CN107354178B - 一种添加氨基酸促进微生物合成2,3-丁二醇的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种添加氨基酸促进微生物合成2，3‑丁二醇的方法，包括以下步骤：1)配制多粘类芽孢杆菌的种子培养基，接种活化的多粘类芽孢杆菌至种子培养基中进行种子培养，制得多粘类芽孢杆菌种子液；2)配制多粘类芽孢杆菌的发酵培养基，在接种种子液前向发酵培养基中加入氨基酸，氨基酸的初始浓度为0.5～2.5g/L；3)将步骤1)制得的多粘类芽孢杆菌种子液接种至步骤2)制得的发酵培养基中进行发酵培养。本发明通过在发酵培养基加入特定浓度的氨基酸，使得多粘类芽孢杆菌发酵过程中的菌体生长量增加，并使菌体内的代谢活动旺盛，提升了对目标产物2，3‑丁二醇的合成能力，提高了菌体对于底物的利用率、目标产物的产量以及生产强度。

Description

一种添加氨基酸促进微生物合成2,3-丁二醇的方法
技术领域
本发明属于生物化工领域，具体涉及一种添加氨基酸促进微生物合成2，3- 丁二醇的方法。
背景技术
2，3-丁二醇(2，3-Butanediol，简写为2，3-BD)在化工、食品、燃料及航空航天等领域均有着优良的应用前景，其燃烧值为27198J/g，媲美乙醇(29005J/g)，是极具潜力的液体燃料，其众多的衍生物，如甲乙酮、1，3-丁二烯、异构化辛烷以及3-羟基-2-丁酮(俗称乙偶姻)等，也广泛应用于油漆、橡胶、优质航空用油以及食品添加剂等产品的生产过程。
2，3-丁二醇的制备方法分为化学合成法和生物发酵法。化学合成法合成2，3 丁二醇的过程如图1所示，以石油裂解后形成的1-丁醇为原料，依次合成化合物 1-丁烯、2-氯丁烷、2-丁烯和3-溴-2-丁醇，最后水解3-溴-2-丁醇制得混旋型的 2，3-丁二醇。上述2，3-丁二醇的工业化合成方法存在工艺复杂、生产成本高以及环境污染严重等弊端，不利于可持续发展，不符合环境友好型经济发展的主题。 R，R-2，3-丁二醇等单一构型2，3-丁二醇的制备，需要在此基础上对混旋型2，3-丁二醇进行进一步的手性拆分。生物法合成2，3-丁二醇的过程如图2所示，以非粮可再生的资源(菊芋、乳清、糖蜜和木质纤维素等)为原料，通过稀酸水解或酶解制得的糖液，可供微生物代谢利用制备2，3-丁二醇。与化学合成法相比，生物炼制的原料为可再生资源，减少了对日益枯竭的石油资源的依赖性，且工艺过程简单，减少了化学法合成过程中造成的环境污染。
菌种的选择对生物发酵法制备2，3-丁二醇十分关键。目前，已报道的用于2，3- 丁二醇生产的菌属主要有：克雷伯氏杆菌属(Klebsiella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、肠杆菌属(Enterobacter)以及沙雷氏菌属(Serratia)等兼性厌氧菌，其中研究较多的是克雷伯氏杆菌和芽孢杆菌。由于Klebsiella被世界卫生组织界定为条件致病菌(pathogenicmicroorganisms)，使得其在大规模工业化制备2，3-丁二醇时存在一定的安全隐患。不同于克雷伯氏菌，多粘类芽孢杆菌为非致病菌，产物中 R，R-2，3-丁二醇的光学纯度约＞98％，是研究制备超高光学纯度(＞99.99％)R，R-2，3- 丁二醇最常用的菌种。
在发酵生产2，3-丁二醇时，除提供菌体生长所必需的碳源和氮源，有研究报道，适当添加少量的营养因子，如乙酸、柠檬酸、维生素和微量元素等，可有助于促进微生物的生长以及产物的合成。
Ernest等人以水解木质纤维素制备的水解糖液为原料，利用克雷伯氏菌发酵制备2，3-丁二醇，通过向水解糖液中添加酵母膏、尿素、硫酸铵和微量元素等营养物质，使得产物中2，3-丁二醇的产量提高了10％～50％。添加适量乙酸至水解糖液进行发酵时，2，3-丁二醇的产量最高达到22g/L(Ernest K C，Saddler J N. Applied and environmentalmicrobiology，1982，44(4)：777-784.)。营养因子的添加，能增强2，3-丁二醇合成途径相关代谢酶的酶活力，从而促进产物2，3-丁二醇的合成(Bryn K，Hetland
Figure BDA0001355613050000021
Figure BDA0001355613050000022
FC.European Journal of Biochemistry， 1971，18(1)：116-119)。李元芳等人研究了Serratia marcescens发酵制备2，3-丁二醇时，添加柠檬酸和无机盐(MnSO4、FeSO4、ZnSO4和MgSO4)对菌体生长及产物2，3-丁二醇合成的影响，研究结果表明，添加柠檬酸和无机盐MnSO4均可有效促进菌体生长和产物合成，2，3-丁二醇的产量分别提高了43.5％和41.5％，此外，添加柠檬酸加快了底物消耗和发酵生产的进程(李元芳，徐勤，曹学，等。工业微生物，2007，37(3)：24-28.)。张根林等人针对K.pneumonia XJ-Li发酵葡萄糖和木糖合成2，3-丁二醇进行了研究，考察了添加维生素Vc对于发酵制备2，3- 丁二醇的影响，研究结果显示，向培养基中添加适量Vc后，可将产物2，3-丁二醇的产量提高44.3％，Vc可调控菌体内NADH/NAD+再生系统，从而促进2，3- 丁二醇的合成(张根林，邓辉，鲁建江，等。过程工程学报，2009(06)：1174-1177.)。目前为止，还未有文献报道单纯通过添加氨基酸来促进微生物合成2，3-丁二醇的研究。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种能够克服生物发酵制备2，3-丁二醇的过程中，底物利用率及目标产物产量低等缺点的促进微生物合成2，3-丁二醇的方法。
技术方案：本发明提供一种添加氨基酸促进微生物合成2，3-丁二醇的方法，该方法包括以下步骤：
1)配制多粘类芽孢杆菌的种子培养基，接种活化的多粘类芽孢杆菌至种子培养基中进行种子培养，制得多粘类芽孢杆菌种子液；
2)配制多粘类芽孢杆菌的发酵培养基，在接种种子液前向发酵培养基中加入氨基酸，使发酵培养基中任意一种氨基酸的初始浓度为0.5～2.5g/L；
3)将步骤1)制得的多粘类芽孢杆菌种子液接种至步骤2)制得的发酵培养基中进行发酵培养。
其中，步骤2)中，氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸中的一种或多种；优选地，氨基酸为天冬酰胺，或天冬酰胺Asn、丝氨酸Ser、组氨酸His和精氨酸Arg的混合氨基酸；任意一种氨基酸的初始浓度为1.5～2.0g/L。
其中，步骤1)中，种子培养的条件为在30℃下200-300rpm摇瓶培养18～20 小时。
其中，步骤2)中，发酵培养基pH为6.0，其中各物质的浓度为葡萄糖75～90 g/L，酵母粉6～12g/L，蛋白胨2g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，K2HPO43.09g/L， MnSO4·H2O0.001g/L，NH4Cl0.93g/L，FeSO4·7H2O0.04g/L，ZnSO4·7H2O0.001 g/L。
其中，步骤3)中，多粘类芽孢杆菌种子液的接种量为8～10％。
其中，步骤3)中，发酵培养的条件为在30℃下200～300rpm摇瓶培养30～48 小时。
有益效果：本发明通过在发酵培养基加入特定浓度的氨基酸，使得多粘类芽孢杆菌发酵过程中的菌体生长量增加，并使菌体内的代谢活动旺盛，提升了对目标产物2，3-丁二醇的合成能力，提高了菌体对于底物的利用率、目标产物的产量以及生产强度。
附图说明
图1是化学法合成2，3-丁二醇的工艺流程图；
图2是生物法合成2，3-丁二醇的工艺流程图；
图3是吸光度-果糖浓度标准工作曲线；
图4是添加天冬酰胺Asn后，不同发酵时间发酵液中各物质的浓度变化情况；
图5是添加丝氨酸Ser后，不同发酵时间发酵液中各物质的浓度变化情况；
图6是添加组氨酸His后，不同发酵时间发酵液中各物质的浓度变化情况；
图7是添加精氨酸Arg后，不同发酵时间发酵液中各物质的浓度变化情况；
图8是添加氨基酸混合物后，不同发酵时间发酵液中各物质的浓度变化情况。
具体实施方式：
一般性说明：
菌种：
本发明实例采用的菌种为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)ZJ-9，该菌种保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No.3044。培养基：
LB液体培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母膏5，NaCl 10，pH 7.0。其制备方法为：配制每升培养基时，在950ml去离子水中加入蛋白胨10g，酵母膏5g， NaCl 10g，摇动容器直至溶质溶解，用5mol/L NaOH调节pH至7.0，用去离子水定容至1L。
LB固体培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母膏5，NaCl 10，琼脂10～20，pH 7.0。其制备方法为：在950ml双蒸水中加入蛋白胨10g；酵母膏5g；NaCl 10g，用 1M的NaOH调节pH值到7.0，定容至1L，然后加入10～20g琼脂粉，倒平板。
种子培养基(g/L)：葡萄糖25，酵母粉3，NaCl 5，蛋白胨10，pH 7.0。
发酵培养基(g/L)：葡萄糖75，酵母粉6，蛋白胨2，MgSO4·7H2O 0.5， K2HPO4 3.09，MnSO4·H2O 0.001，NH4Cl 0.93，FeSO4·7H2O 0.04，ZnSO4·7H2O 0.001，pH 6.0。
将上述配制的各种培养基，于115～121℃高温条件下，灭菌15～20min(发酵培养基中的葡萄糖需单独灭菌，之后再与发酵培养基中其他组分混匀)。
检测方法：
(1)2，3-丁二醇、乙偶姻、乙酸、乙醇的产量测定
发酵过程中收集适量发酵液，12000rpm离心20min，上清用0.22μm的滤膜过滤除去菌体，收集上清液取样检测。目标产物2，3-丁二醇及副产物乙偶姻、乙酸、乙醇等的产量，采用示差检测器检测，色谱柱：Aminex HPX-87H(300×7.8 mm)；流动相：0.05M的H2SO4；流速：0.6mL/min；进样量：20μL；柱温： 60℃。
(2)总糖的含量测定
发酵液总糖的测定采用蒽酮-硫酸法进行测定，具体参数和步骤如下：
蒽酮试剂：0.1g蒽酮溶于50mL 98％的H2SO4，现配现用，避光保存。
果糖标准液：0.1g果糖溶于去离子水并定容至1L，终浓度(0.1g/L)。
果糖标准曲线的绘制：分别取0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.6mL、 0.8mL和1mL的果糖标准液，均稀释至1mL后分别与4mL的蒽酮试剂混合均匀，沸水浴煮沸12min，降至室温后测其在620nm波长处的吸光度(OD620nm)，对照为1mL蒸馏水与4mL蒽酮试剂的混合物。以果糖浓度为横坐标，620nm 波长处的吸光度(OD620nm)为纵坐标，绘制吸光度(OD620)-果糖浓度的标准工作曲线如图3所示，标准曲线方程为y＝0.0086x+0.0025，R2＝0.9995。
发酵过程中收集适量发酵液，12000rpm离心20min，上清用0.22μm的滤膜过滤除去菌体，收集上清液取样检测。取1mL待测样品与4mL蒽酮试剂混合均匀，设置三个平行试验；取1mL蒸馏水与4mL蒽酮试剂的混合物作为空白对照。将平行试验和空白对照分别沸水浴10min，降至室温后分别测定OD620nm的吸光度，依据吸光度-果糖浓度的标准工作曲线方程计算待测样品的糖含量 (g/L)。
实施例1
(1)菌种活化
接种甘油管或斜面保存的菌种P.polymyxa ZJ-9至LB固体培养基平板中， 30℃恒温培养箱中培养12～18h，获得P.polymyxa ZJ-9活化的单菌落。
(2)种子培养
挑取步骤(1)获得的P.polymyxa ZJ-9活化的单菌落于装有50mL种子培养基的250mL锥形瓶中，置于30℃，200rpm的摇床中，培养18～20h，获得用于发酵的P.polymyxaZJ-9种子液。
(3)发酵培养
实验组：向发酵培养基中加入氨基酸---天冬酰胺Asn，使发酵培养基中天冬酰胺Asn的浓度为1.5g/L，将步骤(2)中培养好的种子液按8％(体积比)的接种量接入装有100mL发酵培养基的500mL摇瓶中培养，30℃，200r/min摇瓶培养48h。
对照组：发酵培养基中不加氨基酸，将步骤(2)中培养好的种子液按8％ (体积比)的接种量接入装有100mL发酵培养基的500mL摇瓶中培养，30℃， 200r/min摇瓶培养48h。
(4)产物检测
每隔6h分别取实验组和对照组的发酵液，检测发酵液中目标产物2，3-丁二醇及副产物乙偶姻、乙酸、乙醇等的产量，发酵时间为48h。
利用本发明具体实施方式检测方法部分提到的产物及底物的检测方法，测定发酵过程中，目标产物2，3-丁二醇、副产物及残糖的含量。对照组中产物2，3-丁二醇的产量为12.11g/L，而添加了1.5g/L天冬酰胺Asn的实验组中，2，3-丁二醇的产量提高到了24.32g/L，相对于未加氨基酸的对照组增长了100.8％。
表1中所示的6列实验组数据，为发酵培养基中不同天冬酰胺Asn初始浓度(0.5～2.5g/L)条件下，发酵过程中2，3-丁二醇的最高产量。
表1不同天冬酰胺Asn添加浓度对2，3-丁二醇产量的影响
Figure BDA0001355613050000061
从表1中可以看出，在发酵培养基中添加不同浓度(0.5～2.5g/L)的天冬酰胺Asn时，2，3-丁二醇(2，3-BD)的最高产量可以提高20.7％～100.8％。其中，在Asn最适添加浓度1.5g/L条件下的发酵历程如图4所示，当菌体生长进入稳定期时，相比于未添加氨基酸的对照组(图中空心所示)，在添加Asn的实验组 (图中实心所示)中，菌体浓度明显高于对照组(由OD660nm表征)，说明Asn 促进了P.polymyxa ZJ-9的生长，并且减少了副产物乙偶姻的生成，R，R-2，3-丁二醇(R，R-2，3-BD)的产量为24.32g/L，与对照组的产量(12.11g/L)相比，R，R-2，3- 丁二醇的产量提高了100.8％，比较对照组和实验组中总糖耗的数据可知，在添加氨基酸的实验组中，发酵时所消耗的糖量有所上升。分析原因，氨基酸能促进P.polymyxa ZJ-9细胞的生长，使得发酵后期菌体生物量仍维持在较高的水平，提升了发酵后期P.polymyxa ZJ-9的菌体代谢活力以及底物利用效率，进而增长了发酵制备R，R-2，3-丁二醇的产量；氨基酸能增强P.polymyxa ZJ-9中α-乙酰乳酸合成酶、α-乙酰乳酸脱羧酶和2，3-丁二醇脱氢酶等的活力，提高P.polymyxa ZJ-9 中R，R-2，3-丁二醇合成途径的代谢流通量，减少乙酸和乙偶姻等副产物生成，而有利于主产物R，R-2，3-丁二醇的积累。
实施例2
(1)菌种活化
接种甘油管或斜面保存的菌种P.polymyxa ZJ-9至LB固体培养基平板中， 30℃恒温培养箱中培养12～18h，获得P.polymyxa ZJ-9活化的单菌落。
(2)种子培养
挑取步骤(1)获得的P.polymyxa ZJ-9活化的单菌落于装有50mL种子培养基的250mL锥形瓶中，置于30℃，200rpm的摇床中，培养18～20h，获得用于发酵的P.polymyxaZJ-9种子液。
(3)发酵培养
实验组：向发酵培养基中加入氨基酸-丝氨酸Ser，使发酵培养基中丝氨酸 Ser的初始浓度为1.5g/L，将步骤(2)中培养好的种子液按8％(体积比)的接种量接入装有100mL发酵培养基的500mL摇瓶中培养，30℃，200r/min摇瓶培养48h。
对照组：发酵培养基中不加氨基酸，将步骤(2)中培养好的种子液按8％ (体积比)的接种量接入装有100mL发酵培养基的500mL摇瓶中培养，30℃， 200r/min摇瓶培养48h。
(4)产物检测
每隔6h分别取实验组和对照组的发酵液，检测发酵液中目标产物2，3-丁二醇及副产物乙偶姻、乙酸、乙醇等的产量，发酵时间为48h。
利用本发明具体实施方式检测方法部分提到的产物及底物的检测方法，测定发酵过程中，目标产物2，3-丁二醇、副产物及残糖的含量。对照组中产物2，3-丁二醇的产量为12.11g/L，而添加1.5g/L丝氨酸Ser的实验组中，2，3-丁二醇的产量提高到了22.32g/L，增长了84.3％。
表2中所示的6列实验组数据，为发酵培养基中不同丝氨酸Ser初始浓度 (0.5～2.5g/L)条件下，发酵过程中2，3-丁二醇的最高产量。
表2不同丝氨酸Ser添加浓度对2，3-丁二醇产量的影响
Figure BDA0001355613050000081
从表2中可以看出，在发酵培养基中添加不同浓度(0.5～2.5g/L)的丝氨酸 Ser时，2，3-丁二醇的最高产量可以提高12.2％～84.3％。其中，在Ser最适添加浓度1.5g/L条件下的发酵历程如图5所示，当菌体生长进入稳定期时，相比于未添加氨基酸的对照组(图中空心所示)，在添加Ser的实验组(图中实心所示) 中，菌体浓度明显高于对照组(由OD660nm表征)，说明Ser促进了P.polymyxa ZJ-9的生长，并且减少了副产物乙偶姻的生成，R，R-2，3-丁二醇(R，R-2，3-BD) 的产量为22.32g/L，与对照组的产量(12.11g/L)相比，R，R-2，3-丁二醇的产量提高了84.3％，比较对照组和实验组中总糖耗的数据可知，在添加氨基酸的实验组中，发酵时所消耗的糖量有所上升。分析原因，氨基酸能促进P.polymyxa ZJ-9细胞的生长，使得发酵后期菌体生物量仍维持在较高的水平，提升了发酵后期 P.polymyxaZJ-9的菌体代谢活力以及底物利用效率，进而增长了发酵制备 R，R-2，3-丁二醇的产量；氨基酸能增强P.polymyxa ZJ-9中α-乙酰乳酸合成酶、α- 乙酰乳酸脱羧酶和2，3-丁二醇脱氢酶等的活力，提高P.polymyxa ZJ-9中R，R-2，3- 丁二醇合成途径的代谢流通量，减少乙酸和乙偶姻等副产物生成，而有利于主产物R，R-2，3-丁二醇的积累。
实施例3
(1)菌种活化
接种甘油管或斜面保存的菌种P.polymyxa ZJ-9至LB固体培养基平板中， 30℃恒温培养箱中培养12～18h，获得P.polymyxa ZJ-9活化的单菌落。
(2)种子培养
挑取步骤(1)获得的P.polymyxa ZJ-9活化的单菌落于装有50mL种子培养基的250mL锥形瓶中，置于30℃，200rpm的摇床中，培养18～20h，获得用于发酵的P.polymyxaZJ-9种子液。
(3)发酵培养
实验组：向发酵培养基中加入氨基酸-组氨酸His，使发酵培养基中组氨酸 His的初始浓度为1.5g/L，将步骤(2)中培养好的种子液按8％(体积比)的接种量接入装有100mL发酵培养基的500mL摇瓶中培养，30℃，200r/min摇瓶培养48h。
对照组：发酵培养基中不加氨基酸，将步骤(2)中培养好的种子液按8％ (体积比)的接种量接入装有100mL发酵培养基的500mL摇瓶中培养，30℃， 200r/min摇瓶培养48h。
(4)产物检测
每隔6h分别取实验组和对照组的发酵液，检测发酵液中目标产物2，3-丁二醇及副产物乙偶姻、乙酸、乙醇等的产量，发酵时间为48h。
利用本发明具体实施方式检测方法部分提到的产物及底物的检测方法，测定发酵过程中，目标产物2，3-丁二醇、副产物及残糖的含量。对照组中产物2，3-丁二醇的产量为12.11g/L，而添加1.5g/L组氨酸His的实验组中，2，3-丁二醇的产量提高到了22.03g/L，增长了81.9％。
表3中所示的6列实验组数据，为发酵培养基中不同组氨酸His初始浓度(0.5～2.5g/L)条件下，发酵过程中2，3-丁二醇的最高产量。
表3不同组氨酸His添加浓度对2，3-丁二醇产量的影响
Figure BDA0001355613050000091
从表3中可以看出，在发酵培养基中添加不同浓度(0.5～2.5g/L)的组氨酸 His时，2，3-丁二醇的最高产量可以提高29.2％～81.9％。其中，在His最适添加浓度1.5g/L条件下的发酵历程如图6所示，当菌体生长进入稳定期时，相比于未添加氨基酸的对照组(图中空心所示)，在添加His的实验组(图中实心所示) 中，菌体浓度明显高于对照组(由OD660nm表征)，说明His促进了P.polymyxa ZJ-9的生长，并且减少了副产物乙偶姻的生成，R，R-2，3-丁二醇(R，R-2，3-BD) 的产量为22.03g/L，与对照组的产量(12.11g/L)相比，R，R-2，3-丁二醇的产量提高了81.9％，比较对照组和实验组中总糖耗的数据可知，在添加氨基酸的实验组中，发酵时所消耗的糖量有所上升。分析原因，氨基酸能促进P.polymyxa ZJ-9细胞的生长，使得发酵后期菌体生物量仍维持在较高的水平，提升了发酵后期 P.polymyxaZJ-9的菌体代谢活力以及底物利用效率，进而增长了发酵制备 R，R-2，3-丁二醇的产量；氨基酸能增强P.polymyxa ZJ-9中α-乙酰乳酸合成酶、α- 乙酰乳酸脱羧酶和2，3-丁二醇脱氢酶等的活力，提高P.polymyxa ZJ-9中R，R-2，3- 丁二醇合成途径的代谢流通量，减少乙酸和乙偶姻等副产物生成，而有利于主产物R，R-2，3-丁二醇的积累。
实施例4
(1)菌种活化
接种甘油管或斜面保存的菌种P.polymyxa ZJ-9至LB固体培养基平板中， 30℃恒温培养箱中培养12～18h，获得P.polymyxa ZJ-9活化的单菌落。
(2)种子培养
挑取步骤(1)获得的P.polymyxa ZJ-9活化的单菌落于装有50mL种子培养基的250mL锥形瓶中，置于30℃，200rpm的摇床中，培养18～20h，获得用于发酵的P.polymyxaZJ-9种子液。
(3)发酵培养
实验组：向发酵培养基中加入1.5g/L的氨基酸-精氨酸Arg，使发酵培养基中精氨酸Arg的初始浓度为1.5g/L，将步骤(2)中培养好的种子液按8％(体积比)的接种量接入装有100mL发酵培养基的500mL摇瓶中培养，30℃，200r/min 摇瓶培养48h。
对照组：发酵培养基中不加氨基酸，将步骤(2)中培养好的种子液按8％ (体积比)的接种量接入装有100mL发酵培养基的500mL摇瓶中培养，30℃， 200r/min摇瓶培养48h。
(4)产物检测
每隔6h分别取实验组和对照组的发酵液，检测发酵液中目标产物2，3-丁二醇及副产物乙偶姻、乙酸、乙醇等的产量，发酵时间为48h。对照组中产物2，3- 丁二醇的产量为12.11g/L，而添加1.5g/L精氨酸Arg的实验组中，2，3-丁二醇的产量提高到了21.04g/L，增长了73.7％。
表4中所示的6列实验组数据，为发酵培养基中不同精氨酸Arg初始浓度 (0.5～2.5g/L)条件下，发酵过程中2，3-丁二醇的最高产量。
表4不同精氨酸Arg添加浓度对2，3-丁二醇产量的影响
Figure BDA0001355613050000111
从表4中可以看出，在发酵培养基中添加不同浓度(0.5～2.5g/L)的精氨酸 Arg时，2，3-丁二醇的最高产量可以提高20.9％～73.7％。其中，在Arg最适添加浓度1.5g/L条件下的发酵历程如图7所示，当菌体生长进入稳定期时，相比于未添加氨基酸的对照组(图中空心所示)，在添加Arg的实验组(图中实心所示) 中，菌体浓度明显高于对照组(由OD660nm表征)，说明Arg促进了P.polymyxa ZJ-9的生长，并且减少了副产物乙偶姻的生成，R，R-2，3-丁二醇(R，R-2，3-BD) 的产量为21.04g/L，与对照组的产量(12.11g/L)相比，R，R-2，3-丁二醇的产量提高了73.7％，比较对照组和实验组中总糖耗的数据可知，在添加氨基酸的实验组中，发酵时所消耗的糖量有所上升。分析原因，氨基酸能促进P.polymyxa ZJ-9细胞的生长，使得发酵后期菌体生物量仍维持在较高的水平，提升了发酵后期 P.polymyxaZJ-9的菌体代谢活力以及底物利用效率，进而增长了发酵制备 R，R-2，3-丁二醇的产量；氨基酸能增强P.polymyxa ZJ-9中α-乙酰乳酸合成酶、α- 乙酰乳酸脱羧酶和2，3-丁二醇脱氢酶等的活力，提高P.polymyxa ZJ-9中R，R-2，3- 丁二醇合成途径的代谢流通量，减少乙酸和乙偶姻等副产物生成，而有利于主产物R，R-2，3-丁二醇的积累。
实施例5
采取将2种或2种以上氨基酸混合添加的方式，使发酵培养基中每种氨基酸的初始浓度分别为0.5～2.5g/L。具体方法为：
(1)菌种活化
接种甘油管或斜面保存的菌种P.polymyxa ZJ-9至LB固体培养基平板中， 30℃恒温培养箱中培养12～18h，获得P.polymyxa ZJ-9活化的单菌落。
(2)种子培养
挑取步骤(1)获得的P.polymyxa ZJ-9活化的单菌落于装有50mL种子培养基的250mL锥形瓶中，置于30℃，200rpm的摇床中，培养18～20h，获得用于发酵的P.polymyxaZJ-9种子液。
(3)发酵培养
实验组：向发酵培养基中加入天冬酰胺Asn、丝氨酸Ser、组氨酸His和精氨酸Arg的氨基酸混合物，使发酵培养基中每种氨基酸的初始浓度均为1.5g/L，将步骤(2)中培养好的种子液按8％(体积比)的接种量接入装有100mL发酵培养基的500mL摇瓶中培养，30℃，200r/min摇瓶培养48h。
对照组：发酵培养基中不加氨基酸，将步骤(2)中培养好的种子液按8％ (体积比)的接种量接入装有100mL发酵培养基的500mL摇瓶中培养，30℃， 200r/min摇瓶培养48h。
(4)产物检测
每隔6h分别取实验组和对照组的发酵液，检测发酵液中目标产物2，3-丁二醇及副产物乙偶姻、乙酸、乙醇等的产量，发酵时间为48h。其发酵历程如图8 所示，对照组中(图中空心代表对照组)产物2，3-丁二醇的产量为12.11g/L，而添加氨基酸混合物的实验组中(图中实心代表实验组)，2，3-丁二醇的产量提高到了25.07g/L，增长了107％，而副产物乙偶姻的含量维持在0.3～0.6g/L之间。关键氨基酸混合物的添加，可能促进了P.polymyxa ZJ-9中合成R，R-2，3-丁二醇的相关代谢过程，有利于胞内2，3-丁二醇脱氢酶的合成，从而加速乙偶姻转化为 R，R-2，3-丁二醇，因此有助于R，R-2，3-丁二醇的积累。

Claims (1)

1.一种添加氨基酸促进微生物合成2,3-丁二醇的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
1）配制多粘类芽孢杆菌的种子培养基，接种活化的多粘类芽孢杆菌至所述种子培养基中进行种子培养，制得多粘类芽孢杆菌种子液；
2）配制多粘类芽孢杆菌的发酵培养基，在接种种子液前向所述发酵培养基中加入氨基酸，所述氨基酸为丝氨酸，所述丝氨酸初始浓度为1.5 g/L；
3）将步骤1）制得的多粘类芽孢杆菌种子液接种至步骤2）制得的发酵培养基中进行发酵培养；
所述种子培养的条件为在30℃下200~300 rpm摇瓶培养18~20小时，所述发酵培养基pH为6.0，其中各物质的浓度为，葡萄糖75~90 g/L，酵母粉6~12 g/L，蛋白胨2 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，K2HPO4 3.09 g/L，MnSO4·H2O 0.001 g/L，NH4Cl 0.93 g/L，FeSO4·7H2O0.04 g/L，ZnSO4·7H2O 0.001 g/L，步骤3）中，所述多粘类芽孢杆菌种子液的接种量为8~10%，所述多粘类芽孢杆菌为菌种P. polymyxa ZJ-9，保藏编号为CGMCC No. 3044，步骤3）中，所述发酵培养的条件为在30℃下200~300 rpm摇瓶培养30~48小时。
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