CN108713058A - 葡萄糖组合物、微生物发酵原料和化学品的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的特征在于，是葡萄糖组合物，作为换算成葡萄糖浓度为100g/L的该组合物水溶液时的含量，含有木糖0～25g/L、乙酸0.1～10g/L、香豆酸0.15～2.0g/L和阿魏酸0.007～0.28g/L。通过将本发明的葡萄糖组合物作为利用微生物发酵的化学品的制造方法的原料使用，能够提高化学品的收率。

Description

葡萄糖组合物、微生物发酵原料和化学品的制造方法
技术领域
本发明涉及提高微生物发酵效率的葡萄糖组合物和微生物发酵原料、以及利用微生物发酵的化学品的制造方法。
背景技术
以糖为原料的化学品的发酵生产工艺被用于各种工业原料生产中。作为成为该发酵原料的糖，现在工业上使用源自甘蔗、淀粉、甜菜等食用原料的糖。由甘蔗、甜菜获得的粗糖以蔗糖为主成分，成为蔗糖纯度为95％以上的纯度高的糖液。另一方面，在获得粗糖的过程中产生的结晶化后的母液作为废糖蜜出现在市场上，但这是蔗糖、葡萄糖、果糖混合而成的，作为杂质包含各种盐类、蛋白质等，因而成为蔗糖、葡萄糖、果糖等各种合计糖浓度为50％左右的糖以外的杂质多的糖液。由玉米、小麦、木薯等获得的淀粉通过酶转换成葡萄糖后，经过纯化、浓缩而制造，成为葡萄糖纯度为98％以上的纯度高的糖液。
除了上述由食用资源制造的糖之外，从今后世界人口增加引起食用原料价格的暴涨、或与食用竞争的伦理层面出发，对于以可再生的非食用资源、即含纤维素生物质作为原料的糖的制造也进行了开发。作为由含纤维素生物质制造糖液的方法，已知使用浓硫酸将纤维素和半纤维素进行酸水解来制造糖液的方法，在用稀硫酸将含纤维素生物质进行水解处理之后，进一步通过进行纤维素酶等酶处理来制造糖液的方法(非专利文献1)。另外，公开了在用240～280℃的加压热水将含纤维素生物质进行水解处理之后，进一步通过糖化酶处理来制造糖液的方法(专利文献1)。但是，以含纤维素生物质为原料的糖中，除了葡萄糖以外，还包含作为难发酵性的戊糖的木糖，进而作为发酵抑制物，含有乙酸等有机酸、HMF(羟甲基糠醛)、香豆酸、阿魏酸、香草醛等，因此在作为微生物发酵原料的情况下，存在发酵收率低这样的课题。作为解决上述课题的方法，已知使包含将含纤维素生物质原料用加压热水处理后用纤维素酶水解而得的发酵抑制物质的糖液，通过超滤膜、纳滤膜或反渗透膜，从而制造除去了发酵抑制物质的糖液的方法等(专利文献2、3)。
以糖作为主原料制作的微生物发酵原料需要符合一般营养的原则的构成。细胞的固体物除了能够从水、空气供给的氢和氧之外，还依次包含大量的碳、氮、磷和硫，这些元素相当于细胞干重的95％。其余5％包含大量矿物元素。此外，作为不能利用简单的碳源生物合成、需要在培养基中添加的物质，有氨基酸、嘌呤/嘧啶、维生素这样的增殖因子，但这些在量上仅要求少量。即作为微生物发酵原料，作为最主要的成分，为了供给微生物，使用作为糖的碳水化合物等制备碳源，使用酵母提取物、玉米浆(Corn Steep Liquor)(CSL)或氨盐等制备氮源等。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特许3041380号公报
专利文献2：WO2010/067785
专利文献3：WO2013/018694
非专利文献
非专利文献1：A.Aden等，“Lignocellulosic Biomass to Ethanol ProcessDesign and Economics Utilizing Co-Current Dilute Acid Prehydrolysis andEnzymatic Hydrolysis for Corn Stover”NREL Technical Report(2002)
发明内容
发明要解决的课题
如前所述，作为成为微生物发酵原料的糖，有来源于食用原料的糖、来源于含纤维素生物质原料的糖等，使用这些糖制作发酵用的培养基，但产业界要求能得到更高的发酵效率的糖组合物。因此，本发明的课题是，开发能得到高于现有的糖组合物的高发酵效率的葡萄糖组合物。
用于解决课题的方法
本发明者进行了深入研究，令人惊讶地新发现了，以特定量含有本领域技术人员作为发酵抑制物质已知的乙酸、香豆酸和阿魏酸的葡萄糖组合物适合作为微生物发酵原料，完成了本发明。
即本发明具有以下[1]～[5]的构成。
[1]葡萄糖组合物，作为换算成葡萄糖浓度为100g/L的该组合物水溶液时的含量，含有木糖0～25g/L、乙酸0.1～10g/L、香豆酸0.15～2.0g/L和阿魏酸0.007～0.28g/L。
[2]根据[1]に记载的葡萄糖组合物，作为换算成葡萄糖浓度为100g/L的所述葡萄糖组合物水溶液时的含量，以如下定义的浓度含有用1cm宽的样品池测定时在280nm具有吸收的物质，该物质是对甘蔗渣进行碱处理时得到的，所述浓度是以吸光度即ABS为20～350定义的。
[3]微生物发酵用葡萄糖组合物，含有[1]或[2]所述的葡萄糖组合物。
[4]微生物发酵原料，含有[1]或[2]所述的葡萄糖组合物、或者[3]所述的微生物发酵用葡萄糖组合物。
[5]化学品的制造方法，其中，使用[4]所述的微生物发酵原料，来培养具有生产化学品的能力的微生物。
发明的效果
在利用本发明的葡萄糖组合物作为微生物发酵原料的情况下，能够获得高于现有的糖组合物的发酵效率，能够降低以糖为原料的化学品的发酵生产中的化学品的制造成本。
具体实施方式
对于用于实施本发明的方式进行详细说明。
[葡萄糖组合物]
作为本发明的葡萄糖组合物的主成分即葡萄糖，可以使用以玉米、小麦、木薯等为原料由淀粉通过酶水解生产的纯度高的葡萄糖。另外，如后所述，也可以使用将含纤维素生物质适宜水解而得的葡萄糖。
作为本发明的葡萄糖组合物所含的木糖，在玉米的芯等中大量包含，可以将其纯化而获得。另外，如后所述，也可以使用将含纤维素生物质适宜水解而得的木糖。
乙酸可以使用通过甲醇的羰基化等由来自石油的原料获得的，也可以使用通过利用醋杆菌(Acetobacter)属微生物等的发酵生产获得的。另外，如后所述，乙酸作为水解含纤维素生物质而制造葡萄糖等糖时的副成分被包含，因此也可以是来源于含纤维素生物质的。
香豆酸、阿魏酸是植物中的木质素构成成分之一，可以由植物原料等纯化、或由来源于石油的原料通过化学合成制造。另外，与乙酸同样地，香豆酸、阿魏酸也作为水解含纤维素生物质而制造葡萄糖等糖时的副成分被包含，因此也可以是来源于含纤维素生物质的。另外，香豆酸具有邻香豆酸、间香豆酸、对香豆酸3种异构体，本发明的葡萄糖组合物所含的香豆酸可以是其任一种，或其2种以上的混合物，但对香豆酸作为木质素的构成成分之一在自然界大量存在，因此优选是对香豆酸或以对香豆酸为主成分的混合物。进而，作为对香豆酸，存在顺式体、反式体，可以是其任一种，或这2种的混合物，但在不照射光的自然界状态下，反式体稳定地存在，因此优选反式对香豆酸。
本发明的葡萄糖组合物可以通过将成为构成成分的上述化合物在适宜溶剂中溶解、配合来制备。例如，将上述物质充分纯化后，以在葡萄糖浓度为100g/L的水溶液中木糖为0～25g/L、优选为0.5～25g/L的范围内、乙酸为0.1～10g/L、优选为0.2～4g/L的范围内、香豆酸为0.15～2.0g/L、优选为0.3～1.0g/L的范围内、阿魏酸为0.007～0.28g/L、优选为0.014～0.14g/L的范围内的浓度进行混合，从而可以制造本发明的葡萄糖组合物。对溶解/配合的顺序不特别限制，也可以适宜调节pH、温度等。此外，使本发明的葡萄糖组合物溶解于溶剂时的葡萄糖和木糖浓度可以使用高速液相色谱(HPLC)通过RI检测器来定量，香豆酸、阿魏酸浓度可以同样使用高速液相色谱通过UV检测器或光电二极管测定来定量，乙酸可以同样地使用高速液相色谱通过电导率计来定量。
本发明的葡萄糖组合物可以以含纤维素生物质为原料制造，例如，将含纤维素生物质通过碱处理等进行前处理后，将固液分离后的固体用来源于丝状菌的纤维素酶等糖化酶水解而得的糖水溶液纯化成本发明的葡萄糖组合物的构成成分为规定的浓度，进行制造，从而以比混合各种纯化品更低的成本得到本发明的葡萄糖组合物。
含纤维素生物质是指包含5重量％以上的纤维素的来源于生物的资源。具体可列举甘蔗渣、柳枝稷、象草、蔗茅、玉米秸、稻秸、麦秸等草本系生物质、树木、废建材等木质系生物质等作为例子。这些含纤维素生物质由于含有作为芳香族高分子的木质素和纤维素、半纤维素，因而也称为木质纤维素。通过水解作为含纤维素生物质所含的多糖成分的纤维素、半纤维素，能够获得包含木糖和葡萄糖的糖液。
作为所述含纤维素生物质优选为甘蔗渣。甘蔗渣是将甘蔗的茎压榨并榨取甘蔗汁后的残渣，含水率为40～50％，包含纤维素为35～45％(wt/wt-干甘蔗渣)、木糖为20～28％(wt/wt-干甘蔗渣)、木质素为3～20％(wt/wt-干甘蔗渣)。甘蔗渣中只要含有上述纤维素、木糖、木质素即可，对甘蔗的种类不特别限制。
含纤维素生物质的前处理具体可列举：用氢氧化钙、氢氧化钠等碱性水溶液进行处理的碱处理；用高温高压的稀硫酸、亚硫酸盐等进行处理的酸处理；用加压热水进行处理的水热处理。此外，本发明中，优选通过碱处理进行的前处理。
作为糖化酶，优选为来源于丝状菌的纤维素酶，作为丝状菌，可例示木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、梭菌属(Clostridium)、链霉菌属(Streptomyces)、腐质霉属(Humicola)、枝顶孢霉属(Acremonium)、耙齿菌属(Irpex)、毛霉属(Mucor)、篮状菌属(Talaromyces)等的微生物。这样的丝状菌中，木霉属在培养液中大量生产在纤维素的水解中比活性的高的酶成分，因此优选使用。
作为纯化糖水溶液制备本发明的葡萄糖组合物的方法，可列举通过截留分子量为300～1,000、优选为300～500的分离膜进行过滤，作为透过液回收的方法。作为分离膜的具体例，可列举Synder社的NFW(截留分子量300～500)、NFG(截留分子量600～800)、NDX(截留分子量800～1,000)等。
本发明的葡萄糖组合物中在不阻碍本发明的效果的范围内也可以包含前述的木糖、乙酸、香豆酸、阿魏酸的其他物质，例如，在使用作为含纤维素生物质的甘蔗渣作为原料制造本发明的葡萄糖组合物的情况下，可以包含用1cm宽的样品池测定时在280nm具有吸收的物质。本物质设想是来源于甘蔗渣中的木质素的成分，由于具有复杂的结构而没有特定化学结构，但通过具有芳香环而在属于紫外区域的280nm具有吸收，另外，本物质的浓度具有与280nm的吸光度成比例这样的特征。本发明的葡萄糖组合物包含本物质时的含量在不阻碍本发明的效果的范围内不特别限制，但作为换算成葡萄糖浓度为100g/L的水溶液时的含量，通过以吸光度(ABS)为20～350定义的浓度含有，能够进一步提高微生物发酵中的发酵收率。
所述用1cm宽的样品池测定时在280nm具有吸收的物质包含在将甘蔗渣用糖化酶水解而得的糖水溶液中，因此也可以通过在不以含纤维素生物质为原料制备的葡萄糖组合物中适宜配合糖水溶液来配合本物质。
本发明的葡萄糖组合物，只要是在以葡萄糖浓度为100g/L使该组合物溶解在水中而得的该组合物的水溶液中包含特定量的如前所述特定的葡萄糖以外的物质，就对其形态不特别限制，另外，可以通过适宜浓缩或稀释来调制成各种葡萄糖浓度，但通过以水溶液的形态使葡萄糖浓度为600g/L以上，可以将水分活性抑制得较低，另外，能够防止由微生物的污染造成的糖消耗，能够提高保守稳定性。
[微生物发酵用葡萄糖组合物]
对本发明的葡萄糖组合物的用途不特别限定，但由于与仅使用葡萄糖时相比能够提高微生物发酵效率，因而可以适合作为微生物发酵用途使用。具体地，在使用本发明的葡萄糖组合物作为微生物发酵用途的情况下，在发酵效率、具体在发酵速度、发酵收率对理论比、发酵收率对消耗糖比或微生物增殖能力方面能够获得优异的效果。
发酵速度是指每单位时间发酵生产物浓度上升的速度。发酵速度是初速度高，随着糖被消耗的发酵终结临近而逐渐接近零。本发明中的发酵速度使用在从发酵开始起12～24小时测定的值。
发酵收率对理论比定义为，实际上生产生产物的浓度相对于由糖减少量发酵生产菌所具有的理论上能得到的生产物浓度的比例。关于理论上能得到的生产物，在乙醇发酵时为0.51g-乙醇/g-消耗糖，在乳酸发酵时为1.0g-乳酸/g-消耗糖，在琥珀酸发酵时根据所研究的菌株不同而不同，在产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus Succinogenes)的情况下为0.66g-琥珀酸/g-消耗糖。
发酵收率对消耗糖比定义为，生产生产物的浓度相对于糖减少浓度的比例。例如，在作为糖原料仅消耗葡萄糖的情况下，是指发酵收率对消耗葡萄糖比。
微生物增殖能力通过作为发酵培养液的OD值测定的数值来定量。本发明的OD值可以作为可见光600nm的吸光度，使用1cm宽的样品池用分析用的分光光度计进行测定。
在本发明的葡萄糖组合物包含木糖的情况下，木糖根据发酵中使用的微生物不同而同化性不同，因此在例如不具有木糖同化性的酵母中，通过己糖转运蛋白的作用等木糖被摄入微生物内，但不被同化，因此发酵收率对理论比降低。然而，在包含木糖、乙酸、香豆酸、阿魏酸的本发明的葡萄糖组合物中，木糖向微生物的摄入被抑制，由此能够提高以葡萄糖的代谢为主的发酵速度、发酵收率对理论比。另外，在具有木糖同化性的微生物中，通过包含乙酸、香豆酸、阿魏酸，由木糖向生产物的转换被促进，能够提高发酵速度、发酵收率对理论比。
[微生物发酵原料]
本发明的葡萄糖组合物其单独也能够作为微生物发酵原料利用，但也可以根据发酵生产中使用的微生物的种类为了氮源、维生素的供给而制成适宜添加了副原料的微生物发酵原料。作为副原料，可列举酵母提取物、胨、玉米浆(Corn Steep Liquor)(CSL)等来源于天然物的成分、矿物、维生素等。
对利用本发明的葡萄糖组合物作为微生物发酵原料时的葡萄糖浓度不特别限制，优选为10～200g/L的范围。另外在葡萄糖、木糖消耗的阶段，也可以仅补加葡萄糖、木糖。
[化学品的制造方法]
使用含有本发明的葡萄糖组合物的微生物发酵原料，通过培养生产所期望的化学品的微生物，能够制造所期望的化学品。
作为微生物的培养方法不特别限制，可以按照本领域技术人员公知的发酵培养方法培养，但从生产性的观点考虑，优选采用WO2007/097260所公开的连续培养方法。
作为能够以本发明的葡萄糖组合物作为发酵原料发酵生产化学品的微生物，具体可列举酵母、乳酸菌、琥珀酸生产菌、大肠菌、醇发酵菌、有机酸发酵菌、氨基酸发酵菌等，优选为酵母、乳酸菌、琥珀酸生产菌。这些微生物可以是从自然环境分离的，也可以是通过突变、基因重组改变一部分性质而得的。
作为化学品，可列举醇、有机酸、氨基酸、核酸等发酵工业中大量生产的物质。可举出例如，乙醇、1,3-丙二醇、1,4-丁二醇、甘油等醇，乳酸、琥珀酸、丙酮酸、苹果酸、衣康酸、柠檬酸等有机酸，肌苷、鸟苷等核苷，肌苷酸、鸟苷酸等核苷酸，赖氨酸、谷氨酸、色氨酸、缬氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、乙酰丙酸等氨基酸、尸胺等胺化合物。还可以适用于酶、抗生素、重组蛋白质等的生产。作为发酵生产的化学品优选为乙醇、乳酸、琥珀酸、赖氨酸、尸胺。
作为发酵生产所述化学品的酵母，具体可列举例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces Pombe)、树干毕赤酵母(Pichiastipitis)、休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)等。
作为乳酸菌，具体可列举例如属于乳杆菌(Lactobacillus)属、乳球菌(Lactococcus)属的微生物等，更具体可列举植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、凝结芽孢杆菌(Bacillus Coagulans)等。
作为琥珀酸生产菌，具体可列举例如产琥珀酸放线杆菌(Actinobaccillussuccinogenes)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)等。
作为赖氨酸生产菌，可列举大肠菌(Escherichia coli)、棒状型细菌等。作为大肠菌的具体例，可以使用MC1061株、HB101株、JM105株、JM109株、DH5α株和JE5505株等。棒状型细菌是好氧型的革兰氏阳性杆菌，以往分类于短杆菌属，但现在也包含统一于棒状杆菌属的细菌(Int.J.Syst.，Bacteriol.，(1981)41,p.225)。另外，也包含与棒状杆菌属非常亲缘的短杆菌属细菌。作为这样的棒状型细菌的例子，可列举嗜乙酰乙酸棒状杆菌(Corynebacterium acetoacidophylum)、醋谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumacetoglutamicum)、解烷棒状杆菌(Corynebacterium alkanolyticum)、帚石南棒状杆菌(Corynebacterium callunae)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、百合棒状杆菌(Corynebacterium lilium)、栖糖蜜棒状杆菌(Corynebacterium mellassecola)、嗜热产氨棒状杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)、有效棒状杆菌(Corynebacterium efficiens)、力士棒状杆菌(Corynebacterium herculis)、叉开短杆菌(Brevivacterium divaricatum)、黄色短杆菌(Brevivacterium flavum)、ブレビバクテリウム·インマリオフィルム(Brevivacterium immariophilum)、乳糖发酵短杆菌(Brevivacterium lactofermentum)、玫瑰色短杆菌(Brevivacterium roseum)、解糖短杆菌(Brevivacterium saccharolyticum)、产硫短杆菌(Brevivacterium thiogenitalis)、产氨棒状杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、白短杆菌(Brevivacterium album)、蜡黄短杆菌(Brevivacterium cerinum)、嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)。
实施例
以下举出实施例对本发明进行具体说明。但是，本发明不受这些实施例限定。
(参考例1)用于乙醇发酵评价试验的酵母制备(Saccaromyces cereveciae)
作为乙醇发酵微生物，使用酿酒酵母(Saccaromyces cereveciae)(红酒用酵母OC2株、NBRC2260)。将YPD培养基(将胨、酵母提取物浓缩液和葡萄糖浓缩液分别进行121℃、20分钟高压灭菌器杀菌，调制成胨20g/L、酵母提取物10g/L葡萄糖10g/L而得的培养基)2mL加入试验管中，在超净工作台内，使用铂环接种用YPD琼脂培养基平板培养(30℃、1～2天)而形成的酵母的集落。将其使用振荡装置(TAITEC社制、BIO-SHAKER BR-40LF)以倾斜50度、30℃、120rpm往复振荡培养24小时，得到预培养液。将预培养液以15,000×g、5分钟、4℃进行离心分离，除去上清后，悬浮在生理盐水2mL中，得到OD7.5的预培养菌体液。
(参考例2)糖、乙醇浓度的测定
糖液所含的葡萄糖和木糖浓度、以及发酵生产的乙醇浓度在下述所示的HPLC条件下通过与标准品的比较来定量。
柱：Shodex SH1011(昭和电工株式会社制)
移动相：硫酸5mM(流速0.6mL/分钟)
反应液：无
检测方法：RI(差示折射率)
温度：65℃。
(实施例1)葡萄糖组合物的制作和乙醇发酵生产
以葡萄糖(和光纯药株式会社制、D(+)葡萄糖)100g/L、乙酸(和光纯药株式会社制、试剂特级99.7％)0.1g/L、香豆酸(东京化成株式会社制、反式对香豆酸)0.15g/L、阿魏酸(东京化成株式会社制、反式阿魏酸)0.007g/L的方式溶解于纯水中，制作葡萄糖组合物。此外，香豆酸、阿魏酸在酸性条件下不溶解，因此使用6N氢氧化钠水溶液制备pH8的各1g/L的浓缩液，通过稀释该浓缩液来制备。另外，葡萄糖组合物使用6N氢氧化钠调制成最终pH为7。
在制作的葡萄糖组合物9mL中，作为氮源加入20％CSL(王子コーンスターチ株式会社制，用1N NaOH调制成pH5后，用平均细孔径0.45μm的过滤器灭菌)溶液1mL，接种参考例1中记载的预培养菌体使得初期OD0.5。将其以倾斜50度、30℃、120rpm往复振荡培养144小时。每隔约24小时进行取样，分析糖浓度、乙醇浓度，计算出最大发酵速度、发酵收率对理论比(乙醇的理论收率为0.51g/g-消耗全糖时的对理论比)。另外，作为微生物增殖能力的评价，测定培养48小时后的培养液的OD(OD600)。结果示于表1。
(实施例2)葡萄糖组合物的制作和乙醇发酵生产
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖(和光纯药株式会社制、D(+)木糖)0.7g/L、乙酸0.1g/L、香豆酸0.15g/L、阿魏酸0.007g/L，除此以外，进行与实施例1同样的操作。结果示于表1。
(实施例3)葡萄糖组合物的制作和乙醇发酵生产
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖22.3g/L、乙酸1g/L、香豆酸0.5g/L、阿魏酸0.06g/L，除此以外，进行与实施例1同样的操作。结果示于表1。
(实施例4)葡萄糖组合物的制作和乙醇发酵生产
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖25g/L、乙酸10g/L、香豆酸2g/L、阿魏酸0.28g/L，除此以外，进行与实施例1同样的操作。结果示于表1。
(比较例1)葡萄糖组合物的乙醇发酵生产比较例
使制作的葡萄糖组合物为仅葡萄糖100g/L，除此以外，进行与实施例1同样的操作。结果示于表1。
(比较例2)葡萄糖组合物的乙醇发酵生产比较例
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖22.3g/L、乙酸15g/L、香豆酸0.5g/L、阿魏酸0.06g/L，除此以外，进行与实施例1同样的操作。结果示于表1。
(比较例3)葡萄糖组合物的乙醇发酵生产比较例
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖22.3g/L、不添加乙酸、香豆酸0.5g/L、阿魏酸0.06g/L，除此以外，进行与实施例1同样的操作。结果示于表1。
(比较例4)葡萄糖组合物的乙醇发酵生产比较例
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖22.3g/L、乙酸1g/L、香豆酸3.0g/L、阿魏酸0.06g/L，除此以外，进行与实施例1同样的操作。结果示于表1。
(比较例5)葡萄糖组合物的乙醇发酵生产比较例
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖22.3g/L、乙酸1g/L、不添加香豆酸、阿魏酸0.06g/L，除此以外，进行与实施例1同样的操作。结果示于表1。
(比较例6)葡萄糖组合物的乙醇发酵生产比较例
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖22.3g/L、乙酸1g/L、香豆酸0.5g/L、阿魏酸0.4g/L，除此以外，进行与实施例1同样的操作。结果示于表1。
(比较例7)葡萄糖组合物的乙醇发酵生产比较例
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖22.3g/L、乙酸1g/L、香豆酸0.5g/L、不添加阿魏酸，除此以外，进行与实施例1同样的操作。结果示于表1。
(比较例8)葡萄糖组合物的乙醇发酵生产比较例
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖50g/L、乙酸1g/L、香豆酸0.5g/L、阿魏酸0.06g/L，除此以外，进行与实施例1同样的操作。结果示于表1。
表1：以各葡萄糖组合物作为发酵原料的乙醇发酵试验结果
(参考例3)来源于丝状菌的纤维素酶(培养液)的制备方法
来源于丝状菌的纤维素酶(培养液)通过以下方法制备。
[预培养]
以玉米浸渍液(CSL)5％(w/vol)、葡萄糖2％(w/vol)、酒石酸铵0.37％(w/vol)、硫酸铵0.14(w/vol)、磷酸二氢钾0.2％(w/vol)、氯化钙二水合物0.03％(w/vol)、硫酸镁七水合物0.03％(w/vol)、氯化锌0.02％(w/vol)、氯化铁(III)六水合物0.01％(w/vol)、硫酸铜(II)五水合物0.004％(w/vol)、氯化锰四水合物0.0008％(w/vol)、硼酸0.0006％(w/vol)、七钼酸六铵四水合物0.0026％(w/vol)的方式添加至蒸馏水中，将100mL加入500mL带挡板的三角烧瓶中，在121℃的温度高压釜灭菌15分钟。放冷后，添加与其分别在121℃的温度高压釜灭菌15分钟后的PE-M和Tween80各0.01％(w/vol)。在该预培养培养基中接种里氏木霉ATCC68589 1×105个/mL，以28℃的温度、72小时、180转/分钟振荡培养，作为预培养(振荡装置：TAITEC社制BIO-SHAKER BR-40LF)。
[主培养]
以玉米浸渍液(CSL)5％(w/vol)、葡萄糖2％(w/vol)、纤维素(旭化成ケミカルズ社制、商品名：アビセル(艾维素))10％(w/vol)、酒石酸铵0.37％(w/vol)、硫酸铵0.14％(w/vol)、磷酸二氢钾0.2％(w/vol)、氯化钙二水合物0.03％(w/vol)、硫酸镁七水合物0.03％(w/vol)、氯化锌0.02％(w/vol)、氯化铁(III)六水合物0.01％(w/vol)、硫酸铜(II)五水合物0.004％(w/vol)、氯化锰四水合物0.0008％(w/vol)、硼酸0.0006％(w/vol)、七钼酸六铵四水合物0.0026％(w/vol)的方式添加至蒸馏水中，将2.5L加入5L容量的搅拌广口瓶(ABLE社制DPC-2A)容器中，在121℃的温度高压釜灭菌15分钟。放冷后，添加与其分别在121℃的温度高压釜灭菌15分钟后的PE-M和Tween80各0.1％，接种250mL预先通过上述的方法在液体培养基中进行了预培养的里氏木霉ATCC66589 250mL。然后，在28℃的温度以87小时、300rpm、通气量1vvm的条件进行振荡培养，离心分离后，将上清进行膜过滤(ミリポア社制的ステリカップ-GV材质：PVDF)。将该在上述条件下制备的培养液作为来源于丝状菌的纤维素酶，在以下的实施例中使用。
(参考例4)纤维素酶浓度的测定
水溶液中的纤维素酶浓度以通过Bradford法测定的酶液中的蛋白质浓度(mg/mL)的值作为基准。蛋白质的浓度使用利用Bradford法的测定试剂盒(Quick Start BradfordProtein Assay、Bio-Rad社制)进行测定。
(实施例5)以含纤维素生物质作为原料的葡萄糖组合物的制作和乙醇发酵生产
相对于甘蔗渣干重1kg，以生物质加入量5％混合30g的苛性钠，90℃使其反应3小时，制作碱处理甘蔗渣。将碱处理甘蔗渣通过螺旋压榨机进行固液分离，得到含水率60％的固液分离固体。
将所得的固液分离固体以固体成分浓度5％进行再次悬浮，用参考例3中制作的来源于丝状菌的纤维素酶通过参考例4所示的测定以蛋白量8mg/g-甘蔗渣进行水解，得到葡萄糖组合物糖化液。作为水解条件，为40℃、pH7.0、反应时间24小时。所得的葡萄糖组合物糖化液通过螺旋沉降机除去固体成分，将回收的葡萄糖组合物糖液使用孔径0.22μm的精密过滤膜进行总量过滤后，进一步将所得的透过液进行利用超滤膜的过滤处理。超滤膜使用TMUS10k(Toray Membrane USA社制、材质：聚-1,1-二氟乙烯、截留分子量:10,000)。超滤使用平膜过滤单元“SEPA-II”(GEオスモニクス制)，在膜面线速度20cm/秒、过滤压3MPa的条件下进行过滤处理直至从非透过侧回收的液量为0.6L，在透过侧得到葡萄糖组合物糖化液。
将所得的葡萄糖组合物糖化液进行利用分离膜(Synder社制、NFW(材质：哌嗪聚酰胺、截留分子量300～500))的过滤处理。过滤处理在膜面线速度20cm/秒、过滤压3MPa的条件下进行过滤处理直至非透过侧的浓缩倍率为12倍，在透过侧得到葡萄糖组合物。
将所得的葡萄糖组合物用蒸发器浓缩，制作葡萄糖100g/L、木糖22.3g/L、乙酸1.0g/L、香豆酸(反式对香豆酸)0.5g/L、阿魏酸0.06g/L、用1cm宽的样品池测定时在280nm具有吸收的物质为以吸光度(ABS)128定义的浓度的葡萄糖组合物。另外，葡萄糖组合物使用6N氢氧化钠调制成最终pH为7。
在制作的葡萄糖组合物9mL中，作为氮源加入20％玉米浆(Corn Steep Liquor)(CSL)(王子コーンスターチ株式会社制，用1N NaOH调制成pH5后，用平均细孔径0.45μm的过滤器灭菌)溶液1mL，接种参考例1中记载的预培养菌体(酿酒酵母(红酒用酵母OC2株、NBRC2260))使得初期OD0.5。将其以倾斜50度、30℃、120rpm往复振荡培养144小时。每隔约24小时进行取样，分析糖浓度、乙醇浓度，求出最大发酵速度、发酵收率对理论比。另外，作为微生物增殖能力的评价，测定培养48小时后的培养液的OD(OD600)。结果示于表2。
(实施例6)以含纤维素生物质作为原料的葡萄糖组合物的制作和乙醇发酵生产
使分离膜为东丽株式会社制的UTC-60(材质：哌嗪聚酰胺、截留分子量200～250)，除此以外，进行与实施例5同样的操作，制作葡萄糖100g/L、木糖22.3g/L、乙酸1.0g/L、香豆酸0.5g/L、阿魏酸0.06g/L、用1cm宽的样品池测定时在280nm具有吸收的物质为以吸光度(ABS)12定义的浓度的葡萄糖组合物。对于制作的葡萄糖组合物，与实施例5同样地进行乙醇发酵生产。结果示于表2。
(实施例7)以含纤维素生物质作为原料的葡萄糖组合物的制作和乙醇发酵生产
使分离膜为东丽株式会社制的UTC-60，除此以外，进行与实施例5同样的操作，在作为透过液得到的葡萄糖组合物中以体积比为1/800添加碱处理甘蔗渣的固液分离液体，用蒸发器浓缩，从而制作葡萄糖100g/L、木糖22.3g/L、乙酸1.0g/L、香豆酸0.5g/L、阿魏酸0.06g/L、用1cm宽的样品池测定时在280nm具有吸收的物质为以吸光度(ABS)20定义的浓度的葡萄糖组合物。另外，葡萄糖组合物使用6N盐酸调制成最终pH为7。对于制作的葡萄糖组合物，与实施例5同样地进行乙醇发酵生产。结果示于表2。
(实施例8)以含纤维素生物质作为原料的葡萄糖组合物的制作和乙醇发酵生产
使分离膜为Synder社的NDX(材质：哌嗪聚酰胺、截留分子量800～1,000)，除此以外，进行与实施例5同样的操作，制作葡萄糖100g/L、木糖22.3g/L、乙酸1.0g/L、香豆酸(反式对香豆酸)0.5g/L、阿魏酸0.06g/L、用1cm宽的样品池测定时在280nm具有吸收的物质为以吸光度(ABS)350定义的浓度的葡萄糖组合物。对于制作的葡萄糖组合物，与实施例5同样地进行乙醇发酵生产。结果示于表2。
(实施例9)以含纤维素生物质作为原料的葡萄糖组合物的制作和乙醇生产
使分离膜为GE的GH系列(材质：聚乙二醇、截留分子量2,500)，除此以外，进行与实施例5同样的操作，制作葡萄糖100g/L、木糖22.3g/L、乙酸1.0g/L、香豆酸0.5g/L、阿魏酸0.06g/L、用1cm宽的样品池测定时在280nm具有吸收的物质为以吸光度(ABS)1,040定义的浓度的葡萄糖组合物。另外，葡萄糖组合物使用6N盐酸调制成最终pH为7。对于制作的葡萄糖组合物，与实施例5同样地进行乙醇发酵生产。结果示于表2。
表2：以各葡萄糖组合物作为发酵原料的乙醇发酵试验结果
(参考例5)用于乳酸发酵评价试验的乳酸菌的制备
作为乳酸发酵微生物，使用凝结芽孢杆菌(Bacillus Coagulans)NBRC12583株。将MRS培养基2mL加入试验管中，在超净工作台内，使用铂环接种MRS琼脂平板培养(42℃、1～2天)而形成的Bacillus Coagulans的集落。将其使用振荡装置(TAITEC社制、BIO-SHAKERBR-40LF)以倾斜50度、42℃、120rpm往复振荡培养24小时，得到预培养液。将预培养液以15,000×g、5分钟、4℃进行离心分离，除去上清后，悬浮于生理盐水2mL中，得到OD2.8的预培养菌体液。
(参考例6)乳酸、琥珀酸浓度的测定
糖液所含的乳酸和琥珀酸浓度在下述所示的HPLC条件下通过与标准品的比较来定量。
柱：Shim-Pack SPR-H(株式会社岛津制作所制)
移动相：对甲苯磺酸盐5mM(流速0.8mL/分钟)
反应液：对甲苯磺酸盐5mM、Bis-Tris20mM、EDTA·2Na 0.1mM(流速0.8mL/分钟)
检测方法：电导率
温度：45℃。
(实施例10)葡萄糖组合物的制作和乳酸发酵生产
以葡萄糖(和光纯药株式会社制、D(+)葡萄糖)100g/L、乙酸(和光纯药株式会社制、试剂特级99.7％)0.2g/L、香豆酸(东京化成株式会社制、反式对香豆酸)0.3g/L、阿魏酸(东京化成株式会社制、反式阿魏酸)0.014g/L的方式溶解于纯水中，制作葡萄糖组合物。此外，香豆酸、阿魏酸在酸性条件下不溶解，因此使用6N氢氧化钠水溶液制备pH8的各1g/L的浓缩液，通过稀释该浓缩液来制备。另外，葡萄糖组合物使用6N氢氧化钠调制成最终pH为7。
在制作的葡萄糖组合物4.5mL中，作为氮源等副原料，添加以终浓度换算为酵母提取物10g/L、硫酸铵1g/L、磷酸氢二钾0.4g/L、碳酸钙20g/L的方式溶解而成的浓缩液5.5mL，接种1％的参考例5中记载的预培养菌体液。将其在42℃静置培养144小时。每隔约24小时进行取样，通过参考例2、参考例6所述的方法分析糖浓度、乳酸浓度，求出最大发酵速度、发酵收率对理论比(乳酸的理论收率为1.0g/g-消耗全糖时的对理论比)。另外，作为微生物增殖能力的评价，测定培养48小时后的培养液的OD(OD600)。结果示于表3。
(实施例11)葡萄糖组合物的制作和乳酸发酵生产
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖(和光纯药株式会社制、D(+)木糖)1.4g/L、乙酸0.2g/L、香豆酸0.3g/L、阿魏酸0.014g/L，除此以外，进行与实施例10同样的操作。结果示于表3。
(实施例12)葡萄糖组合物的制作和乳酸发酵生产
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖22.3g/L、乙酸1g/L、香豆酸0.5g/L、阿魏酸0.06g/L，除此以外，进行与实施例10同样的操作。结果示于表3。
(实施例13)葡萄糖组合物的制作和乳酸发酵生产
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖25g/L、乙酸4g/L、香豆酸0.8g/L、阿魏酸0.14g/L，除此以外，进行与实施例10同样的操作。结果示于表3。
(比较例9)葡萄糖组合物的乳酸发酵生产比较例
使制作的葡萄糖组合物为仅葡萄糖100g/L，除此以外，进行与实施例10同样的操作。结果示于表3。
(比较例10)葡萄糖组合物的乳酸发酵比较例
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖22.3g/L、乙酸15g/L、香豆酸0.5g/L、阿魏酸0.06g/L，除此以外，进行与实施例10同样的操作。结果示于表3。
(比较例11)葡萄糖组合物的乳酸发酵比较例
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖22.3g/L、不添加乙酸、香豆酸0.5g/L、阿魏酸0.06g/L，除此以外，进行与实施例10同样的操作。结果示于表3。
(比较例12)葡萄糖组合物的乳酸发酵比较例
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖22.3g/L、乙酸1g/L、香豆酸3g/L、阿魏酸0.06g/L，除此以外，进行与实施例10同样的操作。结果示于表3。
(比较例13)葡萄糖组合物的乳酸发酵比较例
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖22.3g/L、乙酸1g/L、不添加香豆酸、阿魏酸0.06g/L，除此以外，进行与实施例10同样的操作。结果示于表3。
(比较例14)葡萄糖组合物的乳酸发酵比较例
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖22.3g/L、乙酸1g/L、香豆酸0.5g/L、阿魏酸0.4g/L，除此以外，进行与实施例10同样的操作。结果示于表3。
(比较例15)葡萄糖组合物的乳酸发酵比较例
使制作的葡萄糖组合物为相对于葡萄糖100g/L，木糖22.3g/L、乙酸1g/L、香豆酸0.5g/L、不添加阿魏酸，除此以外，进行与实施例10同样的操作。结果示于表3。
(比较例16)葡萄糖组合物的乳酸发酵比较例
使制作的葡萄糖组合物为相对于葡萄糖100g/L，木糖50g/L、乙酸1g/L、香豆酸0.5g/L、阿魏酸0.06g/L，除此以外，进行与实施例10同样的操作。结果示于表3。
表3：以各葡萄糖组合物作为发酵原料的乳酸发酵试验结果
(实施例14)以含纤维素生物质作为原料的葡萄糖组合物的制作和乳酸发酵生产
使用实施例5中制作的葡萄糖组合物，与实施例10同样地进行乳酸发酵。结果示于表4。
(实施例15)以含纤维素生物质作为原料的葡萄糖组合物的制作和乳酸发酵生产
使用实施例6中制作的葡萄糖组合物，与实施例10同样地进行乳酸发酵。结果示于表4。
(实施例16)以含纤维素生物质作为原料的葡萄糖组合物的制作和乳酸发酵生产
使用实施例7中制作的葡萄糖组合物，与实施例10同样地进行乳酸发酵。结果示于表4。
(实施例17)以含纤维素生物质作为原料的葡萄糖组合物的制作和乳酸发酵生产
使用实施例8中制作的葡萄糖组合物，与实施例10同样地进行乳酸发酵。结果示于表4。
(实施例18)以含纤维素生物质作为原料的葡萄糖组合物的制作和乳酸发酵生产
使用实施例9中制作的葡萄糖组合物，与实施例10同样地进行乳酸发酵。结果示于表4。
表4：以各葡萄糖组合物作为发酵原料的乳酸发酵试验结果
(参考例7)用于琥珀酸发酵评价试验的琥珀酸发酵菌制备
作为琥珀酸发酵微生物使用产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus Succinogenes)ATCC55618株。将由Triptic Soy Broth(和光纯药株式会社制)制成的培养基加入合计5支试验管中，每支各2mL，在超净工作台内，接种Actinobacillus Succinogenes的甘油贮存液0.2mL。将其使用振荡装置(TAITEC社制、BIO-SHAKER BR-40LF)以倾斜50度、37℃、120rpm往复振荡培养24小时，得到预培养液计10mL。将预培养液以15,000×g、5分钟、4℃进行离心分离，除去上清后，悬浮于生理盐水1mL中，得到OD8.0的预培养菌体液。
(实施例19)葡萄糖组合物的制作和琥珀酸发酵生产
以葡萄糖(和光纯药株式会社制、D(+)葡萄糖)100g/L、乙酸(和光纯药株式会社制、试剂特级99.7％)0.2g/L、香豆酸(东京化成株式会社制、反式对香豆酸)0.3g/L、阿魏酸(东京化成株式会社制、反式阿魏酸)0.014g/L的方式溶解于纯水中，制作葡萄糖组合物。此外，香豆酸、阿魏酸在酸性条件下不溶解，因此使用6N氢氧化钠水溶液制备pH8的各1g/L的浓缩液，通过稀释该浓缩液来制备。另外，葡萄糖组合物使用6N氢氧化钠调制成最终pH为7。
在制作的葡萄糖组合物4.5mL中，作为氮源等副原料，添加以终浓度换算为BactoTMYeast Extract(日本ベクトン·ディッキンソン株式会社制)16g/L、玉米浆(Corn SteepLiquor)(CSL)(王子コーンスターチ株式会社制)12g/L、磷酸二氢钾3g/L、磷酸氢二钾1.5g/L、氯化钠1g/L、氯化镁六水合物0.64g/L、氯化钙0.3g/L、碳酸镁40g/L的方式溶解而得的浓缩液5.5mL，接种0.2mL的参考例7中记载的预培养液。将其在37℃静置培养144小时。每隔约24小时进行取样，通过参考例2、参考例6所述的方法分析糖浓度、琥珀酸浓度，求出最大发酵速度、发酵收率对理论比(琥珀酸的理论收率为0.66g/g-消耗全糖时的对理论比)。另外，作为微生物增殖能力的评价，测定培养48小时后的培养液的OD(OD600)。结果示于表5。
(实施例20)葡萄糖组合物的制作和琥珀酸发酵生产
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖1.4g/L、乙酸0.2g/L、香豆酸0.3g/L、阿魏酸0.014g/L，除此以外，进行与实施例19同样的操作。结果示于表5。
(实施例21)葡萄糖组合物的制作和琥珀酸发酵生产
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖22.3g/L、乙酸1.0g/L、香豆酸0.5g/L、阿魏酸0.06g/L，除此以外，进行与实施例19同样的操作。结果示于表5。
(实施例22)葡萄糖组合物的制作和琥珀酸发酵生产
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖25.0g/L、乙酸4g/L、香豆酸0.8g/L、阿魏酸0.14g/L，除此以外，进行与实施例19同样的操作。结果示于表5。
(比较例17)葡萄糖组合物的琥珀酸发酵生产比较例
使制作的葡萄糖组合物为仅葡萄糖100g/L，除此以外，进行与实施例19同样的操作。结果示于表5。
(比较例18)葡萄糖组合物的琥珀酸发酵生产比较例
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖22.3g/L、乙酸15g/L、香豆酸0.5g/L、阿魏酸0.06g/L，除此以外，进行与实施例19同样的操作。结果示于表5。
(比较例19)葡萄糖组合物的琥珀酸发酵生产比较例
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖22.3g/L、不添加乙酸、香豆酸0.5g/L、阿魏酸0.06g/L，除此以外，进行与实施例19同样的操作。结果示于表5。
(比较例20)葡萄糖组合物的琥珀酸发酵生产比较例
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖22.3g/L、乙酸1.0g/L、香豆酸3.0g/L、阿魏酸0.06g/L，除此以外，进行与实施例19同样的操作。结果示于表5。
(比较例21)葡萄糖组合物的琥珀酸发酵生产比较例
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖22.3g/L、乙酸1.0g/L、不添加香豆酸、阿魏酸0.06g/L，除此以外，进行与实施例19同样的操作。结果示于表5。
(比较例22)葡萄糖组合物的琥珀酸发酵生产比较例
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖22.3g/L、乙酸1.0g/L、香豆酸0.5g/L、阿魏酸0.4g/L，除此以外，进行与实施例19同样的操作。结果示于表5。
(比较例23)葡萄糖组合物的琥珀酸发酵生产比较例
使制作的葡萄糖组合物为相对于葡萄糖100g/L，木糖22.3g/L、乙酸1.0g/L、香豆酸0.5g/L、不添加阿魏酸，除此以外，进行与实施例19同样的操作。结果示于表5。
(比较例24)葡萄糖组合物的琥珀酸发酵生产比较例
使制作的葡萄糖组合物为相对于葡萄糖100g/L，木糖50g/L、乙酸1.0g/L、香豆酸0.5g/L、阿魏酸0.06g/L，除此以外，进行与实施例19同样的操作。结果示于表5。
表5：以各葡萄糖组合物作为发酵原料的琥珀酸发酵试验结果
(实施例23)以含纤维素生物质作为原料的葡萄糖组合物的制作和琥珀酸发酵生产
使用实施例5所示的葡萄糖组合物，与实施例19同样地进行琥珀酸发酵。结果示于表6。
(实施例24)以含纤维素生物质作为原料的葡萄糖组合物的制作和琥珀酸生产
使用实施例6所示的葡萄糖组合物，与实施例19同样地进行琥珀酸发酵。结果示于表6。
(实施例25)以含纤维素生物质作为原料的葡萄糖组合物的制作和琥珀酸生产
使用实施例7所示的葡萄糖组合物，与实施例19同样地进行琥珀酸发酵。结果示于表6。
(实施例26)以含纤维素生物质作为原料的葡萄糖组合物的制作和琥珀酸生产
使用实施例8所示的葡萄糖组合物，与实施例19同样地进行琥珀酸发酵。结果示于表6。
(实施例27)以含纤维素生物质作为原料的葡萄糖组合物的制作和琥珀酸生产
使用实施例9所示的葡萄糖组合物，与实施例19同样地进行琥珀酸发酵。结果示于表6。
表6：以各葡萄糖组合物作为发酵原料的琥珀酸发酵试验结果
(参考例8)用于氨基酸发酵评价试验的尸胺发酵菌制备
作为生产尸胺的微生物，使用日本特开2004-222569号公报所记载的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium gulutamicum)TR-CAD1株，对同化葡萄糖的尸胺发酵进行研究。
将所述TR-CAD1株与葡萄糖45g/L、柠檬酸1g/L、尿素15g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、L-苏氨酸0.8g/L、L-甲硫氨酸0.6g/L、L-亮氨酸1.5g/L、硫酸铁七水合物6mg/L、硫酸锰一水合物4.2g/L、生物素1mg/L、硫胺素2mg/L、卡那霉素25μg/mL的培养基100mL一起接种于试验管，振荡培养一夜(预培养)。从预培养液中通过离心分离回收谷氨酸棒状杆菌TR-CAD1株，用灭菌水15mL充分洗涤，得到OD5的预培养液。
(参考例9)赖氨酸、尸胺浓度的测定
糖液所含的赖氨酸、尸胺浓度在下述所示的HPLC条件下通过与标准品的比较来定量。
柱：CAPCELL PAK C18(株式会社资生堂制)
移动相：(0.1％磷酸水溶液:乙腈)＝(4.5:5.5)
样品前处理：在分析样品25μL中作为内标，添加混合1,4-二氨基丁烷(0.03M)25μL、碳酸氢钠(0.075M)150μL和2,4-二硝基氟苯(0.2M)的乙醇溶液，在37℃的温度保温1小时。将上述反应溶液50μL溶解于1mL乙腈后，将以10,000rpm离心5分钟后的上清10μL用HPLC进行分析。
检测方法：UV360nm。
(实施例28)葡萄糖组合物的制作和尸胺发酵生产
以葡萄糖(和光纯药株式会社制、D(+)葡萄糖)100g/L、乙酸(和光纯药株式会社制、试剂特级99.7％)0.2g/L、香豆酸(东京化成株式会社制、反式对香豆酸)0.3g/L、阿魏酸(东京化成株式会社制、反式阿魏酸)0.014g/L的方式溶解于纯水中，制作葡萄糖组合物。此外，香豆酸、阿魏酸在酸性条件下不溶解，因此使用6N氢氧化钠水溶液制备pH8的各1g/L的浓缩液，通过稀释该浓缩液来制备。另外，葡萄糖组合物使用6N氢氧化钠调制成最终pH为7。
在制作的葡萄糖组合物4.5mL中，作为副原料添加以终浓度换算为柠檬酸1g/L、尿素15g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、L-苏氨酸0.8g/L、L-甲硫氨酸0.6g/L、L-亮氨酸1.5g/L、硫酸铁七水合物6mg/L、硫酸锰一水合物4.2g/L、生物素1mg/L、硫胺素2mg/L的方式溶解而得的浓缩液5.5mL，接种参考例8中记载的预培养液0.2mL。将其在37℃振荡培养48小时。每隔约12小时进行取样，通过参考例2、参考例9所述的方法分析糖浓度、尸胺浓度，求出最大发酵速度、发酵收率对消耗葡萄糖比。另外，作为微生物增殖能力的评价，测定培养48小时后的培养液的OD(OD600)。结果示于表7。
(实施例29)葡萄糖组合物的制作和尸胺发酵生产
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖1.4g/L、乙酸0.2g/L、香豆酸0.3g/L、阿魏酸0.014g/L，除此以外，进行与实施例28同样的操作。结果示于表7。
(实施例30)葡萄糖组合物的制作和尸胺发酵生产
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖22.3g/L、乙酸1.0g/L、香豆酸0.5g/L、阿魏酸0.06g/L，除此以外，进行与实施例28同样的操作。结果示于表7。
(实施例31)葡萄糖组合物的制作和尸胺发酵生产
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖25.0g/L、乙酸4g/L、香豆酸0.8g/L、阿魏酸0.14g/L，除此以外，进行与实施例28同样的操作。结果示于表7。
(比较例25)葡萄糖组合物的尸胺发酵生产比较例
使制作的葡萄糖组合物为仅葡萄糖100g/L，除此以外，进行与实施例28同样的操作。结果示于表7。
(比较例26)葡萄糖组合物的尸胺发酵生产比较例
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖22.3g/L、乙酸15g/L、香豆酸0.5g/L、阿魏酸0.06g/L，除此以外，进行与实施例28同样的操作。结果示于表7。
(比较例27)葡萄糖组合物的尸胺发酵生产比较例
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖22.3g/L、不添加乙酸、香豆酸0.5g/L、阿魏酸0.06g/L，除此以外，进行与实施例28同样的操作。结果示于表7。
(比较例28)葡萄糖组合物的尸胺发酵生产比较例
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖22.3g/L、乙酸1.0g/L、香豆酸3.0g/L、阿魏酸0.06g/L，除此以外，进行与实施例28同样的操作。结果示于表7。
(比较例29)葡萄糖组合物的尸胺发酵生产比较例
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖22.3g/L、乙酸1.0g/L、不添加香豆酸、阿魏酸0.06g/L，除此以外，进行与实施例28同样的操作。结果示于表7。
(比较例30)葡萄糖组合物的尸胺发酵生产比较例
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖22.3g/L、乙酸1.0g/L、香豆酸0.5g/L、阿魏酸0.4g/L，除此以外，进行与实施例28同样的操作。结果示于表7。
(比较例31)葡萄糖组合物的尸胺发酵生产比较例
使制作的葡萄糖组合物为相对于葡萄糖100g/L，木糖22.3g/L、乙酸1.0g/L、香豆酸0.5g/L、不添加阿魏酸，除此以外，进行与实施例28同样的操作。结果示于表7。
(比较例32)葡萄糖组合物的尸胺发酵生产比较例
使制作的葡萄糖组合物为相对于葡萄糖100g/L，木糖50g/L、乙酸1.0g/L、香豆酸0.5g/L、阿魏酸0.06g/L，除此以外，进行与实施例28同样的操作。结果示于表7。
表7：以各葡萄糖组合物作为发酵原料的尸胺发酵试验结果
(实施例32)以含纤维素生物质作为原料的葡萄糖组合物的制作和尸胺发酵生产
使用实施例5所示的葡萄糖组合物，与实施例28同样地进行尸胺发酵。结果示于表8。
(实施例33)以含纤维素生物质作为原料的葡萄糖组合物的制作和尸胺发酵生产
使用实施例6所示的葡萄糖组合物，与实施例28同样地进行尸胺发酵。结果示于表8。
(实施例34)以含纤维素生物质作为原料的葡萄糖组合物的制作和尸胺发酵生产
使用实施例7所示的葡萄糖组合物，与实施例28同样地进行尸胺发酵。结果示于表8。
(实施例26)以含纤维素生物质作为原料的葡萄糖组合物的制作和尸胺发酵生产
使用实施例8所示的葡萄糖组合物，与实施例28同样地进行尸胺发酵。结果示于表8。
(实施例27)以含纤维素生物质作为原料的葡萄糖组合物的制作和尸胺发酵生产
使用实施例9所示的葡萄糖组合物，与实施例28同样地进行尸胺发酵。结果示于表8。
表8：以各葡萄糖组合物作为发酵原料的尸胺发酵试验结果
(参考例10)用于氨基酸发酵评价试验的赖氨酸发酵菌制备
为了制作能够合成赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌，通过对赖氨酸生物合成基因进行有效突变导入而制作赖氨酸生产菌。通过Apppl.Microbiol.Biotechnol.，(2002)，58，p.217-223所述的方法制作谷氨酸棒状杆菌AK-1(以下简称为AK-1株)株。本菌株解除了由赖氨酸和苏氨酸造成的反馈抑制。因此通过培养能够合成赖氨酸。使用AK-1株，对同化葡萄糖的赖氨酸的发酵进行研究。
将AK-1株与葡萄糖45g/L、柠檬酸1g/L、尿素15g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、L-苏氨酸0.8g/L、L-甲硫氨酸0.6g/L、L-亮氨酸1.5g/L、硫酸铁七水合物6mg/L、硫酸锰一水合物4.2g/L、生物素1mg/L、硫胺素2mg/L、卡那霉素25μg/mL的培养基100mL一起接种于试验管，振荡培养一夜(预培养)。由预培养液通过离心分离回收AK-1株，用灭菌水15mL进行充分洗涤，得到OD5的预培养液。
(实施例37)葡萄糖组合物的制作和赖氨酸发酵生产
以葡萄糖(和光纯药株式会社制、D(+)葡萄糖)100g/L、乙酸(和光纯药株式会社制、试剂特级99.7％)0.2g/L、香豆酸(东京化成株式会社制、反式对香豆酸)0.3g/L、阿魏酸(东京化成株式会社制、反式阿魏酸)0.014g/L的方式溶解于纯水中，制作葡萄糖组合物。此外，香豆酸、阿魏酸在酸性条件下不溶解，因此使用6N氢氧化钠水溶液制备pH8的各1g/L的浓缩液，通过稀释该浓缩液来制备。另外，葡萄糖组合物使用6N氢氧化钠调制成最终pH为7。
在制作的葡萄糖组合物4.5mL中，作为副原料添加以终浓度换算为柠檬酸1g/L、尿素15g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、L-苏氨酸0.8g/L、L-甲硫氨酸0.6g/L、L-亮氨酸1.5g/L、硫酸铁七水合物6mg/L、硫酸锰一水合物4.2g/L、生物素1mg/L、硫胺素2mg/L的方式溶解而得的浓缩液5.5mL，接种参考例10中记载的预培养液0.2mL。将其在37℃振荡培养48小时。每隔约12小时进行取样，通过参考例2、参考例9所述的方法分析糖浓度、赖氨酸浓度，求出最大发酵速度、发酵收率对消耗葡萄糖比。另外，作为微生物增殖能力的评价，测定培养48小时后的培养液的OD(OD600)。结果示于表9。
(实施例38)葡萄糖组合物的制作和赖氨酸发酵生产
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖1.4g/L、乙酸0.2g/L、香豆酸0.3g/L、阿魏酸0.014g/L，除此以外，进行与实施例37同样的操作。结果示于表9。
(实施例39)葡萄糖组合物的制作和赖氨酸发酵生产
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖22.3g/L、乙酸1.0g/L、香豆酸0.5g/L、阿魏酸0.06g/L，除此以外，进行与实施例37同样的操作。结果示于表9。
(实施例40)葡萄糖组合物的制作和赖氨酸发酵生产
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖25.0g/L、乙酸4g/L、香豆酸0.8g/L、阿魏酸0.14g/L，除此以外，进行与实施例37同样的操作。结果示于表9。
(比较例33)葡萄糖组合物的赖氨酸发酵生产比较例
使制作的葡萄糖组合物为仅葡萄糖100g/L，除此以外，进行与实施例37同样的操作。结果示于表9。
(比较例34)葡萄糖组合物的赖氨酸发酵生产比较例
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖22.3g/L、乙酸15g/L、香豆酸0.5g/L、阿魏酸0.06g/L，除此以外，进行与实施例37同样的操作。结果示于表9。
(比较例35)葡萄糖组合物的赖氨酸发酵生产比较例
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖22.3g/L、不添加乙酸、香豆酸0.5g/L、阿魏酸0.06g/L，除此以外，进行与实施例37同样的操作。结果示于表9。
(比较例36)葡萄糖组合物的赖氨酸发酵生产比较例
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖22.3g/L、乙酸1.0g/L、香豆酸3.0g/L、阿魏酸0.06g/L，除此以外，进行与实施例37同样的操作。结果示于表9。
(比较例37)葡萄糖组合物的赖氨酸发酵生产比较例
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖22.3g/L、乙酸1.0g/L、不添加香豆酸、阿魏酸0.06g/L，除此以外，进行与实施例37同样的操作。结果示于表9。
(比较例38)葡萄糖组合物的赖氨酸发酵生产比较例
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖22.3g/L、乙酸1.0g/L、香豆酸0.5g/L、阿魏酸0.4g/L，除此以外，进行与实施例37同样的操作。结果示于表9。
(比较例39)葡萄糖组合物的赖氨酸发酵生产比较例
使制作的葡萄糖组合物为相对于葡萄糖100g/L，木糖22.3g/L、乙酸1.0g/L、香豆酸0.5g/L、不添加阿魏酸，除此以外，进行与实施例37同样的操作。结果示于表9。
(比较例40)葡萄糖组合物的赖氨酸发酵生产比较例
使制作的葡萄糖组合物为相对于葡萄糖100g/L，木糖50g/L、乙酸1.0g/L、香豆酸0.5g/L、阿魏酸0.06g/L，除此以外，进行与实施例37同样的操作。结果示于表9。
表9：以各葡萄糖组合物作为发酵原料的赖氨酸发酵试验结果
(实施例41)以含纤维素生物质作为原料的葡萄糖组合物的制作和赖氨酸发酵生产
使用实施例5所示的葡萄糖组合物，与实施例37同样地进行赖氨酸发酵。结果示于表10。
(实施例42)以含纤维素生物质作为原料的葡萄糖组合物的制作和赖氨酸发酵生产
使用实施例6所示的葡萄糖组合物，与实施例37同样地进行赖氨酸发酵。结果示于表10。
(实施例43)以含纤维素生物质作为原料的葡萄糖组合物的制作和赖氨酸发酵生产
使用实施例7所示的葡萄糖组合物，与实施例37同样地进行赖氨酸发酵。结果示于表10。
(实施例44)以含纤维素生物质作为原料的葡萄糖组合物的制作和赖氨酸发酵生产
使用实施例8所示的葡萄糖组合物，与实施例37同样地进行赖氨酸发酵。结果示于表10。
(实施例45)以含纤维素生物质作为原料的葡萄糖组合物的制作和赖氨酸发酵生产
使用实施例9所示的葡萄糖组合物，与实施例37同样地进行赖氨酸发酵。结果示于表10。
表10：以各葡萄糖组合物作为发酵原料的赖氨酸发酵试验结果
(参考例11)用于乙醇发酵评价试验的酵母制备(Shizosaccharomyces pombe)
作为乙醇发酵微生物，使用粟酒裂殖酵母(Shizosaccharomyces pombe)NBRC1628株。将YPD培养基(将胨、酵母提取物浓缩液和葡萄糖浓缩液分别进行121℃、20分钟高压灭菌器杀菌，调制成胨20g/L、酵母提取物10g/L葡萄糖10g/L而得的培养基)2mL加入试验管中，在超净工作台内，使用铂环接种用YPD琼脂培养基平板培养(30℃、1～2天)而形成的酵母的集落。将其使用振荡装置(TAITEC社制、BIO-SHAKER BR-40LF)以倾斜50度、30℃、120rpm往复振荡培养24小时，得到预培养液。将预培养液以15,000×g、5分钟、4℃进行离心分离，除去上清后，悬浮于生理盐水2mL中，得到OD7.5的预培养菌体液。
(实施例46)葡萄糖组合物的制作和乙醇发酵生产
以葡萄糖(和光纯药株式会社制、D(+)葡萄糖)100g/L、乙酸(和光纯药株式会社制、试剂特级99.7％)0.1g/L、香豆酸(东京化成株式会社制、反式对香豆酸)0.15g/L、阿魏酸(东京化成株式会社制、反式阿魏酸)0.007g/L的方式溶解于纯水，制作葡萄糖组合物。此外，香豆酸、阿魏酸在酸性条件下不溶解，因此使用6N氢氧化钠水溶液制备pH8的各1g/L的浓缩液，通过稀释该浓缩液来制备。另外，葡萄糖组合物使用6N氢氧化钠调制成最终pH为7。
在制作的葡萄糖组合物9mL中，作为氮源加入20％CSL(王子コーンスターチ株式会社制，用1N NaOH调制成pH5后，用平均细孔径0.45μm的过滤器灭菌)溶液1mL，加入参考例11中记载的预培养菌体使得初期OD0.5。将其以倾斜50度、30℃、120rpm往复振荡培养144小时。每隔约24小时进行取样，分析糖浓度、乙醇浓度，求出最大发酵速度、发酵收率对理论比(乙醇的理论收率为0.51g/g-消耗全糖时的对理论比)。另外，作为微生物增殖能力的评价，测定培养48小时后的培养液的OD(OD600)。结果示于表11。
(实施例47)葡萄糖组合物的制作和乙醇发酵生产
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖0.7g/L、乙酸0.1g/L、香豆酸0.15g/L、阿魏酸0.007g/L，除此以外，进行与实施例46同样的操作。结果示于表11。
(实施例48)葡萄糖组合物的制作和乙醇发酵生产
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖22.3g/L、乙酸1.0g/L、香豆酸0.5g/L、阿魏酸0.06g/L，除此以外，进行与实施例46同样的操作。结果示于表11。
(实施例49)葡萄糖组合物的制作和乙醇发酵生产
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖25.0g/L、乙酸10g/L、香豆酸2.0g/L、阿魏酸0.28g/L，除此以外，进行与实施例46同样的操作。结果示于表11。
(比较例41)葡萄糖组合物的乙醇发酵生产比较例
使制作的葡萄糖组合物为仅葡萄糖100g/L，除此以外，进行与实施例46同样的操作。结果示于表11。
(比较例42)葡萄糖组合物的乙醇发酵生产比较例
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖22.3g/L、乙酸15g/L、香豆酸0.5g/L、阿魏酸0.06g/L，除此以外，进行与实施例46同样的操作。结果示于表11。
(比较例43)葡萄糖组合物的乙醇发酵生产比较例
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖22.3g/L、不添加乙酸、香豆酸0.5g/L、阿魏酸0.06g/L，除此以外，进行与实施例46同样的操作。结果示于表11。
(比较例44)葡萄糖组合物的乙醇发酵生产比较例
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖22.3g/L、乙酸1.0g/L、香豆酸3.0g/L、阿魏酸0.06g/L，除此以外，进行与实施例46同样的操作。结果示于表11。
(比较例45)葡萄糖组合物的乙醇发酵生产比较例
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖22.3g/L、乙酸1.0g/L、不添加香豆酸、阿魏酸0.06g/L，除此以外，进行与实施例46同样的操作。结果示于表11。
(比较例46)葡萄糖组合物的乙醇发酵生产比较例
使制作的葡萄糖组合物为葡萄糖100g/L、木糖22.3g/L、乙酸1.0g/L、香豆酸0.5g/L、阿魏酸0.4g/L，除此以外，进行与实施例46同样的操作。结果示于表11。
(比较例47)葡萄糖组合物的乙醇发酵生产比较例
使制作的葡萄糖组合物为相对于葡萄糖100g/L，木糖22.3g/L、乙酸1.0g/L、香豆酸0.5g/L、不添加阿魏酸，除此以外，进行与实施例46同样的操作。结果示于表11。
(比较例48)葡萄糖组合物的乙醇发酵生产比较例
使制作的葡萄糖组合物为相对于葡萄糖100g/L，木糖50g/L、乙酸1.0g/L、香豆酸0.5g/L、阿魏酸0.06g/L，除此以外，进行与实施例46同样的操作。结果示于表11。
表11：以各葡萄糖组合物作为发酵原料的乙醇发酵试验结果
(实施例50)以含纤维素生物质作为原料的葡萄糖组合物的制作和乙醇发酵生产
使用实施例5所示的葡萄糖组合物，与实施例46同样地进行乙醇发酵。结果示于表12。
(实施例51)以含纤维素生物质作为原料的葡萄糖组合物的制作和乙醇发酵生产
使用实施例6所示的葡萄糖组合物，与实施例46同样地进行乙醇发酵。结果示于表12。
(实施例52)以含纤维素生物质作为原料的葡萄糖组合物的制作和乙醇发酵生产
使用实施例7所示的葡萄糖组合物，与实施例46同样地进行乙醇发酵。结果示于表12。
(实施例53)以含纤维素生物质作为原料的葡萄糖组合物的制作和乙醇发酵生产
使用实施例8所示的葡萄糖组合物，与实施例46同样地进行乙醇发酵。结果示于表12。
(实施例54)以含纤维素生物质作为原料的葡萄糖组合物的制作和乙醇发酵生产
使用实施例9所示的葡萄糖组合物，与实施例46同样地进行乙醇发酵。结果示于表12。
表12：以各葡萄糖组合物作为发酵原料的乙醇发酵试验结果
产业可利用性
本发明的葡萄糖组合物作为用于通过微生物发酵来制造化学品的微生物发酵原料有用，此外还可以用于公知的葡萄糖组合物的各种用途。

Claims (5)

1.葡萄糖组合物，作为换算成葡萄糖浓度为100g/L的该组合物水溶液时的含量，含有木糖0～25g/L、乙酸0.1～10g/L、香豆酸0.15～2.0g/L和阿魏酸0.007～0.28g/L。
2.根据权利要求1所述的葡萄糖组合物，作为换算成葡萄糖浓度为100g/L的所述葡萄糖组合物水溶液时的含量，以如下定义的浓度含有用1cm宽的样品池测定时在280nm具有吸收的物质，该物质是对甘蔗渣进行碱处理时得到的，所述浓度是以吸光度即ABS为20～350定义的。
3.微生物发酵用葡萄糖组合物，含有权利要求1或2所述的葡萄糖组合物。
4.微生物发酵原料，含有权利要求1或2所述的葡萄糖组合物、或者权利要求3所述的微生物发酵用葡萄糖组合物。
5.化学品的制造方法，其中，使用权利要求4所述的微生物发酵原料，来培养具有生产化学品的能力的微生物。
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