BRPI0707027B1 - Método de fabricação de um produto químico e aparelho de fermentação contínua - Google Patents

Método de fabricação de um produto químico e aparelho de fermentação contínua Download PDF

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Katsushige Yamada
Takashi Mimitsuka
Kenji Sawai
Tetsu Yonehara
Yohito Ito
Masahiro Henmi
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Abstract

MÉTODO DE FABRICAÇÃO DE UM PRODUTO QUÍMICO E APARELHOS DE FERMENTAÇÃO CONTÍNUA A presente invenção fornece método de fabricação de produto químico por meio de fermentação continua, que inclui a filtragem de cultivo de microorganismo ou células cultivadas com membrana de separação para recuperar produto de filtrado, retenção simultânea de fluido não filtrado no cultivo ou envio para ele em refluxo e adição de materiais de fermentação ao cultivo, em que membrana porosa que possui tamanho médio de poro de 0,01 um ou mais a menos de 1 um é utilizada como membrana de separação e a filtragem é conduzida com diferença de pressão transmembrana na faixa de 0,1 a 20 kPa. Segundo este método, a produtividade de fermentação do produto químico pode ser grandemente elevada sob alta estabilidade e baixo custo.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção refere-se a um método de fabricação de um produto químico e aparelhos de fermentação contínua.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] O método de fermentação que é um método de produção de uma substância, que envolve a cultura de microrganismo ou células cultivadas, pode ser grosseiramente classificado em (1) método de fermentação em bateladas ou método de fermentação em bateladas alimentadas e (2) método de fermentação contínua.
[003] O método de fermentação ou fermentação alimentada possui vantagens tais como instalações simples e menos danos por bactérias contaminantes por ser cultura de curto prazo. A concentração de produto em cultura aumenta com o tempo, entretanto, para reduzir a produtividade e o rendimento devido à influência de pressão osmótica ou inibição pelo produto. Conseqüentemente, é difícil manter alto rendimento e alta produtividade de forma estável por longo período.
[004] O método de fermentação contínua é caracterizado pelo fato de que alto rendimento e alta produtividade podem ser mantidos por longo período, evitando acúmulo de substância objetiva em alta concentração em fermentador. Foram descritos métodos de fermentação contínua para a fermentação de ácido L-glutâmico e L-lisina (Documento Não Patente 1). Nestes exemplos, entretanto, materiais brutos são alimentados continuamente a cultura enquanto cultura que contém microrganismos e células é retirada, de forma que os microrganismos e as células na cultura sejam diluídos e, portanto, o aumento da eficiência de produção é limitado.
[005] No método de fermentação contínua, propôs-se que microrganismos e células cultivadas sejam filtrados com membrana de separação para recuperar produto de filtrado, enquanto os microrganismos filtrados e células cultivadas são retidos em cultura ou enviados para dita cultura em refluxo, de forma a manter alta densidade dos microrganismos e células cultivadas na cultura.
[006] Foram descritos, por exemplo, métodos de fermentação contínua em aparelho de fermentação contínua utilizando membrana de cerâmica (Documentos de Patente 1, 2 e 3). Os métodos descritos, entretanto, possuem problema na redução da velocidade de fluxo de filtragem e eficiência de filtragem causados pela obstrução da membrana de cerâmica e, para evitar esta obstrução, conduz-se lavagem reversa ou similar.
[007] Foi descrito processo de produção de ácido succínico utilizando membrana de separação (Documento de Patente 4). Neste método, utiliza-se alta pressão de filtragem (cerca de 200 kPa) em separação de membrana. Esta alta pressão de filtragem não apenas apresenta desvantagem de custos, mas também causa danos físicos para os microrganismos e células por pressão em tratamento de filtragem e, portanto, não é apropriada para fermentação contínua, em que microrganismos e células são devolvidos continuamente para cultura.
[008] Cultura contínua convencional é método de cultura em que meio novo é alimentado em velocidade constante para fermentador e cultura na mesma quantidade do meio é descarregado do fermentador, de forma a manter o volume de fluido no fermentador sempre constante. Em cultura de bateladas, a cultura é encerrada quando substrato inicial é consumido, enquanto, em cultura contínua, a cultura pode teoricamente prosseguir infinitamente. Isso significa que a fermentação infinita é teoricamente viável.
[009] Na cultura contínua convencional, por outro lado, microrganismos junto com cultura são descarregados de fermentador, de forma que a densidade de microrganismos no fermentador dificilmente é mantida alta. Caso microrganismos de fermentação possam ser mantidos em alta densidade em produção de fermentação, a eficiência da produção de fermentação por volume de fermentação pode ser aumentada. Com este propósito, os microrganismos deverão ser retidos em fermentador ou a ele conduzidos em refluxo. O método em que microrganismos são retidos em fermentador, ou a ele conduzidos em refluxo, inclui método que envolve a separação de sólidos e líquidos de cultura descarregada por gravidade, tal como centrifugação, e retorno de microrganismos precipitados para fermentador, bem como método que envolve filtragem para separar microrganismos na forma de sólidos e descarga de sobrenadante de cultura somente a partir de fermentador. O método que utiliza centrifugação, entretanto, não é prático devido ao alto custo de energia. O método que utiliza filtragem necessita de alta pressão para filtragem conforme descrito acima e foi examinado principalmente em nível de laboratório.
[010] Conforme descrito acima, os métodos de fermentação contínua convencionais sofrem vários problemas e dificilmente são industrialmente aplicáveis.
[011] Isso significa que ainda é difícil no método de fermentação contínua atingir alta produtividade de substâncias por meio da filtragem de microrganismos e células com membrana de separação, de forma a recuperar produto de filtrado e causar refluxo simultâneo dos microrganismos e células para cultura para aumentar a densidade dos microrganismos e células na cultura e manter a sua densidade alta. Desta forma, tem havido demanda por técnicas inovadoras.
[012] Documento de Patente 1: Pedido de Patente Japonês em Aberto n° 5-95778.
[013] Documento de Patente 2: JP-A N° 62-138184.
[014] Documento de Patente 3: JP-A N° 10-174594.
[015] Documento de Patente 4: JP-A N° 2005-333886.
[016] Documento Não Patente 1: Toshihiko Hirao et al, Appl. Microbiol. Biotechnol., 32, 269-273 (1989).
DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO
[017] A presente invenção refere-se a método de fabricação de um produto químico por meio de fermentação contínua, que inclui a filtragem de uma cultura de um microrganismo ou células cultivadas com uma membrana de separação para recuperar um produto de um filtrado, retenção simultânea de fluido não filtrado na cultura, ou envio em refluxo para dita cultura, e adição de materiais de fermentação à cultura, em que uma membrana porosa que possui um tamanho médio de poro de 0,01 μm ou mais a menos de 1 μm é utilizada como membrana de separação e a filtragem é conduzida com uma diferença de pressão transmembrana na faixa de 0,1 a 20 kPa.
[018] A presente invenção refere-se ao método de fabricação de um produto químico, em que o coeficiente de permeabilidade da água purificada para a membrana porosa é de preferencialmente 2 x 10-9 m3/m2/s/Pa ou mais a 6 x 10-7 m3/m2/s/Pa ou menos.
[019] A presente invenção refere-se ao método de fabricação de um produto químico, em que o tamanho médio de poro da membrana porosa é de preferencialmente 0,01 μm ou mais a menos de 0,2 μm e o desvio padrão do tamanho de poro da membrana porosa é de preferencialmente 0,1 μm ou menos.
[020] A presente invenção refere-se ao método de fabricação de um produto químico, em que a membrana porosa é preferencialmente membrana porosa que possui aspereza de superfície de 0,1 μm ou menos.
[021] A presente invenção refere-se ao método de fabricação de produto químico, em que a membrana porosa é preferencialmente membrana porosa que contém camada de resina porosa.
[022] Um aparelho de fermentação contínua de acordo com a presente invenção é um aparelho de fabricação de um produto químico por meio de fermentação contínua que inclui filtragem de uma cultura de fermentação de um microrganismo ou células cultivadas com uma membrana de separação para recuperar um produto de um filtrado, retenção simultânea de fluido não filtrado na cultura, ou envio para dita cultura em refluxo, e adição de materiais de fermentação à cultura de fermentação, que inclui um tanque de reação de fermentação para cultura de fermentação de um microrganismo ou células cultivadas; um tanque de separação de membrana para filtragem da cultura de fermentação, que é conectado por meios de circulação de cultura de fermentação para o tanque de reação de fermentação e equipado no seu interior com uma membrana de separação; e meios de regulagem da diferença de pressão transmembrana da membrana de separação na faixa de 0,1 a 20 kPa, em que a membrana de separação é uma membrana porosa que possui tamanho médio de poro de 0,01 μm ou mais até menos de 1 μm.
[023] Outro aparelho de fermentação contínua de acordo com a presente invenção é um aparelho de fabricação de um produto químico por meio de fermentação contínua que inclui filtragem de uma cultura de fermentação de um microrganismo ou células cultivadas com uma membrana de separação para recuperar um produto de um filtrado, retenção simultânea de um fluido não filtrado na cultura, ou envio para ela em refluxo, e adição de materiais de fermentação à cultura de fermentação, que incluem um tanque de reação de fermentação para cultura de fermentação de um microrganismo ou células cultivadas; um elemento de membrana de separação para filtragem da cultura de fermentação, que é disposto no interior do tanque de reação de fermentação e nele equipado com uma membrana de separação; meios de descarga de um produto de fermentação filtrado, que são conectados ao elemento de membrana de separação; e meios de regulagem da diferença de pressão transmembrana da membrana de separação na faixa de 0,1 a 20 kPa, em que a membrana de separação é uma membrana porosa que possui tamanho médio de poro de 0,01 μm ou mais a menos de 1 μm.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[024] A Fig. 1 é vista lateral esquemática para exibir um exemplo do aparelho de fermentação contínua do tipo separação de membranas de acordo com a presente invenção.
[025] A Fig. 2 é vista lateral esquemática para exibir outro exemplo do aparelho de fermentação contínua do tipo separação de membranas de acordo com a presente invenção.
[026] A Fig. 3 é vista em perspectiva esquemática para exibir um exemplo do elemento de membrana de separação de acordo com a presente invenção.
[027] A Fig. 4 é vista em seção cruzada para exibir outro exemplo do elemento de membrana de separação de acordo com a presente invenção.
[028] A Fig. 5 exibe mapa físico do vetor de expressão de levedura pTRS11. DESCRIÇÃO DOS ALGARISMOS DE REFERÊNCIA 1 Tanque de reação de fermentação 2 Elemento de membrana de separação 3 Aparelho de regulagem da diferença de cabeça d’água 4 Aparelho de alimentação de gás 5 Agitador 6 Sensor de nível 7 Bomba de alimentação de meio 8 Bomba de alimentação de solução reguladora de pH 9 Sensor/regulador de pH 10 Regulador de temperatura 11 Bomba de circulação de líquido de fermentação 12 Tanque de separação de membrana 13 Placa de sustentação 14 Material de passagem 15 Membrana de separação 16 Parte côncava 17 Cano de coleta de água 18 Feixe de membranas de separação 19 Camada de vedação de resina superior 20 Camada de vedação de resina inferior 21 Quadro de sustentação 22 Cano de coleta de água
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[029] A presente invenção refere-se a método de fabricação de produto químico por meio de fermentação contínua, que inclui a filtragem de cultura de microrganismo ou células cultivadas com membrana de separação para recuperar produto de filtrado, retenção simultânea de fluido não filtrado na cultura ou envio para ela em refluxo e adição de materiais de fermentação à cultura, em que membrana porosa que possui tamanho médio de poro de 0,01 μm ou mais a menos de 1 μm é utilizada como membrana de separação e a filtragem é conduzida com diferença de pressão transmembrana na faixa de 0,1 a 20 kPa.
[030] É descrita a membrana porosa utilizada como membrana de separação na presente invenção.
[031] É descrita a constituição da membrana porosa utilizada como membrana de separação na presente invenção. A membrana porosa de acordo com a presente invenção possui desempenho de separação e desempenho de permeação de água, dependendo do uso pretendido e da qualidade de água da água a ser tratada.
[032] A membrana porosa é preferencialmente membrana porosa que contém camada de resina porosa do ponto de vista de desempenho de prevenção, desempenho de permeação de água e desempenho de separação, tal como resistência à contaminação.
[033] Preferencialmente, a membrana porosa que contém camada de resina porosa possui camada de resina porosa que desempenha papel em camada funcional de separação sobre a superfície de material base poroso. O material base poroso sustenta a camada de resina porosa para dar resistência à membrana de separação.
[034] A membrana porosa utilizada na presente invenção contém camada de resina porosa preferencialmente sobre a superfície de material base poroso, em que a camada de resina porosa pode ou não penetrar no material base poroso, dependendo do uso.
[035] A espessura média do material base poroso é de preferencialmente 50 ou mais a 3000 μm ou menos.
[036] O material do material base poroso é elaborado com material orgânico e/ou material inorgânico e são desejavelmente utilizadas fibras orgânicas. O material base poroso é preferencialmente material tecido ou não tecido preparado com fibras orgânicas tais como fibras de celulose, fibras de triacetato de celulose, fibras de poliéster, fibras de polipropileno e fibras de polietileno. De maior preferência, utiliza-se material não tecido de baixo custo e fácil fabricação com densidade regulada de forma relativamente fácil.
[037] Como a camada de resina porosa, pode-se preferencialmente utilizar membrana de polímero orgânico. O material da membrana de polímero orgânico inclui, por exemplo, resina de polietileno, resina de polipropileno, resina de cloreto de polivinila, resina de fluoreto de polivinilideno, resina de polissulfona, resina de poliéter sulfona, resina de poliacrilononitrila, resina de celulose e resina de triacetato de celulose. A membrana de polímero orgânico pode ser mistura de resina que contém estas resinas como componente principal. O componente principal utilizado no presente designa componente que está contido em quantidade de 50% em peso ou mais, preferencialmente 60% em peso ou mais. O material da membrana de polímero orgânico é preferencialmente resina que possui excelente durabilidade física e resistência química, cuja solução pode ser formada facilmente em membrana, tal como resina de cloreto de polivinila, resina de fluoreto de polivinilideno, resina de polissulfona, resina de poliéter sulfona ou resina de poliacrilonitrila e é utilizada, de maior preferência, resina de polivinilideno ou resina que o contém como principal ingrediente.
[038] Como a resina de fluoreto de polivinilideno, é preferencialmente utilizado homopolímero de fluoreto de vinilideno. Como resina de fluoreto de polivinilideno, pode também ser preferencialmente utilizado copolímero de fluoreto de vinilideno e monômero de vinila com ele copolimerizável. O monômero de vinila copolimerizável com fluoreto de vinilideno pode ser exemplificado por tetrafluoroetileno, hexafluoropropileno e tricloreto cloreto de etileno.
[039] É importante que a membrana porosa utilizada na presente invenção possua tamanho médio de poro de 0,01 μm ou mais a menos de 1 μm. Quando o tamanho médio de poro da membrana porosa for de 0,01 μm ou mais a menos de 1 μm, a membrana porosa dificilmente sofre obstrução com microrganismos utilizados em fermentação e possui desempenho de filtragem que permanece estável por longo período. Além disso, quando o tamanho médio de poro da membrana porosa for de 0,01 μm ou menos a menos de 1 μm, alta taxa de exclusão em microrganismos ou evita-se o vazamento de células cultivadas e alta permeabilidade a água podem ser simultaneamente satisfeitas e, desta forma, permeabilidade a água pode ser mantida por longo período com alta precisão e capacidade de reprodução.
[040] O tamanho médio de poro da membrana porosa é de menos de 1 μm pois, quando o tamanho de poro estiver próximo do tamanho de microrganismo ou célula cultivada, o poro pode ser obstruído diretamente com o microrganismo ou célula cultivada. O tamanho médio de poro da membrana porosa preferencialmente não é grande demais em comparação com o tamanho de microrganismo ou célula cultivada, para evitar vazamento do microrganismo ou célula cultivada, ou seja, para evitar desvantagem de redução da taxa de exclusão. Quando o microrganismo ou célula cultivada for bactéria que contém célula pequena, o tamanho médio de poro é de preferencialmente 0,4 μm ou menos, particularmente menos de 0,2 μm para operação de maior preferência.
[041] Microrganismo ou células cultivadas podem produzir substâncias diferentes de produto químico objetivo, tais como substâncias facilmente agregadas como proteínas e polissacarídeos, e parte dos microrganismos ou células cultivadas em cultura pode perecer para formar células rompidas. Para evitar obstrução da membrana porosa com essas substâncias, o tamanho médio de poro é de preferencialmente 0,1 μm ou menos.
[042] Geralmente, o tamanho médio de poro da membrana porosa é de preferencialmente 0,4 μm ou menos, de maior preferência menos de 0,2 μm, 0,1 μm ou menos.
[043] Quando o tamanho médio de poro for pequeno demais, o desempenho de permeação de água da membrana porosa pode ser reduzido, de forma a tornar operação eficiente inviável, mesmo quando a membrana não estiver suja. Portanto, o tamanho médio de poro da membrana porosa de acordo com a presente invenção é de 0,01 μm ou mais, de maior preferência 0,02 μm ou mais, de preferência ainda maior 0,04 μm ou mais.
[044] O tamanho médio de poro pode ser determinado por meio de medição dos diâmetros de todos os poros observáveis em área de 9,2 μm x 10,4 μm sob observação com microscópio eletrônico de varredura em ampliação de x10.000 e, em seguida, calculando-se a média dos diâmetros medidos. Alternativamente, o tamanho médio de poro pode ser determinado tirando-se fotografia da superfície da membrana com microscópio eletrônico de varredura em ampliação de x10.000, selecionando-se em seguida dez ou mais (preferencialmente, vinte ou mais) poros aleatoriamente, medindo-se os diâmetros dos poros selecionados e calculando-se a média numérica dos diâmetros medidos. Quando o poro não for circular, o tamanho médio de poro pode ser determinado por meio de método de determinação de círculo que possui área equivalente à do poro com processador de imagens ou similares e, considerando que o diâmetro do círculo equivalente é o diâmetro do poro, determina-se o tamanho médio de poro.
[045] A derivação padrão G do tamanho médio de poro da membrana porosa de acordo com a presente invenção é de preferencialmente 0,1 μm ou menos. O desvio padrão do tamanho médio de poro é desejavelmente mais baixo. O desvio padrão g do tamanho médio de poro pode ser calculado utilizando a equação (1) a seguir:
Figure img0001
em que N é o número de poros observável na área mencionada acima de 9,2 μm x 10,4 μm, Xk é o diâmetro de cada um dos poros medidos e X (ave) é o tamanho médio de poro.
[046] Para a membrana porosa utilizada na presente invenção, a sua permeabilidade a cultura é desempenho importante. Como indicador da permeabilidade da membrana porosa, pode-se utilizar o coeficiente de permeabilidade da água purificada da membrana porosa antes do uso. Na presente invenção, o coeficiente de permeabilidade da água purificada da membrana porosa, conforme calculado por meio de medição, sob pressão superior de 1 m de água, a quantidade de água penetrada a 25 °C previamente purificada com membrana de osmose reversa, preferencialmente não é de menos de 2 x 10-9 m3/m2/s/Pa. Quando o coeficiente de permeabilidade da água purificada encontrar-se na faixa de 2 x 10-9 m3/m2/s/Pa ou mais a 6 x 10-7 m3/m2/s/Pa ou menos, pode-se atingir quantidade praticamente suficiente de água penetrada.
[047] Na membrana porosa utilizada na presente invenção, a aspereza da superfície é a altura média em direção perpendicular à superfície. A aspereza de superfície da membrana é um dos fatores pelos quais os microrganismos ou células cultivadas que se aderem à superfície da membrana de separação tornam-se facilmente removíveis por efeito de lavagem de superfície da membrana resultante de fluxo de líquido sob agitação ou com bomba de circulação. A aspereza de superfície da membrana porosa é preferencialmente de 0,1 μm ou menos. Quando a aspereza da superfície for de 0,1 μm ou menos, microrganismos ou células cultivadas que se aderem à membrana são facilmente removíveis.
[048] Descobriu-se que membrana porosa que possui aspereza de superfície de 0,1 μm ou menos, tamanho médio de poro de 0,01 μm ou mais a menos de 1 μm e coeficiente de permeabilidade da água purificada de não menos de 2 x 10-9 m3/m2/s/Pa pode ser utilizada de maior preferência para conduzir a operação mais facilmente sem a necessidade de potência excessiva necessária para lavagem da superfície da membrana. Quando a aspereza de superfície da membrana porosa for de 0,1 μm ou menos, a resistência de corte gerada sobre a superfície da membrana mediante filtragem de microrganismos ou células cultivadas pode ser reduzida e, desta forma, pode-se evitar que os microrganismos sejam rompidos e pode-se também evitar que a membrana porosa seja obstruída, de forma a permitir filtragem estável mais facilmente por longo período. A aspereza de superfície da membrana porosa é preferencialmente de 0,1 μm ou menos, de forma que a membrana permita fermentação contínua com diferença de pressão transmembrana mais baixa e, mesmo mediante obstrução, é de excelente recuperação por meio de lavagem em comparação com o caso de operação com alta diferença de pressão transmembrana. Como a fermentação contínua estável é tornada viável ao evitar-se obstruções, a aspereza de superfície da membrana porosa é preferencialmente mais baixa.
[049] A aspereza de superfície da membrana foi medida com o microscópio de força atômica (AFM) a seguir sob as seguintes condições. UNIDADE
[050] Microscópio de força atômica (Nanoscope IIIa fabricado pela Digital Instruments).
CONDIÇÕES
[051] Sonda: braço SiN (fabricado pela Digital Instruments).
[052] Modo de varredura: modo de contato (medição em ar).
[053] Modo de derivação subaquática (medição em água).
[054] Faixa de varredura: 10 μm, 25 μm sobre um lado (medição em ar).
[055] 5 μm, 10 μm sobre um lado (medição em ar).
[056] Resolução de varredura: 512 x 512.
[057] Preparação de amostra: Amostra de membrana foi mergulhada em etanol sob temperaturas comuns por quinze minutos, mergulhada em seguida em água RO por 24 horas, lavada e seca em ar antes da medição.
[058] A partir da altura na direção do eixo Z em cada ponto, foi calculada rigidez de superfície da membrana drough com o microscópio de força atômica (AFM) utilizando a equação a seguir (2):
Figure img0002
drough: aspereza média da superfície Zn: altura no eixo Z Z: altura média na faixa de varredura
[059] A membrana porosa utilizada na presente invenção é preferencialmente membrana de folha plana. Quando a membrana porosa for membrana de folha plana, sua espessura média é selecionada dependendo do uso pretendido. Quando a membrana porosa for membrana de folha plana, a sua espessura média é preferencialmente de 20 ou mais a 5000 μm ou menos, de maior preferência 50 ou mais a 2000 μm ou menos.
[060] A membrana porosa utilizada na presente invenção é preferencialmente membrana de fibra oca. Quando a membrana porosa for membrana de fibra oca, o diâmetro interno da fibra oca é preferencialmente de 200 a 5000 μm e a espessura da membrana é preferencialmente de 20 a 2000 μm. Tecido ou material têxtil fabricado com fibras orgânicas ou inorgânicas cilíndricas pode estar contido no lado interno da fibra oca.
[061] Método de formação da membrana porosa utilizada na presente invenção é descrito por meio de referência a linhas gerais do método.
[062] Será agora descrito resumidamente o método de formação de membrana de folha plana da membrana porosa.
[063] Revestimento de solução padrão que contém resina e solvente é formado sobre a superfície de material base poroso e, simultaneamente, o material base poroso é impregnado com a solução padrão. Em seguida, somente a superfície, ao lado do revestimento, do material base poroso é colocada em contato com banho de coagulação que contém não solvente, de forma a coagular a resina e, simultaneamente, formar camada de resina porosa sobre a superfície do material base poroso.
[064] A solução padrão é preparada na forma de dissolução de resina em solvente. Do ponto de vista de propriedade de fabricação de membrana, normalmente é preferível que a temperatura da solução padrão seja selecionada na faixa de 5 a 120 °C. O solvente dissolve resina e age sobre a resina para promover a formação de camada de resina porosa da resina. O solvente que pode ser utilizado no presente inclui N-metilpirrolidinona (NMP), N,N-dimetilacetamida (DMAc), N,N-dimetilformamida (DMF), sulfóxido de dimetila (DMSO), N-metil-2-pirrolidona, metil etil cetona, tetraidrofuran, tetrametil ureia, fosfato de trimetila, ciclohexanona, isoforona, y-butirolactona, metil isoamil cetona, ftalato de dimetila, propileno glicol metil éter, carbonato de propileno, álcool diacetona, triacetato de glicerol, acetona e metil etil cetona. Dentre estes solventes, podem ser preferencialmente utilizados N-metilpirrolidinona (NMP), N,N-dimetilacetamida (DMAc), N,N-dimetilformamida (DMF) e sulfóxido de dimetila (DMSO), que podem apresentar alta dissolução da resina. Estes solventes podem ser utilizados isoladamente ou na forma de mistura de dois ou mais destes.
[065] Componentes diferentes do solvente, tais como polietileno glicol, álcool polivinílico, polivinil pirrolidona e glicerina, podem ser adicionados ao solvente. Não solvente pode também ser adicionado ao solvente. O não solvente é líquido que não dissolve a resina. O não solvente age como regulador do tamanho dos poros por meio de regulagem da velocidade de coagulação da resina. Como não solvente, podem ser utilizados água e alcoóis tais como metanol e etanol. Particularmente, o não solvente é preferencialmente água ou metanol, do ponto de vista do preço. O componente diferente de solvente e o não solvente podem também ser mistura.
[066] Agente formador de poros pode também ser adicionado à solução padrão. O agente formador de poros possui papel tal que, mediante imersão em banho de coagulação, é extraído de camada de resina para tornar porosa a camada de resina. Por meio de adição do agente formador de poros, pode-se regular o tamanho médio de poro da membrana porosa. Preferencialmente, o agente formador de poros é altamente solúvel no banho de coagulação. Exemplos dos agentes formadores de poros utilizáveis incluem sais inorgânicos, tais como cloreto de cálcio e carbonato de cálcio. Alternativamente, como agentes formadores de poros, podem ser utilizados polioxialquilenos, tais como polietileno glicol e polipropileno glicol; polímeros hidrossolúveis, tais como álcool polivinílico, polivinil butiral e ácidos poliacrílicos; e glicerina.
[067] Será agora descrito resumidamente o método de formação de membrana de folha oca como a membrana porosa.
[068] A membrana de fibra oca pode ser preparada por meio de descarga de solução padrão elaborada com resina e solvente por meio de cano externo de base de cano duplo, descarregando simultaneamente fluido de formação de espaços ocos por meio de cano interno da base de cano duplo, solidificando-os por meio de resfriamento em banho de resfriamento.
[069] A solução padrão pode ser preparada por meio de dissolução da resina descrita acima no método de preparação de membrana de folha plana, em concentração de 20% ou mais a 60% ou menos em peso, no solvente descrito acima no método de preparação de membrana de folha plana. O fluido de formação de espaços ocos pode ser normalmente gás ou líquido. A superfície externa da membrana de fibra oca resultante pode também ser revestida (laminada) com nova camada de resina porosa. Laminação pode ser conduzida para alterar as propriedades (tais como hidrofilicidade/hidrofobicidade, tamanho de poro etc.) da membrana de fibra oca para propriedades desejadas. A nova camada de resina porosa a ser laminada sobre ela pode ser preparada colocando-se a solução padrão que possui resina dissolvida em solvente em contato com banho de coagulação que não contém solvente para coagular a resina. Como material da resina, o mesmo material da membrana de polímero orgânico, por exemplo, pode ser preferencialmente utilizado. O método de laminação não é particularmente limitado e a membrana de fibra oca pode ser imersa na solução padrão ou pode ser revestida sobre ela com a solução padrão e, após a laminação, parte da solução padrão de adesão pode ser raspada ou soprada com faca de ar para regular a quantidade do laminado.
[070] A membrana porosa utilizada na presente invenção pode ser formada em elemento de membrana de separação por meio de união/vedação de espaço oco da membrana de fibra oca com membro tal como resina e, em seguida, colocação da membrana sobre suporte.
[071] A membrana porosa utilizada na presente invenção pode ser combinada com suporte para formar elemento de membrana de separação. O elemento de membrana de separação que possui placa de sustentação como suporte no qual a membrana porosa utilizada na presente invenção é disposta sobre pelo menos um lado da placa de sustentação é um modo preferível do elemento de membrana de separação que contém a membrana porosa utilizada na presente invenção. Elemento de membrana de separação que contém a membrana porosa sobre os dois lados de placa de sustentação para aumentar a quantidade de água em penetração também é modo preferível do elemento de membrana de separação.
[072] O método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção inclui filtragem com diferença de pressão transmembrana na faixa de 0,1 a 20 kPa. Quando uma cultura de fermentação for filtrada com diferença de pressão transmembrana de mais de 20 kPa, é necessário energia elétrica para aplicar pressão, o que reduz a eficácia econômica de fabricação de produto químico. Dada a diferença de pressão transmembrana de mais de 20 kPa, microrganismo ou células cultivadas podem ser rompidas para reduzir a capacidade de fabricação de produto químico. No método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, diferença de pressão transmembrana, ou seja, pressão de filtragem encontra-se na faixa de 0,1 a 20 kPa, que pode ser atingida por diferença de cabeça d’água e, desta forma, não é necessário que o lado interno do fermentador seja particularmente mantido sob pressão, de forma que a capacidade de fabricação de produto químico não seja reduzida. Como não é necessário que o lado interno do fermentador seja particularmente mantido sob pressão, a membrana porosa pode ser disposta no interior do fermentador, o que pode resultar em outra desvantagem do pequeno dimensionamento do aparelho de fermentação. O método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção inclui filtragem com diferença de pressão transmembrana preferencialmente na faixa de 0,1 a 2 kPa.
[073] No método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, são utilizados materiais de fermentação. Os materiais de fermentação utilizados na presente invenção podem ser quaisquer materiais que promovam o crescimento de um microrganismo de cultura para permitir que o microrganismo gere satisfatoriamente produto de fermentação objetivo como produto químico.
[074] Os materiais de fermentação utilizados na presente invenção encontram-se preferencialmente na forma de meio líquido comum que contém fonte de carbono, fonte de nitrogênio e sais inorgânicos e que contém adequadamente micronutrientes orgânicos tais como aminoácidos e vitaminas, conforme o necessário. A fonte de carbono que pode ser utilizada no presente inclui açúcares tais como glicose, sacarose, frutose, galactose e lactose, açúcares de amido que contêm esses açúcares, melaços de batata doce, melaços de beterraba de açúcar e melaços de alto teste, ácidos orgânicos tais como ácido acético, alcoóis tais como etanol e glicerina. A fonte de nitrogênio que pode ser utilizada no presente inclui gás amônia, água de amônia, sais de amônio, ureia, nitratos e outras fontes de nitrogênio orgânicas utilizadas secundariamente, tais como aglomerados de óleo, hidrolisados de soja, digeridos de caseína, outros aminoácidos, vitaminas líquido de fermentação de milho, leveduras ou extrato de levedura, extrato de carne, peptídeos tais como peptona e vários microrganismos de fermentação e seus hidrolisados. Os sais inorgânicos que podem ser adequadamente adicionados incluem fosfatos, sais de magnésio, sais de cálcio, sais de ferro e sais de manganês.
[075] Quando os microrganismos utilizados na presente invenção necessitarem de nutriente específico para o seu crescimento, o nutriente é adicionado na forma de preparação ou de produto natural que o contém. Agente antiespumante é utilizado, se necessário. A cultura de acordo com a presente invenção designa líquido obtido como resultado do crescimento de um microrganismo ou células cultivadas com os materiais de fermentação. A composição de materiais de fermentação a ser adicionada pode ser adequadamente alterada da composição dos materiais de fermentação utilizados no início da cultura.
[076] Na presente invenção, a concentração de açúcares na cultura é mantida preferencialmente em 5 g/l ou menos. A razão pela qual a concentração de açúcares na cultura é mantida preferencialmente em 5 g/l ou menos é que o fluxo de saída de açúcares mediante retirada da cultura pode ser minimizado àquela concentração.
[077] O microrganismo é cultivado normalmente sob pH 4 a 8 sob temperatura na faixa de 20 a 40 °C. O pH da cultura é ajustado em valor previamente determinado, normalmente na faixa de pH 4 a 8 com ácido orgânico ou inorgânico, substância alcalina, ureia, carbonato de cálcio, gás amônia ou similares. Quando for necessário aumentar a velocidade de fornecimento de oxigênio, é possível empregar meios de adição de oxigênio a ar para manter concentração de oxigênio de não menos de 21% ou meios de pressurização da cultura, aumento da velocidade de agitação ou aumento da aeração.
[078] No método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, cultura de bateladas ou cultura de bateladas alimentadas pode ser conduzida em estágio inicial de cultura para aumentar a densidade de microrganismos, seguido por cultura contínua (retirada). No método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, a densidade de microrganismos pode aumentar, seguida por semeadura de alta densidade de microrganismos, de forma a iniciar a cultura e conduzir simultaneamente cultura contínua. No método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, o fornecimento da cultura inicial e a retirada da cultura podem ser iniciados em etapa apropriada. O momento de início do fornecimento da cultura inicial e o momento de início da retirada da cultura podem nem sempre ser o mesmo. O fornecimento da cultura inicial e a retirada da cultura podem ser conduzidos contínua ou intermitentemente.
[079] Os nutrientes necessários para o crescimento do microrganismo podem ser adicionados à cultura inicial, de forma que o microrganismo cresça continuamente. Para atingir produtividade eficiente, a densidade de microrganismos ou células cultivadas na cultura é preferencialmente mantida alta em faixa em que o ambiente da cultura não se torna inadequado para o crescimento dos microrganismos ou células cultivadas para causar alta taxa de mortalidade. Os microrganismos ou células cultivadas na cultura mantido em densidade de não menos de 5 g/l em peso seco, por exemplo, possibilitaram excelente eficiência de produção.
[080] No método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, os microrganismos ou células cultivadas podem ser retirados conforme o necessário do fermentador. Como a membrana de separação é facilmente obstruída, por exemplo, quando a densidade dos microrganismos ou células cultivadas no fermentador tornar-se alta demais, essa obstrução pode ser evitada por meio de retirada. O desempenho de fabricação de produto químico pode variar dependendo da densidade dos microrganismos ou células cultivadas no fermentador e o desempenho produtivo pode ser mantido por meio de retirada dos microrganismos ou células cultivadas com o desempenho produtivo como indicador.
[081] No método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, o número de fermentadores não é limitado, desde que a operação de cultura contínua durante a qual microrganismos novos capazes de produção por fermentação são cultivados seja conduzida por meio de método de cultura contínua em que os microrganismos são cultivados e, simultaneamente, é formado produto. No método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, é preferível para controle de cultura que a operação de cultura contínua seja normalmente conduzida em um único fermentador. Uma série de fermentadores pode ser utilizado, entretanto, por motivos tais como pequena capacidade do fermentador. Neste caso, uma série de fermentadores pode ser conectada em paralelo ou em série, em fermentação contínua para atingir alta produtividade do produto de fermentação.
[082] São agora descritos os microrganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados no método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção. Os microrganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados no método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção não são limitados. Os microrganismos ou células cultivadas utilizados na presente invenção incluem, por exemplo, leveduras tais como levedura de padaria (Saccharomyces cerevisiae) utilizada freqüentemente em indústria de fermentação, bactérias tais como Escherichia coli ou bactérias corineformes, bactérias filamentosas, micobactérias, células de animais e células de insetos. Os microrganismos ou células utilizados podem ser isolados do ambiente natural ou podem ser aqueles que possuem propriedades modificadas parcialmente por meio de mutação ou recombinação genética.
[083] O produto químico fabricado por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção não é limitado, desde que seja substância produzida em cultura pelos microrganismos ou células descritos acima. O produto químico fabricado por meio do método de fabricação de produtos químicos de acordo com a presente invenção inclui substâncias tais como alcoóis, ácidos orgânicos, aminoácidos e ácidos nucléicos que são produzidos em grandes quantidades na indústria de fermentação. Exemplos desses produtos químicos incluem alcoóis tais como etanol, 1,3- propanodiol, 1,4-butanodiol e glicerol, ácidos orgânicos tais como ácido acético, ácido láctico, ácido pirúvico, ácido succínico, ácido málico, ácido itacônico e ácido cítrico, ácidos nucléicos tais como nucleosídeos como inosina e guanosina e nucleotídeos tais como ácido inosínico e ácido guanílico, bem como compostos de diamina tais como cadaverina. A presente invenção pode também ser aplicada à produção de substâncias tais como enzimas, antibióticos e proteínas recombinantes.
[084] São agora descritos os microrganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados no método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção por meio de referência a produtos químicos específicos.
[085] No método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, os microrganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricação de ácido L-láctico não são particularmente limitados, desde que sejam microrganismos capazes de produzir ácido L-láctico. No método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, os microrganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricação de ácido L-láctico são preferencialmente bactérias de ácido láctico. As bactérias de ácido láctico da forma utilizada no presente podem ser definidas como microrganismos procarióticos que produzem 50% ou mais de ácido láctico na forma de rendimento em açúcar (glicose consumida). Exemplos preferíveis de bactérias de ácido láctico incluem bactérias de ácido láctico pertencentes ao gênero Lactobacillus, gênero Pediococcus, gênero Tetragenococcus, gênero Carnobacterium, gênero Vagococcus, gênero Leuconostoc, gênero Oenococcus, gênero Atopobium, gênero Streptococcus, gênero Enterococcus, gênero Lactococcus e gênero Bacillus. Dentre eles, a bactéria de ácido láctico que possui alto rendimento de ácido láctico em açúcar pode ser selecionada e utilizada preferencialmente na produção de ácido láctico. No método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, bactérias de ácidos lácticos que possuem alto rendimento de ácido láctico, particularmente ácido L-láctico, em açúcar podem ser selecionadas e utilizadas preferencialmente na produção de ácido láctico. Ácido L-láctico é um tipo de isômeros óticos de ácido láctico e pode ser claramente diferenciado do seu enantiômero ácido D-láctico. Exemplos de bactérias de ácido láctico que possuem alto rendimento de ácido L-láctico em açúcar incluem Lactobacillus yamanashiensis, Lactobacillus animalis, Lactobacillus agilis, Lactobacillus aviaries, Lactobacillus casei, Lactobacillus delbruekii, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus ruminis, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus sharpeae, Pediococcus dextrinicus e Lactococcus lactis, e estes podem ser selecionados para produzir ácido L-láctico.
[086] Quanto ácido L-láctico for produzido por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, pode-se utilizar os microrganismos ou células cultivadas que foram dotadas artificialmente com a capacidade de produção de ácido láctico, ou que se permitiu ampliarem esta produção. Os microrganismos ou células cultivadas nos quais foi introduzido gene L-lactato desidrogenase (às vezes indicado a seguir como L-LDH) para proporcionar ou aumentar a capacidade de produção de ácido L-láctico, por exemplo, podem ser utilizados. O método de fornecimento ou aumento da capacidade de produção de ácido L-láctico pode também ser método de mutagênese química conhecido na técnica. O microrganismo é preferencialmente microrganismo recombinante cuja capacidade de produção de ácido L-láctico foi aumentada pela integração de L-LDH. Quando ácido L-láctico for produzido por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, um hospedeiro do microrganismo recombinante é preferencialmente Escherichia coli ou bactéria de ácido láctico que é célula procariótica ou levedura que é célula eucariótica, de preferência específica levedura. A levedura é preferencialmente levedura que pertence ao gênero Saccharomyces, de maior preferência Saccharomyces cerevisiae.
[087] O L-LDH utilizado na presente invenção não é limitado, desde que codifique proteína que possui atividade de conversão de dinucleotídeo nicotinamida adenina reduzido (NADH) e ácido pirúvico em dinucleotídeo nicotinamida adenina (NAD+) oxidado e ácido L-láctico. Pode-se utilizar, por exemplo, L-LDH derivado de bactérias de ácido láctico que possuem alto rendimento de ácido L-láctico em açúcar. Preferencialmente, pode-se utilizar L- LDH derivado de mamífero. Pode-se particularmente utilizar L-LDH derivado de Homo sapiens ou de sapo. O L-LDH derivado de sapo que pode ser utilizado na presente invenção é, de preferência específica, L-LDH derivado de sapo pertencente a Pipidae, de maior preferência L-LDH derivado de Xenopus laevis que é sapo pertencente a Pipidae.
[088] O L-LDH derivado de sapo ou de seres humanos utilizado na presente invenção inclui genes do tipo mutante resultantes de polimorfismo genético, mutagênese ou similares. Polimorfismo genético designa alteração parcial em seqüência de nucleotídeos de gene por meio de mutação espontânea sobre o gene. Mutagênese designa introdução artificial de mutação em gene. Pode-se atingir mutagênese, por exemplo, por meio de método de uso de kit para mutagênese dirigida a local (Mutan-K fabricado pela Takara Bio) ou método de uso de kit para mutagênese aleatória (Mutagênese Aleatória PCR BD Diversify fabricado pela CLONTECH). O L-LDH derivado de seres humanos ou sapos utilizado na presente invenção pode possuir exclusão ou inserção em parte da sua seqüência de nucleotídeos, desde que codifique proteína que possua atividade de conversão de NADH e ácido pirúvico em NAD+ e ácido L-láctico.
[089] Quando ácido L-láctico for produzido por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, a separação e a purificação de ácido L-láctico contido no líquido de fermentação filtrado/separado produzido podem ser conduzidas por meio de combinação de métodos convencionalmente conhecidos, tais como concentração, destilação e cristalização. Seus exemplos incluem um método que envolve a redução do pH do líquido de fermentação filtrado/separado para 1 ou menos e, em seguida, extração de ácido L-láctico com dietil éter, acetato de etila ou similar, método que envolve a adsorção do líquido de fermentação para resina de troca de íons, lavagem da resina e eluição de ácido L-láctico, método que envolve a reação de ácido L-láctico no líquido de fermentação com álcool na presença de catalisador ácido para convertê-lo no éster correspondente seguido pela sua destilação e método que envolve a cristalização de ácido L-láctico como sal de cálcio ou sal de lítio. Preferencialmente, solução de ácido L-láctico concentrada obtida por meio da evaporação de água do líquido de fermentação filtrado/separado pode ser submetida a destilação. Durante a destilação, a solução original a ser destilada é submetida a destilação, preferencialmente durante a alimentação de água, de forma que a concentração de água da solução seja mantida constante. Solução aquosa de ácido L-láctico obtida por meio de destilação pode ser concentrada por meio de evaporação de água sob aquecimento para gerar concentração objeto de ácido L-láctico purificado. Quando solução aquosa de ácido L-láctico que contém componentes com baixo ponto de ebulição tais como etanol e ácido acético for obtida na forma de destilado, os componentes com baixo ponto de ebulição são preferencialmente removidos em etapa de concentração de ácido L-láctico. Após a operação de destilação, o destilado pode também ser purificado com resina de troca de íons ou carvão ativado, por meio de separação cromatográfica ou similar conforme o necessário para remover impurezas, para gerar ácido L-láctico com pureza mais alta.
[090] Quando ácido D-láctico for produzido por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, os microrganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricação de ácido D-láctico não são limitados, desde que possam produzir ácido D-láctico. Os microrganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados em produção de ácido D-láctico incluem, por exemplo, microrganismos pertencentes à linhagem de tipo selvagem dos gêneros Lactobacillus, Bacillus e Pediococcus que possuem capacidade de sintetizar ácido D-láctico.
[091] Quando ácido D-láctico for produzido por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, os microrganismos ou células cultivadas utilizados são preferencialmente aqueles em que a atividade enzimática de D-lactato desidrogenase (às vezes denominada a seguir D-LDH) da linhagem do tipo selvagem foi aumentada. O método de aumento da atividade enzimática pode também ser método de mutagênese química conhecido na técnica. De maior preferência, o microrganismo é microrganismo recombinante no qual a atividade enzimática de D-lactato desidrogenase foi aumentada por meio de integração de gene que codifica D-lactato desidrogenase. Quando ácido D-láctico for produzido por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, um hospedeiro do microrganismo recombinante é preferencialmente Escherichia coli ou bactéria de ácido láctico que é célula procariótica ou levedura que é célula eucariótica, de preferência específica levedura.
[092] Quando ácido D-láctico for produzido por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, o gene que codifica D-lactato desidrogenase é preferencialmente gene derivado de Lactobacillus plantarum, Pediococcus acidilactici ou Bacillus laevolacticus, de maior preferência gene derivado de Bacillus laevolacticus.
[093] Quando ácido D-láctico for produzido por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, a separação e a purificação de ácido D-láctico contido no líquido de fermentação filtrado/separado produzido podem ser conduzidas por meio de combinação de métodos convencionalmente conhecidos, tais como concentração, destilação e cristalização. Seus exemplos incluem um método que envolve a redução do pH do líquido de fermentação filtrado/separado para 1 ou menos e, em seguida, extração de ácido D-láctico com dietil éter, acetato de etila ou similar, método que envolve a adsorção do líquido de fermentação para resina de troca de íons, lavagem da resina e eluição de ácido D-láctico, método que envolve a reação de ácido -láctico no líquido de fermentação com álcool na presença de catalisador ácido para convertê-lo no éster correspondente seguido pela sua destilação e método que envolve a cristalização de ácido D-láctico como sal de cálcio ou sal de lítio. Preferencialmente, solução de ácido D-láctico concentrada obtida por meio da evaporação de água do líquido de fermentação filtrado/separado pode ser submetida a destilação quando ácido D-láctico for produzido por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção. Durante a destilação, a solução original a ser destilada é submetida a destilação, preferencialmente durante a alimentação de água, de forma que a concentração de água da solução seja mantida constante. Solução aquosa de ácido D-láctico obtida por meio de destilação pode ser concentrada por meio de evaporação de água sob aquecimento para gerar concentração objeto de ácido D-láctico purificado. Quando solução aquosa de ácido D-láctico que contém componentes com baixo ponto de ebulição (etanol, ácido acético etc.) for obtida na forma de destilado, os componentes com baixo ponto de ebulição são preferencialmente removidos em etapa de concentração de ácido D-láctico. Após a operação de destilação, o destilado pode também ser purificado com resina de troca de íons ou carvão ativado, por meio de separação cromatográfica ou similar conforme o necessário para remover impurezas, para gerar ácido D-láctico com pureza mais alta.
[094] Quando etanol for produzido por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, os microrganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricação de etanol não são limitados, desde que sejam microrganismos ou células cultivadas que possam produzir ácido pirúvico. Os microrganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na produção de etanol incluem, por exemplo, microrganismos pertencentes ao gênero Saccharomyces, gênero Kluyveromyces e gênero Schizosaccharomyces. Dentre estes, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis e Schizosaccharomyces pombe podem ser preferencialmente utilizados. Microrganismos pertencentes ao gênero Lactobacillus e ao gênero Zymomonas podem também ser preferencialmente utilizados. Dentre eles, Lactobacillus brevis e Zymomonas mobilis podem ser preferencialmente utilizados.
[095] Os microrganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na produção de etanol na presente invenção podem ser microrganismos ou células cultivadas que possuem capacidade aumentada artificialmente de produção de etanol. Especificamente, os microrganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na produção de etanol na presente invenção podem ser os que possuem propriedades modificadas parcialmente por meio de mutação ou recombinação genética. Exemplos dos microrganismos ou células cultivadas que possuem propriedades parcialmente modificadas incluem leveduras dotadas de capacidade de assimilação de amido bruto por meio de integração de gene glicoamilase derivado de fungo pertencente ao gênero Rhizopus (Biseibutsu (Microorganism), 3: 555-564 (1987)). Método de purificação utilizando destilação ou método de concentração/purificação que utiliza NF, membrana de RO ou membrana de separação de zeólitos pode ser preferencialmente utilizado na separação e purificação de etanol contido no líquido de fermentação filtrado/separado elaborado por meio do método de produção de acordo com a presente invenção.
[096] Quando ácido pirúvico for produzido por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, os microrganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricação de ácido pirúvico não são limitados, desde que sejam microrganismos ou células cultivadas que possam produzir ácido pirúvico. Os microrganismos ou células cultivadas que podem ser preferencialmente utilizados na produção de ácido pirúvico incluem, por exemplo, microrganismos pertencentes ao gênero Pseudomonas, gênero Corynebacterium, gênero Escherichia e gênero Acinetobacter. De maior preferência, podem ser utilizados microrganismos tais como Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa e Escherichia coli. Podem também ser utilizados microrganismos recombinantes criados submetendo-se estes microrganismos a mutação ou recombinação genética para modificar parcialmente as suas propriedades. São também preferencialmente utilizados, por exemplo, os microrganismos em que o gene ATPase envolvido diretamente na produção de ATP por meio de fosforilação oxidativa sofreu mutação ou foi excluído. Fungos e leveduras podem também ser preferencialmente utilizados. Podem ser utilizados fungos e leveduras pertencentes ao gênero Saccharomyces, gênero Toluropusis, gênero Candida e gênero Schizophyllum. De maior preferência, fungos e leveduras tais como Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces copsis, Candida glabrata, Candida lipolytica, Toluropusis glabrata e Schizophyllum commune podem ser utilizados para produzir ácido pirúvico.
[097] Quando ácido pirúvico for produzido por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, a separação e a purificação de ácido pirúvico contido no líquido de fermentação filtrado/separado podem ser conduzidas por meio de método que utiliza coluna de troca de ânions. Pode ser preferencialmente utilizado, por exemplo, método de purificação que utiliza trocador de íons fracamente halofíticos exibido em JP- A n° 6-345683.
[098] Quando ácido succínico for produzido por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, os microrganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricação de ácido succínico não são limitados, desde que sejam microrganismos ou células cultivadas que possam produzir ácido succínico. Os microrganismos ou células cultivadas que podem ser preferencialmente utilizados na produção de ácido succínico incluem, por exemplo, microrganismos pertencentes aos gêneros Anaerobiospirillum e Actinobacillus. Exemplos específicos desses microrganismos incluem Anaerobiospirillum succiniciproducens, descrito na Patente Norte-Americana n° 5.143.833, e Actinobacillus succinogenes, descrito por James B. Mckinlay et al (Appl. Microbiol. Biotechnol., 71, 6651-6656 (2005). Podem também ser utilizadas bactérias corineformes dos gêneros Corynebacterium e Brevibacterium e Escherichia. Bactérias corineformes são preferencialmente Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum e Brevibacterium lactofermentum.
[099] Os microrganismos podem ser aqueles que possuem capacidade de produção de ácido succínico aprimorada por meio de recombinação genética, por meio do quê a produtividade de ácido succínico pode ser aprimorada. Exemplos dos microrganismos que podem ser utilizados no presente incluem Brevibacterium flavum MJ233AB-41 com deficiência de lactato desidrogenase (FERM BP-1498) descrito em JP-A n° 2005-27533, Corynebacterium glutamicum descrito no Documento Não de Patente 1, e linhagens de Escherichia coli AFP111 com deficiência de liase e lactato desidrogenase descritas na Patente US 5.770.435.
[100] Quando ácido succínico for produzido por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, método habitual de purificação de ácido succínico pode ser aplicado para separação e purificação de ácido succínico. Pode ser preferencialmente utilizado método de purificação de combinação de tratamento de hidrólise eletrodiálise e cristalização/concentração a vácuo exibido em JP-A- n° 2005-333886.
[101] Quando ácido itacônico for produzido por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, os microrganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricação de ácido itacônico não são limitados, desde que sejam microrganismos ou células cultivadas que possam produzir ácido itacônico. Os microrganismos ou células cultivadas que podem ser preferencialmente utilizados na produção de ácido itacônico incluem fungos e leveduras. De maior preferência, fungos pertencentes ao gênero Aspergillus ou gênero Ustilago, ou leveduras pertencentes ao gênero Candida ou gênero Rhodotorula, são utilizados na produção de ácido itacônico. Podem ser particularmente utilizados fungos tais como Aspergillus terreus, Aspergillus itaconicus, Ustilago maydis, Ustilago cynodontis e Ustilago rabenhorstina, ou Candia antarctica, na produção de ácido itacônico.
[102] Quando ácido itacônico for produzido por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, a separação e a purificação de ácido itacônico podem ser conduzidas utilizando ultrafiltragem e eletrodiálise. Pode ser preferencialmente utilizado, por exemplo, método de purificação por meio de ultrafiltragem e eletrodiálise com membrana de resina de troca de cátions do tipo sal exibida na Patente Japonesa n° 50958.
[103] Quando 1,3-propanodiol for produzido por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, os microrganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricação de 1,3-propanodiol não são limitados, desde que sejam microrganismos ou células cultivadas que possam produzir 1,3-propanodiol. Os microrganismos ou células cultivadas que podem ser preferencialmente utilizados na produção de 1,3- propanodiol incluem, por exemplo, linhagens do tipo selvagem tais como microrganismos pertencentes aos gêneros Klebsiella, Clostridium e Lactobacillus que possuem capacidade de produção de 1,3-propanodiol a partir de glicerol.
[104] Quando 1,3-propanodiol for produzido por meio do método de produção de produto químico de acordo com a presente invenção, o microrganismo contém preferencialmente (a) pelo menos um gene que codifica polipeptídeo que possui atividade de glicerol desidratase; (b) pelo menos um gene que codifica fator de reativação de glicerol desidratase; e (c) pelo menos um gene que codifica atividade catalisadora não específica de conversão de 3- hidroxiproponaldeído em 1,3-propanodiol. Na presente invenção, o microrganismo é, de preferência específica, microrganismo recombinante que permite a produção de 1,3-propanodiol.
[105] Quando 1,3-propanodiol for produzido por meio do processo de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, o microrganismo que possui capacidade de produzir 1,3-propanodiol a partir de glicerol é preferencialmente microrganismo recombinante selecionado a partir do grupo que consiste de Klebsiella, Clostridium, Lactobacillus, Cytrobacter, Enterobacter, Aerobacter, Aspergillus, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, Candida, Hansenula, Debaryomyces, Mucor, Torulopsis, Methylobacter, Salmonella, Bacillus, Aerobacter, Streptomyces, Eschericia e Pseudomonas, e é de maior preferência Escherichia coli.
[106] Quando 1,3-propanodiol for produzido por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, o microrganismo recombinante é preferencialmente modificado para permitir a produção de 1,3-propanodiol eficientemente a partir de glicose. O microrganismo recombinante é preferencialmente microrganismo recombinante que contém (a) pelo menos um gene que codifica polipeptídeo que possui atividade de glicerol- 3-fosfato desidratase; e (b) pelo menos um gene que codifica polipeptídeo que possui atividade de glicerol-3-fosfatase e é, de maior preferência, microrganismo recombinante que contém gene no qual fator de reativação de glicerol desidratase é codificado por orfX e orfZ isolado a partir de regulador dha. O microrganismo recombinante é, de preferência ainda maior, microrganismo recombinante com deficiência na atividade de glicerol quinase e/ou atividade de glicerol desidrogenase e/ou atividade de triose fosfato isomerase.
[107] Quando 1,3-propanodiol for produzido por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, a separação e a purificação de 1,3-propanodiol contido no líquido de fermentação filtrado/separado podem ser conduzidas por meio de concentração e cristalização. Pode ser preferencialmente utilizado, por exemplo, método de purificação que utiliza concentração sob pressão reduzida e recristalização exibido em JP-A n° 35785.
[108] Quando cadaverina for produzida por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, os microrganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricação de cadaverina não são limitados, desde que sejam microrganismos ou células cultivadas que possam produzir cadaverina. Os microrganismos ou células cultivadas que podem ser preferencialmente utilizados na produção de cadaverina incluem, por exemplo, microrganismos que possuem atividade de enzima de lisina descarboxilase e/ou antiportador de lisina cadaverina. Os microrganismos são, de maior preferência, microrganismos recombinantes aos quais foram integrados genes que codificam lisina descarboxilase e/ou antiportador de lisina cadaverina. Os microrganismos recombinantes são, de preferência ainda maior, aqueles aos quais foram integrados um ou mais tipos de genes que codificam lisina descarboxilase.
[109] Quando cadaverina for produzida por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, os microrganismos recombinantes são preferencialmente Escherichia coli e bactérias corineformes, de maior preferência bactérias corineformes que possuem atividade de lisina descarboxilase e possuem pelo menos uma propriedade selecionada a partir de auxotrofia de homosserina e resistência a S- (2-aminoetil)-L-cisteína. Os microrganismos são, de maior preferência, os que possuem deficiência na atividade de homosserina desidrogenase, de preferência ainda maior os que possuem deficiência na atividade de homosserina desidrogenase por meio de mutação com gene inserido. Na presente invenção, o gênero de bactéria corineforme é preferencialmente pelo menos um gênero selecionado a partir do grupo que consiste no gênero Corynebacterium e Brevibacterium. O microrganismo é, de maior preferência, Corynebacterium gulutamicum.
[110] Quando cadaverina for produzida por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, a separação e a purificação de cadaverina contida no líquido de fermentação filtrado/separado podem ser conduzidas por meio de combinação de métodos conhecidos na técnica, tais como concentração, destilação e cristalização. Pode ser preferencialmente utilizado, por exemplo, método de purificação que utiliza cristalização exibido em JP-A n° 2004-222569. Dependendo do ácido utilizado em cultura contínua, o produto de acordo com a presente invenção pode ser utilizado como material de diversos polímeros e, quando o produto for utilizado como material de polímero que necessita de alta pureza, é preferencialmente empregado método de purificação que utiliza cristalização. Quando o pH da cultura for mantido com ácido clorídrico, dicloridrato de cadaverina pode ser recuperado do filtrado por meio de etapa de cristalização. É de maior preferência que o pH da cultura seja mantido com ácido dicarboxílico durante cultura contínua e, a partir do filtrado, dicarboxilato de cadaverina pode ser recuperado por meio de etapa de cristalização. O ácido dicarboxílico é, de maior preferência, ácido dicarboxílico alifático e/ou aromático que contém dois grupos carboxila somente como seus grupos funcionais. O ácido dicarboxílico é, de preferência ainda maior, ácido adípico, ácido sebácico, ácido 1,12-dodecanodicarboxílico, ácido succínico, ácido isoftálico ou ácido tereftálico.
[111] Quando ácido nucléico for produzido por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, os microrganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricação de ácido nucléico não são limitados, desde que sejam microrganismos capazes de produzir ácido nucléico. Os microrganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na produção de ácido nucléico podem ser os que possuem inerentemente alta capacidade de produção de ácido nucléico separada do mundo natural, ou podem ser microrganismos procarióticos que possuem capacidade de produção artificialmente aumentada. Especificamente, os microrganismos podem ser aqueles que possuem propriedades modificadas parcialmente por meio de mutação ou recombinação genética.
[112] É agora descrita a modificação de parte de propriedades. Para a produção eficiente de ácido nucléico, o ácido nucléico deverá ser biossintetizado, acumulado e liberado fora do microrganismo. Conseqüentemente, microrganismos ou células cultivadas que produzem eficientemente ácido nucléico podem ser criadas por meio de aprimoramento de enzima envolvida em processo de biossíntese de ácido nucléico, redução da atividade de enzima envolvida em processo de decomposição de ácido nucléico e modificações de proteína envolvida na liberação de ácido nucléico do microrganismo ou para composição de membrana biológica.
[113] Especificamente, quando é produzida inosina, a modificação de parte de propriedades é realizada de tal forma que atividade de adenilossuccinato sintase é desejavelmente liberada ou fraca; atividade de inosinato desidrogenase é desejavelmente livre ou fraca; e atividade de nuclosidase é desejavelmente livre ou fraca. Quando é produzida guanosina, atividade de adenilossuccinato sintase é desejavelmente livre ou fraca; atividade de guanilato desidrogenase é desejavelmente livre ou fraca; atividade de nucleosidase é desejavelmente livre ou fraca; e atividade de nucleotidase é desejavelmente livre ou fraca. Quando é produzida uridina, atividade de uridina fosforilase é desejavelmente livre ou fraca. Quando é produzida citidina, atividade de citidina desaminase é desejavelmente livre ou fraca e homosserina desidrogenase é desejavelmente livre ou fraca.
[114] Quando ácido nucléico for produzido por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, os microrganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados são preferencialmente bactérias corineformes e Bacillus subtilis. As bactérias corineformes incluem bactérias pertencentes ao gênero Corynebacterium. As bactérias do gênero Corynebacterium que podem ser preferencialmente utilizadas incluem Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium guanofaciens e Corynebacterium petrophilium. Bacillus subtilis inclui bactérias pertencentes ao gênero Bacillus. Dentre o gênero Bacillus, são preferencialmente utilizados Bacillus subtilis, Bacillus liqueniformis e Bacillus pumilus. Quando é produzida guanosina, a bactéria corineforme utilizada no presente inclui bactérias pertencentes ao gênero Corynebacterium. Dentre o gênero Corynebacterium, Corynebacterium glutamicum é preferível e Bacillus subtilis inclui bactérias pertencentes ao gênero Bacillus. Dentre o gênero Bacillus, são preferencialmente utilizados Bacillus subtilis, Bacillus liqueniformis e Bacillus pumilus. Quando uridina for produzida, pode-se utilizar Bacillus subtilis e, dentre as bactérias Bacillus subtilis, são preferencialmente utilizadas as bactérias pertencentes ao gênero Bacillus. Dentre o gênero Bacillus, é preferencialmente utilizada Bacillus subtilis. Quando citidina for produzida, pode-se utilizar Bacillus subtilis e, dentre as bactérias Bacillus subtilis, são preferencialmente utilizadas as bactérias pertencentes ao gênero Bacillus. Dentre o gênero Bacillus, é preferencialmente utilizada Bacillus subtilis.
[115] Quando ácido nucléico for produzido por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, a separação e a purificação de ácido nucléico contido no líquido de fermentação filtrado/separado podem ser conduzidas preferencialmente por meio de combinação de tratamento de resina de troca de íons, recristalização por resfriamento/concentração, separação de membranas e outros métodos. Para a remoção de impurezas, pode-se utilizar recristalização e adsorção de carvão ativado convencional na purificação.
[116] Quando aminoácido for produzido por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, os microrganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricação de aminoácido não são limitados, desde que sejam microrganismos que possam produzir aminoácido. Os microrganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na produção de aminoácido podem ser os que possuem originalmente alta capacidade de produção de aminoácido separados do mundo natural, ou podem ser microrganismos ou células cultivadas que possuem capacidade de produção artificialmente aumentada. Quando aminoácido for produzido por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, o aminoácido é preferencialmente L-treonina, L-lisine, ácido L- glutâmico, L-triptofano, L-isoleucina, L-glutamina, L-arginina, L-alanina, L- histidina, L-prolina, L-fenilalanina, ácido L-aspártico, L-tirosina, metionina, serina, valina ou leucina.
[117] São agora descritos os microrganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na produção de aminoácido sobre aminoácidos específicos. Quando L-treonina for produzida por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, os microrganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricação de L-treonina podem ser microrganismos pertencentes a gênero selecionado a partir do gênero Escherichia, gênero Providencia, gênero Corynebacterium, gênero Brevibacterium e gênero Serratia. Dentre eles, bactérias particularmente preferidas são Escherichia coli, Providencia rettgeri, Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum e Serratia marcescens.
[118] Quando L-lisina for produzida por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, os microrganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricação de L-lisina são preferencialmente Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum e Brevibacterium lactofermentum. Quando ácido L-glutâmico for produzido por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, os microrganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricação de ácido L-glutâmico são preferencialmente Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum e Brevibacterium lactofermentum.
[119] Quando L-triptofano for produzido por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, os microrganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricação de L-triptofano são preferencialmente Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens e Escherichia coli.
[120] Quando L-isoleucina for produzida por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, os microrganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricação de L-isoleucina são preferencialmente Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum e Serratia marcescens.
[121] Quando L-glutamina for produzida por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, os microrganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricação de L-glutamina são preferencialmente Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum e Flavobacterium rigense.
[122] Quando L-arginina for produzida por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, os microrganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricação de L-arginina são preferencialmente Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, Serratia marcescens, Escherichia coli e Bacillus subtilis.
[123] Quando L-alanina for produzida por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, os microrganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricação de L-alanina são preferencialmente Brevibacterium flavum e Arthrobacter oxydans.
[124] Quando L-histidina for produzida por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, os microrganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricação de L-histidina são preferencialmente Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium ammoniagenes, Serratia marcescens, Escherichia coli, Bacillus subtilis e Streptomyces coelicolor.
[125] Quando L-prolina for produzida por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, os microrganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricação de L-prolina são preferencialmente Corynebacterium glutamicum, Kurthia catenaforma, Serratia marcescens e Escherichia coli.
[126] Quando L-fenilalanina for produzida por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, os microrganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricação de L-fenilalanina são preferencialmente Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum e Escherichia coli.
[127] Quando ácido L-aspártico for produzido por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, os microrganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricação de ácido L-aspártico são preferencialmente Brevibacterium flavum, Bacillus megatherium, Escherichia coli e Pseudomonas fluorescens.
[128] Quando L-tirosina for produzida por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, os microrganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricação de L-tirosina são preferencialmente Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum e Escherichia coli.
[129] Quando metionina for produzida por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, os microrganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricação de metionina são preferencialmente Corynebacterium glutamicum.
[130] Quando serina for produzida por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, os microrganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricação de serina são preferencialmente Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum e Arthrobacter oxydans.
[131] Quando valina for produzida por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, os microrganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricação de valina são preferencialmente Brevibacterium lactofermentum, Serratia marcescens e Klebsiella pneumoniae.
[132] Quando leucina for produzida por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, os microrganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricação de leucina são preferencialmente Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium lactofermentum e Serratia marcescens.
[133] Quando aminoácido for produzido por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, os microrganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricação de aminoácido podem ser microrganismos ou células cultivadas derivadas dos exemplos de microrganismos ou células cultivadas por meio de aumento artificial da sua capacidade de produção de aminoácido. Os microrganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na produção de aminoácido podem ser os que possuem propriedades parcialmente modificadas por meio de mutação ou recombinação genética. Exemplos dos microrganismos ou células cultivadas que possuem propriedades parcialmente modificadas que podem ser utilizadas na produção de aminoácido incluem Providencia rettgeri com aumento da produtividade de L-treonina descrito em JP-A n° 2-219582 e Corynebacterium glutamicum com aumento da produtividade de L-alanina descrita no Pedido de Patente Japonês publicado n° 3-500486.
[134] Quando fermentação contínua for conduzida por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, velocidade de produção de volume mais alta que a de fermentação em bateladas convencional pode ser atingida para permitir produção por fermentação extremamente eficiente. A velocidade de produção em fermentação contínua é calculada utilizando a Equação (3) a seguir: [Equação 3] Velocidade de produção por fermentação (g/l/h) = concentração de produto em líquido retirado (g/l) x velocidade de retirada de líquido de fermentação (l/h) + quantidade de líquido corrente do aparelho (l) (3)
[135] A velocidade de produção por fermentação em cultura de bateladas é determinada por meio de divisão da quantidade (g) de produto mediante consumo de toda a fonte de carbono inicial pelo tempo (h) necessário para consumo da fonte de carbono e a quantidade (l) de líquido de cultura naquele momento.
[136] É descrito agora o aparelho de fermentação contínua de acordo com a presente invenção. O aparelho de fermentação contínua de acordo com a presente invenção pode ser utilizado na produção de alcoóis tais como etanol, 1,3-propanodiol, 1,4-butanodiol e glicerol, ácidos orgânicos tais como ácido acético, ácido láctico, ácido pirúvico, ácido succínico, ácido málico, ácido itacônico e ácido cítrico, aminoácidos tais como L-treonina, L-lisina, ácido L- glutâmico, L-triptofano, L-isoleucina, L-glutamina, L-arginina, L-alanina, L- histidina, L-prolina, L-fenilalanina, ácido L-aspártico, L-tirosina, metionina, serina, valina e leucina, ácidos nucléicos tais como inosina e guanosina, compostos de diamina tais como cadaverina, enzimas, antibióticos e proteínas recombinantes.
[137] O aparelho de fermentação contínua de acordo com a presente invenção é aparelho de fabricação de produto químico por meio de fermentação contínua, que inclui a filtragem de cultura de fermentação de microrganismo ou células cultivadas com membrana de separação para recuperar produto de filtrado, retenção simultânea de fluido não filtrado na cultura, ou envio para ela em refluxo, e adição de materiais de fermentação à cultura de fermentação.
[138] O aparelho de fermentação contínua de acordo com a presente invenção possui tanque de reação de fermentação para cultura de fermentação de microrganismo ou células cultivadas.
[139] Em uma forma, o aparelho de fermentação contínua de acordo com a presente invenção inclui tanque de separação de membrana para filtragem da cultura de fermentação, que é conectado por meios de circulação de cultura de fermentação ao tanque de reação de fermentação e nele equipado com membrana de separação; e meios de regulagem da diferença de pressão transmembrana da membrana de separação na faixa de 0,1 a 20 kPa, em que a membrana de separação é membrana porosa que possui tamanho médio de poro de 0,01 μm ou mais a menos de 1 μm.
[140] Em outra forma, o aparelho de fermentação contínua de acordo com a presente invenção inclui elemento de membrana de separação para filtragem da cultura de fermentação, que é disposto no interior do tanque de reação de fermentação e equipado no seu interior com membrana de separação; meio de descarga de produto de fermentação filtrado, que é conectado ao elemento de membrana de separação; e meios de regulagem da diferença de pressão transmembrana da membrana de separação na faixa de 0,1 a 20 kPa, em que a membrana de separação é membrana porosa que possui tamanho médio de poro de 0,01 μm ou mais a menos de 1 μm.
[141] No aparelho de fermentação contínua de acordo com a presente invenção, o coeficiente de permeabilidade da água purificada para a membrana porosa é de preferencialmente 2 x 10-9 m3/m2/s/Pa ou mais a 6 x 107 m3/m2/s/Pa ou menos.
[142] No aparelho de fermentação contínua de acordo com a presente invenção, é preferível que o tamanho médio de poro da membrana porosa seja de 0,01 μm ou mais a menos de 0,2 μm e o desvio padrão do tamanho de poro da membrana porosa seja de 0,1 μm ou menos.
[143] No aparelho de fermentação contínua de acordo com a presente invenção, a membrana porosa é preferencialmente membrana porosa que possui aspereza de superfície de 0,1 μm ou menos.
[144] No aparelho de fermentação contínua de acordo com a presente invenção, a membrana porosa é preferencialmente membrana porosa que contém camada de resina porosa. No aparelho de fermentação contínua de acordo com a presente invenção, a camada de resina porosa é preferencialmente camada de resina porosa fabricada com polímero orgânico. No aparelho de fermentação contínua de acordo com a presente invenção, o material da membrana de polímero orgânico é, de maior preferência, fluoreto de polivinilideno.
[145] É agora descrito o aparelho de fermentação contínua utilizado no método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção com referência às figuras.
[146] A Fig. 1 é uma vista lateral esquemática para exibir um exemplo do aparelho de fermentação contínua do tipo separação de membranas utilizado no método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção. A Fig. 1 é um exemplo típico do aparelho em que elemento de membrana de separação é disposto no lado externo de tanque de reação de fermentação.
[147] Na Fig. 1, o aparelho de fermentação contínua do tipo separação de membrana é composto essencialmente de tanque de reação de fermentação 1, camada de separação de membrana 12 e aparelho de regulagem da diferença de cabeça d’água 3. O elemento de membrana de separação 2 inclui membrana porosa integrada no seu interior. Este elemento de membrana de separação utiliza preferencialmente, por exemplo, membrana de separação e elemento de membrana de separação descritos na Publicação Internacional n° WO2002/064240. O tanque de separação de membrana 12 é conectado por meio de bomba de circulação de líquido de fermentação 11 ao tanque de reação de fermentação 1.
[148] Na Fig. 1, é introduzido um meio por bomba de alimentação de meio 7 para o tanque de reação de fermentação 1, o líquido de fermentação no tanque de reação de fermentação 1 é agitado com agitador 5 se necessário e, se necessário, gás necessário pode ser alimentado por meio de aparelho de alimentação de gás 4. Neste momento, gás de alimentação pode ser recuperado, reciclado e novamente alimentado por meio do aparelho de alimentação de gás 4. Se necessário, o pH do líquido de fermentação é regulado com aparelho de regulagem e sensor de pH 9 e bomba de alimentação de solução reguladora de pH 8 e, se necessário, a temperatura do líquido de fermentação é regulada por regulador de temperatura 10, por meio do quê pode ser conduzida produção por fermentação com alto rendimento. O líquido de fermentação no aparelho circula entre o tanque de reação de fermentação 1 e o tanque de separação de membrana 12 por meio da bomba de circulação de líquido de fermentação 11. O líquido de fermentação que contém produto de fermentação é filtrado e separado pelo elemento de membrana de separação 2 em microrganismos e produto de fermentação que pode ser retirado do sistema de aparelho em seguida. Os microrganismos filtrados/separados podem permanecer no sistema de aparelho, de forma a atingir alta densidade de microrganismos no aparelho para atingir produção de fermentação com alto rendimento. Filtragem/separação pelo elemento de membrana de separação 2 é atingida por diferença de pressão de cabeça d’água a partir da superfície da água do tanque de separação de membrana 12, de forma que não necessita de potência especial. Conforme o necessário, a velocidade de filtragem/separação com o elemento de membrana de separação 2 e a quantidade do líquido de fermentação no aparelho podem ser adequadamente controladas com o sensor de nível 6 e o aparelho de regulagem da diferença de pressão de cabeça d’água 3. Conforme o necessário, gás necessário pode ser alimentado por meio do aparelho de alimentação de gás 4 para o tanque de separação de membrana 12. O ar alimentado pode ser recuperado, reciclado e novamente alimentado por meio do aparelho de alimentação de gás 4. Filtragem/separação por meio do elemento de membrana de separação 2 pode também ser atingida por meio de filtragem de sucção com bomba ou similar ou de pressurização no sistema de aparelho. Microrganismos ou células cultivadas podem ser cultivadas continuamente em tanque de cultura e alimentadas conforme o necessário para o fermentador. Cultivando-se os microrganismos ou células cultivadas em tanque de cultura e alimentando-os conforme o necessário para o fermentador, fermentação contínua com microrganismos ou células cultivadas sempre novas que possuem alta capacidade de fabricação de produto químico é possibilitada para permitir fermentação contínua com alto desempenho produtivo mantido por longo tempo.
[149] A Fig. 2 é uma vista lateral esquemática para explicar outro exemplo do aparelho de fermentação contínua do tipo separação de membranas utilizado na presente invenção. Exemplo típico do aparelho de fermentação contínua em que elemento de membrana de separação é disposto no interior do tanque de reação de fermentação utilizado no método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção é exibido na vista esquemática da Fig. 2.
[150] Na Fig. 2, o aparelho de fermentação contínua do tipo separação de membrana é composto essencialmente de tanque de reação de fermentação 1 e aparelho de regulagem da diferença de cabeça d’água 3. Membrana porosa é integrada em elemento de membrana de separação 2 no tanque de reação de fermentação 1. Esta membrana porosa pode utilizar, por exemplo, membrana de separação e elemento de membrana de separação descritos na Publicação Internacional n° WO2002/064240. O elemento de membrana de separação será descrito com mais detalhes posteriormente.
[151] Em seguida, é descrita em detalhes a fermentação contínua no aparelho contínuo do tipo separação de membrana da Fig. 2.
[152] Um meio é introduzido contínua ou intermitentemente por meio de bomba de alimentação de meio 7 para o tanque de reação de fermentação 1. Se necessário, o meio pode haver sido esterilizado por meio de aquecimento ou submetido a esterilização com filtro antes da introdução no tanque de reação de fermentação. Durante a produção de fermentação, o líquido de fermentação no tanque de reação de fermentação 1 é agitado, se necessário, com agitador 5 no tanque de reação de fermentação 1. No momento da produção de fermentação, gás necessário pode ser alimentado, se necessário, por meio de aparelho de alimentação de gás 4 para o tanque de reação de fermentação 1. No momento da produção por fermentação, o pH do líquido de fermentação no tanque de reação de fermentação 1 é regulado, se necessário, com aparelho de regulagem e sensor de pH 9 e bomba de alimentação de solução reguladora de pH 8 e a temperatura do líquido de fermentação no tanque de reação de fermentação 1 é regulada, se necessário, por regulador de temperatura 10, por meio do quê pode ser conduzida produção por fermentação com alto rendimento. Neste exemplo, pH e temperatura são ilustrados como condições físico-químicas do líquido de fermentação a serem reguladas com aparelhos de medição e aparelhos de controle, mas, se necessário, oxigênio dissolvido ou ORP podem ser regulados, ou a concentração de produto químico no líquido de fermentação é medida com analisador tal como sensor químico on-line e condições físico- químicas podem ser reguladas utilizando, como indicador, a concentração de produto químico no líquido de fermentação. Em introdução contínua ou intermitente do meio, é preferível que a quantidade e a velocidade do meio introduzido sejam reguladas adequadamente utilizando, como indicador, certo valor de medição no ambiente físico-químico do líquido de fermentação com o aparelho de medição.
[153] Na Fig. 2, o líquido de fermentação é filtrado e separado em microrganismos e produto de fermentação por elemento de membrana de separação 2 instalado no tanque de reação de fermentação 1 e o produto de fermentação pode ser retirado do sistema de aparelho. Os microrganismos filtrados/separados permanecem no sistema de aparelho, de forma a atingir alta densidade de microrganismos no sistema de aparelho para alançar produção por fermentação com alto rendimento. Filtragem/separação com o elemento de membrana de separação 2 é atingida por diferença de pressão de cabeça d’água a partir da superfície da água do tanque de reação de fermentação 1, de forma que não necessita de potência especial. Conforme o necessário, a velocidade de filtragem/separação com o elemento de membrana de separação 2 e a quantidade do líquido de fermentação no tanque de reação de fermentação 1 podem ser adequadamente controladas com sensor de nível 6 e aparelho de regulagem da diferença de pressão de cabeça d’água 3. Filtragem/separação por meio do elemento de membrana de separação podem também ser atingidas por meio de filtragem de sucção com bomba ou similar ou de pressurização no sistema de aparelho, se necessário. Microrganismos ou células cultivadas podem ser cultivadas continuamente em tanque de cultura e alimentadas conforme o necessário para o fermentador. Cultivando-se os microrganismos ou células cultivadas em tanque de cultura e alimentando-os conforme o necessário para o fermentador, fermentação contínua com microrganismos ou células cultivadas sempre novas que possuem alta capacidade de fabricação de produto químico é possibilitada para permitir a manutenção de fermentação contínua com alto desempenho produtivo por longo tempo.
[154] É agora descrito o elemento de membrana de separação utilizado preferencialmente no aparelho de fermentação contínua empregado no método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção.
[155] É descrito o elemento de membrana de separação exibido na Fig. 3. Membrana de separação e elemento de membrana de separação descritos na Publicação Internacional n° WO2002/064240 podem ser preferencialmente utilizados no aparelho de fermentação contínua utilizado no método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção. Conforme exibido na Fig. 3, o elemento de membrana de separação é constituído pela disposição de material de passagem 14 e da membrana de separação 15, nesta ordem, sobre os dois lados de placa de sustentação 13 que possui rigidez. A placa de sustentação 13 possui parte côncava 16 sobre os seus dois lados. A membrana de separação 15 filtra o líquido de fermentação. Pelo material de passagem 14, água permeada filtrada através da membrana de separação 15 flui eficientemente para a placa de sustentação 13. A água permeada que fluiu para a placa de sustentação 13 passa através da parte côncava 16 da placa de sustentação 13 e é descarregada por meio de cano de coleta de água 17 para o lado externo do tanque de cultura de fermentação. A potência de descarga da água permeada pode ser gerada por meio de método que utiliza diferença de pressão de cabeça d’água, filtragem de sucção com bomba, líquido, gás ou similar, ou pressurização no aparelho.
[156] É descrito agora o elemento de membrana de separação exibido na Fig. 4. Conforme exibido na Fig. 4, o elemento de membrana de separação é composto essencialmente de feixes de membranas de separação 18 compostos de membranas de fibra oca, camada de vedação de resina superior 19 e camada de vedação de resina inferior 20. O feixe de membranas de separação é unido e fixado na forma de feixe pela camada de vedação de resina superior 19 e a camada de vedação de resina inferior 20. Por meio de união/fixação com a camada de vedação de resina inferior, o oco da membrana de fibra oca é vedado para evitar vazamento da cultura de fermentação. Por outro lado, a camada de vedação de resina superior 19 não veda o orifício interno da membrana de fibra oca, para permitir o fluxo de água permeada para o cano de coleta de água 22. Este elemento de membrana de separação pode ser disposto por meio de quadro de sustentação 21 no aparelho de fermentação contínua. A água permeada filtrada através do feixe de membranas de separação 18 passa através do espaço oco da membrana de fibra oca e é descarregada por meio do cano de coleta de água 22 para o lado externo do tanque de cultura de fermentação. A potência de descarga da água permeada pode ser gerada por meio de método que utiliza diferença de pressão de cabeça d’água, filtragem de sucção com bomba, líquido, gás ou similar, ou pressurização no aparelho.
[157] O material que constitui o elemento de membrana de separação do aparelho de fermentação contínua utilizado no método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção é preferencialmente membro resistente a esterilização a vapor sob alta pressão. Caso o lado interno do aparelho de fermentação possa ser esterilizado, pode-se evitar contaminação com microrganismos desfavoráveis durante fermentação contínua, para permitir fermentação contínua mais estável. O membro que constitui o elemento de membrana de separação é preferencialmente resistente às condições (121 °C, quinze minutos) de esterilização a vapor sob alta pressão. O material do membro de elemento de membrana de separação pode ser adequadamente selecionado, por exemplo, a partir de metais tais como aço inoxidável e alumínio e resinas tais como resina de poliamida, resina de flúor, resina de policarbonato, resina poliacetal, resina de tereftalato de polibutileno, PVDF, resina de polifenileno éter modificado e resina de polissulfona.
[158] No aparelho de fermentação contínua utilizado no método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, o elemento de membrana de separação pode ser instalado fora do tanque de fermentação ou pode ser instalado dentro do tanque de fermentação. No caso de instalação fora do tanque de fermentação, o elemento de membrana de separação pode ser instalado em tanque de separação de membrana disposto separadamente para circular o líquido de fermentação entre o tanque de fermentação e o tanque de separação de membrana, durante o quê o líquido de fermentação pode ser filtrado continuamente através do elemento de membrana de separação.
[159] No aparelho de fermentação contínua utilizado no método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, o tanque de separação de membrana é desejavelmente capaz de esterilização a vapor sob alta pressão. Caso o tanque de separação de membrana seja capaz de esterilização a vapor sob alta pressão, pode-se facilmente evitar a contaminação devido a bactérias saprofíticas.
EXEMPLOS
[160] A seguir, a fim de explicar a presente invenção em mais detalhes, realizações específicas nas quais ácido D-láctico, etanol, ácido pirúvico, ácido succínico, 1,3-propanodiol, ácido itacônico, cadaverina, ácido nucléico e aminoácido foram selecionados como o produto químico e microrganismo ou células cultivadas que possuem capacidade de fabricar cada produto químico foram utilizados em fermentação contínua utilizando os aparelhos exibidos nas vistas esquemáticas nas Figs. 1 e 2 são descritas com referência aos Exemplos.
EXEMPLO DE REFERÊNCIA 1 PREPARAÇÃO DE LINHAGEM DE LEVEDURA QUE POSSUI CAPACIDADE DE PRODUÇÃO DE ÁCIDO L-LÁCTICO
[161] Linhagem de leveduras que possui capacidade de produção de ácido L-láctico foi criada conforme segue. Gene LDH derivado de seres humanos foi ligado abaixo no fluxo de promotor PDC1 sobre genoma de levedura, de forma a criar linhagem de leveduras que possui capacidade de produção de ácido L-láctico. Reação em cadeia de polimerase (PCR) foi conduzida utilizando La-Taq (Takara Shuzo Co., Ltd.) ou KOD-Plus-polimerase (TOYOBO CO., LTD.) de acordo com as suas instruções anexas.
[162] Após a cultura e recuperação de linhagem celular estabelecida de câncer de mama humana (MCF-7), o RNA total foi extraído utilizando Reagente TRIZOL (Invirogen). Utilizando o RNA total resultante como modelo, reação de transcrição reversa foi conduzida utilizando Sistema de Seleção SuperScript (Invitrogen) para sintetizar cDNA. Os detalhes da operação foram de acordo com os protocolos anexos. O cDNA obtido desta forma foi utilizado como modelo de amplificação para PCR subseqüente.
[163] Gene L-LDH foi clonado por meio de PCR com KOD-Plus- polimerase e conjunto de primers de oligonucleotídeos descrito em SEQ ID N° 1 e 2, em que o cDNA obtido por meio da operação acima foi utilizado como modelo de amplificação. Cada fragmento de amplificação de PCR foi purificado, fosforilado em seguida no seu término com T4 polinucleotídeo quinase (fabricada pela TAKARA) e ligado a vetor pUC118 (que havia sido tratado por meio de divisão com enzima de restrição HincII e submissão em seguida da superfície de divisão a desfosforilação). Esta ligação foi conduzida com kit de ligação de DNA Ver. 2 (fabricado pela TAKARA). O produto de plasmídeo de ligação foi utilizado para transformar Escherichia coli DH5α do qual DNA de plasmídeo foi recuperado em seguida para gerar plasmídeos em que vários genes L-ldh (SEQ ID N° 3) haviam sido subclonados. Os plasmídeos pUC118 resultantes nos quais o gene L-ldh havia sido inserido foram digeridos com enzimas de restrição XhoI e NotI e cada um dos fragmentos de DNA resultantes foi inserido em local de divisão XhoI/NotI de vetor de expressão de levedura pTRS11 (Fig. 5). O plasmídeo de expressão de gene L-ldh derivado de seres humanos pL-ldh5 (gene L-ldh) foi obtido desta forma. O pL-ldh5 mencionado acima que é vetor de expressão de gene L-ldh derivado de seres humanos foi depositado como plasmídeo isolado sob FERM AP-20421 em 21 de fevereiro de 2005 junto ao Depositário do Organismo Internacional de Patentes (IPOD), Instituto Nacional de Tecnologia e Ciência Industrial Avançada (AIST) (Central 6, 1-1-1 Higashi, Cidade de Tsukuba, Prefeitura de Ibaraki, Japão).
[164] Fragmento de DNA com 1,3 kb que contém o gene LDH derivado de seres humanos e seqüência de término de gene TDH3 derivado de Saccharomyces cerevisiae foi amplificada por meio de PCR com conjunto de primers de oligonucleotídeos descrito em SEQ ID N° 4 e 5, em que o plasmídeo pL-ldh5 que contém o gene LDH derivado de seres humanos foi utilizado como modelo de amplificação. Fragmento de DNA com 1,2 kb que contém gene TRP1 derivado de Saccharomyces cerevisiae foi amplificado por meio de PCR com conjunto de primers de oligonucleotídeos descrito em SEQ ID N° 6 e 7 e o plasmídeo pRS424 na forma de modelo de amplificação. Os fragmentos de DNA correspondentes foram separados por meio de eletroforese de gel de agarose a 1,5% e purificados de forma habitual. Mistura dos fragmentos de 1,3 kb e 1,2 kb obtidos desta forma foi utilizada como modelo de amplificação em PCR com conjunto de primers de oligonucleotídeos descritos em SEQ ID N° 4 e 7 para gerar produtos que foram submetidos em seguida a eletroforese de gel de agarose a 1,5% para preparar fragmento de DNA de 2,5 kb que consiste do gene LDH derivado de seres humanos e do gene TRP1 a ele ligado de forma habitual. Este fragmento de DNA de 2,5 kb foi transformado de forma habitual em linhagem de levedura de enxerto NBRC10505, de forma a torná-lo triptofano não auxotrófico.
[165] O fato de que as células transformadas resultantes foram aquelas que contêm o gene LDH derivado de seres humanos ligado abaixo no fluxo de promotor de PDC1 sobre genoma de levedura foi confirmado pela preparação, em primeiro lugar, do DNA de genoma da célula transformada de forma habitual, utilizando-o como modelo de amplificação em PCR com conjunto de primer de oligonucleotídeos descritos em SEQ ID N° 8 e 9 para gerar fragmento de DNA de amplificação com 0,7 kb. A capacidade ou não de produção de ácido láctico pelas células transformadas foi confirmada por meio de determinação, em HPLC sob as condições a seguir, da quantidade de ácido láctico contida em sobrenadante de cultura das células transformadas cultivadas em meio SC (Methods in Yeast Genetics, Edição 2000, CSHL Press).
[166] Coluna: Shim-Pack SPR-H (fabricada pela Shimadzu Corporation).
[167] Fase móvel: 5 mM de ácido p-toluenossulfônico (velocidade de fluxo de 0,8 ml/min).
[168] Solução de reação: 5 mM de ácido p-toluenossulfônico, 20 mM de Bis-Tris, 0,1 mM de EDTA^2 Na (velocidade de fluxo de 0,8 ml/min).
[169] Método de detecção: condutividade elétrica.
[170] Temperatura: 45 °C.
[171] A pureza ótica de ácido L-láctico foi medida por meio de HPLC sob as condições a seguir.
[172] Coluna: TSK-gel Enantio L1 (fabricada pela Tosoh Corporation).
[173] Fase móvel: 1 mM de solução aquosa de sulfato de cobre.
[174] Velocidade de fluxo: 1,0 ml/min.
[175] Método de detecção: UV 254 nm.
[176] Temperatura: 30 °C.
[177] A pureza ótica de ácido L-láctico é calculada utilizando a equação a seguir: Pureza ótica (%) = 100 x (L-D)/(L+D) em que L representa a concentração de ácido L-láctico e D representa a concentração de ácido D-láctico.
[178] Como resultado da análise de HPLC, 4 g/l de ácido L-láctico foram detectados e ácido D-láctico estava abaixo do limite de detecção. A partir do estudo acima, confirmou-se que este transformador possui capacidade de produção de ácido L-láctico. As células transformadas resultantes foram utilizadas como linhagem de levedura SW-1 nos Exemplos abaixo.
EXEMPLO DE REFERÊNCIA 2 PREPARAÇÃO DE MEMBRANA POROSA (N° 1)
[179] Resina de fluoreto de polivinilideno (PVDF) e N,N- dimetilacetamida foram utilizadas como resina e solvente, respectivamente, e agitadas suficientemente sob temperatura de 90 °C para gerar solução padrão que possui a composição a seguir: fluoreto de polivinilideno: 13,0% em peso; e N,N-dimetilacetamida: 87,0% em peso
[180] Em seguida, a solução padrão foi resfriada até temperatura de 25 °C, aplicada em seguida sobre tecido não tecido de fibra de poliéster que possui densidade de 0,48 g/cm3 e espessura de 220 μm previamente fixado a placa de vidro e que foi imediatamente mergulhado por cinco minutos em banho de coagulação sob temperatura de 25 °C que possui a composição a seguir, para gerar material base poroso que contém camada de resina porosa formada sobre ele.
[181] Água: 30,0% em peso.
[182] N,N-dimetilacetamida: 70,0% em peso.
[183] Este material base poroso foi destacado da placa de vidro, mergulhado por três vezes em água quente sob temperatura de 80 °C, de forma a ser lavado para remover N,N-dimetilacetamida, para gerar membrana de separação.
[184] A superfície da camada de resina porosa em área de 9,2 μm x 10,4 μm foi observada em ampliação de dez mil vezes sob microscópio eletrônico de varredura. O diâmetro médio de todos os poros observáveis foi de 0,1 μm.
[185] Em seguida, a membrana de separação foi avaliada para determinar o seu coeficiente de permeabilidade da água purificada. A medição do coeficiente de permeabilidade da água purificada foi conduzida com água purificada tratada com membrana de osmose reversa a 25 °C com altura de cabeça de um metro.
[186] O desvio padrão do tamanho médio de poro foi de 0,035 μm e a aspereza da superfície da membrana foi de 0,06 μm. A membrana porosa preparada desta forma poderá ser preferencialmente utilizada na presente invenção.
EXEMPLO DE REFERÊNCIA 3 PREPARAÇÃO DE MEMBRANA POROSA (N° 2)
[187] Resina de fluoreto de polivinilideno (PVDF) foi utilizada como resina, polietileno glicol (PEG) que possui peso molecular de cerca de 20.000 como agente formador de poros, N,N-dimetilacetamida como solvente e água purificada como não solvente e estes materiais foram agitados suficientemente sob temperatura de 90 °C para gerar solução padrão que possui a composição a seguir: Fluoreto de polivinilideno: 13,0% em peso Polietileno glicol: 5,5% em peso N,N-dimetilacetamida: 78,0% em peso; e Água purificada: 3,5% em peso.
[188] Em seguida, a solução padrão foi resfriada até temperatura de 25 °C, aplicada em seguida sobre tecido não tecido de fibra de poliéster que possui densidade de 0,48 g/cm3 e espessura de 220 μm, imediatamente mergulhada por cinco minutos em água purificada a 25 °C, mergulhada por três vezes em água quente a 80 °C, de forma a ser lavada para remover N,N- dimetilacetamida e polietileno glicol para gerar membrana de separação.
[189] A superfície da camada de resina porosa em área de 9,2 μm x 10,4 μm no local da membrana de separação à qual havia sido aplicada a solução padrão foi observada em ampliação de dez mil vezes sob microscópio eletrônico de varredura. O diâmetro médio de todos os poros observáveis foi de 0,02 μm.
[190] A membrana de separação foi avaliada para determinar o seu coeficiente de permeabilidade da água purificada. O coeficiente de permeabilidade da água purificada foi de 2 x 10-9 m3/mzs?a. A medição do coeficiente de permeabilidade da água purificada foi conduzida com água purificada tratada com membrana de osmose reversa a 25 °C com altura de cabeça de um metro.
[191] O desvio padrão do tamanho médio de poro foi de 0,0055 μm e a aspereza da superfície da membrana foi de 0,1 μm. A membrana porosa preparada desta forma poderá ser preferencialmente utilizada na presente invenção.
EXEMPLO DE REFERÊNCIA 4 PREPARAÇÃO DE MEMBRANA POROSA (N° 3)
[192] Membrana de separação foi obtida da mesma forma do Exemplo de Referência 3, exceto pelo uso de solução padrão que possui a composição a seguir: Fluoreto de polivinilideno: 13,0% em peso Polietileno glicol: 5,5% em peso N,N-dimetilacetamida: 81,5% em peso.
[193] A superfície da camada de resina porosa em área de 9,2 μm x 10,4 μm no local da membrana de separação à qual havia sido aplicada a solução padrão foi observada em ampliação de dez mil vezes sob microscópio eletrônico de varredura. O diâmetro médio de todos os poros observáveis foi de 0,19 μm.
[194] O coeficiente de permeabilidade da água purificada avaliado desta membrana de separação foi de 100 x 10-9 m3/m2.s.Pa. A medição do coeficiente de permeabilidade da água purificada foi conduzida com água purificada tratada com membrana de osmose reversa a 25 °C com altura de cabeça de um metro.
[195] O desvio padrão do tamanho médio de poro foi de 0,060 μm e a aspereza da superfície da membrana foi de 0,08 μm. A membrana porosa preparada desta forma poderá ser preferencialmente utilizada na presente invenção.
EXEMPLO DE REFERÊNCIA 5 PREPARAÇÃO DE MEMBRANA POROSA (N° 4)
[196] Resina de fluoreto de polivinilideno (PVDF) e N,N- dimetilacetamida foram utilizadas como resina e solvente, respectivamente, e agitadas suficientemente sob temperatura de 90 °C para gerar solução padrão que possui a composição a seguir: Fluoreto de polivinilideno: 15,0% em peso; e N,N-dimetilacetamida: 85,0% em peso
[197] Em seguida, a solução padrão foi resfriada até temperatura de 25 °C, aplicada em seguida sobre tecido não tecido de fibra de poliéster que possui densidade de 0,48 g/cm3 e espessura de 220 μm previamente fixado a placa de vidro e que foi imediatamente mergulhado por cinco minutos em banho de coagulação sob temperatura de 25 °C que possui a composição a seguir, para gerar material base poroso que contém camada de resina porosa formada sobre ele.
[198] Água: 100,0% em peso.
[199] Este material de base porosa foi destacado da placa de vidro, mergulhada por três vezes em água quente sob temperatura de 80 °C, de forma a ser lavado para remover N,N-dimetilacetamida, para gerar membrana de separação. A superfície da camada de resina porosa em área de 9,2 μm x 10,4 μm foi observada em ampliação de dez mil vezes sob microscópio eletrônico de varredura. O diâmetro médio de todos os poros observáveis foi de 0,008 μm. O coeficiente de permeabilidade da água purificada avaliado desta membrana de separação foi de 0,3 x 10-9 m3/mzs^Pa. A medição do coeficiente de permeabilidade da água purificada foi conduzida com água purificada tratada com membrana de osmose reversa a 25 °C com altura de cabeça de um metro. O desvio padrão do tamanho médio de poro foi de 0,002 μm e a aspereza da superfície da membrana foi de 0,06 μm.
EXEMPLO 1 PRODUÇÃO DE ÁCIDO L-LÁCTICO POR MEIO DE FERMENTAÇÃO CONTÍNUA UTILIZANDO LEVEDURA (N° 1)
[200] A produção de ácido L-láctico foi conduzida utilizando o aparelho de fermentação contínua do tipo separação de membrana da Fig. 1 e meio de fermentação de ácido láctico de levedura que possui a composição exibida na Tabela 1. O meio foi utilizado após esterilização a vapor em alta pressão (121 °C, quinze minutos). Como material de elemento de membrana de separação, utilizou-se moldagem de resina de polissulfona e aço inoxidável. Como membrana de separação, foi utilizada a membrana porosa preparada no Exemplo de Referência 2. A menos que indicado em contrário, as condições de operação do Exemplo 1 são as seguintes: - Capacidade de tanque de reação: 2 (L) - Capacidade do tanque de separação de membrana: 0,5 (L) - Membrana de separação utilizada: membrana de filtragem de fluoreto de polivinilideno - Área de filtragem eficaz do elemento de separação de membrana: 60 cm2 - Controle de temperatura: 30 (°C) - Aeração do tanque de reação: 0,05 (l/min) - Aeração do tanque de separação de membrana: 0,3 (l/min) - Velocidade de agitação do tanque de reação: 100 rpm - Ajuste de pH: ajustado em pH 5 com 1 N NaOH - Velocidade de alimentação do meio de fermentação de ácido láctico: controle variável na faixa de 50 a 300 ml/h - Quantidade de líquido em circulação com aparelho de circulação de líquido de fermentação: 0,1 (l/min) - Regulagem da quantidade de água de permeação da membrana: regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana (do início da fermentação contínua até cem horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 5 kPa ou menos, 100 a 200 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2 kPa ou menos; e 200 a 300 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 20 kPa ou menos).
[201] Levedura SW-1 criada no Exemplo de Referência 1 foi utilizada como microrganismo, meio de fermentação de ácido láctico que possui a composição exibida na Tabela 1 foi utilizada como meio, a concentração de ácido láctico na forma de produto foi avaliada por meio de HPLC exibida no Exemplo de Referência 1 e a concentração de glicose foi medida com Teste de Glicose Wako C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). TABELA 1 MEIO DE FERMENTAÇÃO DE ÁCIDO LÁCTICO DE LEVEDURA
Figure img0003
[202] Em primeiro lugar, a linhagem de SW-1 foi cultivada com agitação por uma noite em 5 ml de meio de fermentação de ácido láctico em tubo de ensaio (antes da pré-cultura preliminar). A cultura resultante foi inoculada em 100 ml de meio de fermentação de ácido láctico novo e cultivado com agitação por 24 horas a 30 °C em frasco Sakaguchi de 500 ml (pré-cultura preliminar). A pré-cultura preliminar foi inoculada em 1,5 l de meio de fermentação de ácido láctico no aparelho de fermentação contínua do tipo de separação de membrana exibido na Fig. 1, tanque de reação 1 foi agitado com agitador a ele fixado, seguido pela regulagem de aeração, controle de temperatura e ajuste de pH do tanque de reação 1 e, sem operar bomba de circulação de líquido de fermentação 10, o microrganismo foi cultivado por 24 horas (pré-cultura). Imediatamente após o término da pré-cultura, a bomba de circulação de líquido de fermentação 10 foi operada e o microrganismo foi cultivado continuamente sob as condições em que, além das condições de operação no momento da pré- cultura, tanque de separação de membrana 2 foi aerado, meio de fermentação de ácido láctico foi alimentado continuamente e a quantidade de água de permeação de membrana foi regulada de tal forma que a quantidade do líquido de fermentação no aparelho de fermentação contínua do tipo separação de membrana tornou-se 2 L, por meio do quê ácido L-láctico foi produzido por meio de fermentação contínua. Neste teste de fermentação contínua, a quantidade de água de permeação de membrana foi regulada e alterada sob as condições de controle de água de permeação de membrana descritas acima, durante o quê a diferença de cabeça d’água foi medida como a diferença de pressão transmembrana com aparelho de regulagem de diferença de cabeça d’água 3. A concentração de ácido L-láctico produzida no líquido de fermentação de permeação de membrana e a concentração de glicose residual foram medidas em momento apropriado.
[203] Os resultados no teste de fermentação contínua por trezentas horas são exibidos na Tabela 2. A produção de ácido L-láctico por meio de fermentação contínua estável foi viável por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção utilizando o aparelho de fermentação contínua do tipo de separação de membrana da Fig. 1. A diferença de pressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o período de fermentação contínua.
EXEMPLO 2 PRODUÇÃO DE ÁCIDO L-LÁCTICO POR MEIO DE FERMENTAÇÃO CONTÍNUA UTILIZANDO LEVEDURA (N° 2)
[204] O mesmo teste de fermentação contínua de ácido L-láctico do Exemplo 1 foi conduzido utilizando a membrana porosa do Exemplo de Referência 3 como membrana de separação. Os resultados são exibidos na Tabela 2. Como resultado, tornou-se viável a produção estável de ácido L-láctico por meio de fermentação contínua. A diferença de pressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o período de fermentação contínua.
EXEMPLO 3 PRODUÇÃO DE ÁCIDO L-LÁCTICO POR MEIO DE FERMENTAÇÃO CONTÍNUA UTILIZANDO LEVEDURA (N° 3)
[205] O mesmo teste de fermentação contínua de ácido L-láctico do Exemplo 1 foi conduzido utilizando a membrana porosa do Exemplo de Referência 4 como membrana de separação. Os resultados são exibidos na Tabela 2. Como resultado, tornou-se viável a produção estável de ácido L-láctico por meio de fermentação contínua. A diferença de pressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o período de fermentação contínua.
EXEMPLO 4 PRODUÇÃO DE ÁCIDO L-LÁCTICO POR MEIO DE FERMENTAÇÃO CONTÍNUA UTILIZANDO LEVEDURA (N° 4)
[206] A produção de ácido L-láctico foi conduzida utilizando o aparelho de fermentação contínua da Fig. 2 e meio de fermentação de levedura que possui a composição exibida na Tabela 1. O meio foi utilizado após esterilização a vapor em alta pressão (121 °C, quinze minutos). Como material de elemento de membrana de separação, utilizou-se moldagem de resina de polissulfona e aço inoxidável. Como membrana de separação, foi utilizada a membrana porosa preparada no Exemplo de Referência 1. A menos que indicado em contrário, as condições de operação deste exemplo são as seguintes: - Capacidade de tanque de reação: 2 (L) - Membrana de separação utilizada: membrana de filtragem de fluoreto de polivinilideno - Área de filtragem eficaz do elemento de separação de membrana: 120 cm2 - Controle de temperatura: 30 (°C) - Aeração do tanque de reação de fermentação: 0,05 (l/min) - Velocidade de alimentação do meio de fermentação de ácido láctico: controle variável na faixa de 50 a 300 ml/h - Velocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 800 rpm - Ajuste de pH: ajustado em pH 5 com 1 N NaOH - Regulagem da quantidade de água de permeação da membrana: regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana (do início da fermentação contínua até 80 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 5 kPa ou menos, 80 a 160 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2 kPa ou menos; e 160 a 240 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 20 kPa ou menos). - Esterilização: o tanque de cultura, incluindo o elemento de membrana de separação, e o meio utilizado, foram esterilizados com vapor sob alta pressão em autoclave a 121 °C por vinte minutos.
[207] A levedura SW-1 criada no Exemplo de Referência 1 foi utilizada como microrganismo, meio de fermentação de ácido láctico que possui a composição exibida na Tabela 1 foi utilizada como meio, a concentração de ácido L-láctico na forma de produto foi avaliada por meio de HPLC exibida no Exemplo de Referência 1 e a concentração de glicose foi medida com Teste de Glicose Wako C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
[208] Em primeiro lugar, a linhagem de SW-1 foi cultivada com agitação por uma noite em 5 ml de meio de fermentação de ácido láctico em tubo de ensaio (antes da pré-cultura preliminar). A cultura resultante foi inoculada em 100 ml de meio de fermentação de ácido láctico novo e cultivado com agitação por 24 horas a 30 °C em frasco Sakaguchi de 500 ml (pré-cultura preliminar). A pré-cultura preliminar foi inoculada em 1,5 l de meio de fermentação de ácido láctico no aparelho de fermentação contínua do tipo de separação de membrana exibido na Fig. 2, tanque de reação 1 foi agitado a 400 rpm com agitador 5 a ele fixado, seguido pela regulagem de aeração, controle de temperatura e ajuste de pH do tanque de reação 1 e o microrganismo foi cultivado por 24 horas (pré- cultura). Imediatamente após o término da pré-cultura, o microrganismo foi cultivado continuamente com meio de fermentação de ácido láctico alimentado continuamente e com a quantidade de água de permeação de membrana regulada de tal forma que a quantidade do líquido de fermentação no aparelho de fermentação contínua do tipo de separação de membrana tornou-se 1,5 l, por meio do quê foi produzido ácido L-láctico por meio de fermentação contínua. Neste teste de fermentação contínua, a quantidade de água de permeação de membrana foi regulada e alterada sob as condições de controle de água de permeação de membrana descritas acima, durante o quê a diferença de cabeça d’água foi medida como a diferença de pressão transmembrana com aparelho de regulagem de diferença de cabeça d’água 3. A concentração de ácido L- láctico produzida no líquido de fermentação de permeação de membrana e a concentração de glicose residual foi medida em momento apropriado. O rendimento de ácido L-láctico em açúcar e a velocidade de produção de ácido L- láctico calculada a partir do ácido L-láctico e glicose introduzida calculada a partir da concentração de glicose são exibidos na Tabela 2.
[209] Como resultado do teste de fermentação por 240 horas, produção estável de ácido L-láctico por meio de fermentação contínua foi viável por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção utilizando o aparelho de fermentação contínua da Fig. 2. A diferença de pressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o período de fermentação contínua.
EXEMPLO 5 PRODUÇÃO DE ÁCIDO L-LÁCTICO POR MEIO DE FERMENTAÇÃO CONTÍNUA UTILIZANDO LEVEDURA (N° 5)
[210] O mesmo teste de fermentação contínua de ácido L-láctico do Exemplo 4 foi conduzido utilizando a membrana porosa preparada no Exemplo de Referência 3 como membrana de separação. Os resultados são exibidos na Tabela 2. Como resultado, tornou-se viável a produção estável de ácido L-láctico por meio de fermentação contínua. A diferença de pressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o período de fermentação contínua.
EXEMPLO 6 PRODUÇÃO DE ÁCIDO L-LÁCTICO POR MEIO DE FERMENTAÇÃO CONTÍNUA UTILIZANDO LEVEDURA (N° 6)
[211] O mesmo teste de fermentação contínua de ácido L-láctico do Exemplo 5 foi conduzido utilizando a membrana porosa preparada no Exemplo de Referência 4 como membrana de separação. Os resultados são exibidos na Tabela 2. Como resultado, tornou-se viável a produção estável de ácido L-láctico por meio de fermentação contínua. A diferença de pressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o período de fermentação contínua.
EXEMPLO COMPARATIVO 1 PRODUÇÃO DE ÁCIDO L-LÁCTICO POR MEIO DE FERMENTAÇÃO EM BATELADAS
[212] Como forma de fermentação utilizando microrganismo, a maior parte da fermentação em bateladas típica foi conduzida para avaliar a sua produtividade de ácido L-láctico. Foi conduzido teste de fermentação em bateladas, em que foi utilizado o meio de fermentação de ácido láctico exibido na Tabela 1 e foi utilizado o tanque de reação 1 somente do aparelho de fermentação contínua do tipo de separação de membrana da Fig. 1. O meio foi utilizado após esterilização a vapor em alta pressão (121 °C, quinze minutos). A levedura SW-1 criada no Exemplo de Referência 1 também foi utilizada como microrganismo neste exemplo comparativo, a concentração de ácido L-láctico na forma de produto foi avaliada por meio de HPLC exibida no Exemplo de Referência 1 e a concentração de glicose foi medida com Teste de Glicose Wako C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). As condições de operação do Exemplo Comparativo 2 são as seguintes: - Capacidade do tanque de reação (quantidade do meio de fermentação de ácido láctico): 1 (L) - Controle de temperatura: 30 (°C) - Aeração do tanque de reação: 0.05 (l/min) - Velocidade de agitação do tanque de reação: 100 rpm - Ajuste de pH: ajustado em pH 5 com 1 N NaOH.
[213] Em primeiro lugar, a linhagem de SW-1 foi cultivada com agitação por uma noite em 5 ml de meio de fermentação de ácido láctico em tubo de ensaio (pré-cultura preliminar). A pré-cultura preliminar foi inoculada em 100 ml de meio de fermentação de ácido láctico novo e cultivado com agitação por 24 horas em frasco Sakaguchi de 500 ml (pré-cultura). A pré-cultura foi inoculada em 1,5 l de meio de fermentação de ácido láctico em aparelho de fermentação contínua do tipo de separação de membrana, tanque de reação 1 foi agitado a 100 rpm com agitador 5 a ele fixado e o tanque de reação 1 foi aerado. Foram conduzidos ajuste de temperatura e ajuste de pH e, sem operar bomba de circulação de líquido de fermentação 10, foi conduzida cultura de fermentação em bateladas. A quantidade dos microrganismos cultivados neste cultura foi de 14 em termos de absorção a 600 nm. Os resultados de fermentação em bateladas são exibidos na Tabela 2. TABELA 2
Figure img0004
[214] A velocidade de produção de ácido L-láctico foi significativamente aprimorada pelo método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção utilizando o aparelho de fermentação exibido nas Figs. 1 e 2.
EXEMPLO COMPARATIVO 2 PRODUÇÃO DE ÁCIDO L-LÁCTICO POR MEIO DE FERMENTAÇÃO CONTÍNUA UTILIZANDO LEVEDURA
[215] Fermentação contínua foi conduzida da mesma forma que no Exemplo 1, exceto pelo fato de que a membrana porosa que possui pequeno diâmetro de poro e baixo coeficiente de permeabilidade da água purificada, preparada no Exemplo de Referência 5, foi utilizada como membrana de separação e a quantidade de água que penetrou através da membrana foi regulada por meio de regulagem da velocidade de fluxo com diferença de pressão transmembrana (regulada na faixa de 0,1 ou mais a 20 kPa ou menos em todo o período de fermentação contínua).
[216] Como resultado, a diferença de pressão transmembrana excedeu 20 kPa em 96 horas após o início da cultura, para causar a obstrução da membrana e, desta forma, foi suspensa a fermentação contínua. Conseqüentemente, revelou- se que a membrana porosa preparada no Exemplo de Referência 5 não é apropriada para a produção de ácido L-láctico.
EXEMPLO COMPARATIVO 3 PRODUÇÃO DE ÁCIDO L-LÁCTICO POR MEIO DE FERMENTAÇÃO CONTÍNUA UTILIZANDO LEVEDURA
[217] Fermentação contínua foi conduzida da mesma forma que no Exemplo 4, exceto pelo fato de que a membrana porosa que possui pequeno diâmetro de poro e baixo coeficiente de permeabilidade da água purificada, preparada no Exemplo de Referência 5, foi utilizada como membrana de separação e a quantidade de água que penetrou através da membrana foi regulada por meio de regulagem da velocidade de fluxo com diferença de pressão transmembrana (regulada na faixa de 0,1 ou mais a 20 kPa ou menos em todo o período de fermentação contínua).
[218] Como resultado, a diferença de pressão transmembrana excedeu 20 kPa em 80 horas após o início da cultura, para causar a obstrução da membrana e, desta forma, foi suspensa a fermentação contínua. Conseqüentemente, revelou- se que a membrana porosa preparada no Exemplo de Referência 5 não é apropriada para a produção de ácido L-láctico.
EXEMPLO 7 PRODUÇÃO DE ETANOL POR MEIO DE FERMENTAÇÃO CONTÍNUA (N° 1)
[219] A produção de etanol foi conduzida utilizando o aparelho de fermentação contínua do tipo separação de membrana da Fig. 1 e meio de fermentação de etanol que possui a composição exibida na Tabela 3. O meio foi utilizado após esterilização a vapor em alta pressão (121 °C, quinze minutos). Como membrana de separação, foi utilizada a membrana porosa preparada no Exemplo de Referência 2. A menos que indicado em contrário, as condições de operação deste exemplo são as seguintes: - Capacidade de tanque de reação: 2 (L) - Capacidade do tanque de separação de membrana: 0,5 (L) - Membrana de separação utilizada: membrana de filtragem de fluoreto de polivinilideno - Área de filtragem eficaz do elemento de separação de membrana: 120 cm2 - Controle de temperatura: 30 (°C) - Aeração do tanque de reação: 0.05 (l/min) - Aeração do tanque de separação de membrana: 0.3 (l/min) - Velocidade de agitação do tanque de reação: 100 rpm - Ajuste de pH: ajustado em pH 5 com 1 N NaOH - Velocidade de alimentação do meio de fermentação de etanol: controle variável na faixa de 50 a 300 ml/h. - Quantidade de líquido em circulação com aparelho de circulação de líquido de fermentação: 0,1 (l/min) - Regulagem da quantidade de água de permeação da membrana: regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana (do início da fermentação contínua até 100 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 5 kPa ou menos, 100 a 200 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2 kPa ou menos, e 200 a 300 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 20 kPa ou menos).
[220] Linhagem NBRC10505 foi utilizada como microrganismo, meio de fermentação de etanol que possui a composição exibida na Tabela 1 foi utilizado como meio e a concentração de etanol como produto foi quantificada por meio de cromatografia de gás para avaliação. Em cromatografia de gás, utilizou-se Shimadzu GC-2010 capilar GC TC-1 (GL Science) 15 metros de comprimento x 0,53 mm de diâmetro interno, df 1,5 μm, e detector de chama de hidrogênio (FID) na detecção e cálculo. A concentração de glicose foi medida com Teste de Glicose Wako C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). TABELA 3 MEIO DE FERMENTAÇÃO DE ETANOL
Figure img0005
[221] Em primeiro lugar, a linhagem de NBRC10505 foi cultivada com agitação por uma noite em 5 ml de meio de fermentação de etanol em tubo de ensaio (antes da pré-cultura preliminar). A cultura resultante foi inoculada em 100 ml de meio de fermentação de etanol novo e cultivado com agitação por 24 horas a 30 °C em frasco Sakaguchi de 500 ml (pré-cultura preliminar). A pré- cultura preliminar foi inoculada em 1,5 l de meio de fermentação de etanol no aparelho de fermentação contínua do tipo de separação de membrana exibido na Fig. 1, tanque de reação 1 foi agitado a 100 rpm com agitador 5 a ele fixado, seguido pela regulagem de aeração, controle de temperatura e ajuste de pH do tanque de reação 1 e, sem operar bomba de circulação de líquido de fermentação 10, o microrganismo foi cultivado por 24 horas (pré-cultura). Imediatamente após o término da pré-cultura, a bomba de circulação de líquido de fermentação 10 foi operada e o microrganismo foi cultivado continuamente sob as condições em que, além das condições de operação no momento da pré- cultura, tanque de separação de membrana 2 foi aerado, meio de fermentação de etanol foi alimentado continuamente e a quantidade de água de permeação de membrana foi regulada de tal forma que a quantidade do líquido de fermentação no aparelho de fermentação contínua do tipo separação de membrana tornou-se 2 L, por meio do quê etanol foi produzido por fermentação contínua. Neste teste de fermentação contínua, a quantidade de água de permeação de membrana foi regulada e alterada sob as condições de controle de água de permeação de membrana descritas acima, durante o quê a diferença de cabeça d’água foi medida como a diferença de pressão transmembrana com aparelho de regulagem de diferença de cabeça d’água 3. A concentração de etanol produzida no líquido de fermentação de permeação de membrana e a concentração de glicose residual foram medidas em momento apropriado. Os resultados são exibidos na Tabela 4.
[222] A produção estável de etanol por meio de fermentação contínua do tipo separação de membrana foi viável por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção utilizando o aparelho de fermentação contínua da Fig. 1. A diferença de pressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o período de fermentação contínua.
EXEMPLO 8 PRODUÇÃO DE ETANOL POR MEIO DE FERMENTAÇÃO CONTÍNUA (N° 2)
[223] A produção de etanol foi conduzida utilizando o aparelho de fermentação contínua da Fig. 2 e meio de fermentação de etanol que possui a composição exibida na Tabela 3. O meio foi utilizado após esterilização a vapor em alta pressão (121 °C, quinze minutos). Como material de elemento de membrana de separação, utilizou-se moldagem de resina de polissulfona e aço inoxidável. Como membrana de separação, foi utilizada a membrana porosa preparada no Exemplo de Referência 2. A menos que indicado em contrário, as condições de operação deste exemplo são as seguintes: - Capacidade de tanque de reação: 2 (L) - Membrana de separação utilizada: membrana de filtragem de fluoreto de polivinilideno - Área de filtragem eficaz do elemento de separação de membrana: 120 cm2 - Controle de temperatura: 30 (°C) - Aeração do tanque de reação de fermentação: 0,05 (l/min) - Velocidade de alimentação do meio de fermentação de ácido láctico: controle variável na faixa de 50 a 300 ml/h. - Velocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 800 rpm - Ajuste de pH: ajustado em pH 5 com 1 N NaOH - Regulagem da quantidade de água de permeação da membrana: regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana (do início da fermentação contínua até 80 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 5 kPa ou menos, 80 a 160 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2 kPa ou menos; e 160 a 240 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 20 kPa ou menos). - Esterilização: o tanque de cultura, incluindo o elemento de membrana de separação, e o meio utilizado, foram esterilizados com vapor sob alta pressão em autoclave a 121 °C por vinte minutos.
[224] Levedura NBRC10505 foi utilizada como microrganismo, meio de fermentação de etanol que possui a composição exibida na Tabela 2 foi utilizado como meio, a concentração de etanol na forma de produto foi avaliada por meio de cromatografia de gás exibida no Exemplo 7 e a concentração de glicose foi medida com Teste de Glicose Wako C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
[225] Em primeiro lugar, a linhagem NBRC10505 foi cultivada com agitação por uma noite em 5 ml de meio de fermentação de etanol em tubo de ensaio (antes da pré-cultura preliminar). A cultura resultante foi inoculada em 100 ml de meio de fermentação de etanol novo e cultivado com agitação por 24 horas a 30 °C em frasco Sakaguchi de 500 ml (pré-cultura preliminar). A pré-cultura preliminar foi inoculada em 1,5 l de meio de fermentação de etanol no aparelho de fermentação contínua do tipo de separação de membrana exibido na Fig. 2, tanque de reação 1 foi agitado a 400 rpm com agitador 5 a ele fixado, seguido pela regulagem de aeração, controle de temperatura e ajuste de pH do tanque de reação 1 e o microrganismo foi cultivado por 24 horas (pré-cultura). Imediatamente após o término da pré-cultura, o microrganismo foi cultivado continuamente em meio de fermentação de etanol alimentado continuamente e com a quantidade de água de permeação de membrana regulada de tal forma que a quantidade do líquido de fermentação no aparelho de fermentação contínua do tipo de separação de membrana tornou-se 1,5 l, por meio do quê foi produzido etanol por fermentação contínua. Neste teste de fermentação contínua, a quantidade de água de permeação de membrana foi regulada e alterada sob as condições de controle de água de permeação de membrana descritas acima, durante o quê a diferença de cabeça d’água foi medida como a diferença de pressão transmembrana com aparelho de regulagem de diferença de cabeça d’água 3. A concentração de etanol produzida no líquido de fermentação de permeação de membrana e a concentração de glicose residual foram medidas em momento apropriado. O rendimento de etanol em açúcar e a velocidade de produção de etanol calculada a partir do etanol e glicose introduzida calculada a partir da concentração de glicose são exibidos na Tabela 4.
[226] A produção estável de etanol por meio de fermentação contínua foi viável por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção utilizando o aparelho de fermentação contínua da Fig. 2. A diferença de pressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o período de fermentação contínua.
EXEMPLO COMPARATIVO 4 PRODUÇÃO DE ETANOL POR MEIO DE FERMENTAÇÃO EM BATELADAS
[227] Como forma de fermentação utilizando microrganismo, a maior parte da fermentação em bateladas típica foi conduzida para avaliar a sua produtividade de etanol. Foi conduzido teste de fermentação em bateladas, em que foi utilizado o meio de fermentação de etanol exibido na Tabela 3 e o tanque de reação 1 somente do aparelho de fermentação contínua do tipo de separação de membrana da Fig. 1. O meio foi utilizado após esterilização a vapor em alta pressão (121 °C, quinze minutos). Levedura NBRC10505 também foi utilizada como microrganismo neste exemplo comparativo, a concentração de etanol na forma de produto foi avaliada por meio de cromatografia de gás exibida no Exemplo 6 e a concentração de glicose foi medida com Teste de Glicose Wako C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). As condições de operação deste exemplo comparativo são as seguintes: - Capacidade do tanque de reação (quantidade do meio de fermentação de etanol): 1 (L) - Controle de temperatura: 30 (°C) - Aeração do tanque de reação: 0,05 (l/min) - Velocidade de agitação do tanque de reação: 100 rpm - Ajuste de pH: ajustado em pH 5 com 1 N NaOH
[228] Em primeiro lugar, a linhagem NBRC10505 foi cultivada com agitação por uma noite em 5 ml de meio de fermentação de etanol em tubo de ensaio (pré-cultura preliminar). A pré-cultura preliminar foi inoculada em 100 ml de meio de fermentação de etanol novo e cultivado com agitação por 24 horas em frasco Sakaguchi de 500 ml (pré-cultura). A pré-cultura foi inoculada em 1,5 l de meio de fermentação de etanol no aparelho de fermentação contínuo do tipo de separação de membrana, tanque de reação 1 foi agitado a 100 rpm com agitador 5 a ele fixado e o tanque de reação 1 foi aerado. Foram conduzidos ajuste de temperatura e ajuste de pH e, sem operar bomba de circulação de líquido de fermentação 10, foi conduzida cultura de fermentação em bateladas. A quantidade dos microrganismos cultivados nesta cultura foi de 18 em termos de absorção a 600 nm. Os resultados de fermentação em bateladas são exibidos na Tabela 4. TABELA 4
Figure img0006
[229] A velocidade de produção de etanol foi significativamente aprimorada pelo método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção utilizando o aparelho de fermentação exibido nas Figs. 1 e 2. EXEMPLO 9 PRODUÇÃO DE ÁCIDO PIRÚVICO POR MEIO DE FERMENTAÇÃO CONTÍNUA (N° 1)
[230] A produção de ácido pirúvico foi conduzida utilizando o aparelho de fermentação contínua do tipo separação de membrana da Fig. 1 e meio de fermentação de ácido pirúvico que possui a composição exibida na Tabela 5. O meio foi utilizado após esterilização a vapor em alta pressão (121 °C, quinze minutos). Como membrana de separação, foi utilizada a membrana porosa preparada no Exemplo de Referência 2. A menos que indicado em contrário, as condições de operação deste exemplo são as seguintes: - Capacidade do tanque de reação de fermentação: 2 (L) - Membrana de separação utilizada: membrana de filtragem de fluoreto de polivinilideno - Área de filtragem eficaz do elemento de separação de membrana: 120 cm2 - Controle de temperatura: 30 (°C) - Aeração do tanque de reação de fermentação: 1,5 (l/min) - Velocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 800 rpm - Ajuste de pH: ajustado em pH 5,5 com 4 N NaOH - Esterilização: o tanque de cultura, incluindo o elemento de membrana de separação, e o meio utilizado, foram esterilizados sob alta pressão em autoclave a 121 °C por vinte minutos. - Regulagem da quantidade de água de permeação da membrana: regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana (do início da fermentação contínua até 100 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 5 kPa ou menos, 100 a 180 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2 kPa ou menos; e 180 a 264 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 20 kPa ou menos).
[231] Linhagem P120-5a de Torulopsis glabrata (FERM P-16745) foi utilizada como microrganismo, meio de fermentação de ácido pirúvico que possui a composição exibida na Tabela 5 foi utilizado como meio e a concentração de ácido pirúvico como produto foi avaliada por meio de HPLC sob as condições a seguir: - Coluna: Shim-Pack SPR-H (fabricada pela Shimadzu Corporation) - Fase móvel: 5 mM de ácido p-toluenossulfônico (velocidade de fluxo de 0,8 ml/min) - Solução de reação: 5 mM de ácido p-toluenossulfônico, 20 mM de Bis-Tris, 0,1 mM de EDTA^2Na Na (velocidade de fluxo de 0,8 ml/min) - Método de detecção: condutividade elétrica - Temperatura: 45 °C
[232] A concentração de glicose foi medida com Teste de Glicose Wako C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). TABELA 5
Figure img0007
[233] Em primeiro lugar, a linhagem de P120-5a foi cultivada com agitação por uma noite em 5 ml de meio de fermentação de ácido pirúvico em tubo de ensaio (antes da pré-cultura preliminar). A cultura resultante foi inoculada em 100 ml de meio de fermentação de ácido pirúvico novo e cultivado com agitação por 24 horas a 30 °C em frasco Sakaguchi de 500 ml (pré-cultura preliminar). A pré-cultura preliminar foi inoculada em 1,5 l de meio de fermentação de ácido pirúvico no aparelho de fermentação contínua do tipo de separação de membrana exibido na Fig. 1, tanque de reação de fermentação 1 foi agitado a 800 rpm com agitador 5 a ele fixado, seguido pela regulagem de aeração, controle de temperatura e ajuste de pH do tanque de reação de fermentação 1 e o microrganismo foi cultivado por 24 horas (pré-cultura). Imediatamente após o término da pré-cultura, a bomba de circulação de líquido de fermentação 10 foi operada e o microrganismo foi cultivado continuamente sob as condições em que, além das condições de operação no momento da pré-cultura, tanque de separação de membrana 2 foi aerado, meio de fermentação de ácido pirúvico foi alimentado continuamente e a quantidade de água de permeação de membrana foi regulada de tal forma que a quantidade do líquido de fermentação no aparelho de fermentação contínua do tipo separação de membrana tornou-se 2 L, por meio do quê ácido pirúvico foi produzido por meio de fermentação contínua. Neste teste de fermentação contínua, a quantidade de água de permeação de membrana foi regulada e alterada sob as condições de controle de água de permeação de membrana descritas acima, durante o quê a diferença de cabeça d’água foi medida como a diferença de pressão transmembrana com aparelho de regulagem de diferença de cabeça d’água 3. A concentração de ácido pirúvico produzida no líquido de fermentação de permeação de membrana e a concentração de glicose residual foram medidas em momento apropriado. Os resultados no teste de fermentação contínua por trezentas horas são exibidos na Tabela 6.
[234] A produção estável de ácido pirúvico por meio de fermentação contínua estável foi viável por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção utilizando o aparelho de fermentação contínua do tipo de separação de membrana da Fig. 1. A diferença de pressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o período de fermentação contínua. EXEMPLO 10 PRODUÇÃO DE ÁCIDO PIRÚVICO POR MEIO DE FERMENTAÇÃO CONTÍNUA (N° 2)
[235] A produção de ácido pirúvico foi conduzida utilizando o aparelho de fermentação contínua da Fig. 2 e meio de fermentação de ácido pirúvico que possui a composição exibida na Tabela 5. O meio foi utilizado após esterilização a vapor em alta pressão (121 °C, quinze minutos). Como material de elemento de membrana de separação, utilizou-se moldagem de resina de polissulfona e aço inoxidável. Como membrana de separação, foi utilizada a membrana porosa preparada no Exemplo de Referência 2. A menos que indicado em contrário, as condições de operação deste exemplo são as seguintes: - Capacidade de tanque de reação: 2 (L) - Membrana de separação utilizada: membrana de filtragem de fluoreto de polivinilideno - Área de filtragem eficaz do elemento de separação de membrana: 120 cm2 - Controle de temperatura: 30 (°C) - Aeração do tanque de reação de fermentação: 1 (l/min) - Velocidade de alimentação do meio de fermentação de ácido láctico: controle variável na faixa de 50 a 300 ml/h. - Velocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 800 rpm - Ajuste de pH: ajustado em pH 5,5 com 4 N NaOH - Regulagem da quantidade de água de permeação da membrana: regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana (do início da fermentação contínua até 100 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 5 kPa ou menos, 100 a 180 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2 kPa ou menos; e 180 a 264 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 20 kPa ou menos). - Esterilização: o tanque de cultura, incluindo o elemento de membrana de separação, e o meio utilizado, foram esterilizados com vapor sob alta pressão em autoclave a 121 °C por vinte minutos.
[236] Linhagem de Torulopsis glabrata P120-5a (FERM P-16745) foi utilizada como microrganismo, meio de fermentação de ácido pirúvico que possui a composição exibida na Tabela 5 foi utilizado como meio e a concentração de ácido pirúvico como produto foi avaliada por meio de HPLC sob as condições a seguir.
[237] Em primeiro lugar, a linhagem de P120-5a foi cultivada com agitação por uma noite em 5 ml de meio de fermentação de ácido pirúvico em tubo de ensaio (antes da pré-cultura preliminar). A cultura resultante foi inoculada em 100 ml de meio de fermentação de ácido pirúvico novo e cultivado com agitação por 24 horas a 30 °C em frasco Sakaguchi de 500 ml (pré-cultura preliminar). A pré-cultura preliminar foi inoculada em 1,5 l de meio de fermentação de ácido láctico no aparelho de fermentação contínua do tipo de separação de membrana exibido na Fig. 2, tanque de reação 1 foi agitado a 800 rpm com agitador 5 a ele fixado, seguido pela regulagem de aeração, controle de temperatura e ajuste de pH do tanque de reação 1 e o microrganismo foi cultivado por 24 horas (pré-cultura). Imediatamente após o término da pré- cultura, meio de fermentação de ácido pirúvico foi alimentado continuamente e o microrganismo foi cultivado continuamente com a quantidade de água de permeação de membrana regulada de tal forma que a quantidade do líquido de fermentação no aparelho de fermentação contínua do tipo de separação de membrana tornou-se 1,5 l, por meio do quê foi produzido ácido pirúvico por meio de fermentação contínua. Neste teste de fermentação contínua, a quantidade de água de permeação de membrana foi regulada e alterada sob as condições de controle de água de permeação de membrana descritas acima, durante o quê a diferença de cabeça d’água foi medida como a diferença de pressão transmembrana com aparelho de regulagem de diferença de cabeça d’água 3. A concentração de ácido pirúvico produzida no líquido de fermentação de permeação de membrana e a concentração de glicose residual foram medidas em momento apropriado. O rendimento de ácido láctico com relação a açúcar e a velocidade de produção de ácido láctico calculada a partir do ácido pirúvico e glicose introduzida calculada a partir da concentração de glicose são exibidos na Tabela 6.
[238] Como resultado do teste de fermentação por 300 horas, produção estável de ácido pirúvico por meio de fermentação contínua foi viável por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção utilizando o aparelho de fermentação contínua da Fig. 2. A diferença de pressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o período de fermentação contínua.
EXEMPLO 11 PRODUÇÃO DE ÁCIDO PIRÚVICO POR MEIO DE FERMENTAÇÃO CONTÍNUA (N° 3)
[239] Foi utilizado o aparelho de fermentação contínua do tipo separação de membrana da Fig. 1, linhagem NBRC0005 foi utilizada como microrganismo e todas as demais condições foram idênticas ao Exemplo 9. Os resultados de fermentação contínua são exibidos na Tabela 6. Como resultado do teste de fermentação por 300 horas, produção estável de ácido pirúvico por fermentação contínua foi viável por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção utilizando o aparelho de fermentação contínua do tipo de separação de membrana da Fig. 1. A diferença de pressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o período de fermentação contínua.
EXEMPLO 12 PRODUÇÃO DE ÁCIDO PIRÚVICO POR MEIO DE FERMENTAÇÃO CONTÍNUA (N° 4)
[240] Foi utilizado o aparelho de fermentação contínua da Fig. 2, linhagem NBRC0005 foi utilizada como microrganismo e todas as demais condições foram idênticas ao Exemplo 10. Os resultados de fermentação contínua são exibidos na Tabela 6. Como resultado do teste de fermentação por 300 horas, produção estável de ácido pirúvico por fermentação contínua foi viável por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção utilizando o aparelho de fermentação contínua da Fig. 2. A diferença de pressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o período de fermentação contínua.
EXEMPLO COMPARATIVO 5 PRODUÇÃO DE ÁCIDO PIRÚVICO POR MEIO DE FERMENTAÇÃO EM BATELADAS (N° 1)
[241] Como forma de fermentação utilizando microrganismo, a maior parte da fermentação em bateladas típica foi conduzida em fermentador de jarra de dois litros para avaliar a sua produtividade de ácido pirúvico. Como meio, foi utilizado o meio exibido na Tabela 5 após esterilização a vapor em alta pressão (121 °C, quinze minutos). Linhagem P120-5a foi utilizada como microrganismo neste exemplo comparativo, a concentração de ácido pirúvico na forma de produto foi avaliada por meio de HPLC exibida no Exemplo 9 e a concentração de glicose foi medida com Teste de Glicose Wako C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). As condições de operação deste exemplo comparativo são as seguintes: - Capacidade do tanque de reação de fermentação (quantidade do meio de fermentação de ácido pirúvico): 1 (L) - Controle de temperatura: 30 (°C) - Aeração do tanque de reação de fermentação: 1 (l/min) - Velocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 600 rpm - Ajuste de pH: ajustado em pH 5,5 com 4 N NaOH
[242] Em primeiro lugar, a linhagem P120-5a foi cultivada com agitação por uma noite em 5 ml de meio de fermentação de ácido pirúvico em tubo de ensaio (pré-cultura preliminar). A pré-cultura preliminar foi inoculada em 50 ml de meio de fermentação de ácido pirúvico novo e cultivado com agitação por 24 horas em frasco Sakaguchi de 500 ml (pré-cultura). A pré-cultura foi inoculada em um litro de meio de fermentação de ácido pirúvico em fermentador de jarra e submetido a fermentação em bateladas. Os resultados de fermentação em bateladas são exibidos na Tabela 6.
EXEMPLO COMPARATIVO 6 PRODUÇÃO DE ÁCIDO PIRÚVICO POR MEIO DE FERMENTAÇÃO EM BATELADAS (N° 2)
[243] Como forma de fermentação utilizando microrganismo, a maior parte da fermentação em bateladas típica foi conduzida em fermentador de jarra de dois litros para avaliar a sua produtividade de ácido pirúvico. Neste exemplo comparativo, linhagem NBRC0005 foi utilizada como microrganismo e todas as demais condições foram idênticas ao Exemplo Comparativo 3. Os resultados de fermentação em bateladas são exibidos na Tabela 6. TABELA 6
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[244] A velocidade de produção de ácido pirúvico foi significativamente aprimorada pelo método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção utilizando o aparelho de fermentação exibido nas Figs. 1 e 2.
EXEMPLO 13 PRODUÇÃO DE ÁCIDO SUCCÍNICO POR MEIO DE FERMENTAÇÃO CONTÍNUA (N° 1)
[245] A produção de ácido succínico foi conduzida utilizando o aparelho de fermentação contínua do tipo separação de membrana da Fig. 1.
[246] A menos que indicado em contrário, ácido succínico e glicose na produção de ácido succínico foram medidos por meio do método a seguir. Ácido succínico em sobrenadante centrifugado de cultura foi analisado por meio de HPLC (Shimadzu LC10A, monitor de RI: RID-10A, coluna: Aminex HPX-87H). A temperatura da coluna era de 50 °C, a coluna foi equilibrada com 0, 01 N H2SO4 e amostra foi injetada em seguida na coluna e analisada por meio de eluição com 0, 01 H2SO4. Glicose foi medida por sensor de glicose (BF-4, Oji Scientific Instruments).
[247] O meio foi utilizado após esterilização a vapor em alta pressão (121 °C, quinze minutos). Como membrana de separação, foi utilizada a membrana porosa preparada no Exemplo de Referência 2. A menos que indicado em contrário, as condições de operação deste exemplo são as seguintes: - Capacidade de tanque de reação: 2 (L) - Capacidade do tanque de separação de membrana: 0,5 (L) - Membrana de separação utilizada: membrana de filtragem de fluoreto de polivinilideno - Área de filtragem eficaz do elemento de separação de membrana: 60 cm2 - Controle de temperatura: 39 (°C) - Aeração de CO2 do tanque de reação: 10 (ml/min) - Aeração de CO2 do tanque de separação de membrana: 100 (ml/min) - Velocidade de agitação do tanque de reação: 100 rpm - Ajuste de pH: ajustado em pH 6,4 com 2 M Na2CO3 - Velocidade de alimentação do meio de fermentação de ácido láctico: controle variável na faixa de 50 a 300 ml/h. - Quantidade de líquido em circulação com aparelho de circulação de líquido de fermentação: 0,1 (l/min) - Regulagem da quantidade de água de permeação da membrana: regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana (do início da fermentação contínua até 100 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 5 kPa ou menos, 100 a 200 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2 kPa ou menos; e 200 a 264 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 20 kPa ou menos).
[248] Neste exemplo, foi conduzida a produção contínua de ácido succínico por Anaerobiospirillum succiniciproducens ATCC 53488 como microrganismo que possui capacidade de produção de ácido succínico. 100 ml de meio de cultura de semente que consiste de 20 g/l de glicose, 10 g/l de polipeptona, 5 g/l de extrato de levedura, 3g/l de K2HPO4, 1 g/l de NaCl, 1 g/L de (NH4)2SO4, 0,2 g/l de MgCl2 e 0,2 g/l de CaCl2-2H2O foram introduzidos em frasco Erlenmeyer de 125 ml e esterilizados por meio de aquecimento. Em porta-luvas anaeróbico, adicionou-se 1 ml de 30 mM Na2CO3 e 0,15 ml de 180 mM H2SO4 e foram adicionalmente agregados 0,5 ml de solução reduzida que consiste de 0,25 g/l de cisteína-HCl e 0,25 g/L de Na2S. Em seguida, linhagem ATCC53488 foi inoculada no meio e mantida em cultura estacionária a 39 °C por uma noite (pré-cultura preliminar). 5 ml de solução reduzida que consiste de 0,25 g/l de cisteína-HCl e 0,25 g/l de Na2S-9H2O foram adicionados a 1,5 l de meio de fermentação de ácido succínico (Tabela 7) no aparelho de fermentação contínua do tipo separação de membrana exibido na Fig. 1 e 50 ml da pré-cultura preliminar foram inoculados. Tanque de reação de fermentação 1 foi agitado a 200 rpm com agitador 5 a ele fixado, seguido pela regulagem de aeração de CO2, controle de temperatura e ajuste de pH do tanque de reação de fermentação 1 e o microrganismo foi cultivado por 24 horas (pré-cultura). TABELA 7
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[249] Imediatamente após o término da pré-cultura, meio de fermentação de ácido succínico foi alimentado continuamente e o microrganismo foi cultivado continuamente enquanto a quantidade de água de permeação de membrana foi regulada de tal forma que a quantidade do líquido de fermentação no aparelho de fermentação contínua do tipo de separação de membrana tornou- se 2 l, por meio do quê foi produzido ácido succínico por fermentação contínua. A quantidade de água de permeação de membrana no teste de fermentação contínua foi regulada por meio de alteração adequada da diferença de cabeça d’água, de tal forma que a diferença de cabeça d’água do tanque de reação de fermentação fosse de até 2 m, ou seja, a diferença de pressão transmembrana foi de 0,1 ou mais a 20 kPa ou menos. A concentração de ácido succínico produzida no líquido de fermentação de permeação de membrana e a concentração de glicose residual foram medidas em momento apropriado. A velocidade de produção de ácido succínico e o rendimento de ácido succínico, calculados a partir da concentração de ácido succínico e de glicose, são exibidos na Tabela 8. A diferença de pressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o período de fermentação contínua.
EXEMPLO 14 PRODUÇÃO DE ÁCIDO SUCCÍNICO POR MEIO DE FERMENTAÇÃO CONTÍNUA (N° 2)
[250] A produção de ácido succínico foi conduzida utilizando o aparelho de fermentação contínua da Fig. 2. O meio foi utilizado após esterilização a vapor em alta pressão (121 °C, quinze minutos). As concentrações de ácido succínico e glicose foram medidas da mesma forma que no Exemplo 13. Como membrana de separação, foi utilizada a membrana porosa preparada no Exemplo de Referência 2. A menos que indicado em contrário, as condições de operação deste exemplo são as seguintes: - Capacidade de tanque de reação: 2 (L) - Membrana de separação utilizada: membrana de filtragem de fluoreto de polivinilideno - Área de filtragem eficaz do elemento de separação de membrana: 120 cm2 - Controle de temperatura: 39 (°C) - Aeração de CO2 do tanque de reação de fermentação: 10 (ml/min) - Velocidade de alimentação do meio de fermentação de ácido láctico: controle variável na faixa de 50 a 300 ml/h. - Velocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 600 rpm - Ajuste de pH: ajustado em pH 6,4 com 2 M Na2CO3 - Regulagem da quantidade de água de permeação da membrana: regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana (do início da fermentação contínua até 80 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 5 kPa ou menos, 80 a 160 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2 kPa ou menos; e 160 a 280 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 20 kPa ou menos). - Esterilização: o tanque de cultura, incluindo o elemento de membrana de separação, e o meio utilizado, foram esterilizados com vapor sob alta pressão em autoclave a 121 °C por vinte minutos.
[251] Neste exemplo, foi conduzida a produção contínua de ácido succínico por linhagem de Anaerobiospirillum succiniciproducens ATCC 53488 como microrganismo que possui capacidade de produção de ácido succínico. 100 ml de meio de cultura de semente que consiste de 20 g/l de glicose, 10 g/l de polipeptona, 5 g/l de extrato de levedura, 3g/L de K2HPO4, 1 g/l de NaCl, 1 g/L de (NH4)2SO4, 0,2 g/l de MgCl2 e 0,2 g/l de CaCl2-2H2O foram introduzidos em frasco Erlenmeyer de 125 ml e esterilizados por meio de aquecimento. Em porta-luvas anaeróbico, adicionou-se 1 ml de 30 mM Na2CO3 e 0,15 ml de 180 mM H2SO4 e foram adicionalmente agregados 0,5 ml de solução reduzida que consiste de 0,25 g/l de cisteína-HCl e 0,25 g/L de Na2S. Em seguida, linhagem ATCC53488 foi inoculada no meio e mantida em cultura estacionária a 39 °C por uma noite (pré-cultura preliminar). 5 ml de solução reduzida que consiste de 0,25 g/l de cisteína-HCl e 0,25 g/l de Na2S-9H2O foram adicionados a 1,5 l de meio de fermentação de ácido succínico (Tabela 7) no aparelho de fermentação contínua exibido na Fig. 2 e 50 ml da pré-cultura preliminar foram inoculados. Tanque de reação de fermentação 1 foi agitado a 600 rpm com agitador 5 a ele conectado, seguido pela regulagem de aeração de CO2, controle de temperatura e ajuste de pH do tanque de reação de fermentação 1 e o microrganismo foi cultivado por 24 horas (pré-cultura).
[252] Imediatamente após o término da pré-cultura, meio de fermentação de ácido succínico foi alimentado continuamente e o microrganismo foi cultivado continuamente enquanto a quantidade de água de permeação de membrana regulada de tal forma que a quantidade do líquido de fermentação no aparelho de fermentação contínua do tipo de separação de membrana tornou-se 1,5 l, por meio do quê foi produzido ácido succínico por fermentação contínua. A quantidade de água de permeação de membrana no teste de fermentação contínua foi regulada por meio de alteração adequada da diferença de cabeça d’água com aparelho de regulagem da diferença de cabeça d’água 3, de tal forma que a cabeça d’água do tanque de reação de fermentação fosse de até 2 m, ou seja, a diferença de pressão transmembrana foi de 0,1 a 20 kPa. A concentração de ácido succínico produzida no líquido de fermentação de permeação de membrana e a concentração de glicose residual foram medidas em momento apropriado. A velocidade de produção de ácido succínico e o rendimento de ácido succínico, calculados a partir da concentração de ácido succínico e de glicose, são exibidos na Tabela 8. A diferença de pressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o período de fermentação contínua.
EXEMPLO COMPARATIVO 7 PRODUÇÃO DE ÁCIDO SUCCÍNICO POR MEIO DE FERMENTAÇÃO EM BATELADAS
[253] A produção de ácido succínico por meio de fermentação em bateladas de Anaerobiospirillum succiniciproducens foi conduzida conforme segue.
[254] 100 ml de meio de cultura de semente que consiste de 20 g/l de glicose, 10 g/l de polipeptona, 5 g/l de extrato de levedura, 3 g/L de K2HPO4, 1 g/l de NaCl, 1 g/L de (NH4)2SO4, 0,2 g/l de MgCl2 e 0,2 g/l de CaCl2-2H2O foram introduzidos em frasco Erlenmeyer de 125 ml e esterilizados por meio de aquecimento. Em porta-luvas anaeróbico, adicionou-se 1 ml de 30 mM Na2CO3 e 0,15 ml de 180 mM H2SO4 e foram adicionalmente agregados 0,5 ml de solução reduzida que consiste de 0,25 g/l de cisteína-HCl e 0,25 g/L de Na2S. Em seguida, linhagem Anaerobiospirillum succiniciproducens ATCC53488 foi inoculada no meio e mantida em cultura estacionária a 39 °C por uma noite. Um litro de meio de fermentação exibido na Tabela 7 foi adicionado a fermentador de mini-jarra (2 l, tipo BMJ, fabricado pela ABLE) e esterilizado por meio de aquecimento (120 °C, vinte minutos).
[255] Gás CO2 foi introduzido sob velocidade de 10 ml/min com aspersor, adicionou-se 10 ml de solução de 3 M Na2CO3 e o pH foi ajustado em 6,8 com solução de ácido sulfúrico. Adicionou-se 5 ml de solução reduzida que consiste de 0,25 g/l de cisteína-HCl e 0,25 g/l de Na2S-9H2O e 50 ml da cultura de semente foram inoculados no meio e cultivados sob velocidade de agitação de 200 rpm sob temperatura de 39 °C enquanto o pH era ajustado em 6,4 com solução de 2 M Na2CO3. Os resultados são exibidos na Tabela 8. TABELA 8
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[256] A velocidade de produção de ácido succínico foi significativamente aprimorada pelo método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção utilizando o aparelho de fermentação exibido nas Figs. 1 e 2.
EXEMPLO 15 PRODUÇÃO DE ÁCIDO SUCCÍNICO POR MEIO DE FERMENTAÇÃO CONTÍNUA (N° 3)
[257] A produção de ácido succínico foi conduzida utilizando o aparelho de fermentação contínua do tipo separação de membrana da Fig. 1. As concentrações de ácido succínico e glicose foram medidas da mesma forma que no Exemplo 13. O meio foi utilizado após esterilização a vapor em alta pressão (121 °C, quinze minutos). Como membrana de separação, foi utilizada a membrana porosa preparada no Exemplo de Referência 2. As condições de operação neste exemplo são idênticas ao Exemplo 13, exceto pela regulagem da quantidade de água de permeação de membrana a seguir: - Regulagem da quantidade de água de permeação da membrana: regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana (do início da fermentação contínua até 100 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 5 kPa ou menos, 100 a 200 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2 kPa ou menos; e 200 a 254 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 20 kPa ou menos).
[258] Neste exemplo, foi conduzida a produção contínua de ácido succínico por linhagem de Anaerobiospirillum succiniciproducens ATCC 53488 como microrganismo que possui capacidade de produção de ácido succínico. 75 mL de meio de fermentação de ácido succínico para Actinobacillus exibido na Tabela 9 e 4,0 g de MgCO3 foram adicionados a tubo de ensaio de 100 ml de soro, seguidos pela substituição do gás no tubo por CO2 e esterilização sob aquecimento. 7,5 ml de suspensão bacteriana da linhagem ATCC55618 foram inoculados e cultivados a 37 °C por 24 horas para preparar cultura de semente (pré-cultura preliminar). TABELA 9 MEIO DE FERMENTAÇÃO DE ÁCIDO SUCCÍNICO
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[259] O aparelho de fermentação contínua do tipo separação de membrana exibido na Fig. 1 foi carregado com 1,5 l de meio de fermentação de ácido succínico (Tabela 9) e 75 ml da pré-cultura preliminar foram inoculados. O microrganismo foi cultivado continuamente da mesma forma que no Exemplo 13, exceto pelo fato de que a aeração de CO2 no banho de reação de fermentação 1 foi de 75 ml/min, a aeração de CO2 no tanque de membrana de separação foi de 150 ml/min, a temperatura foi de 39 °C e o pH foi ajustado em 6, 8 com 5,5 M NaCO3. A concentração de ácido succínico produzida no líquido de fermentação de permeação de membrana e a concentração de glicose residual foram medidas em momento apropriado. A velocidade de produção de ácido succínico e o rendimento de ácido succínico, calculados a partir da concentração de ácido succínico e de glicose, são exibidos na Tabela 10. A diferença de pressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o período de fermentação contínua. EXEMPLO 16 PRODUÇÃO DE ÁCIDO SUCCÍNICO POR MEIO DE FERMENTAÇÃO CONTÍNUA (N° 4)
[260] A produção de ácido succínico foi conduzida utilizando o aparelho de fermentação contínua da Fig. 2. O meio foi utilizado após esterilização a vapor em alta pressão (121 °C, quinze minutos). As concentrações de ácido succínico e glicose foram medidas da mesma forma que no Exemplo 13. Como membrana de separação, foi utilizada a membrana porosa preparada no Exemplo de Referência 2. As condições de operação neste exemplo são idênticas ao Exemplo 14, exceto pela regulagem da quantidade de água de permeação de membrana a seguir: - Regulagem da quantidade de água de permeação da membrana: regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana (do início da fermentação contínua até 100 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 5 kPa ou menos, 100 a 200 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2 kPa ou menos; e 200 a 280 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 20 kPa ou menos).
[261] Neste exemplo, foi conduzida a produção contínua de ácido succínico por linhagem de Actinobacillus succinogenes ATCC 55618 como microrganismo que possui capacidade de produção de ácido succínico. A cultura contínua foi conduzida da mesma forma que no Exemplo 14, exceto pelo fato de que, na produção contínua de ácido succínico por Actinobacillus succinogenes, a aeração de CO2 no banho de reação de fermentação foi de 75 ml/min e o pH foi ajustado em 6,8 com 5,5 M de NaCO3.
[262] Em primeiro lugar, 75 mL de meio de fermentação de ácido succínico para Actinobacillus exibido na Tabela 9 e 4,0 g de MgCO3 foram adicionados a tubo de ensaio de 100 ml de soro, seguidos pela substituição do gás no tubo por CO2 e esterilização sob aquecimento. 7,5 ml de suspensão bacteriana da linhagem ATCC55618 armazenados anteriormente em estado congelado foram inoculados no meio e cultivados a 37 °C por 24 horas para preparar cultura de semente (pré-cultura preliminar). O aparelho de fermentação contínua exibido na Fig. 2 foi carregado com 1,5 l de meio de fermentação de ácido succínico (Tabela 7) e 75 ml da pré-cultura preliminar foram inoculados no meio e cultivados por 24 horas com pH mantido em 6,8 (pré-cultura). Após o término da pré-cultura, o meio de fermentação de ácido succínico da Tabela 9 foi alimentado continuamente e a quantidade de água de permeação de membrana foi regulada de forma que a quantidade do líquido de fermentação no aparelho de fermentação contínua do tipo de separação da Fig. 2 se tornasse 1,5 l, por meio do quê ácido pirúvico foi produzido por fermentação contínua. A concentração de ácido pirúvico produzida no líquido de fermentação de permeação de membrana e a concentração de glicose residual foram medidas em momento apropriado. A velocidade de produção de ácido succínico e o rendimento de ácido succínico, calculados a partir da concentração de ácido succínico e de glicose, são exibidos na Tabela 10. A diferença de pressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o período de fermentação contínua.
EXEMPLO COMPARATIVO 8 PRODUÇÃO DE ÁCIDO SUCCÍNICO POR MEIO DE FERMENTAÇÃO CONTÍNUA (N° 2)
[263] A produção de ácido succínico por Actinobacillus succinogenes foi conduzida conforme segue.
[264] 50 ml de meio de fermentação de ácido succínico para Actinobacillus exibido na Tabela 9 e 4,0 g de MgCO3 foram adicionados a tubo de ensaio de 100 ml de soro, seguidos pela substituição do gás no tubo por CO2 e esterilização sob aquecimento. 5 ml de suspensão bacteriana de Actinobacillus succinofenes ATCC 55618 anteriormente criopreservada foram inoculados no meio e cultivados a 37 °C por 24 horas para preparar cultura de semente. Um litro de meio de fermentação exibido na Tabela 9 foi ajustado em pH 6,8 e adicionado a fermentador de mini-jarra (2 l, tipo BMJ, fabricado pela ABLE) e esterilizado por meio de aquecimento (120 °C, vinte minutos). Gás CO2 foi introduzido em velocidade de 50 ml/min com aspersor e a temperatura foi regulada em 39 °C. 50 ml da cultura de semente acima foram inoculados no meio e cultivados mediante agitação a 600 rpm com lâmina de agitação fixada a ele enquanto o pH era ajustado em 6, 8 com 5, 5 M de NaCO3. Os resultados são exibidos na Tabela 10. TABELA 10
Figure img0015
[265] A velocidade de produção de ácido succínico foi significativamente aprimorada pelo método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção utilizando os aparelhos de fermentação exibidos nas Figs. 1 e 2.
EXEMPLO 17 PRODUÇÃO CONTÍNUA DE ÁCIDO SUCCÍNICO POR MEIO DE FERMENTAÇÃO CONTÍNUA (N° 5)
[266] A produção de ácido succínico foi conduzida utilizando o aparelho de fermentação contínua do tipo separação de membrana da Fig. 1. As concentrações de ácido succínico e glicose foram medidas da mesma forma que no Exemplo 13. O meio foi utilizado após esterilização a vapor em alta pressão (121 °C, quinze minutos). Como membrana de separação, foi utilizada a membrana porosa preparada no Exemplo de Referência 2. As condições de operação neste exemplo são idênticas ao Exemplo 13, exceto pela regulagem da quantidade de água de permeação de membrana a seguir: - Regulagem da quantidade de água de permeação da membrana: regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana (do início da fermentação contínua até 80 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 5 kPa ou menos, 80 a 140 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2 kPa ou menos; e 140 a 200 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 20 kPa ou menos).
[267] Neste exemplo, foi conduzida a produção contínua de ácido succínico por linhagem de Escherichia coli B ATCC 11303 como microrganismo que possui capacidade de produção de ácido succínico. 150 ml de meio de cultura de semente que consiste de 12 g/l de glicose, 10 g/l de polipeptona, 5 g/l de extrato de levedura, 1 g/L de K2HPO4, 1 g/l de NaCl e 0,2 g/l de MgCl2 foram introduzidos em frasco Erlenmeyer de 200 ml e ajustados em pH 6, 8. Após a adição de 7,5 g de MgCO3, o meio foi esterilizado por meio de aquecimento e resfriado à temperatura ambiente e, em porta-luvas anaeróbica, linhagem ATCC 11303 foi inoculada no meio e mantida em cultura estacionário por uma noite a 37 °C (pré-cultura preliminar). O aparelho de fermentação contínua exibido na Fig. 1 foi carregado com 1,5 l de meio de fermentação de ácido succínico que consiste de 12 g/l de glicose, 10 g/l de polipeptona, 5 g/l de extrato de levedura, 1 g/l de K2HPO4, 1 g/l de NaCl e 0,2 g/l de MgCl2 e 150 ml da pré-cultura preliminar foram inoculados no meio. A fermentação contínua de ácido succínico foi conduzida sob as mesmas condições do Exemplo 13, exceto pelo fato de que a temperatura de fermentação foi de 37 °C.
[268] Após pré-cultura por 24 horas, o microrganismo foi cultivado continuamente enquanto o meio de fermentação de ácido succínico exibido na Tabela 11 era alimentado continuamente e a quantidade de água de permeação de membrana foi regulada de forma que a quantidade do líquido de fermentação no aparelho de fermentação contínua se tornasse 2 l. TABELA 11
Figure img0016
[269] A concentração de ácido succínico produzida no líquido de fermentação de permeação de membrana e a concentração de glicose residual foram medidas em momento apropriado. A velocidade de produção de ácido succínico e o rendimento de ácido succínico, calculados a partir da concentração de ácido succínico e de glicose, são exibidos na Tabela 12. A diferença de pressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o período de fermentação contínua. EXEMPLO 18 PRODUÇÃO CONTÍNUA DE ÁCIDO SUCCÍNICO POR MEIO DE FERMENTAÇÃO CONTÍNUA (N° 6)
[270] A produção de ácido succínico foi conduzida utilizando o aparelho de fermentação contínua da Fig. 2. O meio foi utilizado após esterilização a vapor em alta pressão (121 °C, quinze minutos). As concentrações de ácido succínico e glicose foram medidas da mesma forma que no Exemplo 13. Como membrana de separação, foi utilizada a membrana porosa preparada no Exemplo de Referência 2. As condições de operação neste exemplo são idênticas ao Exemplo 14, exceto pela regulagem da quantidade de água de permeação de membrana a seguir: - Regulagem da quantidade de água de permeação da membrana: regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana (do início da fermentação contínua até 80 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 5 kPa ou menos, 80 a 120 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2 kPa ou menos; e 120 a 180 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 20 kPa ou menos).
[271] Neste exemplo, foi conduzida a produção contínua de ácido succínico por linhagem de Escherichia coli B ATCC 11303 como microrganismo que possui capacidade de produção de ácido succínico. 150 ml de meio de cultura de semente que consiste de 12 g/l de glicose, 10 g/l de polipeptona, 5 g/l de extrato de levedura, 1 g/L de K2HPO4, 1 g/l de NaCl e 0,2 g/l de MgCl2 foram introduzidos em frasco Erlenmeyer de 200 ml e ajustados em pH 6,8. Após a adição de 7,5 g de MgCO3, o meio foi esterilizado por meio de aquecimento e resfriado à temperatura ambiente e linhagem ATCC 11303 foi inoculada no meio e mantida em cultura estacionária por uma noite a 37 °C (pré-cultura preliminar). O aparelho de fermentação contínua exibido na Fig. 2 foi carregado com 1,5 l de meio de fermentação de ácido succínico que consiste de 12 g/l de glicose, 10 g/l de polipeptona, 5 g/l de extrato de levedura, 1 g/L de K2HPO4, 1 g/l de NaCl e 0,2 g/l de MgCl2 e 150 ml da pré-cultura preliminar foram inoculados no meio. O microrganismo foi cultivado por 24 horas sob temperatura de 37 °C enquanto o pH era ajustado em 6,8 com 5,5 M de NaCO3 (pré-cultura). Após o término da pré-cultura, o microrganismo foi cultivado enquanto o meio de fermentação de ácido succínico exibido na Tabela 11 era alimentado continuamente e a quantidade de água de permeação de membrana foi regulada de forma que a quantidade do líquido de fermentação no aparelho de fermentação contínua se tornasse 1,5 l. A velocidade de produção de ácido succínico e o rendimento de ácido succínico, calculados a partir da concentração de ácido succínico e de glicose, são exibidos na Tabela 12. A diferença de pressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o período de fermentação contínua.
EXEMPLO COMPARATIVO 9 PRODUÇÃO DE ÁCIDO SUCCÍNICO POR MEIO DE FERMENTAÇÃO EM BATELADAS (N° 3)
[272] A produção de ácido succínico por meio de fermentação em bateladas de Escherichia coli foi conduzida conforme segue.
[273] 100 ml de meio de cultura de semente que consiste de 12 g/l de glicose, 10 g/l de polipeptona, 5 g/l de extrato de levedura, 1 g/L de K2HPO4, 1 g/l de NaCl e 0,2 g/l de MgCl2 foram introduzidos em frasco Erlenmeyer de 1250 ml e ajustados em pH 6,8. Após a adição de 5 g de MgCO3, o meio foi esterilizado por meio de aquecimento e resfriado à temperatura ambiente e, em porta-luvas anaeróbico, linhagem de Escherichia coli B ATCC 11303 foi inoculada no meio e mantida em cultura estacionária por uma noite a 37 °C. Um litro de meio de fermentação que consiste de 12 g/l de glicose, 10 g/l de polipeptona, 5 g/l de extrato de levedura, 1 g/l de K2HPO4, 1 g/l de NaCl e 0,2 g/l de MgCl2 foram ajustados em pH 6,8, adicionados a fermentador de mini-jarra (2 l, tipo BMJ, fabricado pela ABLE) e esterilizado por meio de aquecimento (120 °C, vinte minutos). Gás CO2 foi introduzido em velocidade de 50 ml/min com aspersor e a temperatura foi regulada em 37 °C. 100 ml da cultura de semente acima foram inoculados no meio e cultivados mediante agitação a 600 rpm com lâmina de agitação fixada a ele enquanto o pH era ajustado em 6,8 com 5,5 M de NaCO3. A cultura foi conduzida enquanto 200 ml de solução de 100 g/l de glicose eram adicionados pouco a pouco, de forma que a concentração de glicose na cultura não excedesse 20 g/l. Os resultados são exibidos na Tabela 12. TABELA 12
Figure img0017
[274] A velocidade de produção de ácido succínico foi significativamente aprimorada pelo método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção utilizando os aparelhos de fermentação exibidos nas Figs. 1 e 2.
EXEMPLO 19 PRODUÇÃO DE 1,3-PROPANODIOL POR MEIO DE FERMENTAÇÃO CONTÍNUA (N° 1)
[275] A produção de 1,3-propandiol foi conduzida utilizando o aparelho de fermentação contínua do tipo separação de membrana da Fig. 1 e meio de produção de 1,3-propanodiol com a composição exibida na Tabela 13.
[276] Em primeiro lugar, é descrito o método de isolamento, identificação e medição de 1,3-propanodiol como produto.
[277] A conversão de glicerol em 1,3-propanodiol foi confirmada por meio de HPLC. Esta análise foi conduzida utilizando métodos padrão e materiais disponíveis para os técnicos no campo da técnica de cromatografia. Em método apropriado, foi utilizado sistema HPLC Waters Maxima 820 utilizando detecção de RI e UV (210 nm). Amostra recebeu injeção em velocidade de fluxo de 0,5 ml/min em coluna Shodex SH-1011 (8 mm x 300 mm, adquirida da Waters, Milford MA) regulada em temperatura de 50 °C e equipada com coluna prévia Shodex SH-1011P (6 mm x 50 mm) com 0,01 N H2SO4 como fase móvel. Quando a análise quantitativa estava por ser conduzida, ácido trimetilacético de quantidade conhecida foi utilizado como padrão externo para preparar a amostra. Os tempos de retenção de glicose (detecção de RI), glicerol, 1,3-propanodiol (detecção de RI) e ácido trimetilacético (detecção de RI e UV) foram de cerca de 15 minutos, 20 minutos, 26 minutos e 35 minutos, respectivamente.
[278] A produção de 1,3-propanodiol foi confirmada por meio de GC/MS. Esta análise foi conduzida utilizando métodos padrão e materiais disponíveis para os técnicos no campo da técnica de GC/MS. Utilizou-se, por exemplo, sistema cromatográfico de gás Hewlett Packard 5890 Série II conectado a detector seletivo de massa Hewlett Packard 5971 Série (EI) e coluna HP-INNOWax (comprimento de 30 m, diâmetro interno de 0,25 mm, espessura de filme de 0,25 μm). O tempo de retenção e espectro de massa de 1,3-propanodiol formado foram comparados com os de 1,3- propanodiol padrão (m/e: 57, 58).
[279] Também foi conduzida a derivação de amostra. 30 μl de ácido perclórico concentrado (70% v/v) foram adicionados a 1,0 ml de amostra (tal como sobrenadante de cultura). Após a mistura, a amostra foi liofilizada. Mistura 1:1 (300 μl) de bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida:piridina foi adicionada ao material liofilizado, misturada vigorosamente em seguida e mantida a 65 °C por uma hora. A amostra foi tornada transparente por meio de remoção de materiais insolúveis por centrifugação. O líquido resultante foi separado em duas fases e a sua fase superior foi utilizada em análise. A amostra foi submetida a cromatografia sobre coluna DB-5 (48 m, diâmetro interno de 0,25 mm, espessura do filme de 0,25 μm, da J&W Scientific) e o tempo de retenção e espectro de massa do derivado de 1,3-propanodiol obtido a partir do sobrenadante de cultura foram comparados com os obtidos da amostra padrão. O espectro de massa de 1,3-propanodiol derivado de TMS contém 205, 177, 130 e 115 unidades de massa atômica (AMU) de íons característicos.
[280] O meio foi utilizado após esterilização a vapor em alta pressão (121 °C, quinze minutos). Como material de elemento de membrana de separação, utilizou-se moldagem de resina de polissulfona e aço inoxidável. Como membrana de separação, foi utilizada a membrana porosa preparada no Exemplo de Referência 2. A menos que indicado em contrário, as condições de operação deste exemplo são as seguintes: - Capacidade de tanque de reação: 2 (L) - Membrana de separação utilizada: membrana de filtragem de fluoreto de polivinilideno - Área de filtragem eficaz do elemento de separação de membrana: 120 cm2 - Controle de temperatura: 37 (°C) - Aeração do tanque de reação de fermentação: 0,6 (l/min) de gás nitrogênio - Velocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 800 rpm - Ajuste de pH: ajustado em pH 7,0 com 5 N NaOH - Esterilização: o tanque de cultura, incluindo o elemento de membrana de separação, e o meio utilizado, foram esterilizados com vapor sob alta pressão em autoclave a 121 °C por vinte minutos. - Regulagem da quantidade de água de permeação da membrana: regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana (do início da fermentação contínua até 100 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 5 kPa ou menos, 100 a 200 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2 kPa ou menos; e 200 a 320 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 20 kPa ou menos).
[281] Linhagem ATCC 25955 de Klebsiella pneumoniae foi utilizada como microrganismo, meio de fermentação de 1,3-propanodiol que possui a composição exibida na Tabela 13 foi utilizado como meio e a concentração de 1,3- propanodiol como produto foi avaliada por meio do método de HPLC descrito acima.
[282] A concentração de glicose foi medida com Teste de Glicose Wako C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). TABELA 13 MEIO DE FERMENTAÇÃO DE 1,3-PROPANODIOL
Figure img0018
[283] Em primeiro lugar, a linhagem Klebsiella pneumoniae ATCC 25955 foi cultivada com agitação por uma noite em 5 ml de meio de produção de 1,3-propanodiol em tubo de ensaio (antes da pré-cultura preliminar). A cultura resultante foi inoculado em 50 ml de meio de produção de 1,3-propanodiol novo e cultivado com agitação por 24 horas a 30 °C em frasco Sakaguchi de 500 ml (pré-cultura preliminar). A pré-cultura preliminar foi inoculada em 1,5 l de meio de fermentação de 1,3-propanodiol no aparelho de fermentação contínua do tipo de separação de membrana exibido na Fig. 1, tanque de reação de fermentação 1 foi agitado a 800 rpm com agitador 5 a ele fixado, seguido pela regulagem de aeração, controle de temperatura e ajuste de pH do tanque de reação 1 e o microrganismo foi cultivado por 24 horas (pré-cultura). Imediatamente após o término de pré-cultura, a bomba de circulação de líquido de fermentação e o microrganismo foi cultivado continuamente sob as condições em que, além das condições de operação no momento da pré-cultura, tanque de separação de membrana 2 foi aerado, meio de produção de 1,3-propanodiol (concentração de glicerol: 100 g/l) foi alimentado continuamente e a quantidade de água de permeação de membrana foi regulada de forma que a quantidade do líquido de fermentação no aparelho de fermentação contínua se tornasse 1,5 l, por meio do quê 1,3-propanodiol foi produzido por fermentação contínua. Neste teste de fermentação contínua, a quantidade de água de permeação de membrana foi regulada e alterada sob as condições de controle de água de permeação de membrana descritas acima, durante o quê a diferença de cabeça d’água foi medida como a diferença de pressão transmembrana com aparelho de regulagem de diferença de cabeça d’água 3. A concentração de 1,3-propanodiol produzida no líquido de fermentação de permeação de membrana e a concentração de glicose residual foram medidas em momento apropriado. A velocidade de produção de 1,3-propanodiol calculada a partir do 1,3-propanodiol e glicerol introduzido é exibida na Tabela 14.
[284] Como resultado do teste de fermentação por 320 horas, produção estável de 1,3-propanodiol por fermentação contínua foi viável por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção utilizando o aparelho de fermentação contínua do tipo de separação de membrana exibido na Fig. 1. A diferença de pressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o período de fermentação contínua. EXEMPLO 20 PRODUÇÃO DE 1 ,3-PROPANODIOL POR MEIO DE FERMENTAÇÃO CONTÍNUA (N° 2)
[285] A produção de 1,3-propanodiol foi conduzida utilizando o aparelho de fermentação contínua da Fig. 2 e meio de produção de 1,3- propanodiol com a composição exibida na Tabela 13.
[286] O meio foi utilizado após esterilização a vapor em alta pressão (121 °C, quinze minutos). Como material de elemento de membrana de separação, utilizou-se moldagem de resina de polissulfona e aço inoxidável. Como membrana de separação, foi utilizada a membrana porosa preparada no Exemplo de Referência 2. A menos que indicado em contrário, as condições de operação deste exemplo são as seguintes: - Capacidade do tanque de reação de fermentação: 2 (L) - Membrana de separação utilizada: membrana de filtragem de fluoreto de polivinilideno - Área de filtragem eficaz do elemento de separação de membrana: 120 cm2 - Controle de temperatura: 37 (°C) - Aeração do tanque de reação de fermentação: 0,6 (l/min) de gás nitrogênio - Velocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 800 rpm - Ajuste de pH: ajustado em pH 7,0 com 5 N NaOH - Esterilização: o tanque de cultura, incluindo o elemento de membrana de separação, e o meio utilizado, foram esterilizados com vapor sob alta pressão em autoclave a 121 °C por vinte minutos. - Regulagem da quantidade de água de permeação da membrana: regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana (do início da fermentação contínua até 100 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 5 kPa ou menos, 100 a 200 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2 kPa ou menos; e 200 a 264 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 20 kPa ou menos).
[287] Linhagem ATCC 25955 de Klebsiella pneumoniae foi utilizada como microrganismo, meio de produção de 1,3-propanodiol que possui a composição exibida na Tabela 9 foi utilizado como meio e a concentração de 1,3-propanodiol como produto foi medida por meio do método de HPLC descrito acima. A concentração de glicose foi medida com Teste de Glicose Wako C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
[288] Em primeiro lugar, a linhagem Klebsiella pneumoniae ATCC 25955 foi cultivada com agitação por uma noite em 5 ml de meio de produção de 1,3- propanodiol em tubo de ensaio (antes da pré-cultura preliminar). A cultura resultante foi inoculada em 50 ml de meio de produção de 1,3-propanodiol novo e cultivado com agitação por 24 horas a 30 °C em frasco Sakaguchi de 500 ml (pré-cultura preliminar). O pré-cultura preliminar foi inoculado em 1,5 l de meio de fermentação de 1,3- propanodiol no aparelho de fermentação contínua do tipo de separação de membrana exibido na Fig. 2, tanque de reação de fermentação 1 foi agitado a 800 rpm com agitador 5 a ele fixado, seguido pela regulagem de aeração, controle de temperatura e ajuste de pH do tanque de reação de fermentação 1 e o microrganismo foi cultivado por 24 horas (pré-cultura). Imediatamente após o término da pré-cultura, o microrganismo foi cultivado continuamente em que meio de produção de 1,3- propanodiol (concentração de glicerol: 100 g/l) foi alimentado continuamente e a quantidade de água de permeação de membrana foi regulada de forma que a quantidade do líquido de fermentação no aparelho de fermentação contínua integrada por membrana se tornasse 1,5 l, por meio do quê 1,3-propanodiol foi produzido por fermentação contínua. Neste teste de fermentação contínua, a quantidade de água de permeação de membrana foi regulada e alterada sob as condições de controle de água de permeação de membrana descritas acima, durante o quê a diferença de cabeça d’água foi medida como a diferença de pressão transmembrana com aparelho de regulagem de diferença de cabeça d’água 3. A concentração de 1,3-propanodiol produzida no líquido de fermentação de permeação de membrana e a concentração de glicose residual foram medidas em momento apropriado. A velocidade de produção de 1,3-propanodiol calculada a partir do 1,3- propanodiol medido e glicerol introduzido é exibida na Tabela 14. Como resultado do teste de fermentação por 264 horas, produção estável de 1,3-propanodiol por fermentação contínua foi viável por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção utilizando o aparelho de fermentação contínua da Fig. 2. A diferença de pressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o período de fermentação contínua.
EXEMPLO COMPARATIVO 10 PRODUÇÃO DE 1,3-PROPANODIOL POR MEIO DE FERMENTAÇÃO EM BATELADAS ALIMENTADAS
[289] Como forma de fermentação utilizando microrganismo, a maior parte da fermentação em bateladas típica foi conduzida em fermentador de jarra de dois litros para avaliar a sua produtividade de 1,3-propanodiol. O meio foi utilizado após esterilização a vapor em alta pressão (121 °C, quinze minutos). Linhagem de Klebsiella pneumoniae ATCC 25955 foi utilizada como microrganismo neste exemplo comparativo, a concentração de 1,3-propanodiol na forma de produto foi avaliada por meio de HPLC e a concentração de glicose foi medida com Teste de Glicose Wako C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). As condições de operação do Exemplo Comparativo 10 são as seguintes: - Capacidade do tanque de reação (quantidade do meio de produção de 1,3-propanodiol): 1,0 (L) - Controle de temperatura: 37 (°C) - Aeração do tanque de reação de fermentação: 0,4 (l/min) de gás nitrogênio - Velocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 300 rpm - Ajuste de pH: ajustado em pH 7,0 com 5 N NaOH
[290] Em primeiro lugar, a linhagem Klebsiella pneumoniae ATCC 25955 foi cultivada com agitação por uma noite em 5 ml de meio de produção de 1,3-propanodiol em tubo de ensaio (pré-cultura preliminar). A pré-cultura preliminar foi inoculada em 50 ml de meio de produção de 1,3-propanodiol novo e cultivado com agitação por 24 horas em frasco Sakaguchi de 500 ml (pré- cultura). A pré-cultura foi inoculada em 1,5 l de meio de produção de 1,3- propanodiol em fermentador de jarra. O microrganismo foi submetido a fermentação por bateladas alimentadas por meio de alimentação contínua de meio de produção de 1,3-propanodiol (concentração de glicerol: 500 g/l), de forma que a concentração de glicerol aumentasse de 0 g/l para 10 g/l. Os resultados são exibidos na Tabela 14. TABELA 14
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[291] A velocidade de produção de 1,3-propanodiol foi significativamente aprimorada pelo método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção utilizando os aparelhos de fermentação exibidos nas Figs. 1 e 2. EXEMPLO 21 PRODUÇÃO DE ÁCIDO ITACÔNICO POR MEIO DE FERMENTAÇÃO CONTÍNUA (N° 1)
[292] A produção de ácido itacônico foi conduzida utilizando o aparelho de fermentação contínua do tipo separação de membrana da Fig. 1. Foi utilizado o meio que possui a composição exibida na Tabela 15 após esterilização a vapor em alta pressão (121 °C, quinze minutos). Como material de elemento de membrana de separação, utilizou-se moldagem de resina de polissulfona e aço inoxidável. Como membrana de separação, foi utilizada a membrana porosa preparada no Exemplo de Referência 2. A menos que indicado em contrário, as condições de operação deste exemplo são as seguintes: - Capacidade do tanque de reação de fermentação: 2 (L) - Membrana de separação utilizada: membrana de filtragem de fluoreto de polivinilideno - Área de filtragem eficaz do elemento de separação de membrana: 120 cm2 - Controle de temperatura: 35 (°C) - Aeração do tanque de reação de fermentação: 1.5 (l/min) - Velocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 200 rpm - Esterilização: o tanque de cultura, incluindo o elemento de membrana de separação, e o meio utilizado, foram esterilizados com vapor sob alta pressão em autoclave a 121 °C por vinte minutos. - Ajuste de pH: ajustado em pH 5 com 4 N NaOH - Regulagem da quantidade de água de permeação da membrana: regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana (do início da fermentação contínua até 100 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 5 kPa ou menos, 100 a 200 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2 kPa ou menos; e 200 a 300 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 20 kPa ou menos).
[293] Linhagem de Aspergillus terreus ATCC 10020 foi utilizada como microrganismo, meio de fermentação de ácido itacônico que possui a composição exibida na Tabela 11 foi utilizado como meio, a concentração de ácido itacônico na forma de produto foi medida por meio de método de Koppeshaar (Biseibutsu Kogaku Kouza (Bacterial Optics Coourse), Vol. 5, Kabino Riyou Kogyo (Use and Industry of Mold), págs. 72-73, publicado pela Kyoritsu Shuppan Co., Ltd. (1956)). A concentração de glicose foi medida com Teste de Glicose Wako C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). TABELA 15
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[294] Em primeiro lugar, linhagem de Aspergillus terreus ATCC 10020 foi cultivada com agitação por uma noite em 5 ml de meio de pré-cultura exibida na Tabela 15 em tubo de ensaio (antes da pré-cultura preliminar). A cultura resultante foi inoculada em 100 ml de meio de pré-cultura nova e cultivada com agitação por 48 horas a 35 °C em frasco Sakaguchi de 500 ml (pré-cultura preliminar). a pré-cultura preliminar foi inoculada em 1,5 l de meio de fermentação contínua/em bateladas no aparelho de fermentação contínua do tipo de separação de membrana exibido na Fig. 1, tanque de reação de fermentação 1 foi agitado a 200 rpm com agitador 5 a ele fixado, seguido pela regulagem de aeração e controle de temperatura do tanque de reação de fermentação 1 e o microrganismo foi cultivado por 24 horas (pré-cultura). Imediatamente após o término da pré-cultura, a bomba de circulação de líquido de fermentação foi operada e o microrganismo foi cultivado continuamente sob as condições em que, além das condições de operação no momento da pré- cultura, tanque de separação de membrana 2 foi aerado, meio de fermentação de ácido itacônico foi alimentado continuamente e a quantidade de água de permeação de membrana foi regulada de tal forma que a quantidade do líquido de fermentação no aparelho de fermentação contínua do tipo separação de membrana tornou-se 2 l, por meio do quê ácido itacônico foi produzido por fermentação contínua. Neste teste de fermentação contínua, a quantidade de água de permeação de membrana foi regulada e alterada sob as condições de controle de água de permeação de membrana descritas acima, durante o quê a diferença de cabeça d’água foi medida como a diferença de pressão transmembrana com aparelho de regulagem de diferença de cabeça d’água 3. A concentração de ácido itacônico produzida no líquido de fermentação de permeação de membrana e a concentração de glicose residual foram medidas em momento apropriado. A velocidade de produção de ácido itacônico calculada a partir do ácido itacônico e glicose introduzida calculada a partir da concentração de glicose são exibidas na Tabela 16.
[295] A produção estável de ácido itacônico por fermentação contínua foi viável por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção utilizando o aparelho de fermentação contínua do tipo de separação de membrana da Fig. 1. A diferença de pressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o período de fermentação contínua.
EXEMPLO 22 PRODUÇÃO DE ÁCIDO ITACÔNICO POR MEIO DE FERMENTAÇÃO CONTÍNUA (N° 2)
[296] A produção de ácido itacônico foi conduzida utilizando o aparelho de fermentação contínua da Fig. 2. Foi utilizado o meio que possui a composição exibida na Tabela 15 após esterilização a vapor em alta pressão (121 °C, quinze minutos). Como material de elemento de membrana de separação, utilizou-se moldagem de resina de polissulfona e aço inoxidável. Como membrana de separação, foi utilizada a membrana porosa preparada no Exemplo de Referência 2. A menos que indicado em contrário, as condições de operação deste exemplo são as seguintes: - Capacidade do tanque de reação de fermentação: 2 (L) - Membrana de separação utilizada: Membrana de filtragem de PVDF - Área de filtragem eficaz do elemento de separação de membrana: 120 cm2 - Controle de temperatura: 35 (°C) - Aeração do tanque de reação de fermentação: 1,5 (l/min) - Velocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 200 rpm - Esterilização: o tanque de cultura, incluindo o elemento de membrana de separação, e o meio utilizado foram esterilizados com vapor sob alta pressão em autoclave a 121 °C por vinte minutos. - Ajuste de pH: ajustado em pH 5 com 4 N NaOH - Regulagem da quantidade de água de permeação da membrana: regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana (do início da fermentação contínua até 100 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 5 kPa ou menos, 100 a 200 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2 kPa ou menos; e 200 a 300 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 20 kPa ou menos).
[297] Levedura ATCC10020 de Aspergillus terreus foi utilizada como microrganismo, meio de fermentação de ácido itacônico que possui a composição exibida na Tabela 11 foi utilizado como meio e a concentração de ácido itacônico na forma de produto foi medida por meio do método exibido no Exemplo 17. A concentração de glicose foi medida com Teste de Glicose Wako C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
[298] Em primeiro lugar, linhagem de Aspergillus terreus ATCC 10020 foi cultivada com agitação por uma noite em 5 ml de meio de pré-cultura exibida na Tabela 15 em tubo de ensaio (antes da pré-cultura preliminar). A cultura resultante foi inoculada em 100 ml de meio de pré-cultura nova e cultivada com agitação por 48 horas a 35 °C em frasco Sakaguchi de 500 ml (pré-cultura preliminar). A pré-cultura preliminar foi inoculada em 1,5 l de meio de fermentação contínua/em bateladas no aparelho de fermentação contínua do tipo de separação de membrana exibido na Fig. 2, tanque de reação de fermentação 1 foi agitado a 200 rpm com agitador 5 a ele fixado, seguido pela regulagem de aeração e controle de temperatura do tanque de reação de fermentação 1 e o microrganismo foi cultivado por 24 horas (pré-cultura). Imediatamente após o término da pré-cultura, o microrganismo foi cultivado continuamente enquanto meio de fermentação contínua/em bateladas foi alimentado continuamente e a quantidade de água de permeação de membrana foi regulada de tal forma que a quantidade do líquido de fermentação no aparelho de fermentação contínua tornou-se 1,5 l, por meio do quê foi produzido ácido itacônico por fermentação contínua. Neste teste de fermentação contínua, a quantidade de água de permeação de membrana foi regulada e alterada sob as condições de controle de água de permeação de membrana descritas acima, durante o quê a diferença de cabeça d’água foi medida como a diferença de pressão transmembrana com aparelho de regulagem de diferença de cabeça d’água 3. A concentração de ácido itacônico produzida no líquido de fermentação de permeação de membrana e a concentração de glicose residual foram medidas em momento apropriado. A velocidade de produção de ácido itacônico calculada a partir do ácido itacônico e glicose introduzida calculada a partir da concentração de glicose são exibidas na Tabela 16.
[299] A produção estável de ácido itacônico por meio de fermentação contínua foi viável por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção utilizando o aparelho de fermentação contínua da Fig. 2. A diferença de pressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o período de fermentação contínua. EXEMPLO COMPARATIVO 11 PRODUÇÃO DE ÁCIDO ITACÔNICO POR MEIO DE FERMENTAÇÃO EM BATELADAS
[300] Como forma de fermentação utilizando microrganismo, a maior parte da fermentação em bateladas típica foi conduzida em fermentador de jarra de dois litros para avaliar a sua produtividade de ácido itacônico. O meio exibido na Tabela 15 foi utilizado após esterilização a vapor em alta pressão (121 °C, quinze minutos). No Exemplo Comparativo 11, linhagem de Aspergillus terreus ATCC 10020 foi utilizada como microrganismo, a concentração de ácido itacônico na forma de produto foi avaliada por meio do método exibido no Exemplo 17 e a concentração de glicose foi medida com Teste de Glicose Wako C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). As condições de operação do Exemplo Comparativo 11 são as seguintes: - Capacidade do tanque de reação de fermentação (quantidade de meio de fermentação de ácido itacônico): 1,5 (L) - Controle de temperatura: 35 (°C) - Aeração do tanque de reação de fermentação: 1,5 (l/min) - Velocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 200 rpm - Ajuste de pH: ajustado em pH 5 com 4 N NaOH
[301] Em primeiro lugar, linhagem ATCC 10020 foi cultivada com agitação por uma noite em 5 ml de meio de pré-cultura exibido na Tabela 1 em tubo de ensaio (pré-cultura preliminar). A pré-cultura preliminar foi inoculada em 50 ml de meio de pré-cultura novo e cultivada com agitação por 48 horas em frasco Sakaguchi de 500 ml (pré-cultura). A pré-cultura foi inoculada em 1,5 l do meio de fermentação contínua/em bateladas exibido na Tabela 15 em fermentador de jarra e submetido a fermentação em bateladas. Os resultados de fermentação em bateladas são exibidos na Tabela 16. TABELA 16
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[302] A velocidade de produção de ácido itacônico foi significativamente aprimorada pelo método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção utilizando os aparelhos de fermentação exibidos nas Figs. 1 e 2.
EXEMPLO 23 PRODUÇÃO DE CADAVERINA POR MEIO DE FERMENTAÇÃO CONTÍNUA (N° 1)
[303] A produção de cadaverina foi conduzida utilizando o aparelho de fermentação contínua do tipo separação de membrana da Fig. 1 e meio de fermentação de cadaverina com a composição exibida na Tabela 17.
[304] Em primeiro lugar, é descrito método de avaliação de cadaverina como produto. Cadaverina foi avaliada por meio do método de HPLC a seguir. - Coluna utilizada: CAPCELL PAK C18 (Shiseido Co., Ltd.) - Fase móvel: 0,1% (p/p) ácido fosfórico aquoso: acetonitrila = 4,5:5,5 - Detecção: UV 360 nm
[305] Tratamento prévio de amostra: 25 μl de 1,4-diaminobutano (0,03 M) como padrão interno, 150 μl de bicarbonato de sódio e solução em etanol de 2,4-dinitrofluorobenzeno (0,2 M) foram adicionados a 25 μl de amostra de análise, a ela misturados e a mistura foi mantida sob temperatura de 37 °C por uma hora. 50 μl da solução de reação foram dissolvidos em 1 ml de acetonitrila, centrifugados em seguida a 10.000 rpm por cinco minutos e 10 μl do sobrenadante resultante foram analisados por meio de HPLC.
[306] O meio foi utilizado após esterilização a vapor em alta pressão (121 °C, quinze minutos). Como material de elemento de membrana de separação, utilizou-se moldagem de resina de polissulfona e aço inoxidável. Como membrana de separação, foi utilizada a membrana porosa preparada no Exemplo de Referência 2. A menos que indicado em contrário, as condições de operação deste exemplo são as seguintes: - Capacidade do tanque de reação de fermentação: 2 (L) - Membrana de separação utilizada: membrana de filtragem de fluoreto de polivinilideno - Área de filtragem eficaz do elemento de separação de membrana: 120 cm2 - Controle de temperatura: 30 (°C) - Aeração do tanque de reação de fermentação: 1,5 (l/min) ar - Velocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 800 rpm - Ajuste de pH: ajustado em pH 7,0 com 3 M HCl e 3 M de água com amônia - Esterilização: o tanque de cultura, incluindo o elemento de membrana de separação, e o meio utilizado, foram esterilizados com vapor sob alta pressão em autoclave a 121 °C por vinte minutos. - Regulagem da quantidade de água de permeação da membrana: regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana (do início da fermentação contínua até 100 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 5 kPa ou menos, 100 a 200 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2 kPa ou menos; e 200 a 320 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 20 kPa ou menos).
[307] Linhagem de Corynebacterium glutamicum TR-CAD1 descrita em JP-A n° 2004-222569 foi utilizada como microrganismo produtor de cadaverina e meio de produção de cadaverina que possui a composição exibida na Tabela 17 foi utilizado como meio. A concentração de cadaverina como produto foi medida por meio do método de HPLC. A concentração de glicose foi medida com Teste de Glicose Wako C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). TABELA 17 MEIO DE FERMENTAÇÃO DE CADAVERINA
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[308] Em primeiro lugar, linhagem de Corynebacterium glutamicum TR-CAD1 foi cultivado com agitação por uma noite em 5 ml de meio de fermentação de cadaverina que contém canamicina (25 μg/ml) em tubo de ensaio (antes da pré-cultura preliminar). A cultura resultante foi inoculada em 50 ml de meio de produção de cadaverina novo que contém adição de canamicina (25 μg/ml) e cultivado por 24 horas sob temperatura de 30 °C a 180 rpm com amplitude de 30 cm em frasco Sakaguchi de 500 ml (pré-cultura preliminar). A pré-cultura preliminar foi inoculada em 2,0 l de meio de fermentação de cadaverina no aparelho de fermentação contínua do tipo de separação de membrana exibido na Fig. 1, tanque de reação de fermentação 1 foi agitado a 800 rpm com agitador 5 a ele fixado, seguido pela regulagem de aeração, controle de temperatura e ajuste de pH do tanque de reação de fermentação 1, enquanto o microrganismo era cultivado por 24 horas (pré-cultura).
[309] Imediatamente após o término da pré-cultura, a bomba de circulação de líquido de fermentação 10 foi operada e o microrganismo foi cultivado continuamente sob as condições em que, além das condições de operação no momento da pré-cultura, tanque de separação de membrana 2 foi aerado, meio de fermentação de cadaverina foi alimentado continuamente e a quantidade de água de permeação de membrana foi regulada de tal forma que a quantidade do líquido de fermentação no aparelho de fermentação contínua tornou-se 2 L, por meio do quê cadaverina foi produzida por fermentação contínua. Neste teste de fermentação contínua, a quantidade de água de permeação de membrana foi regulada e alterada sob as condições de controle de água de permeação de membrana descritas acima, durante o quê a diferença de cabeça d’água foi medida como a diferença de pressão transmembrana com aparelho de regulagem de diferença de cabeça d’água 3. A concentração de ácido láctico produzida no líquido de fermentação de permeação de membrana e a concentração de glicose residual foram medidas em momento apropriado.
[310] Os resultados no teste de fermentação contínua por 160 horas são exibidos na Tabela 18. A produção estável de cadaverina por meio de fermentação contínua foi viável por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção utilizando o aparelho de fermentação contínua do tipo de separação de membrana da Fig. 1. A diferença de pressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o período de fermentação contínua.
EXEMPLO 24 PRODUÇÃO DE CADAVERINA POR MEIO DE FERMENTAÇÃO CONTÍNUA (N° 2)
[311] A produção de cadaverina foi conduzida utilizando o aparelho de fermentação contínua da Fig. 2 e meio de fermentação de cadaverina com a composição exibida na Tabela 17. O meio foi utilizado após esterilização a vapor em alta pressão (121 °C, quinze minutos). Como material de elemento de membrana de separação, utilizou-se moldagem de resina de polissulfona e aço inoxidável. Como membrana de separação, foi utilizada a membrana porosa preparada no Exemplo de Referência 2. A menos que indicado em contrário, as condições de operação deste exemplo são as seguintes: - Capacidade do tanque de reação de fermentação: 2 (L) - Membrana de separação utilizada: membrana de filtragem de fluoreto de polivinilideno - Área de filtragem eficaz do elemento de separação de membrana: 120 cm2 - Controle de temperatura: 30 (°C) - Aeração do tanque de reação de fermentação: 1.5 (l/min) ar - Velocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 800 rpm - Ajuste de pH: ajustado em pH 7,0 com 3 M HCl e 3 M de água com amônia - Esterilização: o tanque de cultura, incluindo o elemento de membrana de separação, e o meio utilizado foram esterilizados com vapor sob alta pressão em autoclave a 121 °C por vinte minutos. - Regulagem da quantidade de água de permeação da membrana: regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana (do início da fermentação contínua até 100 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 5 kPa ou menos, 100 a 200 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2 kPa ou menos, e 200 a 264 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 20 kPa ou menos).
[312] Linhagem TR-CAD1 de Corynebacterium glutamicum foi utilizada como microrganismo, meio de fermentação de cadaverina que possui a composição exibida na Tabela 7 foi utilizado como meio e a concentração de cadaverina como produto foi medida por meio do método de HPLC. A concentração de glicose foi medida com Teste de Glicose Wako C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
[313] Em primeiro lugar, linhagem de Corynebacterium glutamicum TR-CAD1 foi cultivada com agitação por uma noite em 5 ml de meio de produção de cadaverina que contém canamicina (25 μg/ml) adicionada em tubo de ensaio (antes da pré-cultura preliminar). A cultura resultante foi inoculada em 50 ml de meio de produção de cadaverina novo que contém adição de canamicina (25 μg/ml) cultivado por 24 horas sob temperatura de 30 °C a 180 rpm com amplitude de 30 cm em frasco Sakaguchi de 500 ml (pré-cultura preliminar).
[314] A pré-cultura preliminar foi inoculada em 1,5 l de meio de produção de cadaverina no aparelho de fermentação contínua do tipo de separação de membrana exibido na Fig. 2, tanque de reação de fermentação 1 foi agitado a 800 rpm com agitador 5 a ele fixado, seguido pela regulagem de aeração, controle de temperatura e ajuste de pH do tanque de reação de fermentação 1, enquanto o microrganismo era cultivado por 24 horas (pré- cultura). Imediatamente após o término da pré-cultura, o microrganismo foi cultivado continuamente enquanto meio de fermentação de cadaverina foi alimentado continuamente e a quantidade de água de permeação de membrana foi regulada de tal forma que a quantidade do líquido de fermentação no aparelho de fermentação contínua tornou-se 1,5 l, por meio do quê foi produzida cadaverina por meio de fermentação contínua. A regulagem da quantidade de água de permeação de membrana no teste de fermentação contínua foi conduzida por meio de alteração adequada da diferença de cabeça d’água com aparelho de regulagem da diferença de cabeça d’água 3, de tal forma que a diferença de cabeça d’água do tanque de reação de fermentação fosse de até 2 m, ou seja, a diferença de pressão transmembrana foi de até 20 kPa. A concentração de cadaverina produzida no líquido de fermentação de permeação de membrana e a concentração de glicose residual foram medidas em momento apropriado. A velocidade de produção de cadaverina calculada a partir da cadaverina e glicose introduzida é exibida na Tabela 18.
[315] Os resultados no teste de fermentação contínua por 320 horas são exibidos na Tabela 18. A produção estável de cadaverina por meio de fermentação contínua foi viável por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção utilizando o aparelho de fermentação contínua da Fig. 2. A diferença de pressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o período de fermentação contínua.
EXEMPLO COMPARATIVO 12 PRODUÇÃO DE CADAVERINA POR MEIO DE FERMENTAÇÃO EM BATELADAS
[316] Como forma de fermentação utilizando microrganismo, a maior parte da fermentação em bateladas típica foi conduzida em fermentador de jarra de dois litros para avaliar a sua produtividade de cadaverina. O meio foi utilizado após esterilização a vapor em alta pressão (121 °C, quinze minutos). Neste exemplo comparativo, linhagem de Corynebacterium glutamicum TR- CAD1 foi utilizada como microrganismo, a concentração de cadaverina na forma de produto foi avaliada por meio do método de HPLC e a concentração de glicose foi medida com Teste de Glicose Wako C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). As condições de operação do Exemplo Comparativo 8 são as seguintes: - Capacidade do tanque de reação de fermentação (quantidade do meio de produção de cadaverina): 1,0 (L) - Controle de temperatura: 35 (°C) - Aeração do tanque de reação de fermentação: 1,5 (l/min) ar - Velocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 800 rpm - Ajuste de pH: ajustado em pH 7,0 com 3 M HCl e 3 M de água com amônia
[317] Em primeiro lugar, linhagem de Corynebacterium glutamicum TR-CAD1 foi cultivada com agitação por uma noite em 5 ml de meio de produção de cadaverina que contém canamicina (25 μg/ml) adicionada em tubo de ensaio (pré-cultura preliminar). A cultura resultante foi inoculada em 50 ml de meio de produção de cadaverina novo que contém adição de canamicina (25 μg/ml) e cultivado por 24 horas sob temperatura de 30 °C a 180 rpm com amplitude de 30 cm em frasco Sakaguchi de 500 ml (pré-cultura).
[318] A pré-cultura foi inoculada em 1,0 l de meio de produção de cadaverina (concentração de glicose: 100 g/l) em fermentador de jarra. O microrganismo foi submetido a fermentação em bateladas com o meio de produção de cadaverina. Os resultados são exibidos na Tabela 18. TABELA 18
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[319] Poder-se-á revelar que a velocidade de produção de cadaverina foi significativamente aprimorada pelo método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção utilizando os aparelhos de fermentação exibidos nas Figs. 1 e 2.
EXEMPLO 25 PRODUÇÃO DE ÁCIDOS NUCLÉICOS POR MEIO DE FERMENTAÇÃO CONTÍNUA (N° 1)
[320] A produção de ácidos nucléicos foi conduzida utilizando o aparelho de fermentação contínua do tipo separação de membrana da Fig. 1. O meio exibido na Tabela 19 foi utilizado após esterilização a vapor em alta pressão (121 °C, quinze minutos). Como material de elemento de membrana de separação, utilizou-se moldagem de resina de polissulfona e aço inoxidável. Como membrana de separação, foi utilizada a membrana porosa preparada no Exemplo de Referência 2. A menos que indicado em contrário, as condições de operação deste exemplo são as seguintes: - Capacidade do tanque de reação de fermentação: 2 (L) - Membrana de separação utilizada: membrana de filtragem de fluoreto de polivinilideno - Área de filtragem eficaz do elemento de separação de membrana: 120 cm2; - Controle de temperatura: 30 (°C) - Aeração do tanque de reação de fermentação: 1000 (ml/min) - Velocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 800 rpm - Esterilização: o tanque de cultura, incluindo o elemento de membrana de separação, e o meio utilizado, foram esterilizados com vapor sob alta pressão em autoclave a 121 °C por vinte minutos. - Ajuste de pH: ajustado em pH 6,8 com amônia aquosa a 25% - Regulagem da quantidade de água de permeação da membrana: regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana (do início da fermentação contínua até 150 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 5 kPa ou menos, 150 a 300 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2 kPa ou menos, e 300 a 400 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 20 kPa ou menos).
[321] Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21479 foi utilizado como microrganismo procariótico e meio de fermentação de ácido nucléico que possui a composição exibida na Tabela 19 foi utilizado como meio. As concentrações de guanosina e inosina contidas em líquido de fermentação foram confirmadas por meio de medição das quantidades dos ácidos nucléicos correspondentes por meio de HPLC sob as condições a seguir: Condições de análise: - Coluna: Asahipak GS-220 (7,6 mm de diâmetro interno x 500 mm de comprimento), tampão: 0,2 M de NaH2PO4 (pH 3,98) com pH ajustado com ácido fosfórico, temperatura: 55 °C, velocidade de fluxo: 1,5 ml/min, detecção: UV 254 nm, tempo de retenção (min): inosina 16,1, guanosina 20,5.
[322] A concentração de glicose foi medida com Teste de Glicose Wako C (marca registrada) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). TABELA 19
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[323] Em primeiro lugar, Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21479 foi cultivado com agitação em 150 ml do meio de pré-cultura exibido na Tabela 15 por 24 horas sob temperatura de 30 °C em frasco Sakaguchi (pré- cultura preliminar). A pré-cultura preliminar foi inoculada em 1 l de meio de pré- cultura no aparelho de fermentação contínua do tipo de separação de membrana exibido na Fig. 1, tanque de reação de fermentação 1 foi agitado a 800 rpm com agitador 5 a ele fixado, seguido pela regulagem de aeração e controle de temperatura a 30 °C do tanque de reação 1, enquanto o microrganismo foi cultivado por 24 horas (pré-cultura). Imediatamente após o término da pré- cultura, a bomba de circulação de líquido de fermentação foi operada e o microrganismo foi cultivado continuamente sob as condições em que, além das condições de operação no momento da pré-cultura, o tanque de separação de membrana 2 foi aerado, meio de fermentação contínua foi alimentado continuamente e, após o término da pré-cultura, o meio de fermentação contínua foi alimentado continuamente, o meio de fermentação foi circulado entre o tanque de reação de fermentação 1 e o tanque de separação de membrana 12 pela bomba de circulação de líquido de fermentação 11 e a quantidade de água de permeação de membrana foi regulada de tal forma que a quantidade do líquido de fermentação no aparelho de fermentação contínua do tipo separação de membrana tornou-se 2 L, por meio do quê ácidos nucléicos foram produzidos por meio de fermentação contínua. Neste teste de fermentação contínua, a quantidade de água de permeação de membrana foi regulada e alterada sob as condições de controle de água de permeação de membrana descritas acima, durante o quê a diferença de cabeça d’água foi medida como a diferença de pressão transmembrana com aparelho de regulagem de diferença de cabeça d’água 3. A concentração de ácidos nucléicos produzida no líquido de fermentação de permeação de membrana e a concentração de glicose residual foram medidas em momento apropriado. A velocidade de produção de ácidos nucléicos calculada a partir de ácido nucleico e glicose introduzida calculada a partir da concentração de glicose é exibida na Tabela 20.
[324] Como resultado do teste de fermentação por 400 horas, produção estável de ácidos nucléicos por meio de fermentação contínua foi viável por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção utilizando o aparelho de fermentação contínua da Fig. 1. A diferença de pressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o período de fermentação contínua.
EXEMPLO 26 PRODUÇÃO DE ÁCIDOS NUCLÉICOS POR MEIO DE FERMENTAÇÃO CONTÍNUA (N° 2)
[325] A produção de ácidos nucléicos foi conduzida utilizando o aparelho de fermentação contínua da Fig. 2. O meio exibido na Tabela 19 foi utilizado após esterilização a vapor em alta pressão (121 °C, quinze minutos). Como material de elemento de membrana de separação, utilizou-se moldagem de resina de polissulfona e aço inoxidável. Como membrana de separação, foi utilizada a membrana porosa preparada no Exemplo de Referência 2. A menos que indicado em contrário, as condições de operação deste exemplo são as seguintes: - Capacidade do tanque de reação de fermentação: 2 (L) - Membrana de separação utilizada: membrana de filtragem de fluoreto de polivinilideno - Área de filtragem eficaz do elemento de separação de membrana: 120 cm2; - Controle de temperatura: 30 (°C) - Aeração do tanque de reação de fermentação: 1000 (ml/min) - Velocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 800 rpm - Esterilização: o tanque de cultura, incluindo o elemento de membrana de separação, e o meio utilizado, foram esterilizados com vapor sob alta pressão em autoclave a 121 °C por vinte minutos. - Ajuste de pH: ajustado em pH 6,8 com amônia aquosa a 25% - Regulagem da quantidade de água de permeação da membrana: regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana (do início da fermentação contínua até 150 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 5 kPa ou menos, 150 a 300 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2 kPa ou menos, e 300 a 400 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 20 kPa ou menos).
[326] Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21479 foi utilizado como microrganismo procariótico e meio de fermentação de ácido nucleico que possui a composição exibida na Tabela 19 foi utilizado como meio. As concentrações de guanosina, inosina e glicose contidas em líquido de fermentação foram confirmadas por meio de medição das quantidades dos ácidos nucléicos correspondentes da mesma forma que no Exemplo 1.
[327] Em primeiro lugar, Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21479 foi cultivado com agitação por 24 horas sob temperatura de 30 °C em 150 ml de meio de pré-cultura exibido na Tabela 19 em frasco Sakaguchi (cultura preliminar). A pré-cultura preliminar foi inoculada em 1 l de meio de pré-cultura no aparelho de fermentação contínua do tipo de separação de membrana exibido na Fig. 2, tanque de reação de fermentação 1 foi agitado a 800 rpm com agitador 5 a ele fixado, seguido pela regulagem de aeração e controle de temperatura a 30 °C do tanque de reação 1, enquanto o microrganismo foi cultivado por 24 horas (pré-cultura). Imediatamente após o término da pré-cultura, o meio de fermentação contínua foi alimentado continuamente e o microrganismo foi cultivado continuamente enquanto a quantidade de água de permeação de membrana foi regulada de tal forma que a quantidade do líquido de fermentação no aparelho de fermentação contínua tornou-se 1,5 l, por meio do quê foram produzidos ácidos nucléicos por fermentação contínua. Neste teste de fermentação contínua, a quantidade de água de permeação de membrana foi regulada e alterada sob as condições de controle de água de permeação de membrana descritas acima, durante o quê a diferença de cabeça d’água foi medida como a diferença de pressão transmembrana com aparelho de regulagem de diferença de cabeça d’água 3. A concentração de ácidos nucléicos produzida no líquido de fermentação de permeação de membrana e a concentração de glicose residual foram medidas em momento apropriado. A velocidade de produção de ácidos nucléicos calculada a partir de ácido nucleico e glicose introduzida calculada a partir da concentração de glicose é exibida na Tabela 20.
[328] Como resultado do teste de fermentação por 400 horas, produção estável de ácidos nucléicos por fermentação contínua foi viável por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção utilizando o aparelho de fermentação contínua da Fig. 2. A diferença de pressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o período de fermentação contínua.
EXEMPLO COMPARATIVO 13 PRODUÇÃO DE ÁCIDOS NUCLÉICOS POR MEIO DE FERMENTAÇÃO EM BATELADAS
[329] Como forma de fermentação utilizando microrganismo, a maior parte da fermentação em bateladas típica foi conduzida em fermentador de jarra de dois litros para avaliar a sua produtividade de ácido nucleico. O meio de fermentação contínua exibido na Tabela 19 foi utilizado após esterilização a vapor em alta pressão (121 °C, quinze minutos). Neste exemplo comparativo, Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21479 foi utilizado como microrganismo procariótico, as concentrações de ácidos nucléicos na forma de produto foram avaliadas por meio do método exibido no Exemplo 21 e a concentração de glicose foi medida com Teste de Glicose Wako C (marca registrada) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). As condições de operação deste exemplo comparativo são as seguintes: - Capacidade do tanque de reação de fermentação: 2 (L) - Controle de temperatura: 30 (°C) - Aeração do tanque de reação de fermentação: 1000 (ml/min) - Velocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 800 rpm - Esterilização: o tanque de cultura, incluindo o elemento de membrana de separação, e o meio utilizado, foram esterilizados com vapor sob alta pressão em autoclave a 121 °C por vinte minutos. - Ajuste de pH: ajustado em pH 6,8 com amônia aquosa a 25%.
[330] Em primeiro lugar, Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21479 foi cultivado com agitação por 24 horas sob temperatura de 30 °C em 150 ml do meio de pré-cultura exibido na Tabela 19 em frasco Sakaguchi (pré- cultura). A pré-cultura resultante foi inoculada em 1 l do meio de fermentação contínua exibido na Tabela 19 em fermentador de jarra e submetido a fermentação em bateladas. Após o início da fermentação, adicionou-se 5% de glicose de forma a prosseguir com a fermentação. Os resultados de fermentação em bateladas por 120 horas são exibidos na Tabela 20. TABELA 20
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[331] Pôde-se revelar que a velocidade de produção de ácidos nucléicos foi significativamente aprimorada pelo método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção utilizando o aparelho de fermentação exibido nas Figs. 1 e 2.
EXEMPLO 27 PRODUÇÃO DE L-TREONINA POR MEIO DE FERMENTAÇÃO CONTÍNUA (N° 1)
[332] A produção de L-treonina foi conduzida utilizando o aparelho de fermentação contínua do tipo separação de membrana da Fig. 1 e meio de fermentação com a composição exibida na Tabela 21.
[333] Em primeiro lugar, é descrito método de avaliação de L- treonina como produto. A quantidade de L-treonina contida em cultura foi medida por meio do método a seguir. 25 μl de cultura que contém L-treonina a ser medido foram removidos e receberam em seguida adição de 150 μl de NaHCO3 (75 mM) e 25 μl de L-metionina padrão interno (2 g/l). Além disso, 900 μl de etanol e 150 μl de DNFB (0,2 M) foram adicionados à solução acima e com ela misturados. A solução resultante foi mantida a 37 °C por uma hora e analisada por meio de HPLC sob as condições a seguir: - Coluna utilizada: CAPCELLPAK C18 TIPO SG120 (Shiseido Co., Ltd.) - Fase móvel: 0,1% (p/v) H3PO4: acetonitrila = 7: 3 (velocidade de fluxo 1,2 ml/min) - Detecção: UV (360 nm) - Temperatura: 23 °C
[334] Curva de calibragem foi preparada por meio de análise de amostras de L-treonina com concentração conhecida como amostra e plotagem das suas concentrações de L-treonina sobre a abscissa e a razão de área (razão área de L-treonina/área de L-metionina (padrão interno)) sobre a ordenada. O meio foi utilizado após esterilização a vapor sob alta pressão (121 °C, quinze minutos). Como membrana de separação, foi utilizada a membrana porosa preparada no Exemplo de Referência 2.
[335] A menos que indicado em contrário, as condições de operação deste exemplo são as seguintes: - Capacidade de tanque de reação: 2 (L) - Capacidade do tanque de separação de membrana: 0.5 (L) - Membrana de separação utilizada: membrana de filtragem de fluoreto de polivinilideno - Área de filtragem eficaz do elemento de separação de membrana: 60 cm2 - Controle de temperatura: 37 (°C) - Aeração do tanque de reação: 1,5 (l/min) - Aeração do tanque de separação de membrana: 1 (l/min) - Velocidade de agitação do tanque de reação: 800 rpm - Ajuste de pH: ajustado em pH 7 com amônia aquosa a 28% - Velocidade de alimentação do meio de fermentação de l- treonina: controle variável na faixa de 50 a 300 ml/h. - Regulagem da quantidade de água de permeação da membrana: regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana (do início da fermentação contínua até 100 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 5 kPa ou menos, e 100 a 200 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2 kPa ou menos).
[336] Em Providencia rettgeri, Providencia rettgeri SGR 588-77 (FERM P-10528) foi utilizado como o microrganismo que produz L-treonina, meio de fermentação que possui a composição exibida na Tabela 21 foi utilizado como meio, a concentração de L-treonina como produto foi medida por meio do método de HPLC descrito acima e a concentração de glicose foi medida com Teste de Glicose Wako C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). TABELA 21 MEIO DE FERMENTAÇÃO DE L-TREONINA
Figure img0030
[337] Em primeiro lugar Providencia rettgeri SGR 588-77 raspado de meio agar foi inoculado em 100 ml de meio de caldo de glicose (1% de glicose, 3% de caldo (fabricado pela Nissui Co., Ltd.)) em frasco Erlenmeyer de 500 ml e cultivado a 37 °C sob agitação a 140 rpm (pré-cultura preliminar). A pré-cultura preliminar foi inoculada em 1,5 l de meio de pré-cultura (Tabela 21) no aparelho de fermentação contínua do tipo de separação de membrana exibido na Fig. 1, tanque de reação 1 foi agitado a 800 rpm com agitador 5 a ele fixado, seguido pela regulagem de aeração e controle de temperatura a 37 °C do tanque de reação 1, enquanto o microrganismo foi cultivado por 24 horas (pré-cultura). Imediatamente após o término da pré-cultura, a bomba de circulação de líquido de fermentação foi operada e o microrganismo foi cultivado continuamente sob as condições em que, além das condições de operação no momento da pré- cultura, o tanque de separação de membrana 2 foi aerado, meio de fermentação que possui a composição exibida na Tabela 17 foi alimentado continuamente e a quantidade de água de permeação de membrana foi regulada de tal forma que a quantidade do líquido de fermentação no aparelho de fermentação contínua tornou-se 2 L, por meio do quê L-treonina foi produzida por fermentação contínua. Neste teste de fermentação contínua, a quantidade de água de permeação de membrana foi regulada e alterada sob as condições de controle de água de permeação de membrana descritas acima, durante o quê a diferença de cabeça d’água foi medida como a diferença de pressão transmembrana com aparelho de regulagem de diferença de cabeça d’água 3. A concentração de L- treonina produzida no líquido de fermentação de permeação de membrana e a concentração de glicose residual foram medidas em momento apropriado. A diferença de cabeça d’água foi apropriadamente alterada, de tal forma que a cabeça d’água do tanque de reação de fermentação fosse de 2 m ou menos no máximo, ou seja, a diferença de pressão transmembrana estava dentro de 20 kPa. A concentração de L-treonina produzida no líquido de fermentação de permeação de membrana e a concentração de glicose residual foram medidas em momento apropriado. Os resultados do teste de fermentação contínua por 200 horas são exibidos na Tabela 22.
[338] A produção estável de L-treonina por meio de fermentação contínua foi viável por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção utilizando o aparelho de fermentação contínua do tipo de separação da Fig. 1. A diferença de pressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o período de fermentação contínua.
EXEMPLO 28 PRODUÇÃO DE L-TREONINA POR MEIO DE FERMENTAÇÃO CONTÍNUA (N° 2)
[339] A produção de L-treonina foi conduzida utilizando o aparelho de fermentação contínua da Fig. 2 e meio de fermentação com a composição exibida na Tabela 21. O meio foi utilizado após esterilização a vapor em alta pressão (121 °C, quinze minutos). Como material de elemento de membrana de separação, utilizou-se moldagem de resina de polissulfona e aço inoxidável. Como membrana de separação, foi utilizada a membrana porosa preparada no Exemplo de Referência 2. A menos que indicado em contrário, as condições de operação deste exemplo são as seguintes: - Capacidade de tanque de reação: 2 (L) - Membrana de separação utilizada: Membrana de filtragem de PVDF - Área de filtragem eficaz do elemento de separação de membrana: 120 cm2 - Controle de temperatura: 37 (°C) - Aeração do tanque de reação: 1.5 (l/min) - Velocidade de agitação do tanque de reação: 800 rpm - Ajuste de pH: ajustado em pH 7 com amônia aquosa a 25% - Velocidade de alimentação do meio de fermentação de l- treonina: controle variável na faixa de 50 a 300 ml/h. - Regulagem da quantidade de água de permeação da membrana: regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana (do início da fermentação contínua até 100 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 5 kPa ou menos, e 100 a 200 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2 kPa ou menos). - Esterilização: o tanque de cultura, incluindo o elemento de membrana de separação, e o meio utilizado, foram esterilizados com vapor sob alta pressão em autoclave a 121 °C por vinte minutos.
[340] Em Providencia rettgeri, Providencia rettgeri SGR 588-77 (FERM P-10528) foi utilizado como o microrganismo que produz L-treonina, meio de fermentação que possui a composição exibida na Tabela 21 foi utilizado como meio, a concentração de L-treonina como produto foi medida por meio de HPLC exibido no Exemplo 23 e a concentração de glicose foi medida com Teste de Glicose Wako C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
[341] Em primeiro lugar, Providencia rettgeri SGR 588-77 raspado de meio agar foi inoculado em 100 ml de meio de caldo de glicose (1% de glicose, 3% de caldo (fabricado pela Nissui Co., Ltd.)) em frasco Erlenmeyer de 500 ml. O microrganismo foi cultivado a 37 °C sob agitação a 140 rpm (pré-cultura preliminar). A pré-cultura preliminar foi inoculada em 1,5 l de meio de pré-cultura (Tabela 21) no aparelho de fermentação contínua exibido na Fig. 1, tanque de reação 1 foi agitado a 800 rpm com agitador 5 a ele fixado, seguido pela regulagem de aeração, controle de temperatura e ajuste de pH do tanque de reação 1, enquanto o microrganismo foi cultivado por 24 horas (pré-cultura). Imediatamente após o término da pré-cultura, o microrganismo foi cultivado continuamente enquanto meio de fermentação que possui a composição exibida na Tabela 21 foi alimentado continuamente e a quantidade de água de permeação de membrana foi regulada de tal forma que a quantidade do líquido de fermentação no aparelho de fermentação contínua tornou-se 1,5 l, por meio do quê foi produzida L-treonina por meio de fermentação contínua. Neste teste de fermentação contínua, a quantidade de água de permeação de membrana foi regulada e alterada sob as condições de controle de água de permeação de membrana descritas acima, durante o quê a diferença de cabeça d’água foi medida como a diferença de pressão transmembrana com aparelho de regulagem de diferença de cabeça d’água 3. A concentração de L-treonina produzida no líquido de fermentação de permeação de membrana e a concentração de glicose residual foram medidas em momento apropriado. O rendimento de L-treonina com relação a açúcar e a velocidade de produção de ácido láctico com base na L-treonina e glicose introduzida calculada a partir da concentração de glicose são exibidos na Tabela 18.
[342] Como resultado do teste de fermentação por 200 horas, produção estável de L-treonina por meio de fermentação contínua foi viável por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção utilizando o aparelho de fermentação contínua da Fig. 2. A diferença de pressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o período de fermentação contínua.
EXEMPLO COMPARATIVO 14 PRODUÇÃO DE L-TREONINA POR MEIO DE FERMENTAÇÃO EM BATELADAS
[343] Como forma de fermentação utilizando microrganismo, a maior parte da fermentação em bateladas típica foi conduzida em fermentador de jarra de dois litros para avaliar a sua produtividade de L- treonina. O meio de pré-cultura exibido na Tabela 21 foi utilizado como meio ao iniciar-se a cultura em bateladas. Estes meios foram utilizados após esterilização a vapor em alta pressão (121 °C, quinze minutos). Neste exemplo comparativo, Providencia rettgeri SGR 588-77 foi utilizada como microrganismo e as concentrações de L-treonina e glicose contidas no líquido de fermentação foram medidas por meio do método exibido no Exemplo 27. As condições de operação deste exemplo comparativo são as seguintes: - Capacidade do tanque de reação de fermentação (quantidade do meio de fermentação de L-treonina): 1 (L) - Controle de temperatura: 37 (°C) - Aeração do tanque de reação de fermentação: 1 (l/min) - Velocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 800 rpm - Ajuste de pH: ajustado em pH 7 com amônia aquosa a 28%.
[344] Em primeiro lugar, Providencia rettgeri SGR 588-77 raspado de meio agar foi inoculado em 90 ml de meio de caldo de glicose (1% de glicose, 3% de caldo (fabricado pela Nissui Co., Ltd.)) em frasco Erlenmeyer de 500 ml. O microrganismo foi cultivado a 37 °C sob agitação a 140 rpm (pré-cultura). A pré-cultura foi inoculada em 810 ml do meio de pré-cultura exibido na Tabela 17 em fermentador de minijarra e submetido a fermentação em bateladas. A composição de meio adicionada durante a cultura é exibida em meio adicional na Tabela 9. O meio foi adicionado em 24, 32, 40 e 48 horas após o início de cultura em quantidade de 50 ml, respectivamente. Os resultados de fermentação em bateladas são exibidos na Tabela 22. TABELA 22
Figure img0031
[345] Poder-se-á revelar que a velocidade de produção de L- treonina foi significativamente aprimorada pelo método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção utilizando o aparelho de fermentação exibido nas Figs. 1 e 2.
EXEMPLO 29 PRODUÇÃO DE ÁCIDO L-LÁCTICO POR MEIO DE FERMENTAÇÃO CONTÍNUA UTILIZANDO BACTÉRIA DE ÁCIDO LÁCTICO (N° 1)
[346] A produção de ácido L-láctico foi conduzida utilizando o aparelho de fermentação contínua do tipo separação de membrana da Fig. 1. O meio de fermentação de ácido láctico por bactérias de ácido láctico exibido na Tabela 23 foi utilizado após esterilização a vapor em alta pressão (121 °C, quinze minutos). Como membrana de separação, foi utilizada a membrana porosa preparada no Exemplo de Referência 2. A menos que indicado em contrário, as condições de operação deste exemplo são as seguintes: - Capacidade do tanque de reação de fermentação: 2 (L) - Membrana de separação utilizada: membrana de filtragem de fluoreto de polivinilideno - Área de filtragem eficaz do elemento de separação de membrana: 120 cm2 - Controle de temperatura: 37 (°C) - Aeração do tanque de reação de fermentação: 50 (ml/min) nitrogênio - Velocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 600 rpm - Esterilização: o tanque de cultura, incluindo o elemento de membrana de separação, e o meio utilizado foram esterilizados com vapor sob alta pressão em autoclave a 121 °C por vinte minutos. - Ajuste de pH: ajustado em pH 6,5 com 8 N de amônia aquosa - Regulagem da quantidade de água de permeação da membrana: regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana (do início da fermentação contínua até 150 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 5 kPa ou menos, 150 a 300 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2 kPa ou menos, e 300 a 400 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 20 kPa ou menos).
[347] Linhagem de Lactococcus lactis JCM 7638 foi utilizada como microrganismo procariótico e meio de fermentação de ácido láctico por bactérias de ácido láctico que possui a composição exibida na Tabela 23 foi utilizado como meio. A concentração de ácido L-láctico contida em líquido de fermentação foi avaliada por meio do mesmo método do Exemplo de Referência 1. A concentração de glicose foi medida com Teste de Glicose Wako C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). TABELA 23 MEIO DE FERMENTAÇÃO DE ÁCIDO LÁCTICO POR BACTÉRIAS LÁCTEAS
Figure img0032
[348] Em primeiro lugar, linhagem de Lactococcus lactis JCM 7638 foi cultivada de forma estática em 5 ml do meio de fermentação de ácido láctico purgado com gás nitrogênio exibido na Tabela 23 por 24 horas sob temperatura de 37 °C em tubo de ensaio (antes da pré-cultura preliminar). A cultura resultante foi inoculada em 50 ml de meio de fermentação de ácido láctico purgado com gás nitrogênio novo e cultivado de forma estática por 48 horas a 37 °C (pré-cultura preliminar). A pré-cultura preliminar foi inoculada em 1,5 l de meio de fermentação de ácido láctico purgado com gás nitrogênio no aparelho de fermentação contínua do tipo de separação de membrana exibido na Fig. 1, tanque de reação de fermentação 1 foi agitado a 600 rpm com agitador 5 a ele fixado, seguido pela regulagem de aeração e controle de temperatura a 37 °C do tanque de reação 1, enquanto o microrganismo foi cultivado por 24 horas (pré-cultura). Imediatamente após o término da pré-cultura, o microrganismo foi cultivado continuamente em meio de fermentação de ácido láctico alimentado continuamente enquanto a quantidade de água de permeação de membrana foi regulada de tal forma que a quantidade do líquido de fermentação no aparelho de fermentação contínua tornou-se 2 l, por meio do quê foi produzido ácido L-láctico por meio de fermentação contínua. Nesse momento, gás nitrogênio foi alimentado de aparelho de alimentação de gás para o tanque de reação de fermentação e o gás descarregado foi recuperado e novamente alimentado para o tanque de reação de fermentação. Isso significa que o gás que contém gás nitrogênio foi fornecido por meio de reciclagem. Neste teste de fermentação contínua, a quantidade de água de permeação de membrana foi regulada e alterada sob as condições de controle de água de permeação de membrana descritas acima, durante o quê a diferença de cabeça d’água foi medida como a diferença de pressão transmembrana com aparelho de regulagem de diferença de cabeça d’água 3. A concentração de ácido L-láctico produzida no líquido de fermentação de permeação de membrana e a concentração de glicose residual foi medida em momento apropriado. O rendimento de ácido L-láctico com relação a açúcar e a velocidade de produção de ácido L-láctico calculada a partir do ácido L-láctico e glicose introduzida calculada a partir da concentração de glicose são exibidos na Tabela 24.
[349] Como resultado do teste de fermentação por 400 horas, produção estável de ácido L-láctico por meio de fermentação contínua foi viável por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção utilizando o aparelho de fermentação contínua do tipo de separação de membrana. A diferença de pressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o período de fermentação contínua.
EXEMPLO 30 PRODUÇÃO DE ÁCIDO L-LÁCTICO POR MEIO DE FERMENTAÇÃO CONTÍNUA UTILIZANDO BACTÉRIA DE ÁCIDO LÁCTICO (N° 2)
[350] A produção de ácido L-láctico foi conduzida utilizando o aparelho de fermentação contínua da Fig. 2. Como meio, o meio de fermentação de ácido láctico por bactérias de ácido láctico exibido na Tabela 23 foi utilizado após esterilização a vapor em alta pressão (121 °C, quinze minutos). O meio foi utilizado após esterilização a vapor em alta pressão (121 °C, quinze minutos). Como membrana de separação, foi utilizada a membrana porosa preparada no Exemplo de Referência 2. A menos que indicado em contrário, as condições de operação deste exemplo são as seguintes: - Capacidade do tanque de reação de fermentação: 2 (L) - Membrana de separação utilizada: membrana de filtragem de fluoreto de polivinilideno - Área de filtragem eficaz do elemento de separação de membrana: 120 cm2 - Controle de temperatura: 37 (°C) - Aeração do tanque de reação de fermentação: 50 (ml/min) nitrogênio - Velocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 600 rpm - Esterilização: o tanque de cultura, incluindo o elemento de membrana de separação, e o meio utilizado, foram esterilizados com vapor sob alta pressão em autoclave a 121 °C por vinte minutos. - Ajuste de pH: ajustado em pH 6,5 com 8 N de amônia aquosa - Regulagem da quantidade de água de permeação da membrana: regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana (do início da fermentação contínua até 150 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 5 kPa ou menos, 150 a 300 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2 kPa ou menos, e 300 a 400 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 20 kPa ou menos).
[351] Linhagem de Lactococcus lactis JCM 7638 foi utilizada como microrganismo procariótico e cultivada da mesma forma que no Exemplo 29 até a pré-cultura. Imediatamente após o término da pré-cultura, o microrganismo foi cultivado continuamente em meio alimentado continuamente enquanto a quantidade de água de permeação de membrana foi regulada de tal forma que a quantidade do líquido de fermentação no aparelho de fermentação contínua tornou-se 1,5 l, por meio do quê foi produzido ácido L-láctico por fermentação contínua. Nesse momento, gás nitrogênio foi alimentado de aparelho de alimentação de gás para o tanque de reação de fermentação e o gás descarregado foi recuperado e novamente alimentado para o tanque de reação de fermentação. Isso significa que o gás que contém gás nitrogênio foi fornecido por meio de reciclagem. Neste teste de fermentação contínua, a quantidade de água de permeação de membrana foi regulada e alterada sob as condições de controle de água de permeação de membrana descritas acima, durante o quê a diferença de cabeça d’água foi medida como a diferença de pressão transmembrana com aparelho de regulagem de diferença de cabeça d’água 3. A concentração de ácido L-láctico produzida no líquido de fermentação de permeação de membrana e a concentração de glicose residual foram medidas em momento apropriado. O rendimento de ácido L-láctico com relação a açúcar calculado a partir do ácido L-láctico e glicose introduzida calculada a partir da concentração de glicose e a velocidade de produção de ácido L-láctico são exibidos na Tabela 24.
[352] Como resultado do teste de fermentação por 400 horas, produção estável de ácido L-láctico por meio de fermentação contínua foi viável por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção utilizando o aparelho de fermentação contínua da Fig. 2. A diferença de pressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o período de fermentação contínua.
EXEMPLO COMPARATIVO 15 PRODUÇÃO DE ÁCIDO L-LÁCTICO POR MEIO DE FERMENTAÇÃO EM BATELADAS
[353] Como forma de fermentação utilizando microrganismo, a maior parte da fermentação em bateladas típica foi conduzida em fermentador de jarra de dois litros para avaliar a sua produtividade de ácido L-láctico. O meio exibido na Tabela 23 foi utilizado após esterilização a vapor em alta pressão (121 °C, quinze minutos). Neste exemplo comparativo, linhagem de Lactococcus lactis JCM7638 foi utilizada como microrganismo procariótico e a concentração de ácido L-láctico como produto foi avaliada por meio do método exibido no Exemplo de Referência 1. A concentração de glicose foi medida com Teste de Glicose Wako C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). As condições de operação deste exemplo comparativo são as seguintes: - Capacidade do tanque de reação de fermentação: 1 (L) - Controle de temperatura: 37 (°C) - Aeração do tanque de reação de fermentação: 50 (ml/min) nitrogênio - Velocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 200 rpm - Ajuste de pH: ajustado em pH 6,5 com 8 N de amônia aquosa.
[354] Em primeiro lugar, linhagem de Lactococcus lactis JCM 7638 foi cultivada de forma estática em 5 ml do meio de fermentação de ácido láctico purgado com gás nitrogênio exibido na Tabela 23 por 24 horas sob temperatura de 37 °C (pré-cultura preliminar). A cultura resultante foi inoculada em 50 ml de meio de fermentação de ácido láctico purgado com gás nitrogênio novo e cultivado de forma estática por 48 horas sob temperatura de 37 °C (pré-cultura). A pré-cultura resultante foi inoculada em 1 l do meio de fermentação contínua/em bateladas exibido na Tabela 23 em fermentador de jarra e submetido a fermentação em bateladas. Os resultados de fermentação em bateladas são exibidos na Tabela 24. TABELA 24
Figure img0033
[355] Poder-se-á revelar que a velocidade de produção de ácido L- láctico foi significativamente aprimorada pelo método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção utilizando o aparelho de fermentação exibido nas Figs. 1 e 2. EXEMPLO DE REFERÊNCIA 6 PREPARAÇÃO DE DNA CROMOSSÔMICO DE LINHAGEM DE BACILLUS LAEVOLACTICUS JCM2513
[356] Linhagem de Bacillus laevolacticus JCM2513 foi inoculada em 100 ml de meio GYP (meio GYP descrito em JP-A n° 2003-088392) e cultivada sob temperatura de 30 °C por 24 horas para obter cultura. A cultura resultante foi centrifugada a 3000 rpm por quinze minutos para obter 0,5 g de microrganismo umedecido e, a partir do microrganismo umedecido, DNA cromossômico foi obtido por meio de método de Saito e Miura (Biochem. Biophys. Acta., 72, 619 (1963)). Em seguida, 60 μg do DNA cromossômico e 3 U de enzima de restrição Sau3AI foram misturados em 10 mM de tampão Tris-HCl (50 mM de NaCl, 10 mM de MgSO4 e 1 mM de ditiotreitol (pH 7,4)) e reagidos sob temperatura de 37 °C por trinta minutos. A solução de reação foi extraída com fenol e precipitada com etanol de forma habitual para obter 50 μg de fragmento de DNA cromossômico digerido por Sau3AI de linhagem de Baciillus laevolacticus JCM2513. EXEMPLO DE REFERÊNCIA 7 PREPARAÇÃO DE BIBLIOTECA DE GENES DE LINHAGEM JCM2513 DE BACILLUS LAEVOLACTICUS UTILIZANDO DNA DE VETOR DE PLASMÍDEO
[357] 20 μg de DNA de vetor de plasmídeo (pUC19) capaz de reprodução autônoma em Escherichia coli e 200 U de enzima de restrição BamHI foram misturados em 50 mM de tampão Tris-HCl (que contém 100 mM de NaCl, 10 mM de sulfato de magnésio (pH 7,4)) e reagiram sob temperatura de 37 °C por duas horas para obter solução de digestão e a solução de digestão foi extraída com fenol e precipitada com etanol de forma habitual.
[358] Em seguida, o fragmento de DNA derivado de vetor de plasmídeo foi desfosforilado por meio de tratamento com fosfatase álcali bacteriana para evitar nova união, extraído com fenol e precipitado com etanol de forma habitual.
[359] 1 μg deste pUC19 digerido com BamHI e 1 μg do fragmento de DNA cromossômico de linhagem de Bacillus laevolacticus JCM 2513 digerida com Sau3AI, obtido no Exemplo de Referência 3, e 2 U de T4 DNA ligase (fabricada pela Takara Shuzo Co., Ltd.) foram adicionados a 66 mM de tampão Tris-HCl (pH 7,5) que contém 66 mM de cloreto de magnésio, 10 mM de ditiotreitol e 10 mM de ATP e reagiram sob temperatura de 16 °C por dezesseis horas para ligar os DNAs. Em seguida, a mistura de DNA resultante foi utilizada de forma habitual para transformar Escherichia coli JM109 que foi colocado em placas em seguida sobre meio LB agar contendo 50 μg/ml de ampicilina sódio, para obter cerca de vinte mil colônias para uso como biblioteca genética. Das cerca de vinte mil colônias, foi recuperado DNA recombinante. O método de recuperação seguiu-se ao método de Saito & Miura descrito acima. EXEMPLO DE REFERÊNCIA 8 PREPARAÇÃO DE HOSPEDEIRO PARA SELEÇÃO DE GENE D-LACTATO DESIDROGENASE
[360] Seleção de gene D-LDH de linhagem JCM2513 de Bacillus laevolacticus foi conduzida por meio de complementação funcional. O princípio é descrito em detalhes em Dominique, G., Appl. Environ. Microbiol., Estados Unidos (1995), 61 266-272. Isso significa que é necessário preparar linhagem de Escherichia coli com deficiência na atividade de D-lactato desidrogenase e na atividade de piruvato formato-liase. Linhagem de Escherichia coli tornada deficiente por meio da destruição de gene D-lactato desidrogenase (ldhA) e gene de piruvato formato-liase (pflB e pflD) foi preparada por meio de método de Kirill et al (Kirill, A., PNAS, Estados Unidos (2000) 97 6640-6645). A linhagem preparada desta forma foi denominada linhagem TM33 (E. coli ΔldhA ΔpflB::Kmr ΔpflD::Cmr) e utilizada como hospedeiro para a seleção de gene D-lactato desidrogenase. EXEMPLO DE REFERÊNCIA 9 SELEÇÃO DE GENE D-LACTATO DESIDROGENASE
[361] Linhagem TM33 de Escherichia coli foi inoculada em 100 ml de meio LB que contém 50 μg/ml de sulfato de canamicina e 15 μg/ml de cloranfenicol e cultivada sob temperatura de 37 °C por 24 horas para obter cultura. A cultura obtida desta forma foi centrifugada a 3000 rpm por quinze minutos para obter 0,8 g de microrganismo úmido. O microrganismo úmido obtido foi lavado por três vezes com 10 ml de glicerol a 10% e suspenso em seguida em 0,1 ml de glicerol a 10% para obter células competentes. 1 μl da biblioteca genética derivada de linhagem de Bacillus laevolacticus JCM2513 obtida no Exemplo de Referência 8 foi adicionado e introduzido de forma habitual por meio de eletroporação às células competentes e as linhagens resultantes foram colocadas sobre meio agar M9GP (meio M9 + 0,4% glicose + 0,2% peptona) que contém 50 μg/ml de ampicilina sódio para obter diversas linhagens capazes de cultura sob condições anaeróbicas. EXEMPLO DE REFERÊNCIA 10 ANÁLISE DE SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS DE DNA QUE CONTÉM O GENE D-LACTATO DESIDROGENASE
[362] A partir da linhagem de Escherichia coli TM33/pBL2 que contém o DNA recombinante obtido acima, foi preparado plasmídeo de forma habitual e o DNA recombinante resultante foi utilizado em sequenciamento de nucleotídeos. Seqüenciamento de nucleotídeos foi conduzido de acordo com o método de Sanger utilizando Kit de Seqüenciamento de Ciclos de Término Taq DyeDeoxy (fabricado pela Applied Biochemical). A seqüência de nucleotídeos resultante do DNA que contém o gene D-lactato desidrogenase foi de 2995 pares de bases. Conduziu-se pesquisa de quadro de leitura aberta para esta seqüência e seqüência de DNA (SEQ ID N° 10) do gene D-lactato desidrogenase com 1011 bp foi determinada temporariamente utilizando Genetyx (fabricado pela Software Kaihatsu Co., Ltd.). EXEMPLO DE REFERÊNCIA 11 PREPARAÇÃO DE VETOR DE EXPRESSÃO PARA GENE D-LACTATO DESIDROGENASE
[363] Gene D-LDH foi clonado de Bacillus laevolacticus. O gene D- LDH foi clonado por meio de PCR e introduzido da mesma forma em vetor de expressão. O método de clonagem é descrito abaixo.
[364] Bacillus laevolacticus foi cultivado e recuperado em seguida por meio de centrifugação, seguido por extração de DNA de genoma com Kit de Isolamento de DNA Microbiano UltraClean (fabricado pela MO BIO). A operação específica seguiu o protocolo ligado ao kit. O DNA de genoma resultante foi utilizado em seguida como modelo em PCR. O DNA obtido acima foi utilizado como modelo na clonagem de gene D-LDH por meio de PCR. Na reação de amplificação por PCR, utilizou-se KOD-Plus-polimerase (fabricada pela Toyobo) estimada como possuindo precisão de cinqüenta vezes com relação a Taq. O tampão de reação, mistura de dNTP etc. utilizados foram os ligados ao kit. Primers de amplificação de gene D-LDH (SEQ ID N° 11 e 12) foram preparados de tal forma que seqüência de reconhecimento de XhoI e seqüência de reconhecimento de NotI foram adicionadas aos lados 5 e 3-terminais, respectivamente.
[365] Cada fragmento de amplificação de PCR foi purificado, fosforilado em seguida no seu término com T4 polinucleotídeo quinase (fabricada pela TAKARA) e ligado a vetor pUC118 (que havia sido tratado por meio de divisão com enzima de restrição HincII e submissão em seguida da superfície de divisão a desfosforilação). Esta ligação foi conduzida com kit de ligação de DNA Ver. 2 (fabricado pela TAKARA). O produto de ligação foi utilizado para transformar Escherichia coli DH5α do qual DNA de plasmídeo foi recuperado em seguida para obter plasmídeo em que cada gene D-LDH havia sido subclonado. O vetor pUC118 resultante no qual o gene D-LDH havia sido inserido foi digerido com enzimas de restrição XhoI e NotI e cada um dos fragmentos de DNA resultantes foi inserido em local de divisão de XhoI/NotI de vetor de expressão de levedura pTRS11 (Fig. 5). O vetor de expressão de gene D-LDH preparado desta forma foi denominado pTM63. EXEMPLO DE REFERÊNCIA 12 INTRODUÇÃO DO VETOR DE EXPRESSÃO DE GENE D-LDH EM LEVEDURA
[366] pTM63 obtido no Exemplo de Referência 11 foi transformado em linhagem de levedura Saccharomyces cerevisiae NBRC 10505. Esta transformação foi conduzida por meio do método de acetato de lítio utilizando Sistema de Transformação de Levedura YEASTMAKER (fabricado pela CLONTECH). A operação específica seguiu o protocolo ligado ao kit. A linhagem de Saccharomyces cerevisiae NBRC 10505 utilizada como hospedeiro é linhagem com deficiência na capacidade de produção de uracil e o seu transformador ao qual havia sido introduzido pTM63 pode ser selecionado sobre meio livre de uracil pela função de gene URA3 possuída por pTM63.
[367] A introdução do vetor de expressão de gene D-LDH no transformador obtido desta forma foi confirmada por meio da extração de DNA de genoma que contém DNA de plasmídeo por meio de kit de extração de DNA de genoma Gentrukun (fabricado pela TAKARA) e utilização em seguida do DNA de genoma como modelo em PCR com Mistura Prévia de Taq (fabricada pela TAKARA). Como primer, foi utilizado o primer empregado na clonagem do gene D-LDH. Como resultado, confirmou-se que todos os transformadores continham gene D-LDH neles introduzido.
[368] Linhagem de Saccharomyces cerevisiae NBRC 10505 na qual havia sido introduzido pTM63 é designada a seguir linhagem NBRC 10505/pTM63.
EXEMPLO 31 PRODUÇÃO DE ÁCIDO D-LÁCTICO POR MEIO DE FERMENTAÇÃO CONTÍNUA (N° 1)
[369] A produção de ácido L-láctico foi conduzida utilizando o aparelho de fermentação contínua do tipo separação de membrana da Fig. 1 e meio de produção de ácido D-láctico que possui a composição exibida na Tabela 25. O meio foi utilizado após esterilização a vapor em alta pressão (121 °C, quinze minutos). Como material de elemento de membrana de separação, utilizou-se moldagem de resina de polissulfona e aço inoxidável. Como membrana de separação, foi utilizada a membrana porosa preparada no Exemplo de Referência 2. A menos que indicado em contrário, as condições de operação deste exemplo são as seguintes: - Capacidade do tanque de reação de fermentação: 2,0 (L) - Membrana de separação utilizada: membrana de filtragem de PVDF - Área de filtragem eficaz do elemento de separação de membrana: 120 cm2 - Controle de temperatura: 30 (°C) - Aeração do tanque de reação de fermentação: 0.2 (l/min) ar - Velocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 800 rpm - Ajuste de pH: ajustado em pH 5,0 com 5 N NaOH - Esterilização: o tanque de cultura, incluindo o elemento de membrana de separação, e o meio utilizado foram esterilizados com vapor sob alta pressão em autoclave a 121 °C por vinte minutos. - Regulagem da quantidade de água de permeação da membrana: regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana (do início da fermentação contínua até 100 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 5 kPa ou menos, 100 a 200 horas: regulada em 2 kPa ou menos, e 200 a 320 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 20 kPa ou menos).
[370] Linhagem NBRC10505/pTM63 foi utilizada como microrganismo, meio de produção de ácido D-láctico que possui a composição exibida na Tabela 25 foi utilizado como meio e a concentração de ácido D-láctico como produto foi medida por meio do mesmo método de HPLC do Exemplo de Referência 1. A concentração de glicose foi medida com Teste de Glicose Wako C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). TABELA 25 MEIO DE FERMENTAÇÃO DE ÁCIDO LÁCTICO DE LEVEDURA
Figure img0034
[371] Em primeiro lugar, a linhagem de NBRC10505/pTM63 foi cultivada com agitação por uma noite em 5 ml de meio de produção de ácido D- láctico em tubo de ensaio (antes da pré-cultura preliminar). A cultura resultante foi inoculada em 50 ml de meio de produção de ácido D-láctico novo e cultivada com agitação por 24 horas sob temperatura de 30 °C em frasco Sakaguchi de 500 ml (pré-cultura preliminar). A pré-cultura preliminar foi inoculada em 2,0 l de meio de produção de ácido D-láctico no aparelho de fermentação contínua do tipo de separação de membrana exibido na Fig. 1, tanque de reação de fermentação 1 foi agitado a 800 rpm com agitador 5 a ele fixado, seguido pela regulagem de aeração, controle de temperatura e ajuste de pH do tanque de reação 1 e o microrganismo foi cultivado por 24 horas (pré-cultura).
[372] Imediatamente após o término da pré-cultura, a bomba de circulação de líquido de fermentação 10 foi operada e o microrganismo foi cultivado continuamente sob as condições em que, além das condições de operação no momento da pré-cultura, tanque de separação de membrana 2 foi aerado, meio de fermentação de ácido D-láctico foi alimentado continuamente e a quantidade de água de permeação de membrana foi regulada de tal forma que a quantidade do líquido de fermentação no aparelho de fermentação contínua do tipo separação de membrana tornou-se 2 l, por meio do quê cadaverina foi produzida por meio de fermentação contínua. Neste teste de fermentação contínua, a quantidade de água de permeação de membrana foi regulada e alterada sob as condições de controle de água de permeação de membrana descritas acima, durante o quê a diferença de cabeça d’água foi medida como a diferença de pressão transmembrana com aparelho de regulagem de diferença de cabeça d’água 3. A concentração de ácido láctico produzida no líquido de fermentação de permeação de membrana e a concentração de glicose residual foram medidas em momento apropriado. Os resultados no teste de fermentação contínua por 320 horas são exibidos na Tabela 26.
[373] A produção estável de ácido D-láctico por meio de fermentação contínua foi viável por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção utilizando o aparelho de fermentação contínua do tipo de separação de membrana. A diferença de pressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o período de fermentação contínua.
EXEMPLO 32 PRODUÇÃO DE ÁCIDO D-LÁCTICO POR MEIO DE FERMENTAÇÃO CONTÍNUA (N° 2)
[374] A produção de ácido D-láctico foi conduzida utilizando o aparelho de fermentação contínua da Fig. 2 e meio de produção de ácido D- láctico que possui a composição exibida na Tabela 25. O meio foi utilizado após esterilização a vapor em alta pressão (121 °C, quinze minutos). Como material de elemento de membrana de separação, utilizou-se moldagem de resina de polissulfona e aço inoxidável. Como membrana de separação, foi utilizada a membrana porosa preparada no Exemplo de Referência 2. A menos que indicado em contrário, as condições de operação deste exemplo são as seguintes: - Capacidade do tanque de reação de fermentação: 1,5 (L) - Membrana de separação utilizada: membrana de filtragem de fluoreto de polivinilideno - Área de filtragem eficaz do elemento de separação de membrana: 120 cm2 - Controle de temperatura: 30 (°C) - Aeração do tanque de reação de fermentação: 0,2 (l/min) ar - Velocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 800 rpm - Ajuste de pH: ajustado em pH 5,0 com 5 N NaOH - Esterilização: o tanque de cultura, incluindo o elemento de membrana de separação, e o meio utilizado, foram esterilizados com vapor sob alta pressão em autoclave a 121 °C por vinte minutos. - Regulagem da quantidade de água de permeação da membrana: regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana (do início da fermentação contínua até 90 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 5 kPa ou menos, 90 a 180 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2 kPa ou menos, e 180 a 264 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 20 kPa ou menos).
[375] Linhagem NBRC10505/pTM63 foi utilizada como microrganismo, meio de produção de ácido D-láctico que possui a composição exibida na Tabela 25 foi utilizado como meio e a concentração de ácido D-láctico como produto foi medida por meio do mesmo método de HPLC do Exemplo de Referência 1. A concentração de glicose foi medida com Teste de Glicose Wako C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
[376] Em primeiro lugar, a linhagem de NBRC10505/pTM63 foi cultivada com agitação por uma noite em 5 ml de meio de produção de ácido D- láctico em tubo de ensaio (antes da pré-cultura preliminar). A cultura resultante foi inoculada em 50 ml de meio de produção de ácido D-láctico novo e cultivada com agitação por 24 horas sob temperatura de 30 °C em frasco Sakaguchi de 500 ml (pré-cultura preliminar).
[377] A pré-cultura preliminar foi inoculada em 1,5 l de meio de produção de ácido D-láctico no aparelho de fermentação contínua exibido na Fig. 2, tanque de reação de fermentação 1 foi agitada a 800 rpm com agitador 5 a ele fixado, seguido pela regulagem de aeração, controle de temperatura e ajuste de pH do tanque de reação de fermentação 1, enquanto o microrganismo foi cultivado por 24 horas (pré-cultura). Imediatamente após o término da pré- cultura, o microrganismo foi cultivado continuamente enquanto meio de produção de ácido D-láctico era alimentado continuamente e a quantidade de água de permeação de membrana foi regulada de tal forma que a quantidade do líquido de fermentação no aparelho de fermentação contínua se tornasse 1,5 l, por meio do quê foi produzido ácido D-láctico por fermentação contínua. Neste teste de fermentação contínua, a quantidade de água de permeação de membrana foi regulada e alterada sob as condições de controle de água de permeação de membrana descritas acima, durante o quê a diferença de cabeça d’água foi medida como a diferença de pressão transmembrana com aparelho de regulagem de diferença de cabeça d’água 3. A concentração de ácido D-láctico produzida no líquido de fermentação de permeação de membrana e a concentração de glicose residual foram medidas em momento apropriado. A velocidade de produção de ácido D-láctico calculada a partir do ácido D-láctico e glicose introduzida é exibida na Tabela 26.
[378] Como resultado do teste de fermentação por 264 horas, produção estável de ácido D-láctico por meio de fermentação contínua foi viável por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção utilizando o aparelho de fermentação contínua da Fig. 2. A diferença de pressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o período de fermentação contínua.
EXEMPLO COMPARATIVO 16 PRODUÇÃO DE ÁCIDO D-LÁCTICO POR MEIO DE FERMENTAÇÃO EM BATELADAS
[379] Como forma de fermentação utilizando microrganismo, a maior parte da fermentação de bateladas típica foi conduzida em fermentador de jarra de dois litros para avaliar a sua produtividade de ácido D-láctico. O meio foi utilizado após esterilização a vapor em alta pressão (121 °C, quinze minutos). Neste exemplo comparativo, linhagem NBRC10505/pTM63 foi utilizada como microrganismo, a concentração de ácido D-láctico como produto foi avaliada por meio de HPLC e a concentração de glicose foi medida com Teste de Glicose Wako C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). As condições de operação deste exemplo comparativo são as seguintes: - Capacidade do tanque de reação de fermentação (quantidade do meio de produção de ácido D-láctico): 1,0 (L) - Controle de temperatura: 30 (°C) - Aeração do tanque de reação de fermentação: 0,2 (l/min) ar - Velocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 300 rpm - Ajuste de pH: ajustado em pH 5,0 com 5 N NaOH.
[380] Em primeiro lugar, a linhagem de NBRC10505/pTM63 foi cultivada com agitação por uma noite em 5 ml de meio de produção de ácido D-láctico em tubo de ensaio (pré-cultura preliminar). A cultura resultante foi inoculada em 50 ml de meio de produção de ácido D-láctico novo e cultivada com agitação por 24 horas sob temperatura de 30 °C em frasco Sakaguchi de 500 ml (pré-cultura). A pré- cultura resultante foi inoculada em 1,5 l de meio de produção de ácido D-láctico em fermentador de jarra. O microrganismo foi submetido a fermentação em bateladas com o meio de produção de ácido D-láctico. Os resultados são exibidos na Tabela 26. TABELA 26
Figure img0035
[381] Pôde-se revelar que a velocidade de produção de ácido D- láctico foi significativamente aprimorada pelo método de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção utilizando o aparelho de fermentação exibido nas Figs. 1 e 2.
EXEMPLO DE REFERÊNCIA 13 PREPARAÇÃO DE MEMBRANA POROSA (N° 5)
[382] Homopolímero de fluoreto de vinilideno que possui peso molecular ponderai médio de 417.000 e y-butirolactona foram fundidos sob temperatura de 170 °C em quantidades de 38% em peso e 62% em peso, respectivamente, para preparar solução padrão. Esta solução padrão, acompanhada por y-butirolactona como líquido de formação de espaços ocos, foi descarregada de base e resfriada em banho de resfriamento que consiste em solução aquosa de y- butirolactona a 80% sob temperatura de 20 °C para preparar membrana de fibra oca.
[383] Em seguida, 14% em peso de homopolímero fluoreto de vinilideno que possui peso molecular ponderal médio de 284.000, 1% em peso de propionato acetato de celulose (CAP482-0.5 fabricado pela Eastman Chemical), 77% em peso de N-metil-2-pirrolidona, 5% em peso de ácido graxo de óleo de coco de polioxietileno sorbitan (nome comercial: Ionet T-20C, fabricado pela Sanyo Chemical Industries, Ltd.) e 3% em peso de água foram misturados e fundidos sob temperatura de 95 °C para preparar solução padrão. Esta solução padrão foi aplicada uniformemente sobre a superfície da membrana de fibra oca e imediatamente coagulada em banho de água para preparar membrana de fibra oca. A membrana de fibra oca resultante apresentou tamanho médio de poro de 0,05 μm sobre a superfície do lado tratado com água. Quando a membrana de separação foi avaliada para determinar o seu coeficiente de permeabilidade da água purificada, o coeficiente de permeabilidade da água purificada foi de 5,5 x 10—9 m3/mzs^Pa. A medição do coeficiente de permeabilidade da água purificada foi conduzida com água purificada tratada com membrana de osmose reversa a 25 °C com altura de cabeça de um metro. O desvio padrão do tamanho médio de poro foi de 0,006 μm. EXEMPLO 33 PREPARAÇÃO DE ÁCIDO L-LÁCTICO COM MEMBRANA DE FIBRA OCA (N° 1)
[384] É descrito o elemento de membrana de separação exibido na Fig. 4 que possui área de filtragem efetiva de 120 cm2 preparada utilizando membrana porosa preparada no Exemplo de Referência 13 como membrana de separação no mesmo teste de fermentação contínua de ácido L-láctico do Exemplo 1. Os resultados, junto com os resultados do Exemplo Comparativo 1, são exibidos na Tabela 27. A produção estável de ácido L-láctico por meio de fermentação contínua foi viável. A diferença de pressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o período de fermentação contínua. EXEMPLO 34 PREPARAÇÃO DE ÁCIDO L-LÁCTICO COM MEMBRANA DE FIBRA OCA (N° 2)
[385] É descrito o elemento de membrana de separação exibido na Fig. 4 que possui área de filtragem efetiva de 120 cm2 preparada utilizando membrana porosa preparada no Exemplo de Referência 13 como membrana de separação no mesmo teste de fermentação contínua de ácido L-láctico do Exemplo 4. Os resultados, junto com os resultados do Exemplo Comparativo 1, são exibidos na Tabela 27. Pôde-se confirmar que a produção estável de ácido L-láctico por meio de fermentação contínua foi viável. A diferença de pressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o período de fermentação contínua. TABELA 27
Figure img0036
APLICAÇÃO INDUSTRIAL
[386] A presente invenção refere-se a método de fabricação de produto químico por meio de fermentação contínua, mantendo alta produtividade de forma estável por longo período por meio de método simples de operação. Segundo a presente invenção, a fermentação contínua mantendo alta produtividade de forma estável por longo tempo sob condições simples de operação torna-se viável e produto químico que é produto de fermentação pode ser amplamente fabricado de forma estável sob baixo custo na indústria de fermentação.

Claims (11)

1. MÉTODO DE FABRICAÇÃO DE UM PRODUTO QUÍMICO, caracterizado por ser por meio de fermentação contínua que inclui a filtragem de uma cultura de um microrganismo ou células cultivadas com uma membrana de separação para recuperar um produto a partir de um filtrado e retenção simultânea de um fluido não filtrado na cultura, ou envio para dita cultura em refluxo, e adição de materiais de fermentação à cultura, em que uma membrana porosa que possui um tamanho médio de poro de 0,01 μm ou mais até menos de 1 μm é utilizada como membrana de separação e a filtragem é conduzida com uma diferença de pressão transmembrana na faixa de 0,1 a 20 kPa, e em que a membrana porosa contém uma camada de resina porosa fabricada com fluoreto de polivinilideno.
2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo coeficiente de permeabilidade da água purificada da membrana porosa ser de preferencialmente 2 x 10-9 m3/m2/s/Pa ou mais a 6 x10-7 m3/m2/s/Pa ou menos.
3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo tamanho médio de poro da membrana porosa ser de 0,01 μm ou mais a menos de 0,2 μm, e o desvio padrão do tamanho de poro da membrana porosa ser de 0,1 μm ou menos.
4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo produto químico ser um ácido orgânico.
5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo produto químico ser ácido láctico.
6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo produto químico ser cadaverina.
7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo produto químico ser um álcool.
8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo produto químico ser 1,3-propanodiol.
9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo produto químico ser um ácido nucléico.
10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo produto químico ser um aminoácido.
11. APARELHO DE FERMENTAÇÃO CONTÍNUA, que é um aparelho para fabricação de um produto químico por meio de fermentação contínua, que inclui a filtragem de uma cultura de fermentação de um microrganismo ou células cultivadas com uma membrana de separação para recuperar um produto a partir de um filtrado, e retenção simultânea de fluido não filtrado na cultura de fermentação, ou envio para dita cultura em refluxo, e adição de materiais de fermentação à cultura de fermentação, caracterizado por compreender: -um tanque de reação de fermentação para cultura de fermentação de um microrganismo ou células cultivadas; um tanque de separação por membrana para filtragem da cultura de fermentação, que é conectado por meios de circulação de cultura de fermentação ao tanque de reação de fermentação e nele equipado com uma membrana de separação; e meios de regulagem da diferença de pressão transmembrana da membrana de separação na faixa de 0,1 a 20 kPa; em que a membrana de separação é uma membrana porosa que possui um tamanho médio de poro de 0,01 μm ou mais até menos de 1 μm, e em que a membrana porosa contém uma camada de resina porosa fabricada com fluoreto de polivinilideno.
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