CN109609392B - 一种用于酵母菌的虹吸导管补料摇床培养方法 - Google Patents

Abstract

一种用于酵母菌的虹吸导管补料摇床培养方法，该方法是以补料摇床为基础，增设功能性虹吸导管固体培养连接器使多只摇瓶串连，从第一只培养瓶加入目标菌株开始，由虹吸导管连通构成固液交替发酵至最后一只摇瓶结束，进而获得有目的的快速多次培养。本发明的方法可用于驯化分离高酒精度酵母以及制备食物营养饮料，其中功能性虹吸导管所用的材料、管径大小、导管的长度、导管内载体成分配制等对目标菌株培养有关键性影响，因此虹吸导管可根据不同使用专一设计；本发明为利用补料摇床从事微生物菌株驯化、分离与纯化提供新的技术手段，适合广泛应用于食品、医药、饲料和生物制品等领域。

Description

一种用于酵母菌的虹吸导管补料摇床培养方法

技术领域

本发明涉及生物学研究的技术方法与摇床设备制造领域，尤其涉及一种用于酵母菌的虹吸导管补料摇床培养方法。

背景技术

摇床是利用三角摇瓶振荡发酵研究微生物的重要工具，历史悠久应用广泛。补料摇床目的是通过及时向三角摇瓶内补加营养和调整瓶内发酵液PH改善发酵环境延长发酵时间，增加发酵产物；补料赋予传统摇床新的功能。

菌种驯化、分离与纯化是微生物培养研究的重要技术手段，三者即独立又相互关联。驯化是第一位，运用达尔文生物进化理论“环境选择，适者生存”为基础，分为三个不同生态位调整过程，第一生态位调整是保持原始营养状态下(菌泥)室内先液体培养使菌株得到恢复，再固体培养用肉眼可以识别，使新环境下适应菌株得到恢复，不适应的菌株被淘汰。第二生态位调整是根据需要改变培养基环境，适应生存使更多菌株被分离淘汰；第三生态位调整是通过再次改变培养环境选择个体菌株并激发其工作能力用于生产。每一过程都是固体培养与液体摇床发酵分别交替进行并反复多次。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于酵母菌的虹吸导管补料摇床培养方法，是一种全新的培养方法，利用多功能虹吸导管和补料摇床，在导管里设置固体培养基再连接摇瓶，使目前固液分别交替培养操作融合在摇床上一次完成，根据需要选择设计虹吸导管，是对补料摇床应用的重大技术改进。

本发明通过以下方案实现：

一种用于酵母菌的虹吸导管补料摇床培养方法，以补料摇床为基础，所述的补料摇床含有多只摇瓶，摇瓶内设置培养液，将相邻两只摇瓶用功能性虹吸导管固体培养连接器连接，最终使多只摇瓶依次串连，所述的功能性虹吸导管固体培养连接器包括虹吸导管，在虹吸导管的两端设置有针头，分别插入相邻两只摇瓶内且与培养液液面不接触，虹吸导管内设置有吸附载体和固态培养基，仅在第一只摇瓶内加入目标菌株，通过补料摇床振荡从而实现固液交替培养，在最后一只摇瓶中获得产品。

上述技术方案中，虹吸导管可以采用硅胶管、医用塑料管、不锈钢管、玻璃管等；内径通常为0.25～5.0mm，管线长通常为30～300mm，导管两端用针头为8～20号针头，针柄长度25～150mm；虹吸导管内的吸附载体材料包括棉线、脱脂棉、纳米人造纤维、吸水凝胶、琼脂等；但是功能性虹吸导管所用的材料、管径大小、导管的长度、针头尺寸、导管内载体成分配制等对目标菌株培养均有关键性影响，因此虹吸导管可根据不同使用目的进行专一设计；

本发明方法用于驯化分离高酒精度酵母时，所述的虹吸导管采用内径3～6mm硅胶管，长度50mm；管内吸附材料选用脱脂棉，导管内营养基与培养方向下游对应瓶内营养液一致，针头选用内径0.45mm注射器针头,针柄长度30～50mm；各摇瓶内设置营养液，且沿培养方向各摇瓶内葡萄糖浓度递增，整体灭菌后，在第一只摇瓶内加入目标菌种南阳酵母，23～25℃进行振荡培养，最终在最后一只摇瓶内获得高酒精度酵母。

当本发明用于制备食物营养饮料时，所述的虹吸导管采用内径5～8mm食用级塑料管，虹吸导管的长度沿培养方向依次为(mm):60，70，80，90，100；管内吸附材料选用琼脂2％，各导管内营养基与培养方向下游对应瓶内营养液一致；针头选用内径0.5mm注射器针头，针柄的长度为20～30mm；各摇瓶内设置营养液，且沿培养方向摇瓶内蔗糖浓度、硒浓度、铬浓度均递增，整体灭菌后，在第一只摇瓶内加入啤酒酵母，25～28℃，进行振荡培养，最终在最后一只摇瓶内获得食物营养饮料。

本发明中所述的补料摇床优选采用上海智城分析仪器制造有限公司ZWYB-292型补料摇床，是一款限位6瓶发酵、双显大屏触摸控制面板、闭环微量脉冲精准补料，保持生物培养环境在最佳控制状态；PH控制，营养补料，温度，转速连续可调；其中PH控制和营养补料分别采用微量电磁泵控制，精度达微毫升级；采用的双显大屏触摸控制器实现人机操作，直观，便捷，实时显示6个摇瓶反应器的六条PH值与生长对应曲线和微量调酸过程曲线，具有发酵过程时实在线观察、记录、保存、比对分析，数据远程输出等先进功能(如图1)。

本发明有益之处在于：

1)简化菌种驯化操作过程，目前菌株驯化仍然采用平皿固体培养挑选得到目标菌株后再进行液体培养，反复多次交替完成。如果某株细菌每次驯化发酵需要24小时，驯化培养6次，菌种液体发酵培养后再转接固体培养，然后再选择菌株进入下一次液体培养，如此反复全部完成时间至少需要二周甚至更长；而采用虹吸导管连接器技术，首先选择合的导管材料类型，确定导管内吸附载体材料导管直径及长度和导管针头的型号，每一段导管都放入设置的固体培养基，驯化培养6次，菌种转接只要1次，而表观适应驯化只要3～5天。

2)可标准化操作并节省实验成本，将虹吸导管内配制固体培养基，一次性严格操作，批量生产，制成标准生化试剂盒，密封保存，重复操作，减少人为实验误差，节省大量实验器材。

3)功能虹吸导管补料摇床，在导管里设置固体培养基，使目前固液交替分别培养融合在摇床上一次完成，虹吸导管是对补料摇床应用的重大技术改进，为摇床开发产品应用带来新的市场发展空间，适合广泛应用于食品、医药、饲料和生物制品等领域。

综上所述，本项发明的创新之处在于：

1)通过虹吸导管固体培养连接器，使菌种驯化，分离，纯化固液体交替分别培养操作，简化在摇床上融为一体，并一次接种连续多次发酵，直至获得高质量产品；

2)用达尔文生物进化理论为指导基础“环境选择适者生存”，虹吸导管内固体培养基为严格设置，用作连接器的导管长度、导管材料，针头孔径大小，管内培养基载体配制等对驯化培养酵母菌、细菌，霉菌，放线菌及病毒等微生物选择适应有关键作用，应用领域十分广泛。

3)功能导管连接器作为菌种选育新技术，被制成标准化制剂盒可贮存海量生物技术信息，便于通用交换菌种资源，因此好的菌种驯化，分离与纯化不仅取决于菌种本身，也取决于采用的哪一种补料摇床虹吸导管连接器，极大提升分析摇床的应用效果，填补分析摇床的技术空白。

附图说明

图1是补料摇床的结构示意图；

图2是本发明方法实施示意图；

图3是各摇瓶间虹吸导管的连接方式示意图；

图4是功能性虹吸导管固体培养连接器的结构示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的方法做进一步说明。

本发明一种用于酵母菌的虹吸导管补料摇床培养方法，以补料摇床为基础，所述的补料摇床含有多只摇瓶，摇瓶内设置培养液，将相邻两只摇瓶用功能性虹吸导管固体培养连接器连接，最终使多只摇瓶依次串连，所述的功能性虹吸导管固体培养连接器包括虹吸导管，在虹吸导管的两端设置有针头，分别插入相邻两只摇瓶内且与培养液液面不接触，虹吸导管内设置有吸附载体和固态培养基，仅在第一只摇瓶内加入目标菌株，通过补料摇床振荡从而实现固液交替培养，在最后一只摇瓶中获得产品。

本发明可以在ZWYB-292型补料摇床(图1)基础上增加功能性虹吸导管固体培养连接器(连接后如图2)11～15，连接方法是先在摇瓶2-Ⅰ的瓶口2-3胶帽上插入虹吸导管针头一端，另一端插在摇瓶2-Ⅱ的瓶口2-3胶帽上，构成虹吸导管Ⅰ，同样的将各相邻摇瓶依次连接至构成虹吸导管Ⅰ～Ⅴ。使用时只在摇瓶2-Ⅰ中加入菌种，通过虹吸导管固体培养连通器的针头两两插入发酵瓶口2-3-Ⅰ～2-3-Ⅵ串连，构成摇瓶液体发酵与虹吸导管固体发酵交替，最终在摇瓶2-Ⅵ中获得产品(图3)。

实施例如下：

1、驯化分离高酒精度酵母：

1)材料与仪器：南阳酒精酵母(北京微生物所有售)基础耐酒精度5.0g/100ml；营养液：磷酸二氢钾1.5g/100ml；硫酸镁0.25g/100ml；蛋白胨0.35g/100ml；以上分装1000ml容量瓶6只；每只装液250ml；每只分别调制葡萄糖浓度10/12/14/16/18g/100ml。营养液补料瓶6加入300ml用于补料，含葡萄糖5.0g/100ml；碱溶液补料瓶7加入300ml，含硫代硫酸钠2.0g/100ml。仪器：采用上海智城分析仪器制造有限公司ZWBY-292型补料摇床(见图1)；

2)设计虹吸导管连接器：采用内径3～6mm硅胶管，长度50mm；管内吸附材料选用脱脂棉，导管内营养基与培养方向对应瓶内营养液一致，针头选用内径0.45mm注射器针头,针柄长度30～50mm；3)操作方法：先将ZWYB-292型补料摇床底板1取出，装配六只大容量(1000ml)发酵瓶2，按顺时针编号2-Ⅰ～2-Ⅵ，瓶内加入配制营养液250ml，瓶口2-1盖好棉，瓶口2-2盖好胶帽封严后插入PH计检测电极4和碱溶液补料管针头5，碱溶液补料管另一端连接在碱溶液补料精准微量泵8的输出端4-Ⅰ～4-Ⅵ，而对应的输入端管线一根(1供6)连接于碱溶液补料瓶7；瓶口2-3盖好胶帽将添加营养液补料管的针头3分别插入在胶帽上，营养液补料管另一端连接在营养液补料精准微量泵9的输出端3-Ⅰ～3-Ⅵ，而对应的输入端管线一根(1供6)连接于营养液补料瓶6；按上述连接好后在每个瓶口2-3上两两插入虹吸导管连通器，构成连接虹吸导管Ⅰ～Ⅴ，针头与液面距离2～3cm，最后将底板1整体灭菌，冷却后在无菌条件下将摇瓶2-Ⅰ中加入目标菌种南阳酵母后，将底板1整体安装在补料摇床上，于温度23～25℃进行振荡培养。通过ZWBY-292型补料摇床检测显示，经过8～10小时振荡培养2-Ⅰ中加入的目标菌种开始恢复，液体振荡适应生存菌株被吸附至虹吸导管Ⅰ内进入固体培养阶段，固体培养成熟后新的酒精酵母菌株在连接器的另一端被摇瓶2-Ⅱ营养液振荡浸染，选择适应生存使新的酒精酵母菌株在2-Ⅱ内繁殖扩增，经过ZWBY-292型补料摇床及时监控补料和调整PH，如此连续交替发酵培养至摇瓶2-Ⅵ中，获得耐酒精度达到8～9g/100ml新的进化适应酒精酵母菌种。

2、食物营养饮料制备

科学家预言，受能源危机影响未来人类食物解决方案，在动物水产养殖和农业种植基础上，最好解决办法是培养食用微生物，而相对动物养殖2年，植物无土栽培或作物种植需要6个月至1年，而食物微生物培养只要十几天。其中酵母菌已经被列为食物微生物研究的重要资源。酵母菌纯天然，富含有多种氨基酸、多肽、呈核苷酸味，味道鲜美，香气浓郁，肉质感强烈，耐高温适合各种烹饪加工。1KG食物干酵母蛋白质含量是大米的5倍，是大豆的2倍或是猪肉的2.5倍。富含有矿物质晒和铬，对人体有肝脏解毒作用，能够抗衰老，抗肿瘤，预防动脉硬化和提高人体免疫力。食物营养饮料制备是利用啤酒酵母发酵制备成液体含有1500大卡/400ml饮料，相当于二两米饭，能量来源于啤酒酵母营养蛋白质。主要解决问题在于诱导培养耐受高渗透能力的啤酒酵母菌；出于口感，影响酵母细胞渗透物质多为培养基中的无机盐和糖类，以及营养矿物质如晒和铬等浓度含量。

具体方法：1)材料：啤酒酵母(北京微生物所有售)；营养液的配制：磷酸二氢钾1.5g/100ml；硫酸镁0.25g/100m，硝酸铵1.0g/100ml，香菇浸出液浓度20g/100ml；以上分装1000ml容量瓶6只，每只装上述营养液400ml；然后依次调制每只发酵摇瓶蔗糖糖浓度为(g/ml):5％、6％、7％、8％、9％、10％，目的在于增加食品饮料酵母菌含量；依次调制矿物质硒浓度(μg/ml)：0.05％，0.06％，0.07％，0.08％，0.09％，0.1％和调制铬浓度(μg/ml)：0.025％，0.026％，0.027％，0.028％，0.029％，0.03％强化饮料营养；营养液补料瓶6加入配制营养液300ml，含葡萄糖5.0g/100ml；碱溶液补料瓶7加入PH调整液300ml，含有硫代硫酸钠2.0g/100ml。仪器采用上海智城分析仪器制造有限公司新型ZWBY-292型补料摇床(见图2)。2)设计虹吸导管：虹吸导管连接器采用内径5～8mm食用级塑料管，虹吸导管Ⅰ～Ⅴ长度分别为(mm):60，70，80，90，100；管内吸附材料选用琼脂2％，营养基与培养方向对应瓶内营养液一致；针头选用内径0.5mm注射器针头，针柄的长度为20～30mm。3)操作方法：具体连接同实施例1；最后将底板1整体灭菌，冷却后在无菌条件下将摇瓶2-Ⅰ中加入少量的啤酒酵母，将底板1整体安装在补料摇床上，控制温度为25～28℃，进行振荡培养。通过ZWBY-292型补料摇床检测显示，经过5～8小时振荡培养2-Ⅰ中加入的啤酒酵母菌开始恢复，液体振荡适应生存菌株被吸附至虹吸导管Ⅰ内进入固体培养阶段，固体培养成熟后新的酵母菌株在导管连接器的另一端被摇瓶2-Ⅱ营养液振荡浸染，经过选择适应生存，啤酒酵母菌株在2-Ⅱ内繁殖扩增，经过ZWBY-292型补料摇床及时监控补料和调整PH，如此连续交替发酵培养至摇瓶2-Ⅵ，最终获得进化适应高耐渗透性和含有高矿物质及高浓度啤酒酵母菌的营养饮料食品。

以上虹吸导管固体培养连接器赋予补料分析摇床具备产品开发应用的新功能；特别是导管内营养物质经严格配制，批量生产，密封保存，可长期使用并减少重复生产的误差。

Claims (3)

1.一种用于酵母菌的虹吸导管补料摇床培养方法，其特征在于，以补料摇床为基础，所述的补料摇床含有多只摇瓶，摇瓶内设置培养液，将相邻两只摇瓶用功能性虹吸导管固体培养连接器连接，最终使多只摇瓶依次串连，所述的功能性虹吸导管固体培养连接器包括虹吸导管，在虹吸导管的两端设置有针头，分别插入相邻两只摇瓶内且针头与液面距离2~3cm，虹吸导管内设置有吸附载体和固态培养基，仅在第一只摇瓶内加入目标菌株，通过补料摇床振荡从而实现固液交替培养，在最后一只摇瓶中获得产品。

2.如权利要求1所述的用于酵母菌的虹吸导管补料摇床培养方法，其特征在于，用于驯化分离高酒精度酵母，所述的虹吸导管采用内径3~6mm硅胶管，长度50mm;管内吸附载体选用脱脂棉，导管内固态培养基与培养方向下游对应瓶内培养液一致，针头选用内径0.45mm注射器针头,针柄长度30~50mm；各摇瓶内设置培养液，且沿培养方向各摇瓶内葡萄糖浓度递增，整体灭菌后，在第一只摇瓶内加入目标菌种南阳酵母，23~25℃进行振荡培养，最终在最后一只摇瓶内获得高酒精度酵母。

3. 如权利要求1所述的用于酵母菌的虹吸导管补料摇床培养方法，其特征在于，用于制备食物营养饮料，所述的虹吸导管采用内径5~8mm食用级塑料管，虹吸导管的长度沿培养方向依次为:60 mm，70mm，80mm，90mm，100mm；管内吸附载体选用琼脂2%，各导管内固态培养基与培养方向下游对应瓶内培养液一致；针头选用内径0.5mm注射器针头，针柄的长度为20~30mm；各摇瓶内设置培养液，且沿培养方向摇瓶内蔗糖浓度、硒浓度、铬浓度均递增，整体灭菌后，在第一只摇瓶内加入啤酒酵母，25~28℃，进行振荡培养，最终在最后一只摇瓶内获得高耐渗透性、高矿物质及高浓度啤酒酵母。

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