JPWO2017154955A1 - グルコース組成物、微生物発酵原料および化学品の製造方法 - Google Patents

グルコース組成物、微生物発酵原料および化学品の製造方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、グルコース組成物であって、グルコース濃度が１００ｇ／Ｌの該組成物水溶液での相当量としてキシロースを０〜２５ｇ／Ｌ、酢酸を０．１〜１０ｇ／Ｌ、クマル酸を０．１５〜２．０ｇ／Ｌ及びフェルラ酸を０．００７〜０．２８ｇ／Ｌ含有することを特徴とする。本発明のグルコース組成物を微生物発酵による化学品の製造方法の原料として使用することで、化学品の収率を高めることができる。【選択図】なし

Description

本発明は微生物発酵効率を高めるグルコース組成物および微生物発酵原料、ならびに微生物発酵による化学品の製造方法に関する。
糖を原料とした化学品の発酵生産プロセスは、種々の工業原料生産に利用されている。この発酵原料となる糖として、現在、さとうきび、澱粉、テンサイなどの食用原料に由来するものが工業的に使用されている。さとうきび、テンサイから得られる粗糖は、ショ糖を主成分とし、ショ糖純度は９５％以上と純度が高い糖液となる。一方で、粗糖を得る過程で出てくる結晶化後の母液は、廃糖蜜として市場に出ているが、これはショ糖、グルコース、フルクトースが混合したものであり、不純物として各種塩類やタンパク質などが含まれるためショ糖、グルコース、フルクトースなどの各種合計糖濃度は５０％程度と糖以外の不純物が多い糖液となる。トウモロコシ、ムギ、キャッサバなどから得られる澱粉は、酵素によりグルコースへと変換した後、精製、濃縮を経て製造され、グルコース純度は９８％以上と純度が高い糖液となる。
前述の食用資源から製造される糖とは別に、今後の世界人口の増加による食用原料価格の高騰、あるいは食用と競合するという倫理的な側面から、再生可能な非食用資源、すなわちセルロース含有バイオマスを原料とした糖の製造も開発されてきている。セルロース含有バイオマスから糖液を製造する方法として、濃硫酸を使用してセルロースおよびヘミセルロースを酸加水分解して糖液を製造する方法、セルロース含有バイオマスを希硫酸で加水分解処理した後にさらにセルラーゼなどの酵素処理をすることにより糖液を製造する方法が知られている（非特許文献１）。また、セルロース含有バイオマスを２４０〜２８０℃の加圧熱水で加水分解処理した後に、さらに糖化酵素処理することにより糖液を製造する方法（特許文献１）が開示されている。しかし、セルロース含有バイオマスを原料とした糖には、グルコース以外に難発酵性のペントースであるキシロースが含まれ、更に発酵阻害物として酢酸などの有機酸、ＨＭＦ（ヒドロキシメチルフルフラール）、クマル酸、フェルラ酸、バニリンなどを含有するため、微生物発酵原料とした場合に発酵収率が低いという課題があった。上記課題を解決する方法として、セルロース含有バイオマス原料を加圧熱水で処理した後にセルラーゼで加水分解することで得られた発酵阻害物質を含む糖液を、限外濾過膜、ナノ濾過膜あるいは逆浸透膜を通じることで発酵阻害物質を除去した糖液を製造する方法などが知られている（特許文献２、３）。
糖を主原料として作製する微生物発酵原料は、一般に栄養の原則に則った構成が必要となる。細胞の固形物は、水や空気から供給できる水素と酸素の他に、炭素、窒素、リン、および硫黄をこれらの順に多く含み、これらの元素は細胞の乾燥重量の９５％に相当する。残りの５％には多くのミネラル元素が含まれる。これに加えて、簡単な炭素源を利用して生合成ができず培地に添加が必要なものとして、アミノ酸、プリン・ピリミジン、ビタミンといった増殖因子があるが、これらは量的には少量しか要求されない。すなわち微生物発酵原料としては、最も主要な成分として糖である炭水化物などを使用して炭素源を、酵母エキス、コーンスティープリカー（ＣＳＬ）あるいはアンモニア塩などを使用して窒素源などを微生物に供給するために調製される。
特許３０４１３８０号公報 ＷＯ２０１０／０６７７８５ ＷＯ２０１３／０１８６９４
前述の通り、微生物発酵原料となる糖としては食用原料に由来する糖、セルロース含有バイオマス原料に由来する糖などが存在し、これら糖を用いて発酵用の培地が作られているが、産業界からはより高い発酵効率が得られる糖組成物が求められていた。したがって、本発明では従来の糖組成物を上回る高い発酵効率が得られるグルコース組成物を開発することを課題とする。
本発明者は鋭意検討の結果、驚くべきことに当業者にとって発酵阻害物質として知られている酢酸、クマル酸およびフェルラ酸を特定量含有するグルコース組成物が微生物発酵原料として好適であることを新規に見出し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、以下の[１]〜[５]の構成を有する。
［１］グルコース組成物であって、グルコース濃度が１００ｇ／Ｌの該組成物水溶液での相当量として、キシロースを０〜２５ｇ／Ｌ、酢酸を０．１〜１０ｇ／Ｌ、クマル酸を０．１５〜２．０ｇ／Ｌ及びフェルラ酸を０．００７〜０．２８ｇ／Ｌ含有する、組成物。
［２］グルコース濃度が１００ｇ／Ｌの前記グルコース組成物水溶液での相当量として、バガスに対しアルカリ処理した際に得られる１ｃｍ幅のセルで測定される２８０ｎｍに吸収を持つ物質を、吸光度（ＡＢＳ）２０〜３５０で定義される濃度で含有する、［１］に記載のグルコース組成物。
［３］［１］または［２］に記載のグルコース組成物を含有する、微生物発酵用グルコース組成物。
［４］［１］または［２］に記載のグルコース組成物、あるいは［３］に記載の微生物発酵用グルコース組成物を含有する、微生物発酵原料。
［５］［４］に記載の微生物発酵原料を使用して化学品を生産する能力を有する微生物を培養する、化学品の製造方法。
本発明であるグルコース組成物を微生物発酵原料として利用した場合、従来の糖組成物を上回る発酵効率を得ることができ、糖を原料とした化学品の発酵生産での化学品の製造コストを下げることができる。
本発明を実施するための形態に関し、詳細に説明する。
［グルコース組成物］
本発明のグルコース組成物の主成分であるグルコースとしては、トウモロコシ、ムギ、キャッサバなどを原料にデンプンから酵素加水分解することで生産される純度の高いグルコースを使用することができる。また、後述の通り、セルロース含有バイオマスを適宜加水分解して得られるグルコースも使用することができる。
本発明のグルコース組成物に含まれるキシロースとしては、トウモロコシの芯などに多く含まれており、これを精製することで得ることができる。また、後述の通り、セルロース含有バイオマスを適宜加水分解して得られるキシロースも使用することができる。
酢酸はメタノールのカルボニル化など石油由来原料で得られるものや、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属微生物などによる発酵生産により得られるものを使用することができる。また、後述の通り、酢酸はセルロース含有バイオマスを加水分解してグルコースなどの糖を製造する場合の副成分として含まれることから、セルロース含有バイオマス由来のものであってもよい。
クマル酸、フェルラ酸は植物中のリグニン構成成分の１つであり、植物原料などから精製したり、石油由来原料から化学合成で製造したりすることができる。また、酢酸と同様にクマル酸、フェルラ酸はセルロース含有バイオマスを加水分解してグルコースなどの糖を製造する場合の副成分として含まれることから、セルロース含有バイオマス由来のものであってもよい。また、クマル酸にはｏ−クマル酸、ｍ−クマル酸、ｐ−クマル酸の３種類の異性体が存在し、本発明のグルコース組成物に含まれるクマル酸はそのいずれであっても、あるいはそれら２種以上の混合物であってもよいが、ｐ−クマル酸はリグニンの構成成分の１つとして自然界に多量に存在することから、ｐ−クマル酸またはｐ−クマル酸を主成分とする混合物であることが好ましい。さらに、ｐ−クマル酸としては、シス体、トランス体が存在するが、そのいずれであっても、あるいはそれら２種類の混合物であってもよいが、光に当らない自然界の状態ではトランス体で安定に存在することから、トランス−ｐ−クマル酸が好ましい。
本発明のグルコース組成物は、構成成分となる前記化合物を適宜溶媒に溶解したり、配合したりすることで調製することができる。例えば、前記物質を十分に精製した後、グルコース濃度が１００ｇ／Ｌの水溶液に、キシロースが０〜２５ｇ／Ｌ、好ましくは０．５〜２５ｇ／Ｌの範囲内、酢酸が０．１〜１０ｇ／Ｌ、好ましくは０．２〜４ｇ／Ｌの範囲内、クマル酸が０．１５〜２．０ｇ／Ｌ、好ましくは０．３〜１．０ｇ／Ｌの範囲内、フェルラ酸が０．００７〜０．２８ｇ／Ｌ、好ましくは０．０１４〜０．１４ｇ／Ｌの範囲内の濃度になるように混合することで本発明のグルコース組成物を製造することができる。溶解・配合する順番は特に制限がなく、適宜、ｐＨ、温度等を調節しても良い。なお、本発明のグルコース組成物を溶媒に溶解させた場合のグルコースおよびキシロース濃度は、液体高速クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いてＲＩ検出器により定量することができ、クマル酸、フェルラ酸濃度は、同じく液体高速クロマトグラフィーを用いてＵＶ検出器またはフォトダイオードアレイにより定量することができ、酢酸は同じく高速液体クロマトグラフィーを用いて電気伝導度計により定量することができる。
本発明のグルコース組成物は、セルロース含有バイオマスを原料に製造してもよく、例えば、セルロース含有バイオマスをアルカリ処理などで前処理後、固液分離後の固体を糸状菌由来セルラーゼ等の糖化酵素で加水分解して得られた糖水溶液を、本発明のグルコース組成物の構成成分が所定の濃度になるように精製して製造することで、各種精製品を混合するよりも低コストで本発明のグルコース組成物を得ることができる。
セルロース含有バイオマスとは、セルロースを５重量％以上含む生物由来の資源を言う。具体的には、バガス、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、コーンストーバー、稲わら、麦わらなどの草本系バイオマス、樹木、廃建材などの木質系バイオマスなどを例として挙げることができる。これらのセルロース含有バイオマスは、芳香族高分子であるリグニンおよびセルロース・ヘミセルロースを含有していることから、リグノセルロースとも呼ばれる。セルロース含有バイオマスに含まれる多糖成分であるセルロースやヘミセルロースを加水分解することにより、キシロースおよびグルコースを含む糖液を得ることができる。
前記セルロース含有バイオマスとしてはバガスであることが好ましい。バガスとは、サトウキビの茎を圧搾してケーンジュースを搾り取った後の残渣であり、含水率が４０〜５０％、セルロースが３５〜４５％（ｗｔ／ｗｔ−ｄｒｙバガス）、キシロースが２０〜２８％（ｗｔ／ｗｔ−ｄｒｙバガス）、リグニンが３〜２０％（ｗｔ／ｗｔ−ｄｒｙバガス）含まれる。バガス中に上記セルロース、キシロース、リグニンが含有されていればよく、サトウキビの種類は特に制限されない。
セルロース含有バイオマスの前処理は、具体的には、水酸化カルシウム、水酸化ナトリウム等のアルカリ性水溶液で処理するアルカリ処理；高温高圧の希硫酸、亜硫酸塩等で処理する酸処理；加圧熱水で処理する水熱処理が挙げられる。なお、本発明においては、アルカリ処理による前処理であることが好ましい。
糖化酵素としては、糸状菌由来のセルラーゼであることが好ましく、糸状菌としては、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、セルロモナス属（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）、クロストリジウム属（Ｃｈｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、イルペックス属（Ｉｒｐｅｘ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）などの微生物を例示することができる。こうした糸状菌の中でもトリコデルマ属は、セルロースの加水分解において比活性の高い酵素成分を培養液中に大量に生産するため、好ましく使用できる。
糖水溶液を精製して、本発明のグルコース組成物を調製する方法としては、分画分子量が３００〜１,０００、好ましくは３００〜５００の分離膜に通じて濾過して、透過液として回収する方法が挙げられる。分離膜の具体例としては、Ｓｙｎｄｅｒ社のＮＦＷ（分画分子量３００〜５００）、ＮＦＧ（分画分子量６００〜８００）、ＮＤＸ（分画分子量８００〜１，０００）などが挙げられる。
本発明のグルコース組成物には、本発明の効果を阻害しない範囲においては前述のキシロース、酢酸、クマル酸、フェルラ酸の他の物質が含まれてもよく、例えば、セルロース含有バイオマスを原料としてバガスを使用して本発明のグルコース組成物を製造する場合、１ｃｍ幅のセルで測定される２８０ｎｍに吸収を持つ物質が含まれていてもよい。本物質はバガス中のリグニンに由来する成分であると想定され、複雑な構造を有するために化学構造は特定されていないが、芳香環を有することによって紫外領域である２８０ｎｍに吸収を持ち、また、本物質の濃度は２８０ｎｍの吸光度に比例するという特徴を有する。本発明のグルコース組成物に本物質が含まれる場合の含有量は、本発明の効果を阻害しない範囲においては特に制限されないが、グルコース濃度が１００ｇ／Ｌの水溶液とした場合での相当量として、吸光度（ＡＢＳ）２０〜３５０で定義される濃度で含有することにより、微生物発酵での発酵収率をさらに高めることができる。
前記１ｃｍ幅のセルで測定される２８０ｎｍに吸収を持つ物質は、バガスを糖化酵素によって加水分解して得られる糖水溶液に含まれることから、セルロース含有バイオマスを原料とせずに調製されたグルコース組成物に、適宜、糖水溶液を配合することによって本物質を配合してもよい。
本発明のグルコース組成物は、グルコース濃度が１００ｇ／Ｌになるように該組成物を水に溶解させて得られる該組成物の水溶液に前述のとおり特定されるグルコース以外の物質を特定量含むものであれば、その形態に特に制限はなく、また、適宜、濃縮または希釈することで様々なグルコース濃度に調整してもよいが、水溶液の形態でグルコース濃度を６００ｇ／Ｌ以上にしておくことで、水分活性を低く抑えることができ、また、微生物のコンタミネーションによる糖の消費を防ぐことができ、保存安定性を高めることができる。
［微生物発酵用グルコース組成物］
本発明のグルコース組成物の用途は特に限定されないが、グルコースのみを使用する場合と比較して微生物発酵効率を高めることができることから、微生物発酵用途として好適に使用することができる。具体的には、本発明のグルコース組成物を微生物発酵用途として使用する場合、発酵効率、具体的には発酵速度、発酵収率対理論比、発酵収率対消費糖比または微生物増殖能において優れた効果を得ることができる。
発酵速度とは単位時間当たりに発酵生産物濃度が上昇する速度である。発酵速度は初速度が高く、糖が消費される発酵終盤になるにつれてゼロに近づく。本発明における発酵速度は、発酵開始から１２〜２４時間で測定した値を用いる。
発酵収率対理論比とは、糖減少量から発酵生産菌が有する理論的に得られることが可能な生産物濃度に対し、実際に生産物が生産された濃度の割合と定義される。理論的に得られることが可能な生産物は、エタノール発酵場合０．５１ｇ−エタノール／ｇ−消費糖、乳酸発酵の場合１．０ｇ−乳酸／ｇ−消費糖、コハク酸発酵の場合は検討する菌株によるがＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ Ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓの場合で０．６６ｇ−コハク酸／ｇ−消費糖である。
発酵収率対消費糖比とは、糖減少濃度に対し、生産物が生産された濃度の割合と定義される。例えば、糖原料としてグルコースしか消費されない場合は発酵収率対消費グルコース比という。
微生物増殖能は、発酵培養液のＯＤ値として測定される数値によって定量される。本発明のＯＤ値は可視光６００ｎｍにおける吸光度とし、１ｃｍ幅のセルを用いて分析用の分光光度計で測定することができる。
本発明のグルコース組成物がキシロースを含む場合、キシロースは発酵に用いる微生物によって資化性が異なるため、例えばキシロース資化性を有しない酵母では、ヘキソーストランスポーターの働きなどによりキシロースは微生物内に微量に取り込まれるが、資化されないため発酵収率対理論比は低下してしまう。しかしながら、キシロース、酢酸、クマル酸、フェルラ酸が含まれる本発明のグルコース組成物では、キシロースの微生物への取り込みが抑えられ、それにより、グルコースの代謝を主とする発酵速度、発酵収率対理論比を向上させることができる。また、キシロース資化性を有する微生物においては、酢酸、クマル酸、フェルラ酸が含まれることによってキシロースから生産物への変換が促進され、発酵速度、発酵収率対理論比を向上させることができる。
［微生物発酵原料］
本発明のグルコース組成物はそれ単独でも微生物発酵原料として利用することができるが、発酵生産に用いる微生物の種類に応じて、窒素源やビタミンの供給を目的に副原料を適宜添加した微生物発酵原料を調製してもよい。副原料としては、酵母エキス、ペプトン、コーンスティープリカー（ＣＳＬ）などの天然物に由来する成分や、ミネラル、ビタミンなどが挙げられる。
本発明のグルコース組成物を微生物発酵原料として利用する場合のグルコース濃度は特に制限はないが、１０〜２００ｇ／Ｌの範囲であることが好ましい。またグルコース、キシロースが消費した段階で、グルコース、キシロースのみを追添加しても良い。
［化学品の製造方法］
本発明のグルコース組成物を含有する微生物発酵原料を使用して、所望の化学品を生産する微生物を培養することで、所望の化学品を製造することができる。
微生物の培養方法としては特に制限はなく、当業者に公知の発酵培養方法に従って培養することができるが、生産性の観点から、ＷＯ２００７／０９７２６０に開示される連続培養方法が好ましく採用される。
本発明のグルコース組成物を発酵原料として化学品を発酵生産しうる微生物としては、具体的には、酵母、乳酸菌、コハク酸生産菌、大腸菌、アルコール発酵菌、有機酸発酵菌、アミノ酸発酵菌などが挙げられるが、好ましくは、酵母、乳酸菌、コハク酸生産菌である。これら微生物は、自然環境から単離されたものであっても、突然変異や遺伝子組み換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。
化学品としては、アルコール、有機酸、アミノ酸、核酸など発酵工業において大量生産されている物質を挙げることができる。例えば、エタノール、１，３−プロパンジオール、１，４−ブタンジオール、グリセロールなどのアルコール、乳酸、コハク酸、ピルビン酸、リンゴ酸、イタコン酸、クエン酸などの有機酸、イノシン、グアノシンなどのヌクレオシド、イノシン酸、グアニル酸などのヌクレオチド、リジン、グルタミン酸、トリプトファン、バリン、スレオニン、アスパラギン酸、アラニン、オルニチン、アミノレブリン酸などのアミノ酸、カダベリンなどのアミン化合物を挙げることができる。さらに、酵素、抗生物質、組換えタンパク質などの生産に適用することも可能である。発酵生産するものとして好ましくは、エタノール、乳酸、コハク酸、リジン、カダベリンである。
前記化学品を発酵生産しうる酵母としては、具体的には、例えばサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス・ポンべ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｐｏｍｂｅ）、ピキア・スチピティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、キャンディダ・シハタエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｈｅｈａｔａｅ）、キャンディダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）等が挙げられる。
乳酸菌としては、具体的には、例えばラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物などが挙げられ、さらに具体的には、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、バシラス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃｏａｇｕｌａｎｓ）などが挙げられる。
コハク酸生産菌としては、具体的には、例えばアクチノバチルス・スクシノジェネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）などが挙げられる。
リジン生産菌としては大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、コリネ型細菌などが挙げられる。大腸菌の具体例としては、ＭＣ１０６１株、ＨＢ１０１株、ＪＭ１０５株、ＪＭ１０９株、ＤＨ５α株及びＪＥ５５０５株などを用いることができる。コリネ型細菌とは好気性のグラム陽性桿菌であり、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが、現在、コリネバクテリウム属に統合された細菌も含まれる（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．，Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，（１９８１）４１,ｐ．２２５）。また、コリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。このようなコリネ型細菌の例として、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｙｌｕｍ）、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・アルカノリティカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｌｋａｎｏｌｙｔｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・リリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｌｉｕｍ）、コリネバクテリウム・メラセコーラ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌｌａｓｓｅｃｏｌａ）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・エッフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウム・ハーキュリス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｒｃｕｌｉｓ）、ブレビバクテリウム・ディバリカタム（Ｂｒｅｖｉｖａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｖａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・インマリオフィラム（Ｂｒｅｖｉｖａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｖａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ブレビバクテリウム・ロゼウム（Ｂｒｅｖｉｖａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Ｂｒｅｖｉｖａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・チオゲニタリス（Ｂｒｅｖｉｖａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｉｏｇｅｎｉｔａｌｉｓ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、ブレビバクテリウム・アルバム（Ｂｒｅｖｉｖａｃｔｅｒｉｕｍ ａｌｂｕｍ）、ブレビバクテリウム・セリヌム（Ｂｒｅｖｉｖａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｅｒｉｎｕｍ）、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ）が挙げられる。
以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらに限定されるものではない。
（参考例１）エタノール発酵評価試験に用いる酵母調製（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｅｃｉａｅ）
エタノール発酵微生物として、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｅｃｉａｅ）（ワイン用酵母ＯＣ２株、ＮＢＲＣ２２６０）を用いた。ＹＰＤ培地（ペプトン、酵母エキス濃縮液とグルコース濃縮液をそれぞれ１２１℃、２０分オートクレーブ殺菌し、ペプトン２０ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌグルコース１０ｇ／Ｌに調製したもの）２ｍＬを試験管に投入し、クリーンベンチ内において、ＹＰＤ寒天培地でプレート培養（３０℃、１〜２日）して形成された酵母のコロニーを、白金耳を使用して植菌した。これを、振とう装置（ＴＡＩＴＥＣ社製、ＢＩＯ−ＳＨＡＫＥＲ ＢＲ−４０ＬＦ）を用いて、傾き５０度、３０℃、１２０ｒｐｍで２４時間、往復振とう培養し、前培養液を得た。前培養液を１５，０００×ｇ、５分、４℃で遠心分離し、上清を除去後、生理食塩水２ｍＬに懸濁し、ＯＤ７．５の前培養菌体液を得た。
（参考例２）糖、エタノール濃度の測定
糖液に含まれるグルコースおよびキシロース濃度、ならびに発酵生産されるエタノール濃度は、下記に示すＨＰＬＣ条件で、標品との比較により定量した。
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ ＳＨ１０１１（昭和電工株式会社製）
移動相：硫酸５ｍＭ（流速０．６ｍＬ／分）
反応液：なし
検出方法：ＲＩ（示差屈折率）
温度：６５℃。
（実施例１）グルコース組成物の作製とエタノール発酵生産
グルコース（和光純薬株式会社製、Ｄ（＋）グルコース）を１００ｇ／Ｌ、酢酸（和光純薬株式会社製、試薬特級９９．７％）０．１ｇ／Ｌ、クマル酸（東京化成株式会社製、トランス−ｐ−クマル酸）０．１５ｇ／Ｌ、フェルラ酸（東京化成株式会社製、トランス−フェルラ酸）０．００７ｇ／Ｌとなるように純水に溶解させ、グルコース組成物を作製した。なお、クマル酸、フェルラ酸は酸性では溶解しないため、６Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ８となるようなそれぞれ１ｇ／Ｌの濃縮液を調製し、その濃縮液を希釈することで調製した。また、グルコース組成物は最終ｐＨが７となるように、６Ｎ水酸化ナトリウムを用いて調整した。
作製したグルコース組成物９ｍＬに、窒素源として２０％ＣＳＬ（王子コーンスターチ株式会社製、１ＮＮａＯＨでｐＨ５に調整後、平均細孔径０．４５μｍのフィルター滅菌）溶液１ｍＬを加え、参考例１に記載した前培養菌体を初期ＯＤ０．５となるように植菌した。これを傾き５０度、３０℃、１２０ｒｐｍで１４４時間往復振とう培養した。約２４時間おきにサンプリングを行い、糖濃度、エタノール濃度を分析し、最大発酵速度、発酵収率対理論比（エタノールの理論収率を０．５１ｇ／ｇ−消費全糖とした時の対理論比）を求めた。また、微生物増殖能の評価として培養４８時間後の培養液のＯＤ（ＯＤ６００）を測定した。結果を表１に示す。
（実施例２）グルコース組成物の作製とエタノール発酵生産
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース（和光純薬株式会社製、Ｄ（＋）キシロース）０．７ｇ／Ｌ、酢酸０．１ｇ／Ｌ、クマル酸０．１５ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．００７ｇ／Ｌとする以外は、実施例１と同様の操作を行った。結果を表１に示す。
（実施例３）グルコース組成物の作製とエタノール発酵生産
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース２２．３ｇ／Ｌ、酢酸１ｇ／Ｌ、クマル酸０．５ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．０６ｇ／Ｌとする以外は、実施例１と同様の操作を行った。結果を表１に示す。
（実施例４）グルコース組成物の作製とエタノール発酵生産
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース２５ｇ／Ｌ、酢酸１０ｇ／Ｌ、クマル酸２ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．２８ｇ／Ｌとする以外は、実施例１と同様の操作を行った。結果を表１に示す。
（比較例１）グルコース組成物のエタノール発酵生産比較例
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌのみとする以外は実施例１と同様の操作を行った。結果を表１に示す。
（比較例２）グルコース組成物のエタノール発酵生産比較例
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース２２．３ｇ／Ｌ、酢酸１５ｇ／Ｌ、クマル酸０．５ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．０６ｇ／Ｌとする以外は、実施例１と同様の操作を行った。結果を表１に示す。
（比較例３）グルコース組成物のエタノール発酵生産比較例
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース２２．３ｇ／Ｌ、酢酸添加せず、クマル酸０．５ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．０６ｇ／Ｌとする以外は、実施例１と同様の操作を行った。結果を表１に示す。
（比較例４）グルコース組成物のエタノール発酵生産比較例
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース２２．３ｇ／Ｌ、酢酸１ｇ／Ｌ、クマル酸３．０ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．０６ｇ／Ｌとする以外は、実施例１と同様の操作を行った。結果を表１に示す。
（比較例５）グルコース組成物のエタノール発酵生産比較例
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース２２．３ｇ／Ｌ、酢酸１ｇ／Ｌ、クマル酸添加なし、フェルラ酸０．０６ｇ／Ｌとする以外は、実施例１と同様の操作を行った。結果を表１に示す。
（比較例６）グルコース組成物のエタノール発酵生産比較例
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース２２．３ｇ／Ｌ、酢酸１ｇ／Ｌ、クマル酸０．５ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．４ｇ／Ｌとする以外は、実施例１と同様の操作を行った。結果を表１に示す。
（比較例７）グルコース組成物のエタノール発酵生産比較例
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース２２．３ｇ／Ｌ、酢酸１ｇ／Ｌ、クマル酸０．５ｇ／Ｌ、フェルラ酸添加なしとする以外は、実施例１と同様の操作を行った。結果を表１に示す。
（比較例８）グルコース組成物のエタノール発酵生産比較例
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース５０ｇ／Ｌ、酢酸１ｇ／Ｌ、クマル酸０．５ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．０６ｇ／Ｌとする以外は、実施例１と同様の操作を行った。結果を表１に示す。
Figure 2017154955
（参考例３）糸状菌由来セルラーゼ（培養液）の調製方法
糸状菌由来セルラーゼ（培養液）は、次の方法で調製した。
［前培養］
コーンスティープリカー（ＣＳＬ）５％（ｗ／ｖｏｌ）、グルコース２％（ｗ／ｖｏｌ）、酒石酸アンモニウム０．３７％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸アンモニウム０．１４（ｗ／ｖｏｌ）、リン酸二水素カリウム０．２％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化カルシウム二水和物０．０３％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸マグネシウム七水和物０．０３％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化亜鉛０．０２％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化鉄（ＩＩＩ）六水和物０．０１％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸銅（ＩＩ）五水和物０．００４％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化マンガン四水和物０．０００８％（ｗ／ｖｏｌ）、ホウ酸０．０００６％（ｗ／ｖｏｌ）、七モリブデン酸六アンモニウム四水和物０．００２６％（ｗ／ｖｏｌ）となるように蒸留水に添加し、１００ｍＬを５００ｍＬバッフル付き三角フラスコに張り込み、１２１℃の温度で１５分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、これとは別に、それぞれ１２１℃の温度で１５分間オートクレーブ滅菌したＰＥ−ＭとＴｗｅｅｎ８０を、それぞれ０．０１％（ｗ／ｖｏｌ）添加した。この前培養培地に、トリコデルマ・リーセイＡＴＣＣ６６５８９を１×１０５個／ｍＬになるように植菌し、２８℃の温度で７２時間、１８０ｒｐｍで振とう培養し、前培養とした（振とう装置：ＴＡＩＴＥＣ社製 ＢＩＯ−ＳＨＡＫＥＲ ＢＲ−４０ＬＦ）。
［本培養］
コーンスティープリカー（ＣＳＬ）５％（ｗ／ｖｏｌ）、グルコース２％（ｗ／ｖｏｌ）、セルロース（旭化成ケミカルズ社製、商品名：アビセル）１０％（ｗ／ｖｏｌ）、酒石酸アンモニウム０．３７％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸アンモニウム０．１４％（ｗ／ｖｏｌ）、リン酸二水素カリウム０．２％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化カルシウム二水和物０．０３％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸マグネシウム七水和物０．０３％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化亜鉛０．０２％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化鉄（ＩＩＩ）六水和物０．０１％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸銅（ＩＩ）五水和物０．００４％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化マンガン四水和物０．０００８％（ｗ／ｖｏｌ）、ホウ酸０．０００６％（ｗ／ｖｏｌ）、七モリブデン酸六アンモニウム四水和物０．００２６％（ｗ／ｖｏｌ）となるように蒸留水に添加し、２．５Ｌを５Ｌ容撹拌ジャー（ＡＢＬＥ社製、ＤＰＣ−２Ａ）容器に張り込み、１２１℃の温度で１５分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、これとは別に、それぞれ１２１℃の温度で１５分間オートクレーブ滅菌したＰＥ−ＭとＴｗｅｅｎ８０を、それぞれ０．１％添加し、あらかじめ前記の方法で液体培地で前培養したトリコデルマ・リーセイＡＴＣＣ６６５８９を２５０ｍＬ接種した。その後、２８℃の温度で８７時間、３００ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍの条件で振とう培養を行い、遠心分離後、上清を膜ろ過（ミリポア社製の“ステリカップ−ＧＶ”、材質：ＰＶＤＦ）した。この前述の条件で調製した培養液を糸状菌由来セルラーゼとして、以下の実施例に使用した。
（参考例４）セルラーゼ濃度の測定
水溶液中のセルラーゼ濃度はブラッドフォード法によって測定した酵素液中のタンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）の値を基準とした。タンパク質の濃度は、ブラッドフォード法による測定キット（Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を使用して測定した。
（実施例５）セルロース含有バイオマスを原料としたグルコース組成物の作製とエタノール発酵生産
バガス乾燥重量１ｋｇに対し、バイオマス仕込み量５％で３０ｇの苛性ソーダを混合し、９０℃、３時間反応させアルカリ処理バガスを作製した。アルカリ処理バガスをスクリュープレスで固液分離し、含水率６０％の固液分離固体を得た。
得られた固液分離固体を固形分濃度５％で再度懸濁し、参考例３で作製した糸状菌由来セルラーゼを参考例４で示す測定によりタンパク量８ｍｇ／ｇ−バガスで加水分解を行い、グルコース組成物糖化液を得た。加水分解条件としては、４０℃、ｐＨ７．０、反応時間２４時間とした。得られたグルコース組成物糖化液をスクリューデカンタで固形分を除去し、回収したグルコース組成物糖液を、孔径０．２２μｍの精密ろ過膜を用いて全量濾過後、さらに得られた透過液を限外ろ過膜によるろ過処理を行った。限外ろ過膜は、ＴＭＵＳ１０ｋ（Ｔｏｒａｙ Ｍｅｍｂｒａｎｅ ＵＳＡ社製、材質：ポリビニリデンフルオライド、分画分子量:１０，０００）を用いた。限外ろ過は、平膜ろ過ユニット“ＳＥＰＡ−ＩＩ”（ＧＥオスモニクス製）を用い、膜面線速度２０ｃｍ／秒、ろ過圧３ＭＰａの条件下で非透過側から回収される液量が０．６Ｌになるまでろ過処理を行い、透過側にグルコース組成物糖化液を得た。
得られたグルコース組成物糖化液を分離膜（Ｓｙｎｄｅｒ社製、ＮＦＷ（材質：ピペラジンポリアミド、分画分子量３００〜５００））による濾過処理を行った。濾過処理は膜面線速度２０ｃｍ／秒、ろ過圧３ＭＰａの条件下で非透過側の濃縮倍率が１２倍までろ過処理を行い、透過側にグルコース組成物を得た。
得られたグルコース組成物をエバポレーターで濃縮し、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース２２．３ｇ／Ｌ、酢酸１．０ｇ／Ｌ、クマル酸（トランス−ｐ−クマル酸）０．５ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．０６ｇ／Ｌ、１ｃｍ幅のセルで測定される２８０ｎｍに吸収を持つ物質が吸光度（ＡＢＳ）１２８で定義される濃度のグルコース組成物を作製した。また、グルコース組成物は最終ｐＨが７となるように、６Ｎ水酸化ナトリウムを用いて調整した。
作製したグルコース組成物９ｍＬに、窒素源として２０％コーンスティープリカー（ＣＳＬ）（王子コーンスターチ株式会社製、１Ｎ ＮａＯＨでｐＨ５に調整後、平均細孔径０．４５μｍのフィルター滅菌）溶液１ｍＬを加え、参考例１に記載した前培養菌体（サッカロマイセス・セレビシエ（ワイン用酵母ＯＣ２株、ＮＢＲＣ２２６０））を初期ＯＤ０．５となるように植菌した。これを傾き５０度、３０℃、１２０ｒｐｍで１４４時間往復振とう培養した。約２４時間おきにサンプリングを行い、糖濃度、エタノール濃度を分析し、最大発酵速度、発酵収率対理論比を求めた。また、微生物増殖能の評価として培養４８時間後の培養液のＯＤ（ＯＤ６００）を測定した。結果を表２に示す。
（実施例６）セルロース含有バイオマスを原料としたグルコース組成物の作製とエタノール発酵生産
分離膜を東レ株式会社製のＵＴＣ−６０（材質：ピペラジンポリアミド、分画分子量２００〜２５０）とする以外は実施例５と同様の操作を行い、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース２２．３ｇ／Ｌ、酢酸１．０ｇ／Ｌ、クマル酸０．５ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．０６ｇ／Ｌ、１ｃｍ幅のセルで測定される２８０ｎｍに吸収を持つ物質が吸光度（ＡＢＳ）１２で定義される濃度のグルコース組成物を作製した。作製したグルコース組成物に関して実施例５と同様にエタノール発酵生産を行った。結果を表２に示す。
（実施例７）セルロース含有バイオマスを原料としたグルコース組成物の作製とエタノール発酵生産
分離膜を東レ株式会社製のＵＴＣ−６０とする以外は実施例５と同様の操作行い、透過液として得られたグルコース組成物に、アルカリ処理バガスの固液分離液体を体積比で１／８００添加し、エバポレーターで濃縮したところ、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース２２．３ｇ／Ｌ、酢酸１．０ｇ／Ｌ、クマル酸０．５ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．０６ｇ／Ｌ、１ｃｍ幅のセルで測定される２８０ｎｍに吸収を持つ物質が吸光度（ＡＢＳ）２０で定義される濃度のグルコース組成物を作製した。また、グルコース組成物は最終ｐＨが７となるように、６Ｎ塩酸を用いて調整した。作製したグルコース組成物に関して実施例５と同様にエタノール発酵生産を行った。結果を表２に示す。
（実施例８）セルロース含有バイオマスを原料としたグルコース組成物の作製とエタノール発酵生産
分離膜をＳｙｎｄｅｒ社のＮＤＸ（材質：ピペラジンポリアミド、分画分子量８００〜１，０００）とする以外は実施例５と同様の操作を行い、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース２２．３ｇ／Ｌ、酢酸１．０ｇ／Ｌ、クマル酸（トランス−ｐ−クマル酸）０．５ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．０６ｇ／Ｌ、１ｃｍ幅のセルで測定される２８０ｎｍに吸収を持つ物質が吸光度（ＡＢＳ）３５０で定義される濃度のグルコース組成物を作製した。作製したグルコース組成物に関して実施例５と同様にエタノール発酵生産を行った。結果を表２に示す。
（実施例９）セルロース含有バイオマスを原料としたグルコース組成物の作製とエタノール生産
分離膜をＧＥのＧＨシリーズ（材質：ポリエチレングリコール、分画分子量２，５００）とする以外は実施例５と同様の操作を行い、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース２２．３ｇ／Ｌ、酢酸１．０ｇ／Ｌ、クマル酸０．５ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．０６ｇ／Ｌ、１ｃｍ幅のセルで測定される２８０ｎｍに吸収を持つ物質が吸光度（ＡＢＳ）１，０４０で定義される濃度のグルコース組成物を作製した。また、グルコース組成物は最終ｐＨが７となるように、６Ｎ塩酸を用いて調整した。作製したグルコース組成物に関して実施例５と同様にエタノール発酵生産を行った。結果を表２に示す。
Figure 2017154955
（参考例５）乳酸発酵評価試験に用いる乳酸菌の調製
乳酸発酵微生物として、バシラス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃｏａｇｕｌａｎｓ）ＮＢＲＣ１２５８３株を用いた。ＭＲＳ培地２ｍＬを試験管に投入し、クリーンベンチ内において、ＭＲＳ寒天プレート培養（４２℃、１〜２日）して形成されたＢａｃｉｌｌｕｓ Ｃｏａｇｕｌａｎｓのコロニーを、白金耳を使用して植菌した。これを、振とう装置（ＴＡＩＴＥＣ社製、ＢＩＯ−ＳＨＡＫＥＲ ＢＲ−４０ＬＦ）を用いて、傾き５０度、４２℃、１２０ｒｐｍで２４時間、往復振とう培養し、前培養液を得た。前培養液を１５，０００×ｇ、５分、４℃で遠心分離し、上清を除去後、生理食塩水２ｍＬに懸濁し、ＯＤ２．８の前培養菌体液を得た。
（参考例６）乳酸、コハク酸濃度の測定
糖液に含まれる乳酸およびコハク酸濃度は、下記に示すＨＰＬＣ条件で、標品との比較により定量した。
カラム：Ｓｈｉｍ−Ｐａｃｋ ＳＰＲ−Ｈ（株式会社島津製作所製）
移動相：ｐ−トルエンスルホン酸塩５ｍＭ（流速０．８ｍＬ／分）
反応液：ｐ−トルエンスルホン酸塩５ｍＭ、ビストリス２０ｍＭ、ＥＤＴＡ・２Ｎａ０．１ｍＭ（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：電気伝導度
温度：４５℃。
（実施例１０）グルコース組成物の作製と乳酸発酵生産
グルコース（和光純薬株式会社製、Ｄ（＋）グルコース）を１００ｇ／Ｌ、酢酸（和光純薬株式会社製、試薬特級９９．７％）０．２ｇ／Ｌ、クマル酸（東京化成株式会社製、トランス−ｐ−クマル酸）０．３ｇ／Ｌ、フェルラ酸（東京化成株式会社製、トランス−フェルラ酸）０．０１４ｇ／Ｌとなるように純水に溶解させグルコース組成物を作製した。なお、クマル酸、フェルラ酸は酸性では溶解しないため、６Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ８となるようなそれぞれ１ｇ／Ｌの濃縮液を調製し、その濃縮液を希釈することで調製した。また、グルコース組成物は最終ｐＨが７となるように、６Ｎ水酸化ナトリウムを用いて調整した。
作製したグルコース組成物４．５ｍＬに、窒素源などの副原料として終濃度換算で酵母エキス１０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸水素２カリウム０．４ｇ／Ｌ、炭酸カルシウム２０ｇ／Ｌとなるように溶解した濃縮液５．５ｍＬを添加し、参考例５に記載した前培養菌体液を１％植菌した。これを、４２℃で１４４時間静置培養した。約２４時間おきにサンプリングを行い、参考例２、参考例６に記載の方法で糖濃度、乳酸濃度を分析し、最大発酵速度、発酵収率対理論比（乳酸の理論収率を１．０ｇ／ｇ−消費全糖とした時の対理論比）を求めた。また、微生物増殖能の評価として培養４８時間後の培養液のＯＤ（ＯＤ６００）を測定した。結果を表３に示す。
（実施例１１）グルコース組成物の作製と乳酸発酵生産
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース（和光純薬株式会社製、Ｄ（＋）キシロース）１．４ｇ／Ｌ、酢酸０．２ｇ／Ｌ、クマル酸０．３ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．０１４ｇ／Ｌとする以外は、実施例１０と同様の操作を行った。結果を表３に示す。
（実施例１２）グルコース組成物の作製と乳酸発酵生産
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース２２．３ｇ／Ｌ、酢酸１ｇ／Ｌ、クマル酸０．５ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．０６ｇ／Ｌとする以外は、実施例１０と同様の操作を行った。結果を表３に示す。
（実施例１３）グルコース組成物の作製と乳酸発酵生産
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース２５ｇ／Ｌ、酢酸４ｇ／Ｌ、クマル酸０．８ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．１４ｇ／Ｌとする以外は、実施例１０と同様の操作を行った。結果を表３に示す。
（比較例９）グルコース組成物の乳酸発酵生産比較例
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌのみとする以外は実施例１０と同様の操作を行った。結果を表３に示す。
（比較例１０）グルコース組成物の乳酸発酵比較例
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース２２．３ｇ／Ｌ、酢酸１５ｇ／Ｌ、クマル酸０．５ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．０６ｇ／Ｌとする以外は、実施例１０と同様の操作を行った。結果を表３に示す。
（比較例１１）グルコース組成物の乳酸発酵比較例
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース２２．３ｇ／Ｌ、酢酸添加せず、クマル酸０．５ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．０６ｇ／Ｌとする以外は、実施例１０と同様の操作を行った。結果を表３に示す。
（比較例１２）グルコース組成物の乳酸発酵比較例
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース２２．３ｇ／Ｌ、酢酸１ｇ／Ｌ、クマル酸３ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．０６ｇ／Ｌとする以外は、実施例１０と同様の操作を行った。結果を表３に示す。
（比較例１３）グルコース組成物の乳酸発酵比較例
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース２２．３ｇ／Ｌ、酢酸１ｇ／Ｌ、クマル酸添加なし、フェルラ酸０．０６ｇ／Ｌとする以外は、実施例１０と同様の操作を行った。結果を表３に示す。
（比較例１４）グルコース組成物の乳酸発酵比較例
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース２２．３ｇ／Ｌ、酢酸１ｇ／Ｌ、クマル酸０．５ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．４ｇ／Ｌとする以外は、実施例１０と同様の操作を行った。結果を表３に示す。
（比較例１５）グルコース組成物の乳酸発酵比較例
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌに対し、キシロース２２．３ｇ／Ｌ、酢酸１ｇ／Ｌ、クマル酸０．５ｇ／Ｌ、フェルラ酸添加なし とする以外は、実施例１０と同様の操作を行った。結果を表３に示す。
（比較例１６）グルコース組成物の乳酸発酵比較例
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌに対し、キシロース５０ｇ／Ｌ、酢酸１ｇ／Ｌ、クマル酸０．５ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．０６ｇ／Ｌとする以外は、実施例１０と同様の操作を行った。結果を表３に示す。
Figure 2017154955
（実施例１４）セルロース含有バイオマスを原料としたグルコース組成物の作製と乳酸発酵生産
実施例５で作製したグルコース組成物を用いて、実施例１０と同様に乳酸発酵を行った。結果を表４に示す。
（実施例１５）セルロース含有バイオマスを原料としたグルコース組成物の作製と乳酸発酵生産
実施例６で作製したグルコース組成物を用いて、実施例１０と同様に乳酸発酵を行った。結果を表４に示す。
（実施例１６）セルロース含有バイオマスを原料としたグルコース組成物の作製と乳酸発酵生産
実施例７で作製したグルコース組成物を用いて、実施例１０と同様に乳酸発酵を行った。結果を表４に示す。
（実施例１７）セルロース含有バイオマスを原料としたグルコース組成物の作製と乳酸発酵生産
実施例８で作製したグルコース組成物を用いて、実施例１０と同様に乳酸発酵を行った。結果を表４に示す。
（実施例１８）セルロース含有バイオマスを原料としたグルコース組成物の作製と乳酸発酵生産
実施例９で作製したグルコース組成物を用いて、実施例１０と同様に乳酸発酵を行った。結果を表４に示す。
Figure 2017154955
（参考例７）コハク酸発酵評価試験に用いるコハク酸発酵菌調製
コハク酸発酵微生物として、アクチノバチルス・スクシノジェネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ Ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ５５６１８株を用いた。Ｔｒｉｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ（和光純薬株式会社製）からなる培地を、合計５本の各試験管に２ｍＬずつ投入し、クリーンベンチ内において、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ Ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓのグリセロールストック０．２ｍＬを植菌した。これを、振とう装置（ＴＡＩＴＥＣ社製、ＢＩＯ−ＳＨＡＫＥＲ ＢＲ−４０ＬＦ）を用いて、傾き５０度、３７℃、１２０ｒｐｍで２４時間、往復振とう培養し、前培養液計１０ｍＬを得た。前培養液を１５，０００×ｇ、５分、４℃で遠心分離し、上清を除去後、生理食塩水１ｍＬに懸濁し、ＯＤ８．０の前培養菌体液を得た。
（実施例１９）グルコース組成物の作製とコハク酸発酵生産
グルコース（和光純薬株式会社製、Ｄ（＋）グルコース）を１００ｇ／Ｌ、酢酸（和光純薬株式会社製、試薬特級９９．７％）０．２ｇ／Ｌ、クマル酸（東京化成株式会社製、トランス−ｐ−クマル酸）０．３ｇ／Ｌ、フェルラ酸（東京化成株式会社製、トランス−フェルラ酸）０．０１４ｇ／Ｌとなるように純水に溶解させグルコース組成物を作製した。なお、クマル酸、フェルラ酸は酸性では溶解しないため、６Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ８となるようなそれぞれ１ｇ／Ｌの濃縮液を調製し、その濃縮液を希釈することで調製した。また、グルコース組成物は最終ｐＨが７となるように、６Ｎ水酸化ナトリウムを用いて調整した。
作製したグルコース組成物４．５ｍＬに、窒素源などの副原料として終濃度換算でＢａｃｔｏＴＭ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製）１６ｇ／Ｌ、コーンスティープリカー（ＣＳＬ）（王子コーンスターチ株式会社製）１２ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム３ｇ／Ｌ、リン酸水素２カリウム１．５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１ｇ／Ｌ、塩化マグネシウム・６水和物０．６４ｇ／Ｌ、塩化カルシウム０．３ｇ／Ｌ、炭酸マグネシウム４０ｇ／Ｌとなるように溶解した濃縮液５．５ｍＬを添加し、参考例７に記載した前培養液を０．２ｍＬ植菌した。これを、３７℃で１４４時間静置培養した。約２４時間おきにサンプリングを行い、参考例２、参考例６に記載の方法で糖濃度、コハク酸濃度を分析し、最大発酵速度、発酵収率対理論比（コハク酸の理論収率を０．６６ｇ／ｇ−消費全糖とした時の対理論比）を求めた。また、微生物増殖能の評価として培養４８時間後の培養液のＯＤ（ＯＤ６００）を測定した。結果を表５に示す。
（実施例２０）グルコース組成物の作製とコハク酸発酵生産
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース１．４ｇ／Ｌ、酢酸０．２ｇ／Ｌ、クマル酸０．３ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．０１４ｇ／Ｌとする以外は、実施例１９と同様の操作を行った。結果を表５に示す。
（実施例２１）グルコース組成物の作製とコハク酸発酵生産
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース２２．３ｇ／Ｌ、酢酸１．０ｇ／Ｌ、クマル酸０．５ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．０６ｇ／Ｌとする以外は、実施例１９と同様の操作を行った。結果を表５に示す。
（実施例２２）グルコース組成物の作製とコハク酸発酵生産
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース２５．０ｇ／Ｌ、酢酸４ｇ／Ｌ、クマル酸０．８ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．１４ｇ／Ｌとする以外は、実施例１９と同様の操作を行った。結果を表５に示す。
（比較例１７）グルコース組成物のコハク酸発酵生産比較例
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌのみとする以外は実施例１９と同様の操作を行った。結果を表５に示す。
（比較例１８）グルコース組成物のコハク酸発酵生産比較例
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース２２．３ｇ／Ｌ、酢酸１５ｇ／Ｌ、クマル酸０．５ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．０６ｇ／Ｌとする以外は、実施例１９と同様の操作を行った。結果を表５に示す。
（比較例１９）グルコース組成物のコハク酸発酵生産比較例
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース２２．３ｇ／Ｌ、酢酸添加せず、クマル酸０．５ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．０６ｇ／Ｌとする以外は、実施例１９と同様の操作を行った。結果を表５に示す。
（比較例２０）グルコース組成物のコハク酸発酵生産比較例
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース２２．３ｇ／Ｌ、酢酸１．０ｇ／Ｌ、クマル酸３．０ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．０６ｇ／Ｌとする以外は、実施例１９と同様の操作を行った。結果を表５に示す。
（比較例２１）グルコース組成物のコハク酸発酵生産比較例
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース２２．３ｇ／Ｌ、酢酸１．０ｇ／Ｌ、クマル酸添加なし、フェルラ酸０．０６ｇ／Ｌとする以外は、実施例１９と同様の操作を行った。結果を表５に示す。
（比較例２２）グルコース組成物のコハク酸発酵生産比較例
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース２２．３ｇ／Ｌ、酢酸１．０ｇ／Ｌ、クマル酸０．５ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．４ｇ／Ｌとする以外は、実施例１９と同様の操作を行った。結果を表５に示す。
（比較例２３）グルコース組成物のコハク酸発酵生産比較例
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌに対し、キシロース２２．３ｇ／Ｌ、酢酸１．０ｇ／Ｌ、クマル酸０．５ｇ／Ｌ、フェルラ酸添加なし とする以外は、実施例１９と同様の操作を行った。結果を表５に示す。
（比較例２４）グルコース組成物のコハク酸発酵生産比較例
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌに対し、キシロース５０ｇ／Ｌ、酢酸１．０ｇ／Ｌ、クマル酸０．５ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．０６ｇ／Ｌとする以外は、実施例１９と同様の操作を行った。結果を表５に示す。
Figure 2017154955
（実施例２３）セルロース含有バイオマスを原料としたグルコース組成物の作製とコハク酸発酵生産
実施例５に示すグルコース組成物を用いて、実施例１９と同様にコハク酸発酵を行った。結果を表６に示す。
（実施例２４）セルロース含有バイオマスを原料としたグルコース組成物の作製とコハク酸生産
実施例６に示すグルコース組成物を用いて、実施例１９と同様にコハク酸発酵を行った。結果を表６に示す。
（実施例２５）セルロース含有バイオマスを原料としたグルコース組成物の作製とコハク酸生産
実施例７に示すグルコース組成物を用いて、実施例１９と同様にコハク酸発酵を行った。結果を表６に示す。
（実施例２６）セルロース含有バイオマスを原料としたグルコース組成物の作製とコハク酸生産
実施例８に示すグルコース組成物を用いて、実施例１９と同様にコハク酸発酵を行った。結果を表６に示す。
（実施例２７）セルロース含有バイオマスを原料としたグルコース組成物の作製とコハク酸生産
実施例９に示すグルコース組成物を用いて、実施例１９と同様にコハク酸発酵を行った。結果を表６に示す。
Figure 2017154955
（参考例８）アミノ酸発酵評価試験に用いるカダベリン発酵菌調製
カダベリンを生産させる微生物として、特開２００４−２２２５６９号公報に記載のコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｕｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＴＲ−ＣＡＤ１株用い、グルコースを資化するカダベリンの発酵を検討した。
前記ＴＲ−ＣＡＤ１株を、グルコース４５ｇ／Ｌ、クエン酸１ｇ／Ｌ、尿素１５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム０．５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌ、Ｌ−スレオニン０．８ｇ／Ｌ、Ｌ−メチオニン０．６ｇ／Ｌ、Ｌ−ロイシン１．５ｇ／Ｌ、硫酸鉄七水和物６ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン１水和物４．２ｇ／Ｌ、ビオチン１ｍｇ／Ｌ、チアミン２ｍｇ／Ｌ、カナマイシン２５μｇ／ｍＬの培地１００ｍＬと共に試験管に植菌し一晩振とう培養した（前培養）。前培養液よりコリネバクテリウム・グルタミカムＴＲ−ＣＡＤ１株を遠心分離により回収し、滅菌水１５ｍＬでよく洗浄しＯＤ５の前培養液を得た。
（参考例９）リジン、カダベリン濃度の測定
糖液に含まれるリジン、カダベリン濃度は、下記に示すＨＰＬＣ条件で、標品との比較により定量した。
カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８（株式会社資生堂製）
移動相：（０．１％リン酸水溶液：アセトニトリル）＝（４．５：５．５）
サンプル前処理：分析サンプル２５μＬに内標として、１，４−ジアミノブタン（０．０３Ｍ）を２５μＬ、炭酸水素ナトリウム（０．０７５Ｍ）を１５０μＬおよび２，４−ジニトロフルオロベンゼン（０．２Ｍ）のエタノール溶液を添加混合し、３７℃の温度で１時間保温する。上記の反応溶液５０μＬを１ｍＬアセトニトリルに溶解後、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心した後の上清１０μＬをＨＰＬＣで分析した。
検出方法：ＵＶ３６０ｎｍ。
（実施例２８）グルコース組成物の作製とカダベリン発酵生産
グルコース（和光純薬株式会社製、Ｄ（＋）グルコース）を１００ｇ／Ｌ、酢酸（和光純薬株式会社製、試薬特級９９．７％）０．２ｇ／Ｌ、クマル酸（東京化成株式会社製、トランス−ｐ−クマル酸）０．３ｇ／Ｌ、フェルラ酸（東京化成株式会社製、トランス−フェルラ酸）０．０１４ｇ／Ｌとなるように純水に溶解させグルコース組成物を作製した。なお、クマル酸、フェルラ酸は酸性では溶解しないため、６Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ８となるようなそれぞれ１ｇ／Ｌの濃縮液を調製し、その濃縮液を希釈することで調製した。また、グルコース組成物は最終ｐＨが７となるように、６Ｎ水酸化ナトリウムを用いて調整した。
作製したグルコース組成物４．５ｍＬに、副原料として終濃度換算でクエン酸１ｇ／Ｌ、尿素１５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム０．５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌ、Ｌ−スレオニン０．８ｇ／Ｌ、Ｌ−メチオニン０．６ｇ／Ｌ、Ｌ−ロイシン１．５ｇ／Ｌ、硫酸鉄七水和物６ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン１水和物４．２ｇ／Ｌ、ビオチン１ｍｇ／Ｌ、チアミン２ｍｇ／Ｌとなるように溶解した濃縮液５．５ｍＬを添加し、参考例８に記載した前培養液を０．２ｍＬ植菌した。これを、３７℃で４８時間振盪培養した。約１２時間おきにサンプリングを行い、参考例２、参考例９に記載の方法で糖濃度、カダベリン濃度を分析し、最大発酵速度、発酵収率対消費グルコース比を求めた。また、微生物増殖能の評価として培養４８時間後の培養液のＯＤ（ＯＤ６００）を測定した。結果を表７に示す。
（実施例２９）グルコース組成物の作製とカダベリン発酵生産
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース１．４ｇ／Ｌ、酢酸０．２ｇ／Ｌ、クマル酸０．３ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．０１４ｇ／Ｌとする以外は、実施例２８と同様の操作を行った。結果を表７に示す。
（実施例３０）グルコース組成物の作製とカダベリン発酵生産
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース２２．３ｇ／Ｌ、酢酸１．０ｇ／Ｌ、クマル酸０．５ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．０６ｇ／Ｌとする以外は、実施例２８と同様の操作を行った。結果を表７に示す。
（実施例３１）グルコース組成物の作製とカダベリン発酵生産
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース２５．０ｇ／Ｌ、酢酸４ｇ／Ｌ、クマル酸０．８ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．１４ｇ／Ｌとする以外は、実施例２８と同様の操作を行った。結果を表７に示す。
（比較例２５）グルコース組成物のカダベリン発酵生産比較例
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌのみとする以外は実施例２８と同様の操作を行った。結果を表７に示す。
（比較例２６）グルコース組成物のカダベリン発酵生産比較例
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース２２．３ｇ／Ｌ、酢酸１５ｇ／Ｌ、クマル酸０．５ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．０６ｇ／Ｌとする以外は、実施例２８と同様の操作を行った。結果を表７に示す。
（比較例２７）グルコース組成物のカダベリン発酵生産比較例
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース２２．３ｇ／Ｌ、酢酸添加せず、クマル酸０．５ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．０６ｇ／Ｌとする以外は、実施例２８と同様の操作を行った。結果を表７に示す。
（比較例２８）グルコース組成物のカダベリン発酵生産比較例
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース２２．３ｇ／Ｌ、酢酸１．０ｇ／Ｌ、クマル酸３．０ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．０６ｇ／Ｌとする以外は、実施例２８と同様の操作を行った。結果を表７に示す。
（比較例２９）グルコース組成物のカダベリン発酵生産比較例
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース２２．３ｇ／Ｌ、酢酸１．０ｇ／Ｌ、クマル酸添加なし、フェルラ酸０．０６ｇ／Ｌとする以外は、実施例２８と同様の操作を行った。結果を表７に示す。
（比較例３０）グルコース組成物のカダベリン発酵生産比較例
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース２２．３ｇ／Ｌ、酢酸１．０ｇ／Ｌ、クマル酸０．５ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．４ｇ／Ｌとする以外は、実施例２８と同様の操作を行った。結果を表７に示す。
（比較例３１）グルコース組成物のカダベリン発酵生産比較例
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌに対し、キシロース２２．３ｇ／Ｌ、酢酸１．０ｇ／Ｌ、クマル酸０．５ｇ／Ｌ、フェルラ酸添加なしとする以外は、実施例２８と同様の操作を行った。結果を表７に示す。
（比較例３２）グルコース組成物のカダベリン発酵生産比較例
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌに対し、キシロース５０ｇ／Ｌ、酢酸１．０ｇ／Ｌ、クマル酸０．５ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．０６ｇ／Ｌとする以外は、実施例２８と同様の操作を行った。結果を表７に示す。
Figure 2017154955
（実施例３２）セルロース含有バイオマスを原料としたグルコース組成物の作製とカダベリン発酵生産
実施例５に示すグルコース組成物を用いて、実施例２８と同様にカダベリン発酵を行った。結果を表８に示す。
（実施例３３）セルロース含有バイオマスを原料としたグルコース組成物の作製とカダベリン発酵生産
実施例６に示すグルコース組成物を用いて、実施例２８と同様にカダベリン発酵を行った。結果を表８に示す。
（実施例３４）セルロース含有バイオマスを原料としたグルコース組成物の作製とカダベリン発酵生産
実施例７に示すグルコース組成物を用いて、実施例２８と同様にカダベリン発酵を行った。結果を表８に示す。
（実施例２６）セルロース含有バイオマスを原料としたグルコース組成物の作製とカダベリン発酵生産
実施例８に示すグルコース組成物を用いて、実施例２８と同様にカダベリン発酵を行った。結果を表８に示す。
（実施例２７）セルロース含有バイオマスを原料としたグルコース組成物の作製とカダベリン発酵生産
実施例９に示すグルコース組成物を用いて、実施例２８と同様にカダベリン発酵を行った。結果を表８に示す。
Figure 2017154955
（参考例１０）アミノ酸発酵評価試験に用いるリジン発酵菌調製
リジンを合成できるコリネバクテリウム・グルタミカムを作製するため、リジン生合成遺伝子への有効変異導入によるリジン生産菌を作製した。Ａｐｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，（２００２），５８，ｐ．２１７−２２３に記載の方法により、コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＫ−１（以下ＡＫ-１株と略す）株を作製した。本菌株は、リジンおよびスレオニンによるフィードバック阻害が解除されている。そのためリジンを培養により合成できるようになっている。ＡＫ−１株用い、グルコースを資化するリジンの発酵を検討した。
ＡＫ−１株を、グルコース４５ｇ／Ｌ、クエン酸１ｇ／Ｌ、尿素１５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム０．５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌ、Ｌ−スレオニン０．８ｇ／Ｌ、Ｌ−メチオニン０．６ｇ／Ｌ、Ｌ−ロイシン１．５ｇ／Ｌ、硫酸鉄七水和物６ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン１水和物４．２ｇ／Ｌ、ビオチン１ｍｇ／Ｌ、チアミン２ｍｇ／Ｌ、カナマイシン２５μｇ／ｍＬの培地１００ｍＬと共に試験管に植菌し一晩振とう培養した（前培養）。前培養液よりＡＫ−１株を遠心分離により回収し、滅菌水１５ｍＬでよく洗浄しＯＤ５の前培養液を得た。
（実施例３７）グルコース組成物の作製とリジン発酵生産
グルコース（和光純薬株式会社製、Ｄ（＋）グルコース）を１００ｇ／Ｌ、酢酸（和光純薬株式会社製、試薬特級９９．７％）０．２ｇ／Ｌ、クマル酸（東京化成株式会社製、トランス−ｐ−クマル酸）０．３ｇ／Ｌ、フェルラ酸（東京化成株式会社製、トランス−フェルラ酸）０．０１４ｇ／Ｌとなるように純水に溶解させグルコース組成物を作製した。なお、クマル酸、フェルラ酸は酸性では溶解しないため、６Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ８となるようなそれぞれ１ｇ／Ｌの濃縮液を調製し、その濃縮液を希釈することで調製した。また、グルコース組成物は最終ｐＨが７となるように、６Ｎ水酸化ナトリウムを用いて調整した。
作製したグルコース組成物４．５ｍＬに、副原料として終濃度換算でクエン酸１ｇ／Ｌ、尿素１５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム０．５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌ、Ｌ−スレオニン０．８ｇ／Ｌ、Ｌ−メチオニン０．６ｇ／Ｌ、Ｌ−ロイシン１．５ｇ／Ｌ、硫酸鉄七水和物６ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン１水和物４．２ｇ／Ｌ、ビオチン１ｍｇ／Ｌ、チアミン２ｍｇ／Ｌとなるように溶解した濃縮液５．５ｍＬを添加し、参考例１０に記載した前培養液を０．２ｍＬ植菌した。これを、３７℃で４８時間振盪培養した。約１２時間おきにサンプリングを行い、参考例２、参考例９に記載の方法で糖濃度、リジン濃度を分析し、最大発酵速度、発酵収率対消費グルコース比を求めた。また、微生物増殖能の評価として培養４８時間後の培養液のＯＤ（ＯＤ６００）を測定した。結果を表９に示す。
（実施例３８）グルコース組成物の作製とリジン発酵生産
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース１．４ｇ／Ｌ、酢酸０．２ｇ／Ｌ、クマル酸０．３ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．０１４ｇ／Ｌとする以外は、実施例３７と同様の操作を行った。結果を表９に示す。
（実施例３９）グルコース組成物の作製とリジン発酵生産
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース２２．３ｇ／Ｌ、酢酸１．０ｇ／Ｌ、クマル酸０．５ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．０６ｇ／Ｌとする以外は、実施例３７と同様の操作を行った。結果を表９に示す。
（実施例４０）グルコース組成物の作製とリジン発酵生産
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース２５．０ｇ／Ｌ、酢酸４ｇ／Ｌ、クマル酸０．８ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．１４ｇ／Ｌとする以外は、実施例３７と同様の操作を行った。結果を表９に示す。
（比較例３３）グルコース組成物のリジン発酵生産比較例
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌのみとする以外は実施例３７と同様の操作を行った。結果を表９に示す。
（比較例３４）グルコース組成物のリジン発酵生産比較例
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース２２．３ｇ／Ｌ、酢酸１５ｇ／Ｌ、クマル酸０．５ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．０６ｇ／Ｌとする以外は、実施例３７と同様の操作を行った。結果を表９に示す。
（比較例３５）グルコース組成物のリジン発酵生産比較例
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース２２．３ｇ／Ｌ、酢酸添加せず、クマル酸０．５ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．０６ｇ／Ｌとする以外は、実施例３７と同様の操作を行った。結果を表９に示す。
（比較例３６）グルコース組成物のリジン発酵生産比較例
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース２２．３ｇ／Ｌ、酢酸１．０ｇ／Ｌ、クマル酸３．０ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．０６ｇ／Ｌとする以外は、実施例３７と同様の操作を行った。結果を表９に示す。
（比較例３７）グルコース組成物のリジン発酵生産比較例
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース２２．３ｇ／Ｌ、酢酸１．０ｇ／Ｌ、クマル酸添加なし、フェルラ酸０．０６ｇ／Ｌとする以外は、実施例３７と同様の操作を行った。結果を表９に示す。
（比較例３８）グルコース組成物のリジン発酵生産比較例
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース２２．３ｇ／Ｌ、酢酸１．０ｇ／Ｌ、クマル酸０．５ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．４ｇ／Ｌとする以外は、実施例３７と同様の操作を行った。結果を表９に示す。
（比較例３９）グルコース組成物のリジン発酵生産比較例
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌに対し、キシロース２２．３ｇ／Ｌ、酢酸１．０ｇ／Ｌ、クマル酸０．５ｇ／Ｌ、フェルラ酸添加なし とする以外は、実施例３７と同様の操作を行った。結果を表９に示す。
（比較例４０）グルコース組成物のリジン発酵生産比較例
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌに対し、キシロース５０ｇ／Ｌ、酢酸１．０ｇ／Ｌ、クマル酸０．５ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．０６ｇ／Ｌとする以外は、実施例３７と同様の操作を行った。結果を表９に示す。
Figure 2017154955
（実施例４１）セルロース含有バイオマスを原料としたグルコース組成物の作製とリジン発酵生産
実施例５に示すグルコース組成物を用いて、実施例３７と同様にリジン発酵を行った。結果を表１０に示す。
（実施例４２）セルロース含有バイオマスを原料としたグルコース組成物の作製とリジン発酵生産
実施例６に示すグルコース組成物を用いて、実施例３７と同様にリジン発酵を行った。結果を表１０に示す。
（実施例４３）セルロース含有バイオマスを原料としたグルコース組成物の作製とリジン発酵生産
実施例７に示すグルコース組成物を用いて、実施例３７と同様にリジン発酵を行った。結果を表１０に示す。
（実施例４４）セルロース含有バイオマスを原料としたグルコース組成物の作製とリジン発酵生産
実施例８に示すグルコース組成物を用いて、実施例３７と同様にリジン発酵を行った。結果を表１０に示す。
（実施例４５）セルロース含有バイオマスを原料としたグルコース組成物の作製とリジン発酵生産
実施例９に示すグルコース組成物を用いて、実施例３７と同様にリジン発酵を行った。結果を表１０に示す。
Figure 2017154955
（参考例１１）エタノール発酵評価試験に用いる酵母調製（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）
エタノール発酵微生物として、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）ＮＢＲＣ１６２８株を用いた。ＹＰＤ培地（ペプトン、酵母エキス濃縮液とグルコース濃縮液をそれぞれ１２１℃、２０分オートクレーブ殺菌し、ペプトン２０ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌグルコース１０ｇ／Ｌに調製したもの）２ｍＬを試験管に投入し、クリーンベンチ内において、ＹＰＤ寒天培地でプレート培養（３０℃、１〜２日）して形成された酵母のコロニーを、白金耳を使用して植菌した。これを、振とう装置（ＴＡＩＴＥＣ社製、ＢＩＯ−ＳＨＡＫＥＲ ＢＲ−４０ＬＦ）を用いて、傾き５０度、３０℃、１２０ｒｐｍで２４時間、往復振とう培養し、前培養液を得た。前培養液を１５，０００×ｇ、５分、４℃で遠心分離し、上清を除去後、生理食塩水２ｍＬに懸濁し、ＯＤ７．５の前培養菌体液を得た。
（実施例４６）グルコース組成物の作製とエタノール発酵生産
グルコース（和光純薬株式会社製、Ｄ（＋）グルコース）を１００ｇ／Ｌ、酢酸（和光純薬株式会社製、試薬特級９９．７％）０．１ｇ／Ｌ、クマル酸（東京化成株式会社製、トランス−ｐ−クマル酸）０．１５ｇ／Ｌ、フェルラ酸（東京化成株式会社製、トランス−フェルラ酸）０．００７ｇ／Ｌとなるように純水に溶解させ、グルコース組成物を作製した。なお、クマル酸、フェルラ酸は酸性では溶解しないため、６Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ８となるようなそれぞれ１ｇ／Ｌの濃縮液を調製し、その濃縮液を希釈することで調製した。また、グルコース組成物は最終ｐＨが７となるように、６Ｎ水酸化ナトリウムを用いて調整した。
作製したグルコース組成物９ｍＬに、窒素源として２０％ＣＳＬ（王子コーンスターチ株式会社製、１ＮＮａＯＨでｐＨ５に調整後、平均細孔径０．４５μｍのフィルター滅菌）溶液１ｍＬを加え、参考例１１に記載した前培養菌体を初期ＯＤ０．５となるように植菌した。これを傾き５０度、３０℃、１２０ｒｐｍで１４４時間往復振とう培養した。約２４時間おきにサンプリングを行い、糖濃度、エタノール濃度を分析し、最大発酵速度、発酵収率対理論比（エタノールの理論収率を０．５１ｇ／ｇ−消費全糖とした時の対理論比）を求めた。また、微生物増殖能の評価として培養４８時間後の培養液のＯＤ（ＯＤ６００）を測定した。結果を表１１に示す。
（実施例４７）グルコース組成物の作製とエタノール発酵生産
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース０．７ｇ／Ｌ、酢酸０．１ｇ／Ｌ、クマル酸０．１５ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．００７ｇ／Ｌとする以外は、実施例４６と同様の操作を行った。結果を表１１に示す。
（実施例４８）グルコース組成物の作製とエタノール発酵生産
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース２２．３ｇ／Ｌ、酢酸１．０ｇ／Ｌ、クマル酸０．５ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．０６ｇ／Ｌとする以外は、実施例４６と同様の操作を行った。結果を表１１に示す。
（実施例４９）グルコース組成物の作製とエタノール発酵生産
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース２５．０ｇ／Ｌ、酢酸１０ｇ／Ｌ、クマル酸２．０ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．２８ｇ／Ｌとする以外は、実施例４６と同様の操作を行った。結果を表１１に示す。
（比較例４１）グルコース組成物のエタノール発酵生産比較例
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌのみとする以外は実施例４６と同様の操作を行った。結果を表１１に示す。
（比較例４２）グルコース組成物のエタノール発酵生産比較例
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース２２．３ｇ／Ｌ、酢酸１５ｇ／Ｌ、クマル酸０．５ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．０６ｇ／Ｌとする以外は、実施例４６と同様の操作を行った。結果を表１１に示す。
（比較例４３）グルコース組成物のエタノール発酵生産比較例
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース２２．３ｇ／Ｌ、酢酸添加せず、クマル酸０．５ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．０６ｇ／Ｌとする以外は、実施例４６と同様の操作を行った。結果を表１１に示す。
（比較例４４）グルコース組成物のエタノール発酵生産比較例
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース２２．３ｇ／Ｌ、酢酸１．０ｇ／Ｌ、クマル酸３．０ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．０６ｇ／Ｌとする以外は、実施例４６と同様の操作を行った。結果を表１１に示す。
（比較例４５）グルコース組成物のエタノール発酵生産比較例
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース２２．３ｇ／Ｌ、酢酸１．０ｇ／Ｌ、クマル酸添加なし、フェルラ酸０．０６ｇ／Ｌとする以外は、実施例４６と同様の操作を行った。結果を表１１に示す。
（比較例４６）グルコース組成物のエタノール発酵生産比較例
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース２２．３ｇ／Ｌ、酢酸１．０ｇ／Ｌ、クマル酸０．５ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．４ｇ／Ｌとする以外は、実施例４６と同様の操作を行った。結果を表１１に示す。
（比較例４７）グルコース組成物のエタノール発酵生産比較例
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌに対し、キシロース２２．３ｇ／Ｌ、酢酸１．０ｇ／Ｌ、クマル酸０．５ｇ／Ｌ、フェルラ酸添加なしとする以外は、実施例４６と同様の操作を行った。結果を表１１に示す。
（比較例４８）グルコース組成物のエタノール発酵生産比較例
作製するグルコース組成物を、グルコース１００ｇ／Ｌに対し、キシロース５０ｇ／Ｌ、酢酸１．０ｇ／Ｌ、クマル酸０．５ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．０６ｇ／Ｌとする以外は、実施例４６と同様の操作を行った。結果を表１１に示す。
Figure 2017154955
（実施例５０）セルロース含有バイオマスを原料としたグルコース組成物の作製とエタノール発酵生産
実施例５に示すグルコース組成物を用いて、実施例４６と同様にエタノール発酵を行った。結果を表１２に示す。
（実施例５１）セルロース含有バイオマスを原料としたグルコース組成物の作製とエタノール発酵生産
実施例６に示すグルコース組成物を用いて、実施例４６と同様にエタノール発酵を行った。結果を表１２に示す。
（実施例５２）セルロース含有バイオマスを原料としたグルコース組成物の作製とエタノール発酵生産
実施例７に示すグルコース組成物を用いて、実施例４６と同様にエタノール発酵を行った。結果を表１２に示す。
（実施例５３）セルロース含有バイオマスを原料としたグルコース組成物の作製とエタノール発酵生産
実施例８に示すグルコース組成物を用いて、実施例４６と同様にエタノール発酵を行った。結果を表１２に示す。
（実施例５４）セルロース含有バイオマスを原料としたグルコース組成物の作製とエタノール発酵生産
実施例９に示すグルコース組成物を用いて、実施例４６と同様にエタノール発酵を行った。結果を表１２に示す。
Figure 2017154955
本発明のグルコース組成物は、微生物発酵によって化学品を製造するための微生物発酵原料として有用である他、公知のグルコース組成物の各種用途にも利用することができる。

Claims (5)

  1. グルコース組成物であって、グルコース濃度が１００ｇ／Ｌの該組成物水溶液での相当量として、キシロースを０〜２５ｇ／Ｌ、酢酸を０．１〜１０ｇ／Ｌ、クマル酸を０．１５〜２．０ｇ／Ｌ及びフェルラ酸を０．００７〜０．２８ｇ／Ｌ含有する、組成物。
  2. グルコース濃度が１００ｇ／Ｌの前記グルコース組成物水溶液での相当量として、バガスに対しアルカリ処理した際に得られる１ｃｍ幅のセルで測定される２８０ｎｍに吸収を持つ物質を、吸光度（ＡＢＳ）２０〜３５０で定義される濃度で含有する、請求項１に記載のグルコース組成物。
  3. 請求項１または２に記載のグルコース組成物を含有する、微生物発酵用グルコース組成物。
  4. 請求項１または２に記載のグルコース組成物、あるいは請求項３に記載の微生物発酵用グルコース組成物を含有する、微生物発酵原料。
  5. 請求項４に記載の微生物発酵原料を使用して化学品を生産する能力を有する微生物を培養する、化学品の製造方法。
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