分离槽2循环。
此外，在循环管中设置了进行由培养槽送液的培养液的流量控制的泵5。泵可以设置在送液管17内或送液管15(返回培养槽)内，也可以设置在两者内。泵的方式、形状和接液部材质等不限，但优选能够耐循环管的蒸汽灭菌的物质。
在本文，图6中表示了循环管中的培养液线速度与具有乳酸生产能力的酵母株的沉淀量之间的关系，由此表明，循环管内(送液管17和送液管15)的培养液线速度如果在2.5cm/秒以上，菌体就可以不沉淀在配管内，培养液得以循环。因此，检测由培养槽输送的送液管17中的培养液和/或送液管15中的未过滤培养液的线流速，优选使流量控制装置25和泵5运作起来，以便该线流速达到2.5cm/秒以上。而且，基于相同的理由，优选设法使旁通管26中培养液的线流速达到2.5cm/秒以上。
而且，如上所述，在绕过膜分离槽的前述部分培养液与培养槽中的培养液或由培养槽向膜分离槽输送的培养液汇合时，检测由培养槽送液的培养液的线流速，可以使流量控制装置25和泵5运作起来，以便该线流速达到2.5cm/秒以上。此外，如后所述，在送液管15的未过滤培养液既按与培养槽内的培养液汇合的方式环流，又按与送液管17的培养液的一部分直接汇合的方式环流时，优选设法使任一这些管中的培养液的线流速都达到2.5cm/秒以上。也就是说，本发明中，优选设法使从培养槽输送到膜分离槽的培养液的线流速、以从膜分离槽向该膜分离槽的上游侧的培养液汇合的方式回流的未过滤培养液的线流速、以及绕过膜分离槽的培养液的线流速都达到2.5cm/秒以上。
并且，在图1所示的装置中，为了调节分离膜3中滤过流量和培养槽内的培养液量，在培养槽1中设置水位感应器12。通过水位感应器12检测培养槽内的培养液量，控制培养基供给泵6。此外，为了调节滤过流量，可以控制透过液量。控制透过液量的方法并没有限制，但可以设置例如通过控制水位差压来改变滤过流量的水位差压控制装置，还可以通过电源动力使泵运作起来从而改变滤过流量。此外，理想的是，在本发明的化学品的制造方法中使用的培养装置中设置用于给培养槽1、膜分离槽2、送液管15、送液管17灭菌的蒸汽供给管。
此外，作为本发明中使用的各种泵，可以列举例如螺旋泵、管泵、隔膜泵等各种种类，但优选根据泵的输出设定，能够计算循环液量或自分离膜的透过液量的泵，具体可列举隔膜泵或管泵。
在采用以上结构的培养装置的化学品的制造方法中，培养按例如如下方式进行。也就是说，在培养槽1中连续培养微生物或培养细胞，培养液从培养槽1中，通过循环管内的泵5，经送液管17，向膜分离槽2供给，通过泵4等在分离膜3的原液侧与透过液侧之间产生压力差，过滤该培养液，回收含有作为微生物或培养细胞的发酵生产物的乳酸等(化学品)的透过液。另一方面，未过滤培养液经送液管15，回流到培养槽1中。此时，泵5的流量以微生物或培养细胞不沉淀在送液管17和送液管15内的速度(例如如上所述的线流速在2.5cm/秒以上)送液。
然而，如果连续地继续进行培养、膜分离，培养液的粘度上升，分离膜堵塞、和膜分离槽内微生物或培养细胞累积，流路闭塞等原因导致膜分离槽内的压力上升。膜分离槽内压力一旦上升，增大了膜分离槽的破损和对微生物或培养细胞的负担。因此，膜分离槽内的压力优选在1MPa以下。另一方面，如果为了抑制膜分离槽内压力上升，从而减少通过泵5由培养槽1提供的培养液送液量，培养槽内的培养条件就会发生大的变化，而且微生物或培养细胞沉淀在循环管内，生产效率降低。
因此，本发明中，使由培养槽1输送的培养液的一部分，根据膜分离槽2的培养液流入侧压力，绕过膜分离槽2，进行回流。优选的是，按膜分离槽的培养液流入侧的压力在1MPa以下，来控制绕过膜分离槽2的培养液的流量。另外，这里所谓的这种压力是计示压力，本发明中所谓压力，只要没有特殊说明，就表示计示压力。这种膜分离槽内的压力变动可以通过设置在培养液供给侧的压力计29进行测定，根据这种测定结果，控制绕过膜分离槽的培养液的流量，从而控制膜分离槽内的压力上升。其结果是，可以防止循环管内微生物或培养细胞的沉淀，稳定地进行培养，而且可减少膜分离槽的破损和对微生物、培养细胞的负担增大，因此可以获得高收率以及高生产性。也就是说，与以往的分批发酵相比，发酵生产物的生产速度更高，可以进行效率极好的发酵生产，同时可以有效回收该发酵生产物。而且，连续培养中的生产速度用下式(1)计算。
[数1]
Figure BDA0000052877920000121
此外，分批培养中的发酵生产速度通过以下方式求出：用消耗所有原料碳源时的生产物量(g)除以碳源消耗所需要的时间(h)和该时间点的培养液量(L)。
图1所示的装置优选按例如如下方式进行变化。也就是说，例如，如图2所示，优选按流量控制装置25与压力计29的测定结果联动，进行运作的方式构成。另外，优选在送液管17中，在旁通管26的连接点的下游侧以及膜分离层2上游侧的位置，设置膜分离槽开闭阀27，在送液管15中，在旁通管26的连接点的上游侧以及膜分离层2下游侧的位置上设置膜分离槽开闭阀28。设置膜分离槽开闭阀27和/或膜分离槽开闭阀28时，设法使得流过送液管17的所有培养液，根据需要，流向旁通管26。这样一来，在分离膜的堵塞和膜分离槽内微生物或培养细胞的累积导致流路闭塞等情况下产生膜分离槽内不适的时候，可以完全停止向膜分离槽供给的培养液，可以修正或交换膜分离槽内不适的地方。
而且，还优选，如图7所示，在送液管15的未过滤培养液与培养槽内的培养液汇合的方式环流的同时，按与送液管17的培养液的一部分直接汇合的方式环流。此时，控制按与培养槽内的培养液汇合的方式环流的未过滤培养液的流速、流量、以及由培养槽送液的培养液的流速、流量的泵5设置在送液管15的分支点14B的培养槽侧的下游，另外，还在送液管17的汇合点14A的下游侧设置泵16。这样一来，在膜分离槽2、送液管17的汇合点14A的下游侧、和送液管15的分支点14B的上游侧，形成与培养槽1独立的循环线路，可以实现分别由泵16、5相互独立地来控制在膜分离槽2、送液管17的汇合点14A的下游侧以及送液管15的分支点14B的上游侧形成的循环回路中的流速、流量，和在送液管15的分支点14B的下游侧、培养槽1以及送液管17的汇合点14A的上游侧的流速、流量。因此，即使在调节泵16，增加该循环回路内的培养液流速，也就是说，使流过膜分离槽内的分离膜3的表面的培养液的线速度(线流速)的情况下，通过泵5也可以使送液管15的分支点14B的下游侧的流速保持一定，使培养液返回培养槽1内的速度保持一定。也就是说，由于可以保持培养槽内的培养条件地使膜分离槽内的培养液流速提高，因此可以以微生物或培养细胞不沉淀的速度送液，而且培养槽内可以保持适于培养的条件，可以稳定地培养，可以维持高收率和高生产性。
另外，返回到培养液的培养槽1内的未过滤培养液的速度一旦变快，就会成为液流变乱的要因，影响氧移动容量系数kLa，因此可以使培养液返回到培养槽1内的速度保持一定，从而使得发酵效率稳定化。
而且，由于本发明增加流过膜分离槽内的分离膜3表面的流速，增加获得的透过液、即发酵生产物的回收量，并且保持培养效率，提高生产速度，因此按与培养槽内的培养液汇合的方式回流的未过滤培养液的流量、流速(也就是，送液管15的分支点14B的下游侧的流量、流速)α优选比按与培养槽到膜分离槽之间的培养液汇合的方式回流的未过滤培养液的流量、流速(也就是送液管17的分支点14A的下游侧的流量、流速)β小，它们的比例α/β优选在1以下。
而且，如图14所示，按未过滤培养液与培养槽内的培养液汇合的方式环流的送液管15优选在浸渍于储存在培养槽1的培养液的位置开口。由于送液管15的一个端部在该位置开口，培养槽1内的氧移动容量系数kLa难以由预期的设定值变化，可以将自该系数的设定值的减少率抑制在该设定值的30％以内的范围。
此外，如图8所示，优选多个膜分离槽2并联连接。通过这种方式，在一个膜分离槽内产生不合适的时候，可以调换膜分离槽再使用，可以不停止用膜分离槽的过滤，继续进行培养。此外，在并联连接多个膜分离槽时，通过将蒸汽供给管连接到各个膜分离槽上，可以分别进行膜分离槽内的灭菌。
本发明中，为了提高发酵生产物的收率，优选防止分离膜的堵塞，稳定地长期维持连续培养。因此，作为由分离膜3获得的透过液的流量相对于输送到膜分离槽的培养液的流量的比例的回收率(以下，有时只称为回收率)优选控制在10.0％以下。
所谓回收率，是每单位时间分离膜3的透过液量相对于输送到膜分离槽的培养液量(循环液量)的比例，通过下述的(式2)计算。但是，在连接多个膜分离装置时，根据各个膜分离装置中的透过液量和循环液量计算。而且，透过液量可以用膜分离装置中使用的分离膜面积和可以运转控制的滤过流量进行替换，(式2)可以转化为下述(式3)。
[数2]
Figure BDA0000052877920000151
[数3]
Figure BDA0000052877920000161
为了控制回收率，可以调节流入膜分离槽的培养液量和/或由分离膜得到的透过液量。也就是说，优选对选自循环液量、滤过流量和透过液量中的1种以上进行控制。为了控制循环液量，优选调节前述位于膜分离槽上游侧的泵5、16的输出。而且，作为控制滤过流量或透过液量的方法，优选泵4的输出调节。
因此，在图1所示的装置中，例如，在送液管17和分离膜3的透过液取出管中设置流量计，定期监控循环液量和透过液量，用(式2)计算回收率，优选按回收率达到10.0％以下那样，在控制泵4、5输出的同时进行运转。
而且，作为控制滤过流量或透过液量的方法，除了泵4的输出调节之外，还可以列举水位差压的调节、通过液体或气体等产生的吸引、或膜分离槽内的加压等。
通过这些方法，就可以实现例如，以保持一定的循环液量，同时只控制滤过流量的方式进行运转。此外，还可以实现以保持一定的滤过流量，同时控制循环液量的方式进行运转。
回收率更优选控制在5.0％以下。另一方面，从提高能量效率这种观点考虑，回收率越高越好。因此，回收率的下限优选至少在0.01％以上。
下面，对滤过流量进行说明。所谓滤过流量，可以用下述(式4)计算。
[数4]
Figure BDA0000052877920000171
装置中使用的膜面积可以任意设定，因此是清楚的。透过液量的体积(m3/天)优选测定1天透过液量的体积，但还可以通过测定1小时左右的透过液量的体积来概算1天的透过液量的体积。本发明中，优选滤过流量在0.500m/天以下，更优选0.050m/天以上0.400m/天以下。滤过流量一旦超过0.500m/天，有时难以通过回收率的控制而稳定地维持连续培养。此外，滤过流量如果不到0.050m/天，这就意味着分离膜面积过大，从经济的观点考虑，难以工业化。
下面，用图1中所示的装置进行化学品的制造的一个例子，按如下方式具体说明。
首先，微生物和培养原料(培养基)储存在培养槽1，通过适当添加中和剂，将这种培养槽1的内部维持在pH4～8的范围内，同时温度维持在20～50℃的范围。由此，进行微生物的培养，此时生产出醇、有机酸、氨基酸和核酸等所希望的发酵生产物(化学品)。这期间，为了连续进行培养，获得所希望的发酵生产物，通过培养基供给泵6，向培养槽1连续的或间歇地供给培养中使用的含有营养素的培养基。
此外，在进行培养的同时，用泵5使得循环管内的线流速达到2.5cm/秒以上，使培养槽1内的培养液在培养槽1和膜分离槽2之间连续循环。在膜分离槽2中，通过分离膜将该培养液过滤和分离成含有微生物的未过滤培养液和含有发酵生产物的透过液。其结果是，从装置系统中取出含有发酵生产物的透过液，再浓缩、蒸馏、晶析该透过液，可以得到纯度提高的发酵生产物。另一方面，经过滤和分离的含有微生物或培养细胞的未过滤培养液停留在培养槽1内，因此培养槽的微生物可以维持在高浓度，可以进行化学品的高生产性的培养。
而且，循环管内的线流速的计算可以通过(每个单位时间的流量)/(配管的截面积)进行计算。或者可以在配管中连接Corioli式数字化流量传感器或电极非接触型2线式电磁流量计等，进行测定。探测这些数字化流量计的输出，进行泵5或流量控制装置25等的控制。
培养槽1中的培养液中的微生物或培养细胞浓度，优选微生物或培养细胞的增殖变得不适应而死亡的比率不变高的范围内，维持在高状态，这是为了获得高效率的生产性。作为一个例子，通过将浓度维持在干燥重量在5g/L以上，可以获得良好的生产效率。
为了维持这种适当的浓度，还优选根据需要，从培养槽内取出微生物或培养细胞。如果培养槽内的微生物或培养细胞浓度过高，有时就会出现容易发生分离膜闭塞的情况。通过取出而维持在合适的浓度，可以回避分离膜的闭塞。而且，由于培养槽内的微生物或培养细胞的浓度有时会导致化学品的生产性能发生变化，因此通过以生产性能作为指标，取出微生物或培养细胞，还可以将生产性能维持在一定范围内。
培养原料的供给和培养液的取出(培养液向膜分离槽的送液)可以从适当的时期开始进行。也就是说，培养原料的供给和培养液取出的开始时期未必需要在同时。而且，培养原料的供给和培养液的取出可以是连续的，也可以是间歇的。
而且，根据需要，还优选通过水位感应器12，适当调节培养槽内的培养液量。培养槽内的培养液量的调节中，还可以不是测定培养槽内的培养液位，而是测定培养液重量进行调节。
本发明中，只要是能够在微生物或培养细胞增殖的同时生成化学品即可，培养装置的数目不限。连续培养操作，从培养管理上考虑，通常优选在单一的培养槽中进行，但由于培养槽容量小等理由，也可以使用多个培养槽。此时，即使用配管并联或串联连接多个发酵槽，进行连续培养，也获得了发酵生产物的高生产性。
而且，本发明中，所谓培养液，是指培养原料中能够得到微生物或培养细胞增殖之结果的液体，所谓培养原料，是指促进所培养的微生物或培养细胞的生长发育，能够良好地生产目的生产物的化学品等的营养素等。对于培养原料的组成，为了提高目的化学品的生产性，也可以对培养开始时的培养原料组成进行适当改变。
本发明中使用的微生物和培养细胞，可以列举，例如可以在工业中常使用的面包酵母等酵母、大肠杆菌、棒状杆菌型细菌等细菌、丝状真菌、放线菌、动物细胞、昆虫细胞等。尤其优选，由于分离核内压力差而容易引起细胞破坏的酵母等真核生物，这其中最优选酵母。使用的微生物或培养细胞可以是从自然环境中分离的，而且，还可以是由于突变或基因重组而导致部分性质改变的。这些微生物或培养细胞中，优选选择使用目的化学品的生产能力高的。而且，本发明中，有时将微生物的培养称为“发酵”或“发酵培养”。
作为培养原料，只要是促进所培养的微生物或培养细胞的生长发育，能够良好地生产目的化学品的原料即可。作为培养原料的具体例子，优选使用碳源、氮源、无机盐类、和根据需要适当含有氨基酸、维生素等有机微量营养素的通常的液体培养基。
作为碳源，还可以使用葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、乳糖等糖类、含有这些糖类的淀粉糖化液、甘薯糖蜜、甜菜糖蜜、高级糖蜜(High Test Molasses)、以及醋酸等有机酸、乙醇等醇类和甘油等。
作为氮源，可以使用氨气、氨水、铵盐类、尿素、硝酸盐类、其它辅助使用的有机氮源例如油粕类、大豆加水分解液、酪蛋白分解物、其它氨基酸、维生素类、玉米浆、酵母或酵母提取物、肉膏、蛋白胨等肽类、各种发酵菌体及其加水分解物等。
作为无机盐类，可以适当添加磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐、和锰盐等。在需要微生物生长发育所需的特定营养素时，可以添加作为制品的营养物，或者含有该营养物的天然物。而且，根据需要还可以使用消泡剂。
本发明中，优选培养液中的糖类浓度保持在5g/l以下。之所以优选该糖类浓度保持在5g/L以下，是为了使得培养液的取出导致的糖类的流失最小化。
而且，微生物或培养细胞的培养，通常大多在pH4～8、温度20～50℃的范围进行。培养液的pH能够用无机酸或有机酸、碱性物质、以及尿素、碳酸钙和氨气等，调节到上述范围内的预先确定的值。而且，如果需要提高氧的供给速度，可以采用在空气中添加氧，将氧浓度保持在21％以上，或对培养反应槽内加压，提高搅拌速度，提高通气量等手段。
本发明中，可以在培养初期进行分批培养或补料分批培养，在微生物或培养细胞的浓度提高后开始连续培养，也可以接种高浓度的菌体，在培养开始的同时进行连续培养。
作为本发明可以制造的化学品(发酵生产物)，只要是前述微生物或培养细胞在培养液中生产的物质即可，没有限制，可以根据培养的微生物或培养细胞适当选择。作为具体例子，可以列举醇、有机酸、氨基酸、核酸等发酵工业中可大量生产的物质。作为醇，可以列举乙醇、1，3-丙二醇、1，4-丁二醇、甘油等，作为有机酸，可以列举醋酸、乳酸、丙酮酸、琥珀酸、苹果酸、衣康酸、柠檬酸，如果是核酸，可以列举次黄苷、鸟苷等核苷、次黄苷酸、鸟苷酸等核苷酸、以及尸胺等二胺化合物。而且，本发明还可以适用于生产酶、抗生素、重组蛋白质等物质。
下面，对用于获得所希望的化学品的微生物或培养细胞，边列举具体的化学品边进行说明。
作为可以在本发明的生产乳酸时使用的微生物或培养细胞，没有特别限制，但优选可以使用乳酸菌。这里所称的乳酸菌，可以定义为，相对于消耗的葡萄糖，产生对糖收率50％以上的乳酸的原核微生物。作为优选的乳酸菌，可以列举，例如，属于乳杆菌属(Lactobacillus)、片球菌属(Pediococcus)、四联球菌属(Tetragenococcus)、肉食杆菌属(Carnobacterium)、漫游球菌属(Vagococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、酒球菌属(Oenococcus)、奇异菌属(Atopobium)、链球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、或芽孢杆菌属(Bacillus)的乳酸菌。这些乳酸菌中，选择乳酸的对糖收率高的乳酸菌，可优选用于乳酸的生产。
进而，乳酸之中，还可以选择乳酸中的L-乳酸的对糖收率高的乳酸菌。所谓L-乳酸，是乳酸的光学异构体的一种，可与其对映体D-乳酸明确区分。作为L-乳酸的对糖收率高的乳酸菌，可以列举例如果汁乳杆菌(Lactobacillus yamanashiensis)、动物乳杆菌(Lactobacillus animalis)、敏捷乳杆菌(Lactobacillus agilis)、鸟类乳杆菌(Lactobacillus aviaries)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbruekii)、类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、瘤胃乳杆菌(Lactobacillus ruminis)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、沙氏乳杆菌(Lactobacillus sharpeae)、糊精片球菌(Pediococcus dextrinicus)或乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)等，可以选择它们，用于L-乳酸的生产。
另一方面，作为可用于D-乳酸生产的微生物或培养细胞，可以列举德氏乳杆菌(Lactobacillus delbruekii)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、左乳酸芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus laevolacticus)或菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)等。
此外，本发明在制造L-乳酸或D-乳酸时，可以采用人为地给予了或增强了乳酸生产能力的微生物或培养细胞。人为地给予或增强乳酸生产能力的方法可以是以往已知的通过药剂变异的方法，但优选使用重组微生物。作为重组微生物，优选通过导入L-乳酸脱氢酶基因(以下，也称为L-LDH)或D-乳酸脱氢酶基因(以下，也称为D-LDH)，给予或增强了微生物或培养细胞的L-乳酸或D-乳酸生产能力的重组微生物。
作为前述重组微生物的宿主，优选作为原核细胞的大肠杆菌、乳酸菌、和作为真核细胞的酵母等，特别优选酵母。酵母中优选属于酵母属(Saccharomyces)的酵母，更优选酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
作为L-LDH或D-LDH，只要是编码具有将还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和丙酮酸转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)和L-乳酸或D-LDH的活性的蛋白质的L-乳酸脱氢酶或D-乳酸脱氢酶，则没有限制。这其中，作为L-LDH，优选可以使用人(Homo sapiens)来源或蛙来源的L-LDH。蛙来源的L-LDH中，优选使用属于负子蟾科(Pipidae)的蛙来源的L-LDH，属于负子蟾科的蛙中，可优选使用非洲爪蟾(Xenopus laevis)来源的L-LDH。此外，作为D-LDH，优选是植物乳杆菌(Lactobacillus Plantarum)和乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)或左乳酸芽孢杆菌(Bacillus laevolacticus)来源的基因，更优选是左乳酸芽孢杆菌来源的基因。
本发明可使用的L-LDH或D-LDH中包括由于遗传的多态性、诱发突变等而造成的突变型的基因。所谓遗传的多态性，是由于基因上的自然突变而导致的基因的碱基序列一部分发生变化。而且，所谓诱发突变，是指在基因中人工导入突变。诱发突变有例如使用部位特异的突变导入用试剂盒(Mutan-K(takara bio社制))的方法、采用随机突变导入用试剂盒(BD Diversify PCR Random Mutagenesis(CLONTECH公司制))的方法等。而且，本发明中使用的L-LDH或D-LDH只要编码具有L-乳酸脱氢酶或D-乳酸脱氢酶活性的蛋白质，也可以在碱基序列的一部分中存在缺失或插入。
而且，在制造L-乳酸时，从上述的分离膜3获得的透过液中所含的L-乳酸的分离和纯化，可以通过组合以往已知的浓缩、蒸馏和晶析等方法来进行。例如，可以列举通过将分离膜3的透过液的pH调节到1以下，然后用二乙醚或乙酸乙酯等提取的方法；吸附于离子交换树脂，清洗后洗脱的方法；在酸催化剂的存在下使之与醇反应，作为酯蒸馏的方法；以及结晶为钙盐或锂盐的方法等。优选地，可以列举用蒸馏操作处理使分离膜3的透过液的水分蒸发的浓缩L-乳酸溶液的方法。其中，蒸馏时，优选一边供给水分一边蒸馏以便蒸馏原液的水分浓度固定。L-乳酸水溶液在馏出后，通过加热蒸发水分而浓缩，可以获得目的浓度的纯化L-乳酸。当获得含有乙醇或醋酸等低沸点成分的L-乳酸水溶液作为馏出液时，在L-乳酸浓缩过程中除去低沸点成分为优选的方式。蒸馏操作后，对于馏出液，根据需要，用离子交换树脂、活性碳和色谱分离等去除杂质，还可以获得更高纯度的L-乳酸。
在与制造D-乳酸时一样，从上述分离膜3中获得的透过液中所含的D-乳酸的分离和纯化可以通过组合以往已知的浓缩、蒸馏和晶析等方法来进行。例如，可以列举通过将分离膜3的透过液的pH调节到1以下，然后用二乙醚或乙酸乙酯等提取的方法；吸附于离子交换树脂，清洗后洗脱的方法；在酸催化剂的存在下使之与醇反应，作为酯蒸馏的方法；以及结晶为钙盐或锂盐的方法等。优选地，可以列举可用蒸馏操作处理使分离膜3的透过液的水分蒸发的浓缩D-乳酸溶液的方法。其中，蒸馏时，优选一边供给水分一边蒸馏以便蒸馏原液的水分浓度固定。D-乳酸水溶液在馏出后，通过加热蒸发水分而浓缩，可以获得目的浓度的纯化D-乳酸。当获得含有低沸点成分(乙醇、醋酸等)的D-乳酸水溶液作为馏出液时，在D-乳酸浓缩过程中除去低沸点成分为优选的方式。蒸馏操作后，对于馏出液，根据需要，用离子交换树脂、活性碳和色谱分离等去除杂质，还可以获得更高纯度的D-乳酸。
接着，作为本发明的可以用于制造乙醇的微生物或培养细胞，没有特别限制，但可以使用例如，属于酵母(Saccharomyces)属、克鲁维酵母(Kluyveromyces)属或裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces)属的酵母。这其中可合适地使用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。而且，还可以优选使用属于乳杆菌属(Lactobacillus)或发酵单胞菌属(Zymomonas)属的细菌。这其中，可合适地使用短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)。
可以在乙醇的生产中使用的微生物或者培养细胞可以是人为地提高了乙醇生产能力的微生物或者培养细胞。具体地也可以是，由于突变或基因重组而导致部分性质改变的微生物或者培养细胞。作为部分性质改变的微生物或者培养细胞的一例，可以列举整合了属于根霉属霉菌的葡糖淀粉酶基因而获得了生淀粉的同化能力的酵母(微生物，3：555-564(1987))。
而且，从上述分离膜3获得的透过液中所含的乙醇的分离和纯化，可合适地使用例如，通过蒸馏法进行的纯化法，或使用NF、RO膜、或者沸石制的分离膜的浓缩、纯化法。
作为可以在本发明的丙酮酸的生产中使用的微生物或者培养细胞，没有特别限制，优选可以使用例如，属于假单胞菌(Pseudomonas)属、棒杆菌(Corynebacterium)属、埃希氏菌(Escherichia)属或不动杆菌(Acinetobacter)属的细菌。更优选可以使用荧光假单胞菌(Pseudomonas fuluorescens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、大肠杆菌(Escherichia coli)等细菌。
可以用于丙酮酸生产的微生物或培养细胞可以是人为提高了丙酮酸生产能力的微生物或培养细胞，也可以使用由于突变或基因重组而导致部分性质发生改变的微生物或培养细胞。例如，还可以优选使用突变或缺失了通过氧化磷酸化而直接参与ATP生产的ATPase基因的细菌。而且，还可以优选使用霉菌、酵母等。例如，可以使用属于酵母(Saccharomyces)属、球拟酵母属(Torulopsis)、假丝酵母属(Candida)、裂褶菌属(Schizophyllum)的霉菌或酵母。更优选，可以使用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、Saccharomyces copsis、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、解脂假丝酵母(Candida lipolytica)、光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)、裂褶菌(Schizophyllum commune)等霉菌或酵母制备丙酮酸。
而且，从上述分离膜3获得的透过液中所含的丙酮酸的分离和纯化，可以通过使用阴离子交换柱的方法进行。例如，可合适地使用特开平6-345683中公开的采用弱碱性离子交换体的纯化法。
作为可以在本发明的琥珀酸的生产中使用的微生物或者培养细胞，可合适地使用属于厌氧螺菌(Anaerobiospirillum)属或放线杆菌(Actinobacillus)属的细菌。具体而言，可以列举美国专利第5143833号说明书中记载的产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)或由James B.Mckinlay公开的琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)(Appl.Microbiol.Biotechnol.，71，6651-6656(2005)。而且，还可以使用棒杆菌(Corynebacterium)属或短杆菌(Brevibacterium)属等棒状杆菌型细菌(Coryneform bacterium)和大肠杆菌等。棒状杆菌型细菌中，合适的是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)和乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)等。
可以用于琥珀酸生产的微生物或培养细胞可以是人为地提高了乙醇生产能力的微生物或培养细胞。作为具体例子，可以使用通过基因重组而导致琥珀酸的生产能力得到了改善的微生物，由此也可使琥珀酸生产性提高。作为这种微生物，可以使用例如特开2005-27533号公报中记载的缺失了乳酸脱氢酶的黄色短杆菌MJ233AB-41(保藏号FERM BP-1498)、上述非专利文献1中记载的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、美国专利第5770435号说明书中记载的丙酮酸甲酸裂解酶(pyruvate formate lyase)和乳酸脱氢酶的缺失株-大肠杆菌AFP111株等。
而且，由上述的分离膜3获得的透过液中含有的琥珀酸的分离和纯化，可以使用常规的琥珀酸纯化法。例如，可合适地使用特开2005-333886号公报中公开的组合了水分解电渗析处理和减压浓缩、晶析的纯化法。
作为可以在本发明的衣康酸的生产中使用的微生物或者培养细胞，没有特别限制，作为具体例子，可以优选使用霉菌或者酵母。更优选可以列举采用属于曲霉属(Aspergillus)或者黑粉菌属(Ustilago)的霉菌和属于假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)的酵母进行衣康酸的生产。这其中，在衣康酸的生产中优选使用土曲霉(Aspergillus terreus)、解乌头酸曲霉(Aspergillus itaconicus)、玉米黑粉菌(Ustilago maydis)、狗牙根黑粉菌(Ustilago cynodontis)和拉宾黑粉菌(Ustilago rabenhorstina)的霉菌、或者南极假丝酵母(Candia antarctica)。
而且，由上述的分离膜3获得的透过液中含有的衣康酸的分离和纯化优选可以采用超滤或电渗析进行。例如，可合适地使用特公昭-50958号公报中公开的通过采用超滤或盐型阳离子交换树脂膜的电渗析进行的纯化法。
作为可以在本发明的1，3-丙二醇的生产中使用的微生物或者培养细胞，没有特别限制，作为具体例子，可以列举，野生型株中，具有由甘油合成1，3-丙二醇的能力的属于克雷伯氏菌(Klebsiella)属、梭菌(Clostridium)属、乳杆菌(Lactobacillus)属的微生物。
在由甘油制造1，3-丙二醇时，微生物优选含有(a)编码具有甘油脱水酶活性的多肽的至少一个基因；(b)编码甘油脱水酶再活性化因子的至少一个基因；和(c)编码具有将3-羟基丙醛转换成1，3-丙二醇的非特异的催化剂活性的至少一个基因。
更优选使用可以由葡萄糖生产1，3-丙二醇的重组微生物。作为重组微生物的宿主，优选为选自于克雷伯氏菌属(Klebsiella)、梭菌属(Clostridium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、柠檬酸细菌属(Cytrobacter)、肠杆菌属(Enterobacter)、气杆菌属(Aerobacter)、曲霉属(Aspergillus)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、毛霉属(Mucor)、球拟酵母属(Torulopsis)、甲基细菌属(Methylobacter)、沙门氏菌属(Salmonella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、气杆菌属(Aerobacter)、链霉菌属(Streptomyces)、埃希氏菌属(Eschericia)和假单胞菌属(Pseudomonas)中的重组微生物，更优选为大肠杆菌。
可以由葡萄糖生产1，3-丙二醇的重组微生物优选为含有例如(a)编码具有甘油-3-磷酸脱氢酶活性的多肽的至少一个基因；和(b)编码具有甘油-3-磷酸酶活性的多肽的至少一个基因的重组微生物。进而，更优选含有甘油脱水酶再活性化因子是由从dha调节子中分离的orfX和orfZ编码的基因的重组微生物。进而，更优选地，重组微生物为缺失了甘油激酶活性和/或甘油脱氢酶活性和/或磷酸丙糖异构酶活性的重组微生物。
而且，由上述的分离膜3获得的透过液中含有的1，3-丙二醇的分离和纯化可以通过浓缩、晶析进行。例如，可以合适地使用特开平-35785号公报中公开的采用减压浓缩、晶析的纯化法。
作为可以在本发明的尸胺的生产中使用的微生物或者培养细胞，没有特别限制，但作为具体例子，优选是微生物所具有的赖氨酸脱羧酶和/或赖氨酸·尸胺反向转运蛋白的酶活性增强的微生物。更优选地，可以列举整合了编码赖氨酸脱羧酶和/或赖氨酸·尸胺反向转运蛋白的基因的重组微生物。更优选地，可以列举整合了1种或2种以上的编码赖氨酸脱羧酶的基因的微生物。
在用重组微生物制造尸胺时，优选以大肠杆菌或棒状杆菌型细菌作为宿主的重组微生物，更优选的是具有赖氨酸脱羧酶活性且具有高丝氨酸营养缺陷型或S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸耐性中的至少任一种特征的棒状杆菌型细菌。而且，棒状杆菌型细菌中，更优选选自于棒杆菌属或短杆菌属，更优选谷氨酸棒杆菌(Corynebacuterium gulutamicum)。进一步地，优选微生物缺失高丝氨酸脱氢酶活性，更优选由于基因插入突变的发生而导致缺失高丝氨酸脱氢酶活性。
而且，由上述的分离膜3获得的透过液中含有的尸胺的分离和纯化可以通过组合了浓缩、蒸馏和晶析等以往已知的方法进行。例如，可合适地使用特开2004-222569号公报中公开的采用晶析的纯化法。本发明中，可以通过连续培养时可使用的酸制成各种聚合物原料，在需要良好纯度的聚合物原料用途中，优选使用通过晶析进行的纯化方法。如果是用盐酸维持培养液的pH，则可以从前述透过液中通过晶析回收尸胺二盐酸盐。更优选地，可以列举在连续培养时用二羧酸维持培养液的pH，回收尸胺二羧酸盐。此时，二羧酸优选是官能团只有2个羧基的脂肪族和/或芳香族的二羧酸，更优选是己二酸、癸二酸、1，12-十二烷二羧酸、琥珀酸、间苯二酸或对苯二酸中的任一。
作为可以在本发明的核酸的生产中使用的微生物或者培养细胞，没有特别限制，可以是从自然界分离的原来核酸的生产能力就高的微生物或者培养细胞，也可以是人为地提高了生产能力的原核微生物。具体地，可以是由于突变或基因重组而导致部分性质被改变的微生物或者培养细胞。
这其中，对于前述部分性质的改变进行说明。为了有效生产核酸，需要生物合成核酸并累积，释放到生物体外。因此，通过增强参与核酸的生物合成途径的酶、降低参与核酸的分解途径的酶活性，以及改变与核酸释放到生物体外相关的蛋白质、或者生物体膜组成等等、改变微生物或者培养细胞的性质，可有效制备生产核酸的微生物或者培养细胞。
具体而言，在生产次黄苷时，理想的是微生物或培养细胞不具有腺苷酸琥珀酸合酶活性或微弱。而且，理想的是不具有次黄苷酸脱氢酶活性或微弱。而且，理想的是不具有核苷酶活性或微弱。在生产鸟苷时，理想的是微生物或培养细胞不具有腺苷酸琥珀酸合酶活性或微弱。而且，理想的是不具有鸟苷酸还原酶活性或微弱。而且，理想的是不具有核苷酶活性或微弱。而且，理想的是不具有核苷酸酶活性或微弱。在生产尿苷时，理想的是微生物或培养细胞不具有尿苷磷酸化酶活性或微弱。在生产胞苷时，理想的是不具有胞苷脱氨酶活性或微弱，理想的是不具有高丝氨酸脱氢酶活性或微弱。
作为可以在本发明制造核酸时使用的微生物或培养细胞，可以优选使用棒状杆菌型细菌或枯草菌。例如，在生产次黄苷时，作为棒状杆菌型细菌，可以列举属于棒杆菌属(Genus Corynebacterium)的细菌，在棒杆菌属中优选使用谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium gulutamicum)、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、Corynebacterium guanofaciens或Corynebacterium Petrophilium。此外，作为枯草菌，可以列举例如，属于芽孢杆菌属(Bacillus)的细菌，其中优选使用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus liqueniformis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。而且，在生产鸟苷时，作为棒状杆菌型细菌，可以列举属于棒杆菌(Corynebacterium)属的细菌，这其中优选谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium gulutamicum)，作为枯草菌，可以列举例如属于芽孢杆菌(Bacillus)属的细菌，这其中优选使用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus liqueniformis)或短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。此外，在生产尿苷或胞苷时，作为枯草菌，这其中可优选使用属于芽孢杆菌(Bacillus)属的细菌，其中优选使用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
而且，由上述的分离膜3获得的透过液中含有的核酸的分离和纯化，优选通过组合了离子交换树脂处理法、浓缩冷却晶析法、膜分离法和其它方法进行。为了除去杂质，可以使用常规方法的活性碳吸附法和重结晶法进行纯化。
在本发明制造氨基酸时，作为该氨基酸，可以列举优选L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-色氨酸、L-异亮氨酸、L-谷氨酰胺、L-精氨酸、L-丙氨酸、L-组氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-天冬氨酸、L-酪氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、缬氨酸、亮氨酸。
作为例如制造L-苏氨酸时的微生物或培养细胞，可以使用属于埃希氏菌属(Escherichia)、普罗威登斯菌属(Providencia)、棒杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)或沙雷氏菌属(Serratia)中的细菌。这其中，特别优选的细菌是大肠杆菌(Escherichia coli)、雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)或粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)。
作为可以在制造L-赖氨酸或L-谷氨酸时使用的微生物或培养细胞，优选谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium gulutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)或乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)。
作为在制造L-色氨酸时的微生物或培养细胞，优选谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium gulutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)或大肠杆菌(Escherichia coli)。
作为制造L-异亮氨酸时的微生物或培养细胞，优选谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium gulutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)或粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)。
作为制造L-谷氨酰胺时的微生物或培养细胞，优选谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium gulutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)或里加黄杆菌(Flavobacterium rigense)。
作为制造L-精氨酸时的微生物或培养细胞，优选谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium gulutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、大肠杆菌(Escherichia coli)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
作为制造L-丙氨酸时的微生物或培养细胞，优选黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)或氧化节杆菌(Arthrobacter oxydans)
作为制造L-组氨酸时的微生物或培养细胞，优选谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium gulutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)。
作为制造L-脯氨酸时的微生物或培养细胞，优选谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium gulutamicum)、Kurthia catenaforma、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)或大肠杆菌(Escherichia coli)。
作为制造L-苯丙氨酸或L-酪氨酸时的微生物或培养细胞，优选谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium gulutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)或大肠杆菌(Escherichia coli)。
作为制造L-天冬氨酸时的微生物或培养细胞，优选黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、巨大芽胞杆菌(Bacillus megatherium)、大肠杆菌(Escherichia coli)或荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。
作为制造蛋氨酸时的微生物或培养细胞，优选谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium gulutamicum)。
作为制造丝氨酸时的微生物或培养细胞，优选谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium gulutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)或氧化节杆菌(Arthrobacter oxydans)。
作为制造缬氨酸时的微生物或培养细胞，优选乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)或肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)。
作为制造亮氨酸时的微生物或培养细胞，优选谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium gulutamicum)、乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)或粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)。
如上所述的可以用于制造氨基酸的微生物或培养细胞，可以从自然界中分离原本氨基酸生产能力就高的微生物或培养细胞，也可以是对例示的微生物或培养细胞人为提高了其生产能力的微生物或培养细胞。此外，还可以是由于突变或基因重组而导致部分性质发生改变的微生物或培养细胞。
作为部分性质发生改变的微生物或培养细胞的一个例子，有特开平2-219582中记载的L-苏氨酸生产性提高了的雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)、和特表平3-500486中记载的L-丙氨酸生产性提高了的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium gulutamicum)等。
下面，对本发明中可作为分离膜优选使用的多孔性膜进行说明。
作为多孔性膜，可以使用以陶瓷等无机材料、树脂等有机材料作为原材料的多孔性膜，但更优选使用含有多孔质树脂层的多孔性的分离膜。这种多孔性膜，在多孔质基材的表面上具有起分离功能层作用的多孔质树脂层。多孔质基材支持多孔质树脂层，给予分离膜强度。多孔质树脂层可以浸透在多孔质基材中，也可以不浸透在多孔质基材中，但从强度方面考虑，优选采用浸透在多孔质基材中的膜。
多孔质基材的材质由有机材料和/或无机材料等构成，其中理想使用有机纤维。优选的多孔质基材是使用纤维素纤维、三乙酸纤维素纤维、聚酯纤维、聚丙烯纤维和聚乙烯纤维等有机纤维构成的织布或无纺布等。其中优选使用密度控制比较容易、制造也容易的便宜的无纺布。
多孔质树脂层，如上所述，起分离功能层的作用，可以合适地使用有机高分子膜。作为有机高分子膜的材质，可以列举例如，聚乙烯类树脂、聚丙烯类树脂、聚氯乙烯类树脂、聚偏氟乙烯类树脂、聚砜类树脂、聚醚砜类树脂、聚丙烯腈类树脂、聚烯烃类树脂、纤维素类树脂和三乙酸纤维素类树脂等。有机高分子膜可以是以这些树脂作为主要成分的树脂混合物。这其中，作为主要成分，是指含有50重量％以上、优选60重量％以上的该成分。其中，作为构成多孔质树脂层的膜原材料，优选由溶液来制膜是容易的、且物理的耐久性和耐药性也优异的聚氯乙烯类树脂、聚偏氟乙烯类树脂、聚砜类树脂、聚醚砜类树脂、聚丙烯腈类树脂或聚烯烃类树脂，更优选聚偏氟乙烯类树脂或聚烯烃类树脂，最优选聚偏氟乙烯类树脂或以其作为主要成分的树脂。
这里，作为聚偏氟乙烯类树脂，优选使用偏氟乙烯的均聚物或与可以与偏氟乙烯共聚的乙烯类单体的共聚体。作为可以与偏氟乙烯共聚的乙烯类单体，可以列举四氟乙烯、六氟丙烯和三氯一氟乙烯等。此外，作为聚烯烃类树脂，可以列举聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯或聚氯丙烯，但优选聚氯乙烯。
以下，例示多孔性膜的制作方法的概要，并进行说明。
首先，对多孔性膜中的平膜的制作方法的概要进行说明。平膜是通过以下方式获得的，即在多孔质基材的表面上形成含有构成多孔质树脂层的树脂和溶剂的制膜原液的被膜，同时使该制膜原液浸渍于多孔质基材中，然后，只使具有被膜的多孔质基材的被膜侧表面与含有非溶剂的凝固浴接触，使树脂凝固，同时在多孔质基材的表面上形成多孔质树脂层。此时，尽管可以根据用途来选择，但多孔质基材的平均厚度优选为50μm以上3000μm以下，而且多孔质树脂层的平均厚度在20μm以上5000μm以下，更优选为50μm以上2000μm以下的范围。
下面，对中空纤维膜的制造方法的概要进行说明。中空纤维膜可以通过从二重管式金属口外侧的管吐出含有由构成多孔质树脂层的树脂和溶剂构成的制膜原液，同时从二重管式金属口内侧的管吐出中空部形成用流体，然后在冷却浴中冷却固化的方式制作。此时，中空纤维的内径优选在200μm以上5000μm以下的范围，多孔质树脂层的膜厚优选在20μm以上2000μm以下的范围。此外，在中空纤维的内部还可以含有由有机纤维或无机纤维制成筒状的织物或编物。
在获得的中空纤维膜的外表面上还可以涂覆(层叠)新的多孔性树脂层。这种多孔质树脂层的层叠可以是为了使中空纤维膜的性质例如亲水性或疏水性、细孔径等变化成所希望的性质而进行的。
这种在表面上层叠的多孔质树脂层可以通过以下方式制造，即通过使树脂溶解于溶剂中的原液与含有非溶剂的凝固浴接触，使树脂凝固。层叠的树脂的材质可优选使用例如与上述多孔质树脂层的材质同样的材质。此外，对层叠方法没有特别限定，可以将中空纤维膜浸渍于原液中，也可以在中空纤维膜的表面上涂布原液，层叠后，通过挤出付着的原液的一部分，用气刀吹跑，来调节层叠量。
本发明中使用的多孔性膜的平均细孔径优选0.01μm以上不到1μm。多孔性膜的平均细孔径如果0.01μm以上且不到1μm，具有不容易发生由发酵时使用的菌体导致的堵塞，且长时间稳定地维持过滤性能的性能。而且，如果多孔性膜的平均细孔径在0.01μm以上且不到1μm，可以实现不漏出微生物或培养细胞的高排除率，并实现长时间保持高透水性。
如果接近微生物或培养细胞的大小，由于存在微生物或培养细胞直接堵塞孔的情况，因此多孔性膜的平均细孔径优选不到1μm。此外，多孔性膜的平均细孔径，为了防止微生物或培养细胞的漏出、即排除率降低的这种麻烦的发生，优选与微生物或培养细胞的大小相比，不会过大的孔径。因此，微生物或培养细胞中，在使用细胞小的酵母或细菌等时，平均细孔径更优选在0.4μm以下，更优选在0.2μm以下。此外，存在微生物或培养细胞生产目的化学品以外的物质，例如蛋白质、多糖类等容易凝集的物质的情况，而且还存在由于培养液中的微生物或培养细胞的一部分死亡而导致产生细胞的破碎物的情况。为了避免这些物质导致的多孔性膜的堵塞，平均细孔径更合适的是在0.1μm以下。
由以上可见，本发明的多孔性膜的平均细孔径优选在0.4μm以下，更优选在0.2μm以下，最优选在0.1μm以下。
一方面，平均细孔径如果过小，多孔性膜的透水性能则降低，膜即使不被污染，也无法进行有效的运转，因此本发明中多孔性膜的平均细孔径优选在0.01μm以上。更优选在0.02μm以上，更合适的是0.04μm以上。
这里，平均细孔径可以通过测定在倍率10,000倍的扫描型电子显微镜观察下，在9.2μm×10.4μm的范围内可以观察到的所有细孔的直径，进行平均后求得。而且，在细孔不成圆状时，用图像处理装置等，求出与细孔的面积相同面积的圆(等价圆)，以等价圆直径作为细孔的直径。
本发明中可以使用的分离膜的细孔径的标准偏差越小，即细孔径大小的分布越窄，则越好。优选细孔径的大小的分布窄，标准偏差在0.1μm以下。细孔径的标准偏差小，即细孔径的大小一致的，能够获得均一特性的透过液，而且装置的运转管理还变得容易了。
细孔径的标准偏差σ可以通过下述(式5)计算得出，该式中以在上述的9.2μm×10.4μm范围内能够观察到的细孔数作为N，以测定的各个直径作为Xk，以细孔直径的平均值作为X(ave)。
[数5]
σ = Σ k = 1 N ( X k - X ( ave ) ) 2 N ....(式5)
在本发明使用的分离膜中，含有化学品的培养液的透过性是重要的性能之一，可以采用使用前的分离膜的纯水透过系数作为透过性的指标。本发明中，分离膜的纯水透过系数使用经反渗透膜处理的25℃的温度的纯化水，以落差高度1m测定透水量计算时，优选为1×10-10m3/m2/s/Pa以上。而且，为了获得实用上足够的透过液量，优选纯水透过系数为2×10- 9m3/m2/s/Pa以上6×10-7m3/m2/s/Pa以下，更优选2×10-9m3/m2/s/Pa以上2×10-7m3/m2/s/Pa以下。
本发明中使用的分离膜的膜表面粗糙度是影响分离膜堵塞的因子。为了使分离膜的剥离系数和膜抵抗适当降低，以更低的膜间差压进行化学品的制造，分离膜的膜表面粗糙度优选在0.1μm以下。由于通过抑制堵塞，可以实现稳定地制造化学品，因此优选表面粗糙度越小越好。
而且，膜表面粗糙度是为了使附着于分离膜表面的微生物或培养细胞容易由于搅拌或通过循环管产生的液流形成的膜面清洗效果而容易剥离的因子之一。根据这种观点，优选分离膜的膜表面粗糙度越小越好，优选在0.1μm以下。表面粗糙度如果在0.1μm以下，附着于膜上的微生物或培养细胞就容易剥离。
此外，通过将多孔性膜的膜表面粗糙度达到0.1μm以下，在微生物或培养细胞的过滤中，能够使膜表面上发生的剪切力降低，抑制对微生物或培养细胞的破坏。其结果是，由于分离膜的堵塞也被抑制，因此可以实现长期稳定的过滤。
这里，所谓膜表面粗糙度，是与膜面方向垂直方向的膜表面变动的平均值，如下所述，可以使用下述的原子力显微镜装置(AFM)测定。
装置：原子力显微镜装置(Digital Instruments(株)制Nanoscope IIIa)
条件
探针：SiN悬臂(Digital Instruments(株)制)
扫描模式   接触模式(气中测定)
水中轻敲(水中测定)
扫描范围   10μm、25μm  四方(气中测定)
5μm、10μm   四方(水中测定)
扫描分辨率 512×512
样品制备：测定时的膜样品，常温下浸渍在乙醇中15分钟后，浸渍于RO水中24小时并洗净后，风干再用。所谓RO水，是采用一种滤膜即反渗透膜(RO膜)进行过滤，排除了离子和盐类等的杂质的水。RO膜的孔的大小大概在2nm以下。
根据上述AFM获得的各点的Z轴方向的高度，用下述的(式6)计算膜表面粗糙度drough。
[数6]
d rough = Σ n = 1 N | Z n - Z ‾ | N ....(式6)
Drough：表面粗糙度(μm)
Zn：Z轴方向的高度(μm)
：扫描范围的平均高度(μm)
N：测定样品数
上述这种分离膜可以配合膜分离槽的形状，适当加工形状。例如，平膜形态的分离膜可以通过与另外准备的支持体组合来制成图3所示的这种分离膜元件。此外，通过用树脂等材料来粘着、封闭中空纤维膜的中空部，可以制成图4所示的分离膜元件。另外，本发明中，从单位体积的膜面积的设置有利这种观点考虑，优选使用中空纤维膜。
以下，采用附图，对这些分离膜元件的概要进行说明。
图3是用于说明采用平膜形态的分离膜的分离膜元件的一个实施方案的概要斜视图。分离膜元件，如图3所示，由在具有刚性的支持板18的两面依次配置流路材料19和分离膜20而构成。支持板18在其两面具有凹部21。分离膜20过滤培养液。流路材料19是使经分离膜20过滤的透过液有效流到支持板18的材料。流到支持板18的含有生产物的透过液通过支持板18的凹部21，经作为排出设备的集液管22，被取出到连续培养装置外部。这里，可以使用以水位差压为代表，泵、通过液体或气体等进行的吸滤、或对装置系统内加压等方法，作为取出透过液的动力。
而且，在配合培养槽需要增大膜面积时，可以通过层叠这种分离膜元件来增大膜面积。
图4是用于说明使用中空纤维形态的分离膜的分离膜元件的概要斜视图，其主要由支持板18，中空纤维形态的分离膜20，上部树脂密封层23和下部树脂密封层24构成。分离膜20被上部树脂密封层23和下部树脂密封层24支撑成束状被粘着和固定在支持板18上。由下部树脂密封层24进行的粘着和固定化形成了密封中空纤维形态的分离膜20的中空部，防止培养液漏出的结构。另一方面，上部树脂密封层23不密封中空纤维形态的分离膜20的中空部，中空部和集液管22连接。该分离膜元件可以通过支持板18设置在连续培养装置内。由分离膜20过滤的透过液通过中空纤维膜的中空部，经集液管22，被取出到连续培养装置外部。作为用于取出透过液的动力，可以使用水位差压、泵、通过液体或气体等进行的吸滤、或对装置系统内加压等方法。
具备分离膜的膜分离槽2理想的是可以进行高压蒸汽灭菌的，这样可以避免杂菌的污染。本发明的所谓高压蒸汽灭菌，是通过蒸汽，对膜分离槽进行加热和加压，使得存在于槽内的微生物或培养细胞灭活。作为加热和加压条件，优选例如在121.1℃、蒸汽压1气压的条件下加压·加温20分钟以上。因此，本发明的连续培养装置的膜分离槽12，和配置在该膜分离槽12中的分离膜、元件构成材料，优选使用具有耐受在这种条件下的高压蒸汽灭菌操作的材料。由此可以进行包含分离膜元件的培养槽内的灭菌。如果培养槽内可以进行灭菌，那么就可以避免在连续培养时被不优选的微生物污染的危险，可以实现稳定的连续培养。
构成分离膜元件的分离膜和支持板等材料优选在高压蒸汽灭菌操作的条件即121.1℃、蒸汽压1气压的条件下20分以上这样的条件下有耐性，只要是这样，则对分离膜和元件构成材料的种类则没有特别限制。作为具有这种耐性的分离膜的原材料，可以采用上述多孔性膜的原材料。此外，作为支持板等元件构成材料，可优选选择例如不锈钢或铝等金属、或者聚酰胺类树脂、氟类树脂、聚碳酸酯类树脂、聚缩醛类树脂、聚对苯二甲酸丁二醇酯类树脂、PVDF、改性聚苯醚类树脂和聚砜类树脂等树脂。
实施例
以下，就本发明，列举实施例、比较例，详细进行说明。
具体地，在实施例1～9、比较例1～4中，对选择L-乳酸作为化学品，具有L-乳酸生产能力的酵母(参考例1)作为微生物或培养细胞，多孔性膜(参考例2：平膜)作为分离膜，使用图2、7、9、13～16任一所示的连续培养装置进行的连续的化学品的制造，进行说明。
另外，在实施例10、比较例5中，对选择尸胺(1，5-戊二胺)作为化学品，具有尸胺生产能力的微生物作为微生物或培养细胞，多孔性膜(参考例2：平膜)作为分离膜，使用图2所示的连续培养装置进行的连续的化学品的制造进行说明。
而且，在实施例11、比较例6中，对选择L-赖氨酸作为化学品，具有L-赖氨酸生产能力的微生物作为微生物或培养细胞，多孔性膜(参考例2：平膜)作为分离膜，使用图2所示的连续培养装置进行的连续的化学品的制造进行说明。
并且，在所有的实施例中，采用蝶阀作为流量控制装置25，由此调节流向膜分离槽的培养液的流量和流入压。
而且，这些实施例是对本发明的一个方案的说明，并不限制本发明。
(参考例1)具有乳酸生产能力的酵母株(SU014株)的制作
本实施例中，作为具有乳酸生产能力的酵母，使用具有序列号1所述的碱基序列的非洲爪蟾(Xenopus laevis)来源的L-ldh基因导入在PDC1启动子下游的酵母。非洲爪蟾来源的L-ldh基因的克隆通过PCR法进行。PCR中，以按照非洲爪蟾的肾脏来源的cDNA文库(STRATAGENE公司制)附带的操作手册制备的噬菌粒DNA作为模板。
PCR扩增反应中使用KOD-Plus聚合酶(东洋纺公司制)，反应缓冲液、dNTPmix等采用试剂盒附带的产品。制备50μl的反应体系，其中如上所述按照附带的操作规程制备的噬菌粒DNA为50ng/样品、引物为50pmol/样品，和KOD-Plus聚合酶为1单位/样品。用PCR扩增装置iCycler(BIO-RAD公司制)，使反应溶液在94℃温度热变性5分钟后，以94℃(热变性)30秒、55℃(引物的退火)30秒、68℃(互补链延伸)1分钟为一个循环，进行30个循环，然后冷却到4℃。并且，基因扩增用引物(序列号2，3)在5末端侧添加SalI识别序列、3末端侧添加NotI识别序列而制备。
纯化PCR扩增片段，用T4多核苷酸激酶(TakaraBio公司制)对末端磷酸化后，连接到pUC118载体(用限制性酶HincII切断，对切断面进行脱磷酸化处理了的载体)中。用DNA连接试剂盒Ver.2(TakaraBio公司制)进行连接。用连接溶液转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞(TakaraBio公司制)，接种到含50μg/mL抗生素氨苄青霉素的LB板上，培养一晚。对生长的菌落，用小型制备法回收质粒DNA，用限制性酶SalI和NotI切断，选择出插入了非洲爪蟾来源的ldh基因的质粒。这一系列操作都按照附带的操作规程进行。
用限制性酶SalI和NotI切断插入了上述非洲爪蟾来源的L-ldh基因的PUC118载体，通过1％琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，按照常规方法纯化含有非洲爪蟾来源的L-ldh基因的片段。获得的含有L-ldh基因的片段连接到图5所示的表达载体pTRS11的XhoI/NotI切断部位中，用与上述相同方法回收质粒DNA，通过用限制性酶XhoI和NotI切断，选择出插入了非洲爪蟾来源的ldh基因的表达载体。以后，将这样制作的整合了非洲爪蟾来源的L-ldh基因的表达载体称为pTRS102。
以该pTRS102作为扩增模板，通过以寡核苷酸(序列号4，5)作为引物组的PCR，扩增出含有非洲爪蟾来源的L-ldh基因和TDH3终止子序列的1.3kb的PCR片段。这里，序列号4被设计成添加了对应于PDC1基因的起始密码子上游60bp的序列。
然后，以质粒pRS424作为扩增模板，通过以寡核苷酸(序列号6，7)作为引物组的PCR，扩增出含有作为酵母选择标记的TRP1基因的1.2kb的PCR片段。这里，序列号7被设计成添加了对应于PDC1基因终止密码子下游60bp的序列。
用1％琼脂糖凝胶电泳分离各个DNA片段，按常规方法纯化。以混合了此处获得的各1.3kb片段、1.2kb片段的混合物作为扩增模板，通过以寡核苷酸(序列号4，7)作为引物组的PCR法，扩增出了在5末端和3末端分别添加了对应于PDC1基因的上游和下游60bp的序列的连接了非洲爪蟾来源的L-ldh基因、TDH3终止子和TRP1基因的约2.5kb的PCR片段。
用1％琼脂糖凝胶电泳分离上述PCR片段，按常规方法纯化后，转化酵母中的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)NBRC10505株，用色氨酸非添加培养基进行培养，选择出非洲爪蟾来源的L-ldh基因导入在染色体上的PDC1基因启动子下游的转化株。
按下述方式对用上述方式获得的转化株为非洲爪蟾来源的L-ldh基因导入在染色体上PDC1基因启动子下游的酵母进行确认。首先，用基因组DNA提取试剂盒“Genとるくん”(注册商标)(Takarabio公司制)制备转化株的基因组DNA，以其作为扩增模板，通过以寡核苷酸(序列号8，9)作为引物组的PCR，确认获得了约2.8kb的扩增DNA片段。而且，非转化株中，通过上述PCR获得了约2.1kb的扩增DNA片段。以下，将上述非洲爪蟾来源的L-ldh基因导入在染色体上的PDC1基因启动子下游的转化株称为B2株。而且，PDC1基因的上游和下游序列可以从酵母属基因组数据库(URL：http://www.yeastgenome.org/)获得。
然后，使国际公开WO2007/097260号小册子中记载的pdc1基因置换为TRP1标记，且pdc5基因中具有温度感受性变异的酵母SW015株与上述获得的B2株接合，获得2倍体细胞。使该2倍体细胞在子囊形成培养基中形成子囊。用显微操作器解剖子囊，获得各个单倍体细胞，研究各个单倍体细胞的营养缺陷型。从获得的单倍体细胞中，选择出在pdc1基因座中插入了非洲爪蟾(Xenopus laevis)来源的ldh基因，且pdc5基因中具有温度感受性变异的(34℃不能生长)株。获得的酵母株称为SU014株。
并且，在下述所示的条件下通过HPLC法测定SC培养基(METHODSIN YEAST GENETICS 2000 EDITION，CSHL PRESS)中培养了转化细胞的培养上清中所含乳酸，从而确认SU014株是否具有乳酸生产能力。
柱：    Shim-Pack SPR-H(岛津社制)
移动相：5mM对甲苯磺酸(流速0.8mL/分钟)
反应液：5mM对甲苯磺酸、20mM Bis-Tris、0.1mM EDTA·2Na(流速0.8mL/分钟)
检测方法：导电性
温度：    45℃。
此外，L-乳酸的光学纯度测定在以下条件下通过HPLC法测定。
柱：      TSK-gel Enantio L1(东曹株式会社制)
移动相：  1mM硫酸铜水溶液
流速：    1.0ml/分钟
检测方法：UV254nm
温度：    30℃。
另外，L-乳酸的光学纯度用下式计算。
光学纯度(％)＝100×(L-D)/(L+D)
其中，L表示L-乳酸的浓度，D表示D-乳酸的浓度。
HPLC分析的结果是，检测到L-乳酸，D-乳酸在检测界限以下。根据以上研究，确认了该SU014株具有L-乳酸生产能力。
(参考例2)多孔性平膜的制作
分别使用聚偏氟乙烯(PVDF)树脂作为树脂，并且N，N-二甲基乙酰胺(DMAc)作为溶剂，在90℃的温度下将它们充分搅拌，获得了具有以下组成的原液。
·PVDF：13.0重量％
·DMAc：87.0重量％。
接着，上述原液在冷却到25℃的温度后，涂布在预先贴附在玻璃板上的密度为0.48g/cm3、厚度为220μm的聚酯纤维制无纺布(多孔质基材)上，立即浸渍于25℃温度的具有下述组成的凝固浴中5分钟，获得了在多孔质基材上形成了多孔质树脂层的多孔质性膜。
·水：30.0重量％
·DMAc：70.0重量％。
将该多孔质性膜从玻璃板上剥离后，浸渍于80℃温度的热水中3次，洗出DMAc，获得了分离膜(多孔性膜)。用扫描型电子显微镜以10,000倍的倍率观察多孔质树脂层表面9.2μm×10.4μm的范围，能够观察到的所有细孔的直径平均值为0.1μm。然后，对上述分离膜的纯水透过系数进行评价，结果是50×10-9m3/m2·s·Pa。纯水透水量的测定用通过反渗透膜获得的25℃温度的纯化水，以1m的落差高度进行。另外，细孔径的标准偏差为0.035μm，膜表面粗糙度为0.06μm。
(实施例1)
使用参考例1制备的SU014株，通过图2所示的连续培养装置进行连续培养，制造L-乳酸。并且，使用原料糖培养基(60g/L优糖精(ムソ一株式会社制)、1.5g/L硫酸铵)作为培养基。该原料糖培养基在121℃的温度高压(2个大气压)蒸汽灭菌处理15分钟后再使用。分离膜元件材料使用不锈钢和聚砜树脂树脂的成型品，分离膜使用参考例2制作的多孔性平膜。使用隔膜式泵“APLS-20”(タクミナ社)作为送液管17内的泵5，使用蠕动泵作为用于从膜分离槽中取出透过液的泵4。而且，实施例中的运转条件如下。
培养槽容量：20(L)
使用分离膜：PVDF过滤膜(参考例2中制作)
膜分离槽容量：5(L)
膜分离元件有效过滤面积：4000cm2
温度调节：32(℃)
培养槽通气量：空气1(L/分钟)
培养槽搅拌速度：100(rpm)pH调节：用8N氢氧化钙调节到pH5
培养基供给速度：用培养槽内的水位感应器12可变控制
灭菌：膜分离槽、培养槽和使用培养基都采用121℃、0.2MPa、20分钟的加压蒸汽灭菌
泵4的流量：3L/小时
送液管15、17的最大内径：50mm
泵5的输出：5L/分钟
送液管15，17的线流速：4.2cm/秒
滤过流量：0.180m/天
回收率：非控制(1％以下)。
于是，作为前培养，在试管中用5ml的原料糖培养基振荡培养SU014株一夜(前前前培养)。在100ml新鲜的原料糖培养基中接种获得的培养液，用500ml容坂口烧瓶，30℃振荡培养24小时(前前培养)。将获得的培养液接种在1000ml新鲜的原料糖培养基中，用3000ml容坂口烧瓶，30℃振荡培养24小时(前培养)。
将该前培养液接种在培养槽1和膜分离槽内的总计20L的乳酸发酵培养基中，用附带的搅拌机搅拌培养槽内，进行通气量的调节、温度调节、pH调节，在进行50小时培养后，使泵4运转，取出含有L-乳酸的透过液。此时，一天一次测定向膜分离槽2流入的培养液的压力，调节设置在旁通管26中的流量控制装置25(蝶阀)，使得计示压力达到0.1MPa。
进行250小时培养，测定培养槽中的酵母浊度、作为透过液中的生产物质的乳酸浓度、糖浓度，计算出乳酸的对糖收率。其结果示于图10、表1。并且，乳酸浓度用参考例1所示的方法测定。酵母浊度通过用光度计在600nm的吸光来测定。此外，所谓乳酸的对糖收率，是生产出的乳酸重量相对于消耗的糖重量的比例，用下述(式7)计算。
[数7]
Figure BDA0000052877920000441
糖浓度的测定在以下条件下通过HPLC法测定。
柱：Luna NH2 250x4.6mm(Phenomenex公司制)
移动相：水∶乙腈＝25∶75
流速：0.6ml/分钟
检测方法：RI(差示折射仪)
应答：4
极性：+
温度：30℃。
(比较例1)
除了使用图9所示的连续培养装置以外，其余与实施例1一样的方式进行连续培养，测定酵母浊度、作为生产物质的乳酸浓度。并且，除图9所示的装置不设置旁通管26、流量控制装置25和膜分离槽阀开关27、28以外，其余与图2所示装置的构成一样。
结果示于图11、表1。并且，对连续培养中向膜分离槽供给的培养液的压力测定的结果示于图12。
比较例1中，由于不控制向膜分离槽供给的培养液的压力，因此如图12所示，压力在连续培养中变化，从培养开始250小时时变化到1MPa以上。而且，酵母浊度和生产的乳酸浓度都低于实施例1，乳酸的对糖收率在250小时的连续培养后为63％。
根据以上内容，可以确认由于用旁通管26和设置在其中的流量控制装置25调节培养液向膜分离槽的流入，产生了酵母的高密度培养、乳酸(化学品)浓度提高且乳酸对糖收率提高这些无法预想的效果。
(实施例2)
使用实施例1中完成了培养的连续培养装置和培养液，以循环管内的线流速达到0.5、1.5、2.5cm/秒，分别进行2小时送液，测定沉淀在配管内，累积的菌体的量。其结果示于图6。这样可以说，通过使循环管内的培养液线速度达到2.5cm/秒以上，可以以菌体不沉淀在配管内的方式循环培养液。
(实施例3)
除了将泵5的输出改变为10L/分钟以外，其余以与实施例1同样的方式进行连续培养。测定进行100小时的培养后和进行250小时的培养后的培养槽中的酵母浊度、作为透过液中的生产物质的乳酸浓度、糖浓度，再计算乳酸的对糖收率。结果示于表1。
实施例3比实施例1的乳酸浓度、乳酸的对糖收率要降低一些。我们认为这是因为，通过使循环流量(泵5)增加，恐怕培养槽的液体混合状态发生了变化。
(比较例2)
除了使用图9中所示的连续培养装置以外，其余均以与实施例3相同方式进行连续培养。
由于在比较例2中，没有控制向膜分离槽供给的培养液的压力，因此连续培养中膜分离槽内压力增加，培养开始70小时时达到1MPa以上，如果再继续运转，培养液就开始从膜分离槽泄漏，形成了无法实施连续培养的状态。
通过实施例3和比较例2，清楚了无旁通管26，就无法实施连续培养，通过设置在旁通管26中的流量控制装置25调节培养液向膜分离槽的流入，可以说具有可以稳定地实施连续培养的效果。
(实施例4)
使用图7所示的连续培养装置，除了泵5的输出为5L/分钟，泵16的输出为10L/分钟以外，其余与实施例3一样的方式进行连续培养。
测定进行了100小时培养后和250小时培养后的培养槽中的酵母浊度、作为透过液中的生产物质的乳酸浓度、糖浓度，再计算出乳酸的对糖收率。结果示于表1。
其结果，与实施例1相反，即使通过泵16，与实施例3同样增加循环流量，由于通过泵16控制返回培养槽的液体的流量，乳酸浓度、酵母浊度和乳酸的对糖收率也都可以达到与循环流量改变前的实施例1同等的成绩。
(比较例3)
除了使用图13所示的连续培养装置以外，其余与实施例4相同的方式进行连续培养。并且，除了图13所示的装置没有设置旁通管26、流量控制装置25和膜分离槽阀27、28之外，其余结构与图7所示的装置相同。
由于比较例3中不控制向膜分离槽供给的培养液的压力，因此连续培养中压力增加，在培养开始的70小时时达到1MPa以上，如果再继续运转，培养液就开始从膜分离槽泄漏，形成了无法实施连续培养的状态。
(实施例5)
除了使用图14所示的连续培养装置以外，其余与实施例3同样方式进行连续培养。并且，图14所示的装置除了送液管15在浸渍于培养槽1中存储的培养液中的位置开口以外，其余结构和图2所示装置相同。
测定进行了100小时培养后和250小时培养后的培养槽中的酵母浊度、作为透过液中的生产物质的乳酸浓度、糖浓度，再计算出乳酸的对糖收率。结果示于表1。
其结果，与实施例1相反，即使通过泵5，与实施例3同样增加循环流量，由于通过将液体返回到培养槽的位置设置在浸渍于培养液中的位置，乳酸浓度、酵母浊度和乳酸的对糖收率也都可以达到与循环流量改变前的实施例1同等的成绩。
(比较例4)
除了使用图15所示的连续培养装置以外，其余与实施例5相同的方式进行连续培养。并且，除了图15所示的装置没有设置旁通管26、流量控制装置25和膜分离槽开关阀27、28之外，其余结构与图14所示的装置相同。
由于比较例4中不控制向膜分离槽供给的培养液的压力，因此连续培养中压力增加，在培养开始的70小时时达到1MPa以上，如果再继续运转，培养液就开始从膜分离槽泄漏，形成了无法实施连续培养的状态。
[表1]
Figure BDA0000052877920000481
(实施例6)
使用图16所示的连续培养装置，根据流量计30的值计算回收率，通过泵4调节透过液取出流量使得回收率达到1.5％，与此同时进行连续培养，并且经过250小时后，继续连续培养之外，其余与实施例1一样进行连续培养。而且，图16所示的装置除了设置流量计30以外，其余与图2所示的装置相同。同时，经时测定作用于分离膜3的膜间差压，评价自膜间差压的骤然上升引起的膜的闭塞时间。
图17中示出了测定的膜间差压的推移。自运转开始经过1000小时，膜间差压稳定，以1.5％的回收率运转，可以实现长时间稳定地通过连续培养制造L-乳酸。此外，连续培养完成时测定并计算的培养槽中酵母浊度、作为透过液中的生产物质的乳酸浓度、糖浓度、乳酸的对糖收率的结果示于表2。
(实施例7)
除了回收率为3.0％以外，其余与实施例6同样方式进行连续培养。
图17中示出了测定的膜间差压的推移。自运转开始经过800小时，膜间差压稳定，即使以3.0％的回收率运转，也可以实现长时间稳定地通过连续培养制造L-乳酸。此外，连续培养完成时测定并计算的培养槽中酵母浊度、作为透过液中的生产物质的乳酸浓度、糖浓度、乳酸的对糖收率的结果示于表2。
(实施例8)
除了回收率变成9.9％以外，其余与实施例6同样方式进行连续培养。
图17中示出了测定的膜间差压的推移。自运转开始经过550小时，膜间差压稳定，即使在回收率9.9％，也可以实现稳定地通过连续培养制造L-乳酸。此外，连续培养完成时测定并计算的培养槽中酵母浊度、作为透过液中的生产物质的乳酸浓度、糖浓度、乳酸的对糖收率的结果示于表2。
(实施例9)
除了回收率变成12.0％以外，其余与实施例6同样方式进行连续培养。
图17中示出了测定的膜间差压的推移。自运转开始100小时时，膜间差压急剧上升，膜细孔关闭。此外，连续培养完成时测定并计算的培养槽中酵母浊度、作为透过液中的生产物质的乳酸浓度、糖浓度、乳酸的对糖收率的结果示于表2。在进行100小时连续培养后的培养槽中的乳酸浓度为45g/L。而且，酵母浊度增加到OD600为100，乳酸的对糖收率为80％。
然而，过滤变困难了，超过100小时，难以通过连续培养继续制造L-乳酸。
以上，根据实施例6～9的结果，可以确认，通过以将回收率调节到10％以下的方式进行连续培养运转，可以进行长时间(500小时以上)的连续培养运转的这种无法预料的显著效果。
[表2]
  实施条件   实施例6   实施例7   实施例8   实施例9
  化学品   乳酸   乳酸   乳酸   乳酸
  微生物   SU014   SU014   SU014   SU014
  装置   图16   图16   图16   图16
  泵4   变化   变化   变化   变化
  泵5   5L/min   5L/min   5L/min   5L/min
  泵16   -   -   -   -
  滤过流量   变化   变化   变化   变化
  回收率   1.50％   3.00％   9.90％   12.00％
  培养时间   1000h   800h   550h   100h
  化合物浓度   45g/L   45g/L   45g/L   45g/L
  微生物浓度   320   270   250   100
  对糖收率   80％   80％   80％   80％
(实施例10)
使用特开2004-222569号公报所述的谷氨酸棒杆菌TR-CAD1株，通过图2所示的连续培养装置进行连续培养，制造尸胺。而且，使用表3所示组成的尸胺生产培养基作为培养基。该尸胺生产培养基于121℃的温度高压(2个大气压)蒸汽灭菌处理15分钟后再使用。分离膜元件材料使用不锈钢和聚砜树脂树脂的成型品，分离膜使用参考例2制作的多孔性平膜。使用隔膜式泵“APLS-20”(タクミナ社)作为送液管17内的泵5，使用蠕动泵作为用于从膜分离槽中取出透过液的泵4。
[表3]
Figure BDA0000052877920000511
而且实施例中的条件如下。
培养槽容量：20(L)
使用分离膜：PVDF过滤膜(参考例2中制作)
膜分离槽容量：5(L)
膜分离元件有效过滤面积：4000cm2
温度调节：30(℃)
培养槽通气量：空气3(L/分钟)
培养槽搅拌速度：100(rpm)pH调节：用3M HCl和3M氨水调节到pH7.0
培养基供给速度：用培养装置内的液面水位感应器可变控制
灭菌：膜分离槽、培养槽和使用培养基都采用121℃、0.2MPa、20分钟的加压蒸汽灭菌
泵4的流量：3L/小时
送液管15、17的最大内径：50mm
泵5的输出：5L/分钟
送液管15，17的线流速：4.2cm/秒
滤过流量：0.180m/天
回收率：非控制(1％以下)。
于是，作为前培养，在试管中用添加了5ml卡那霉素(25μg/ml)的尸胺生产培养基振荡培养TR-CAD1株一晚(前前前培养)。在50ml新鲜的添加了卡那霉素(25μg/ml)的尸胺生产培养基中接种获得的培养液，用500ml容坂口烧瓶，在30℃的温度，以振幅30cm、在180rpm的条件下，培养24小时(前前培养)。将获得的培养液接种在1000ml新鲜的尸胺生产培养基中，用3000ml容坂口烧瓶，30℃振荡培养24小时(前培养)。将该前培养液接种在培养槽1和膜分离槽2内的总计20L的尸胺生产培养基中，用附带的搅拌机搅拌培养槽内，进行通气量的调节、温度调节、pH调节，在进行50小时培养后，使泵4运转，取出含有尸胺的透过液。
此时，一天一次测定向膜分离槽2流入的培养液的压力，调节设置在旁通管26中的流量控制装置25(蝶阀)，使得计示压力达到0.1MPa。
进行250小时培养，测定培养槽中的酵母浊度、作为透过液中的生产物质的尸胺浓度、糖浓度，再计算尸胺的对糖收率。其结果示于图18、表4中。尸胺浓度为3.5g/L。此外，棒杆菌浊度通过用光度计在600nm的吸光来测定。尸胺的对糖收率为3％。
而且，尸胺浓度用以下方法测定。
[通过HPLC进行的尸胺浓度的分析方法]
·使用柱：CAPCELL PAK C18(资生堂)
·移动相：0.1％(w/w)磷酸水溶液∶乙腈＝4.5∶5.5
·检测：UV360nm
·试样前处理：在25μl分析试样中，作为内标，添加混合25μl 1，4-二氨基丁烷(0.03M)，150μl的碳酸氢钠(0.075M)，和2，4-二硝基氟苯(0.2M)的乙醇溶液，于37℃的温度保温1小时。
将上述的反应溶液50μl溶解于1ml的乙腈后，以10,000rpm离心5分钟后，对10μl的其上清进行HPLC分析。
(比较例5)
除了使用图9所示的装置以外，其余与实施例10一样的方式进行连续培养，测定棒杆菌浊度、作为生产物质的尸胺浓度。并且，除图9所示的装置不设置旁通管26、流量控制装置25和膜分离槽阀开关27、28以外，其余与图2所示装置的构成一样。
结果示于图19、表4。并且，对连续培养中向膜分离槽供给的培养液的压力测定的结果示于图20。
[表4]
  实施条件   实施例10   比较例5
  化学品   尸胺   尸胺
  微生物   TR-CAD1   TR-CAD1
  装置   图2   图9
  泵4   3L/hr   3L/hr
  泵5   5L/min   5L/min
  泵16   -   -
  滤过流量   0.180m/天   0.180m/天
  回收率   1％以下   1％
  培养时间   250h   250h
  化合物浓度   3.5g/L   1.2g/L
  微生物浓度   250   100
  对糖收率   3％   1％
由于比较例5中不控制向膜分离槽供给的培养液的压力，因此如图20所示，连续培养中压力变化，在培养开始后的225小时时达到1MPa以上。而且，棒杆菌浊度、尸胺浓度均低于实施例10。而且，尸胺的对糖收率为1.0％。
由以上可以确认，由于用旁通管26和设置在其中的流量控制装置25调节培养液向膜分离槽的流入，棒杆菌的高密度培养、尸胺(化学品)浓度提高且尸胺的对糖收率提高这些无法预想的效果。
(实施例11)
使用特开2008-212138号公报所述的谷氨酸棒杆菌Δ-HOM株，通过图2所示的连续培养装置进行连续培养，制造L-赖氨酸。而且，使用表5所示组成的L-赖氨酸生产培养基作为培养基。该L-赖氨酸生产培养基于121℃的温度高压(2个大气压)蒸汽灭菌处理15分钟后再使用。分离膜元件材料使用不锈钢和聚砜树脂的成型品，分离膜使用参考例2制作的多孔性平膜。使用隔膜式泵“APLS-20”(タクミナ社)作为送液管17内的泵5，使用蠕动泵作为用于从膜分离槽中取出透过液的泵4。
[表5]
Figure BDA0000052877920000541
而且实施例中的条件如下。
培养槽容量：20(L)
使用分离膜：PVDF过滤膜(参考例2中制作)
膜分离装置液量：5(L)
膜分离元件有效过滤面积：4000cm2
温度调节：30(℃)
培养槽通气量：空气5(L/分钟)
培养槽搅拌速度：300(rpm)pH调节：用3M HCl和3M氨水调节到pH7.3
培养基供给速度：用培养装置内的液面水位感应器可变控制
灭菌：膜分离槽、培养槽和使用培养基都采用121℃、0.2MPa、20分钟的加压蒸汽灭菌
泵4的流量：3L/小时
送液管15、17的最大内径：50mm
泵5的输出：5L/分钟
送液管15，17的线流速：4.2cm/秒
滤过流量：0.180m/天
回收率：非控制(1％以下)。
于是，作为前培养，在试管中用5ml的BY培养基(0.5％酵母提取物、0.7％肉膏、1％蛋白胨、0.3％氯化钠)振荡培养Δ-HOM株一晚(前前前培养)。将获得的培养液接种在50ml的L-赖氨酸生产培养基中，用500ml容坂口烧瓶，在30℃的温度，以振幅30cm、在180rpm的条件下，培养24小时(前前培养)。将获得的培养液接种在1000ml新鲜的L-赖氨酸生产培养基中，用3000ml容坂口烧瓶，30℃振荡培养24小时(前培养)。将该前培养液接种在培养槽1和膜分离槽内的20L的L-赖氨酸生产培养基中，用附带的搅拌机搅拌培养槽内，进行通气量的调节、温度调节、pH调节，在进行50小时培养后，使泵4运转，取出含有L-赖氨酸的透过液。
此时，一天一次测定向膜分离槽2流入的培养液的压力，调节设置在旁通管26中的流量控制装置25(蝶阀)，使得计示压力达到0.1MPa。
进行250小时培养，测定培养槽中的棒杆菌浊度、作为透过液中的生产物质的L-赖氨酸浓度、糖浓度，再计算L-赖氨酸浓度的对糖收率。其结果示于图21、表6。L-赖氨酸浓度为6.0g/L。此外，棒杆菌浊度通过用光度计在600nm的吸光来测定。L-赖氨酸的对糖收率为5.5％。此外，L-赖氨酸浓度按与尸胺浓度的测定法相同的方法测定。
(比较例6)
除了使用图9所示的装置以外，其余与实施例11同样的方式进行连续培养，测定棒杆菌浊度、作为生产物质的L-赖氨酸浓度。并且，除图9所示的装置不设置旁通管26、流量控制装置25和膜分离槽阀开关27、28以外，其余与图2所示装置的构成一样。
结果示于图22、表6。并且，对连续培养中向膜分离槽供给的培养液的压力测定的结果示于图23。
[表6]
  实施条件   实施例11   比较例6
  化学品   L-赖氨酸   L-赖氨酸
  微生物   Δ-HOM   Δ-HOM
  装置   图2   图9
  泵4   3L/hr   3L/hr
  泵5   5L/分钟   5L/分钟
  泵16   -   -
  滤过流量   0.180m/天   0.180m/天
  回收率   1％以下   1％
  培养时间   250h   250h
  化合物浓度   6.0g/L   1.2g/L
  微生物浓度   250   100
  对糖收率   5.5％   1.1％
由于比较例6中不控制向膜分离槽供给的培养液的压力，因此如图23所示，连续培养中压力变化，在培养开始后的225小时时达到1MPa以上。而且，棒杆菌浊度、L-赖氨酸浓度均低于实施例11。而且，L-赖氨酸的对糖收率为1.1％。
由以上可以确认，由于用旁通管26和设置在其中的流量控制装置25调节培养液向膜分离槽的流入，产生棒杆菌的高密度培养、L-赖氨酸(化学品)浓度提高且L-赖氨酸的对糖收率提高这些无法预想的效果。
工业实用性
本发明能够合适地用于醇、有机酸、氨基酸、核酸、酶、抗生素、重组蛋白质等通过微生物培养可以获得的各种化学品的生产。
符号说明
1.培养槽
2、2’.膜分离槽
3、3’.分离膜
4.过滤泵
5.泵
6.培养基供给泵
7.搅拌轴
8.气体供给管
9.pH传感器
10.中和剂泵
11.温度调节器
12.水位感应器
13.大气压开放部
14A.汇合点
14B.分支点
15.送液管(未过滤培养液向培养槽返回)
16.泵
17.送液管
18.支持板
19.流路材料
20.分离膜
21.凹部
22.集液管
23.上部树脂密封层
24.下部树脂密封层
25.流量控制装置
26.旁通管
27、27’.膜分离槽开闭阀(培养基供给侧)
28、28’.膜分离槽开闭阀(培养基排出侧)
29.压力计
30.流量计
Figure IDA0000052878010000011
Figure IDA0000052878010000021
Figure IDA0000052878010000031

Claims (14)

1.使由培养槽送液的培养液的一部分，根据膜分离槽的培养液流入侧压力，绕过膜分离槽的化学品的制造方法，该方法是在培养槽中培养微生物或培养细胞，由培养槽向膜分离槽输送培养液，再用分离膜过滤，从透过液中回收作为化学品的发酵生产物，同时使未经过滤的未过滤培养液以与膜分离槽上游侧的培养液汇合的方式回流。
2.根据权利要求1所述的化学品的制造方法，其以膜分离槽的培养液流入侧的计示压力为1MPa以下那样，控制绕过膜分离槽的培养液的流量。
3.根据权利要求1或2所述的化学品的制造方法，其使未过滤培养液的一部分以与培养槽内的培养液汇合的方式回流，同时使未过滤培养液的其余部分以与培养槽至膜分离槽之间的培养液汇合的方式回流。
4.根据权利要求3所述的化学品的制造方法，其相互独立地控制以与培养槽至膜分离槽之间的培养液汇合方式回流的未过滤培养液的流量，和以与培养槽内的培养液汇合方式回流的未过滤培养液的流量。
5.权利要求3或4所述的化学品的制造方法，以与培养槽内的培养液汇合方式回流的未过滤培养液的流量相对于以与培养槽至膜分离槽之间的培养液汇合方式回流的未过滤培养液的流量之比在1以下。
6.根据权利要求1～5任一项所述的化学品的制造方法，由培养槽向膜分离槽输送的培养液的线流速、以由膜分离槽向该膜分离槽上游侧的培养液汇合的方式回流的未过滤培养液的线流速、以及绕过膜分离槽的培养液的线流速都在2.5cm/秒以上。
7.根据权利要求1～6任一项所述的化学品的制造方法，调节流入膜分离槽的培养液量和/或自分离膜的透过液量，以便自分离膜的透过液量相对于流入膜分离槽的培养液量的回收率为10.0％以下。
8.根据权利要求1～7任一项所述的化学品的制造方法，培养槽中培养液体积与膜分离槽中培养液体积之比为4以上100以下。
9.具备膜分离槽的旁通管、膜分离槽的培养液流入侧压力的检测装置、和设置在旁通管的流量控制装置的连续培养装置，该连续培养装置具备用于培养微生物或培养细胞的培养槽，具备用于回收来自培养槽的培养液中生产的发酵生产物的分离膜的膜分离槽，连接培养槽与膜分离槽并在将培养液输送到前述膜分离槽的同时使未经分离膜过滤的未过滤培养液以与膜分离槽上游侧的培养液汇合的方式回流的循环管，和设置在循环管的培养液送液装置。
10.根据权利要求9所述的连续培养装置，所述流量控制装置是由检测装置的结果联动而运转的。
11.根据权利要求9或10所述的连续培养装置，其具备循环管的线流速检测装置，流量控制装置和/或前述培养液送液装置是根据该线流速检测装置的结果而运转的。
12.根据权利要求9～11任一项所述的连续培养装置，所述膜分离槽安装在具有与前述培养液送液装置不同的送液装置、且与培养槽独立的循环回路内。
13.根据权利要求9～12任一项所述的连续培养装置，循环管在浸渍于培养槽中存留的培养液中的位置开口。
14.根据权利要求9～13任一项所述的连续培养装置，培养槽体积与膜分离槽体积之比在4以上100以下。
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