CN109576183B - 一种用于细菌的虹吸导管补料摇床培养方法 - Google Patents

一种用于细菌的虹吸导管补料摇床培养方法 Download PDF

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Abstract

一种用于细菌的虹吸导管补料摇床培养方法，该方法是以补料摇床为基础，增设功能性虹吸导管固体培养连接器使多只摇瓶串连，从第一只培养瓶加入目标菌株开始，由虹吸导管连通构成固液交替发酵至最后一只摇瓶结束，进而获得有目的的快速多次培养。本发明的方法可用于细菌淀粉糖化酶菌株的诱变以及样品中大肠杆菌的检测，其中功能性虹吸导管所用的材料、管径大小、导管的长度、导管内载体成分配制等对目标菌株培养有关键性影响，因此虹吸导管可根据不同使用专一设计；本发明为利用补料摇床从事微生物菌株驯化、分离、诱变与检测提供新的技术手段，适合广泛应用于食品、医药、饲料和生物制品等领域。

Description

一种用于细菌的虹吸导管补料摇床培养方法
技术领域
本发明涉及生物学研究的技术方法与摇床设备制造领域，尤其涉及一种用于细菌的虹吸导管补料摇床培养方法。
背景技术
摇床是利用三角摇瓶振荡发酵研究微生物的重要工具，历史悠久应用广泛。补料摇床目的是通过及时向三角摇瓶内补加营养和调整瓶内发酵液PH改善发酵环境延长发酵时间，增加发酵产物；补料赋予传统摇床新的功能。
菌种驯化、分离与诱变是微生物培养研究的重要技术手段，三者即独立又相互关联。驯化是第一位，运用达尔文生物进化理论“环境选择，适者生存”为基础，分为三个不同生态位调整过程，第一生态位调整是保持原始营养状态下(菌泥)室内先液体培养使菌株得到恢复，再固体培养用肉眼可以识别，使新环境下适应菌株得到二次恢复，不适应的菌株被淘汰。第二生态位调整是根据需要改变培养基环境，适应生存使更多菌株被分离淘汰；第三生态位调整是通过再次改变培养环境选择个体菌株并激发其工作能力用于生产。每一过程都是固体培养与液体摇床发酵分别交替进行并反复多次。
本发明提供与一种全新的培养方法，在补料摇床的基础上增设多功能虹吸导管，是在导管里设置固体培养基再连接摇瓶，使目前固液分别交替培养操作融合在摇床上一次完成，根据需要选择设计虹吸导管，是对补料摇床应用的重大技术改进。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于细菌的虹吸导管补料摇床培养方法，该方法是一种全新的培养方法，在补料摇床的基础上增设多功能虹吸导管，是在导管里设置固体培养基再连接摇瓶，使目前固液分别交替培养操作融合在摇床上一次完成，根据需要选择设计虹吸导管，是对补料摇床应用的重大技术改进。
本发明通过以下方案实现：
一种用于细菌的虹吸导管补料摇床培养方法，以补料摇床为基础，所述的补料摇床含有多只摇瓶，摇瓶内设置培养液，将相邻两只摇瓶用功能性虹吸导管固体培养连接器连接，最终使多只摇瓶依次串连，所述的功能性虹吸导管固体培养连接器包括虹吸导管，在虹吸导管的两端设置有针头，分别插入相邻两只摇瓶内且与培养液液面不接触，虹吸导管内设置有吸附载体和固态培养基，仅在第一只摇瓶内加入目标菌株，通过补料摇床振荡从而实现固液交替培养，在最后一只摇瓶中获得产品。
上述技术方案中，虹吸导管可以采用硅胶管、医用塑料管、不锈钢管、玻璃管等；内径通常为0.25～5.0mm，管线长通常为30～300mm，导管两端用针头为8～20号针头，针柄长度25～150mm；虹吸导管内的吸附载体材料包括棉线、脱脂棉、纳米人造纤维、吸水凝胶、琼脂等；但是功能性虹吸导管所用的材料、管径大小、导管的长度、针头尺寸、导管内载体成分配制等对目标菌株培养均有关键性影响，因此虹吸导管可根据不同使用目的进行专一设计；
当本发明方法用于细菌淀粉糖化酶菌株的诱变，所述的虹吸导管采用内径2-3mm的玻璃管，长度60mm，在管内设置有琼脂，并在管内贯穿浸有碘液的棉线，针头选用内径0.35mm注射器针头,针柄长度50～60mm；各摇瓶内设置营养液，针头与液面距离2～3cm，从第二只摇瓶开始每隔一只摇瓶内加入诱变剂，整体灭菌后，在第一只摇瓶内加入目标菌种枯草杆菌BF7658，于温度35～37℃进行振荡培养，当各虹吸导管内棉线蓝色消失，在最后一只摇瓶内获得稳定诱变的适应淀粉酶细菌菌株。
当本发明方法用于样品中大肠杆菌的检测，所述的虹吸导管采用采用内径3～5mm薄壁玻璃管，长度60mm；管内设置琼脂营养基，并加入有伊红美蓝试剂，虹吸导管的针头选用内径0.35mm注射器针头，针柄的长度为100～130mm；各摇瓶内设置营养液，整体灭菌后，在第一只摇瓶内加入样品，于温度35～37℃进行振荡培养，当虹吸导管中呈现紫红色则表明样品中存在大肠杆菌，不呈现则样品中不含大肠杆菌。
此外，本发明中所述的补料摇床优选采用上海智城分析仪器制造有限公司ZWYB-292型补料摇床，是一款限位6瓶发酵、双显大屏触摸控制面板、闭环微量脉冲精准补料，保持生物培养环境在最佳控制状态；PH控制，营养补料，温度，转速连续可调；其中PH控制和营养补料分别采用微量电磁泵控制，精度达微毫升级；采用的双显大屏触摸控制器实现人机操作，直观，便捷，实时显示6个摇瓶反应器的六条PH值与生长对应曲线和微量调酸过程曲线，具有发酵过程时实在线观察、记录、保存、比对分析，数据远程输出等先进功能(如图1)。
本发明有益之处在于：
1)简化菌种驯化操作过程，目前菌株驯化仍然采用平皿固体培养挑选得到目标菌株后再进行液体培养，反复多次交替完成。如果某株细菌每次驯化发酵需要24小时，驯化培养6次，菌种液体发酵培养后再转接固体培养，然后再选择菌株进入下一次液体培养，如此反复全部完成时间至少需要二周甚至更长；而采用本发明的虹吸导管连接器技术后，首先选择合适的导管材料类型，确定导管内吸附载体材料导管直径及长度和导管针头的型号，每一段导管都放入设置的固体培养基，驯化培养6次，菌种转接只要1次，而表观适应驯化只要3～5天。
2)可标准化操作并节省实验成本，将虹吸导管内配制固体培养基，一次性严格操作，批量生产，功能性虹吸导管固体培养连接器可制成标准生化试剂盒，密封保存，重复操作，减少人为实验误差，节省大量实验器材。
3)功能虹吸导管补料摇床，是在导管里设置固体培养基后连通多只发酵瓶，使目前固液交替分别培养融合在摇床上一次完成，虹吸导管是对补料摇床应用的重大技术改进，为摇床开发产品应用带来新的市场发展空间，适合广泛应用于食品、医药、饲料和生物制品等领域。
综上所述，本项发明的创新之处在于：1)通过虹吸导管固体培养连接器，使菌种驯化，分离，诱变固体液体交替分别培养操作，简化在摇床上自动完成，并一次接种连续多次发酵，直至获得高质量产品；
2)用达尔文生物进化理论为指导基础“环境选择适者生存”，虹吸导管内固体培养基为严格设置，用作连接器的导管长度、导管材料，针头孔径大小，管内培养基载体配制等对驯化培养细菌、霉菌、酵母菌、放线菌及病毒等微生物选择适应有关键作用，应用领域十分广泛。
3)功能导管连接器作为菌种选育新技术，被制成标准化制剂盒可贮存海量生物技术信息，便于通用交换菌种资源，因此好的菌种驯化，分离与诱变不仅取决于菌种本身，也取决于采用的哪一种补料摇床虹吸导管连接器，极大提升分析摇床的应用效果，填补长期以来分析摇床为产品生产应用摇床的技术空白。
附图说明
图1是补料摇床的结构示意图；
图2是本发明方法实施示意图；
图3是各摇瓶间虹吸导管的连接方式示意图；
图4是功能性虹吸导管固体培养连接器的结构示意图。
图中：1、ZWYB-292型补料摇床底盘，2、补料三角摇瓶Ⅰ～Ⅵ，3、营养输液瓶Ⅰ～Ⅵ，4、PH计Ⅰ～Ⅵ，5、输入碱液瓶Ⅰ～Ⅵ，6、营养液瓶，7、碱溶液瓶，8、碱溶液管泵Ⅰ～Ⅵ，9、营养液管泵Ⅰ～Ⅵ，10、精准微量泵；11、虹吸导管Ⅰ～Ⅱ，12、虹吸导管Ⅱ～Ⅲ，13、虹吸导管Ⅲ～Ⅳ，14、虹吸导管Ⅳ～Ⅴ，15、虹吸导管Ⅴ～Ⅵ，16、卡带式数据连接线，17、双线触控屏。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的方法做进一步说明。
本发明一种用于细菌的虹吸导管补料摇床培养方法，以补料摇床为基础，所述的补料摇床含有多只摇瓶，摇瓶内设置培养液，将相邻两只摇瓶用功能性虹吸导管固体培养连接器连接，最终使多只摇瓶依次串连，所述的功能性虹吸导管固体培养连接器包括虹吸导管，在虹吸导管的两端设置有针头，分别插入相邻两只摇瓶内且与培养液液面不接触，虹吸导管内设置有吸附载体和固态培养基，仅在第一只摇瓶内加入目标菌株，通过补料摇床振荡从而实现固液交替培养，在最后一只摇瓶中获得产品。
本发明可以在ZWYB-292型补料摇床(图1)基础上增加功能性虹吸导管固体培养连接器(连接后如图2)11～15，连接方法是先在摇瓶2-Ⅰ的瓶口2-3胶帽上插入虹吸导管针头一端，另一端插在摇瓶2-Ⅱ的瓶口2-3胶帽上，构成虹吸导管Ⅰ，同样的将各相邻摇瓶依次连接至构成虹吸导管Ⅰ～Ⅴ。使用时只在摇瓶2-Ⅰ中加入菌种，通过虹吸导管固体培养连通器的针头两两插入发酵瓶口2-3-Ⅰ～2-3-Ⅵ串连，构成摇瓶液体发酵与虹吸导管固体发酵交替，最终在摇瓶2-Ⅵ中获得产品(图3)。
实施例如下：
1、细菌淀粉糖化酶菌株诱变：
淀粉水解经淀粉酶作用产生饴糖，而饴糖是食品医药领域的重要工业原料。淀粉酶是细菌产生的胞外酶，自然界有许多细菌具有产生淀粉酶的能力，但酶的活力强度大小各有不同，通过化学诱变剂改变细菌基因的顺序形成基因突变产酶活力强的菌株为细菌诱变。原理：选用常规的枯草杆菌BF7658菌株，在淀粉蛋白胨培养基内扩增后用硫酸二乙酯进行化学诱变，再利用碘液棉线淀粉蛋白胨固体培养观察，诱变后的枯草杆菌会使碘液棉线蓝色消失。
操作：
1)实验材料：枯草杆菌BF7658菌株(北京微生物所有售)；诱变剂：硫酸乙二醇(化学纯)；营养液(g/ml)：可溶性淀粉2％；蛋白胨0.5％；NaCIK0.5％；PH7.2～7.5；以上分装1000ml棕黑色容量瓶6只；其中摇瓶2-Ⅰ、2-Ⅲ、2-Ⅴ和2-Ⅵ每只各装营养液150ml；摇瓶2-Ⅱ、2-Ⅳ各加入0.1M磷酸缓冲液PH7.0，150ml，另加硫酸二乙酯1.8ml；营养液补料瓶6加入营养液300ml；PH调整补料瓶7加入溶液300ml，含有0.1M磷酸缓冲液PH7.0。
2)仪器：采用上海智城分析仪器制造有限公司ZWYB-292型补料摇床(见图1)；虹吸导管连接器：采用内径2～3mm玻璃管，导管长度60mm；管内吸附材料选用琼脂管内贯穿浸有碘液的棉线，导管内营养基与培养方向对应瓶内液体一致，针头选用内径0.35mm注射器针头,针柄长度50～60mm；
3)操作方法：先将ZWYB-292型补料摇床底板1取出，装配六只棕黑色大容量(1000ml)发酵瓶2，按顺时针编号2-Ⅰ～2-Ⅵ，瓶内加入配制营养液150ml，瓶口2-1盖好棉，瓶口2-2盖好胶帽封严后插入PH计检测电极4和碱溶液补料管针头5，碱溶液补料管另一端连接在碱溶液补料精准微量泵8的输出端4-Ⅰ～4-Ⅵ，而对应的输入端管线一根(1供6)连接于碱溶液补料瓶7；瓶口2-3盖好胶帽将添加营养液补料管的针头3分别插入在胶帽上，营养液补料管另一端连接在营养液补料精准微量泵9的输出端3-Ⅰ～3-Ⅵ，而对应的输入端管线一根(1供6)连接于营养液补料瓶6；按上述连接好后在每个瓶口2-3上两两插入虹吸导管连通器，构成连接虹吸导管Ⅰ～Ⅴ，针头与液面距离2～3cm，最后将底板1整体灭菌，冷却后在无菌条件下在摇瓶2-Ⅰ中加入目标菌种枯草杆菌BF7658，将底板1整体安装在补料摇床上，于温度35～37℃进行振荡培养。通过ZWYB-292型补料摇床检测显示，经过10～12小时振荡培养2-Ⅰ中加入的目标菌株进入生长对数期，液体振荡适应生存菌株被吸附至虹吸导管Ⅰ内已经开始固体培养，固体培养适应后新的枯草杆菌在虹吸导管连通器Ⅰ的另一端被摇瓶2-Ⅱ诱变液振荡浸染，在2-Ⅱ内液体诱变适应生存的新的枯草杆菌菌株得到扩增，经过ZWYB-292型补料摇床及时监控补料和调整PH，如此连续交替，全过程经过2-Ⅱ和2-Ⅳ两次液体条件诱变和2-Ⅲ、2-Ⅴ和2-Ⅵ三次液体扩增培养，导管Ⅰ～Ⅴ棉线蓝色逐渐消失，最终在摇瓶2-Ⅵ中获得新的稳定的诱变进化适应淀粉酶细菌菌株。
2、大肠杆菌检测：
大肠杆菌存在于畜禽及人的肠道，控制不当可随粪便污染环境与河流，分布极为广泛。大肠杆菌有多种类型，有的与人类共生，特别是在直肠内大肠杆菌与粪便共生为人体合成维生素K；而有些种类，如：大肠杆菌O157︰H7引起人类感染水泻、带血腹泻、发烧、腹绞痛及呕吐。大肠杆菌检测是食品，医药，饮料和生物制品诸多企业必需检测的项目，是细菌检测的代表，主要考查水源和产品制品是否受到细菌微生物的污染。检测大肠杆菌方法很多，最常用的是国际上公认的平皿涂布法，原理：取样放入肉汤液体培养基振荡扩增培养后，取培养液进行稀释，稀释度为10-1，10-2和10-3，将每一个稀释度进行平皿固体培养基涂布培养，对平皿上长出的菌落进行滴加伊红美蓝试验，出现紫红色有金属光泽确定为有大肠杆菌存在。
以饼干食品厂为例同时检测水源和饼干产品，具体方法：
1)材料和仪器：水样：饼干生产处理后的用水；产品：随机抽取出厂包装饼干成品；肉汤营养液配制(g/ml)：牛肉膏0.3％；蛋白胨1％，NaCl0.5％，PH7.0～7.2；以上分装1000ml容量瓶6只，每只装上述营养液200ml；营养液补料瓶6加入上述配制营养液300ml；碱溶液补料瓶7加入含有硫代硫酸钠2.0g/100ml的PH调整液300ml。仪器采用上海智城分析仪器制造有限公司新型ZWYB-292型补料摇床(见图2)。
2)选用虹吸导管：虹吸导管连接器采用内径3～5mm薄壁玻璃管，虹吸导管Ⅰ～Ⅴ长度分别为60mm；管内吸附材料选用琼脂2％，营养基与培养方向对应瓶内营养液一致，其中加入少许伊红美蓝试剂；虹吸导管的针头选用内径0.35mm注射器针头，针柄的长度为100～130mm。
3)操作方法：先将ZWYB-292型补料摇床底板1取出，装配六只大容量(1000ml)发酵瓶2，按顺时针编号2-Ⅰ～2-Ⅵ，瓶内各加入配制营养液200ml，瓶口2-1盖好棉，瓶口2-2盖好胶帽封严后插入PH计检测电极4和碱溶液补料管针头5，碱溶液补料管另一端连接在碱溶液补料精准微量泵8的输出端4-Ⅰ～4-Ⅵ，而对应的输入端管线一根(1供6)连接于碱溶液补料瓶7；瓶口2-3盖好胶帽将添加营养液补料管的针头3分别插入在胶帽上，营养液补料管另一端连接在营养液补料精准微量泵9的输出端3-Ⅰ～3-Ⅵ，而对应的输入端管线一根(1供6)连接于营养液补料瓶6；按上述连接好后在瓶口2-3-Ⅰ～2-3-Ⅲ之间安装两根虹吸导管；在瓶口2-3-Ⅳ～2-3-Ⅵ之间另安装两根虹吸导管；而瓶口2-3-Ⅲ与瓶口2-3-Ⅳ之间不连接虹吸导管；构成两组，每组二支虹吸导管固体培养与三瓶液体补料培养交替。虹吸导管内吸附载体为琼脂2％，营养液与培养方向对应摇瓶液体相一致，另加有少量伊红美蓝试剂。将底板1整体灭菌，冷却后在无菌条件下于摇瓶2-Ⅰ中加入水样1ml；于摇瓶2-Ⅳ中加入饼干样品混合物1g。将底板1整体安装在摇床上，于温度35～37℃进行振荡培养。通过ZWYB-292型补料摇床检测显示，经10～12小时振荡培养，摇瓶2-Ⅰ中加入的水样如果有细菌则开始恢复，液体振荡适应生存菌株会被吸附至虹吸导管Ⅰ和虹吸导管Ⅱ内进入固体培养，若是有金属光泽紫红色呈现，则表明有细菌存在；同理，摇瓶2-Ⅳ中加入饼干混合物样品，如果有细菌则开始恢复，液体振荡适应生存菌株会被吸附至虹吸导管Ⅳ和虹吸导管Ⅴ中呈现带有金属光泽的紫红色；如果都没有则表明食品生产的水源与饼干产品，细菌不存在。
企业微生物卫生指标检测难度大，一直依赖于培养或引入专业人员，检测成本费用高；虹吸导管固体培养连接器赋予分析摇床具备微生物自动检测新功能；特别是导管内营养物质经严格配制批量生产密封保存，可减少重复检测误差，检测成本低，操作极为简便，出结果快，观察效果直观，明显。

Claims (3)

1.一种用于细菌的虹吸导管补料摇床培养方法，其特征在于，以补料摇床为基础，所述的补料摇床含有多只摇瓶，摇瓶内设置培养液，将相邻两只摇瓶用功能性虹吸导管固体培养连接器连接，最终使多只摇瓶依次串连，所述的功能性虹吸导管固体培养连接器包括虹吸导管，在虹吸导管的两端设置有针头，分别插入相邻两只摇瓶内且针头与培养液液面距离2~3cm，虹吸导管内设置有吸附载体和固态培养基，仅在第一只摇瓶内加入目标菌株，通过补料摇床振荡从而实现固液交替培养，在最后一只摇瓶中获得产品；使目前固液交替分别培养融合在所述补料摇床上一次完成。
2.如权利要求1所述的用于细菌的虹吸导管补料摇床培养方法，其特征在于，用于细菌淀粉糖化酶菌株的诱变，所述的虹吸导管采用内径2-3mm的玻璃管，长度60mm，在管内设置有琼脂，并在管内贯穿浸有碘液的棉线，针头选用内径0.35mm注射器针头,针柄长度50~60mm；各摇瓶内设置营养液，针头与液面距离2~3cm，从第二只摇瓶开始每隔一只摇瓶内加入诱变剂，整体灭菌后，在第一只摇瓶内加入目标菌种枯草杆菌BF7658，于温度35~37℃进行振荡培养，当各虹吸导管内棉线蓝色消失，在最后一只摇瓶内获得稳定诱变的适应淀粉酶细菌菌株。
3.如权利要求1所述的用于细菌的虹吸导管补料摇床培养方法，其特征在于，用于样品中大肠杆菌的检测，所述的虹吸导管采用内径3~5mm薄壁玻璃管，长度60mm；管内设置琼脂营养基，并加入有伊红美蓝试剂，虹吸导管的针头选用内径0.35mm注射器针头，针柄的长度为100~130mm；各摇瓶内设置营养液，整体灭菌后，在第一只摇瓶内加入样品，于温度35~37℃进行振荡培养，当虹吸导管中呈现紫红色则表明样品中存在大肠杆菌，不呈现则样品中不含大肠杆菌。
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