CN101935618A - 一种乳酸杆菌和由木质纤维素稀酸水解液发酵生产乳酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种短乳杆菌，该短乳杆菌的保藏编号为CGMCC3051，其具有能够直接发酵未经脱毒处理的木质纤维素稀酸水解液而生产乳酸的能力。本发明还提供了一种由木质纤维素稀酸水解液发酵生产乳酸的方法，本发明提供菌株和方法可以直接利用木质纤维素稀酸水解液，而不需经过脱毒处理。抗性实验表明该菌株可耐受10mM的阿魏酸和20mM的糠醛。该菌可利用糖含量为56.9g/l的木质纤维素稀酸水解液，在48h内产生39.1g/l的乳酸。该菌能够同时利用木质纤维素稀酸水解液中的五碳糖和六碳糖，不存在葡萄糖阻遏效应，能够有效而快捷的转化木质纤维素稀酸水解液为乳酸。
Description
技术领域
本发明涉及一种乳酸杆菌和使用该乳酸杆菌的由木质纤维素稀酸水解液发酵生产乳酸的方法。
背景技术
目前利用稀酸预处理木质纤维素被认为是最有效和经济的水解方式，但是利用木质纤维素稀酸水解液发酵生产大宗化学品如乳酸，存在两大难点。一是木质纤维素稀酸水解液的糖组分复杂，不仅含有葡萄糖，也包含大量的木糖和阿拉伯糖等五碳糖。传统的乳酸发酵微生物往往缺乏五碳糖代谢的能力，或者因存在葡萄糖阻遏效应，而严重影响了水解液中五碳糖的利用。二是木质纤维素稀酸水解液中存在大量的抑制物如有机酸，酚类和糠醛类物质，这些抑制物对微生物的生长代谢具有明显的抑制作用。因此筛选或者基因改造能够同时代谢葡萄糖和木糖，同时又对木质纤维素稀酸水解液中的抑制物具有抗性的菌种，成为解决利用木质纤维素稀酸水解液生产乳酸的关键所在。
一些研究报道了，利用菌株如戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)[1]，短乳杆菌(Lactobacillus brevis)[2]，干酪乳杆菌(Lactobacillus.casei ssp.Rhamnous)[3]，冷凝芽孢杆菌(Bacillus coagulancs)[4]和基因工程大肠杆菌(E.coli)[5]发酵木质纤维素水解液生成乳酸。干酪乳杆菌因其存在葡萄糖阻遏效应，同时对木质纤维素水解液中的代谢抑制物比较敏感，当水解液中的糖含量达到5g/l，干酪乳杆菌的生长就因水解液中的抑制物受到抑制。，冷凝芽孢杆菌和基因工程大肠杆菌虽然能够同时利用水解液中的葡萄糖和木糖，但是当水解液中的木糖含量分别达到35g/l和15g/l时，其生长就因水解液中的抑制物而受到阻遏。木质纤维素稀酸水解液虽然可以通过生物，物理或化学的方法脱毒，但是势必增加乳酸发酵的成本。
为能够获得不存在葡萄糖阻遏效应，同时对木质纤维素稀酸水解液的抑制物具有一定抗性的菌株，本发明通过大量筛选工作，从酸菜中筛选到一株短乳杆菌(L.brevis S3F4)，该菌株可同时利用葡萄糖和木糖，同时对木质纤维素稀酸水解液中的代谢抑制物具有良好的抗性。抗性试验和木质纤维素稀酸水解液发酵试验表明该菌株可以应用到木质纤维素水解液发酵乳酸的生产当中，具有良好的应用前景。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种短乳杆菌，该短乳杆菌的保藏编号为：CGMCC3051，其具有能够直接发酵未经脱毒处理的木质纤维素稀酸水解液而生产乳酸的能力。
本发明的另一个目的是提供一种由木质纤维素稀酸水解液发酵生产乳酸的方法，其中，该方法包括：将所述短乳杆菌制成种子液，将所述种子液接种于发酵培养基中进行发酵，所述发酵培养基含有以下组分：木质纤维素稀酸水解液50-200ml/l，蛋白胨5-15g/l，酵母粉5-15g/l，牛肉膏5-10g/l，MgSO4 0.1-0.5g/l，MnSO4 0.1-0.5g/l，NaCl 0.01-0.05g/l，FeSO4 0.01-0.05g/l，NaAC 2-8g/l，柠檬酸铵1-5g/l，KH2PO4 1-5g/l，吐温801-5ml/l，所述木质纤维素稀酸水解液的含糖量为20-80g/l。
本发明的菌株是通过大量筛选工作，以木质纤维素稀酸水解液为底物筛选到的，该菌能够同时代谢木质纤维素中的木糖和葡萄糖，不存在葡萄糖阻遏效应，同时对稀酸水解液中的抑制物具有良好的抗性。该菌株已于2009年5月4日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC 3051。
本发明菌株可耐受10mM的阿魏酸和20mM的糠醛，在该两种浓度抑制物存在的情况下，以25g/l木糖为底物，经24h发酵可产生18.2和18.9g/l的乳酸。
将本发明菌株应用在木质纤维素稀酸水解液发酵中，在稀酸水解液不经过脱毒的情况下，接种5％，该菌株利用初始糖含量为56.9g/l的稀酸水解液(葡萄糖4.0g/l，木糖46.4g/l，阿拉伯糖，6.5g/l)，在48h内生成乳酸39.1g/l，乳酸转化率和产率分别达到0.7和0.81。
本发明利用短乳杆菌(CGMCC3051)(S3F4)发酵木质纤维素稀酸水解液生产乳酸，解决了葡萄糖阻遏及水解液中有毒物质的抑制作用。该菌株在木质纤维素稀酸水解液发酵产乳酸的应用中，不经过脱毒处理，直接发酵，48h内产生39.1g/l的乳酸，具有一定的应用价值。
附图说明
图1显示了短乳杆菌(Lactobacillus brevis)(CGMCC3051)(S3F4)利用不同碳源的生长情况；
图2显示了短乳杆菌(Lactobacillus brevis)(CGMCC3051)(S3F4)在不同浓度抑制物阿魏酸和糠醛下的生长情况，其中a图代表短乳杆菌S3F4在不同浓度阿魏酸下的生长情况，b图代表S3F4在不同浓度糠醛下的生长情况，c图代表S3F4在不同浓度阿魏酸和糠醛同时存在下的生长情况；
图3显示了短乳杆菌(Lactobacillus brevis)(CGMCC3051)(S3F4)发酵混合糖木糖/葡萄糖(1∶1，W∶W，25g/l)，9h和11h后发酵样品的HPLC分析图谱，其中，1号曲线为发酵11h后样品的HPLC图谱，2号曲线为发酵9h后样品的HPLC图谱。
具体实施方式
本发明提供了一种短乳杆菌，该短乳杆菌的保藏编号为：CGMCC3051，其具有能够直接发酵未经脱毒处理的木质纤维素稀酸水解液而生产乳酸的能力。
本发明还提供一种由木质纤维素稀酸水解液发酵生产乳酸的方法，其中，该方法包括：将所述短乳杆菌制成种子液，将所述种子液接种于发酵培养基中进行发酵，所述发酵培养基含有以下组分：木质纤维素稀酸水解液50-200ml/l，蛋白胨5-15g/l，酵母粉5-15g/l，牛肉膏5-10g/l，MgSO4 0.1-0.5g/l，MnSO4 0.1-0.5g/l，NaCl 0.01-0.05g/l，FeSO4 0.01-0.05g/l，NaAC 2-8g/l，柠檬酸铵1-5g/l，KH2PO4 1-5g/l，吐温80 1-5ml/l，所述木质纤维素稀酸水解液的含糖量为20-80g/l。优选情况下，所述发酵培养基含有以下组分：木质纤维素稀酸水解液100ml/l，蛋白胨10g/l，酵母粉10g/l，牛肉膏6g/l，MgSO40.2g，MnSO4 0.2g/l，NaCl 0.03g/l，FeSO4 0.01g/l，NaAC 4.0g/l，柠檬酸铵2g/l，KH2PO4 2g/l，吐温80 1ml/l。
根据本发明能够，所述发酵使乳酸的产量达到35-45g/l，乳酸转化率和产率分别达到0.7以上和0.81以上。
根据本发明，以所述发酵培养基的体积为基准，所述种子液的接种量为所述发酵培养基的体积的1-10％，所述种子液的活菌数为1-5×105个/升，所述发酵的方法包括接种后在温度为25-35℃、摇床转速150-200转/分钟下培养3-6小时，之后添加2-5重量％的碳酸钙作为发酵的中和剂，继续发酵40-48小时。
本发明菌株可耐受10mM的阿魏酸和20mM的糠醛，在该两种浓度抑制物存在的情况下，以25g/l木糖为底物，经24h发酵可产生18.2和18.9g/l的乳酸。
将本发明菌株应用在木质纤维素稀酸水解液发酵中，在稀酸水解液不经过脱毒的情况下，接种5％，该菌株利用初始糖含量为56.9g/l的稀酸水解液(葡萄糖4.0g/l，木糖46.4g/l，阿拉伯糖，6.5g/l)，在48h内生成乳酸39.1g/l，乳酸转化率和产率分别达到0.7和0.81。
需要强调的是：以下实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的宗旨和范围的技术方案均应涵盖在本发明的范围当中。
实施例1短乳杆菌S3F4的分离鉴定
短乳杆菌S3F4的筛选
将从自然界筛选的样品，首先在以木质纤维素喜酸水解液为碳源的MRS液体培养基中富集，然后将富集样品稀释适当倍数，涂布在以木糖为碳源的MRS平板上，平板中添加适量溴甲酚绿作为酸碱指示剂。挑去产酸的单菌落，进行复筛。经过多轮筛选获得一株能够同时利用木糖和葡萄糖，同时耐受木质纤维素稀酸水解液中的抑制物的产乳酸菌株。
短乳杆菌S3F4的16S rRNA鉴定
提取S3F4的基因组DNA，以其基因组DNA为模板，以
16SF 5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’和
1541R 5′AAGGAGGTGATCCAG-CC3′为上下游引物，PCR扩增其16S rDNA序列，扩增的条件和体系参照《分子克隆实验指南》第三版(J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔著)，PCR产物提交测序，其16S rRNA基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示。
Blast分析结果显示该菌株的16S rRNA序列与短乳杆菌具有99％的相似性。
实施例2短乳杆菌S3F4对木质纤维素稀酸水解液中的抑制物抗性的验证
1.S3F4在不同浓度抑制物下的生长情况
将培养12h的菌株短乳杆菌S3F4种子液(1×105个/升)，分别接种于添加有5mM、10mM、15mM的阿魏酸，10mM、15mM、20mM的糠醛，以及5mM/15mM，5mM/20mM，10mM/15mM的阿魏酸和糠醛的木糖发酵培养基(木质纤维素稀酸水解液100ml/l，蛋白胨10g/l，酵母粉10g/l，牛肉膏6g/l，MgSO4 0.2g，MnSO4 0.2g/l，NaCl 0.03g/l，FeSO4 0.01g/l，NaAC4.0g/l，柠檬酸铵2g/l，KH2PO4 2g/l，吐温80 1ml/l)中，采用酶标仪，在96孔板中30℃培养，每30min读取样品在600nm下的OD值，结果如图2所示。该结果显示虽然较高浓度的阿魏酸对菌株的比生长速率有一定影响，但是菌株在不同浓度抑制物存在下，稳定期OD基本相同，低浓度抑制物甚至对菌体的生长具有一定刺激作用。
S3F4在不同浓度抑制物下利用木糖产乳酸的情况
表1.S3F4在不同浓度抑制物下利用木糖产乳酸的情况
Lacmax：最高乳酸浓度，Ace：乙酸
以25g/l的木糖为碳源，将培养12h的短乳杆菌S3F4种子液(1×105个/升)，分别接种于添加有5mM、10mM、15mM的阿魏酸，10mM、15mM、20mM的糠醛，以及5mM/15mM，5mM/20mM，10mM/15mM的阿魏酸和糠醛的木糖发酵培养基(木质纤维素稀酸水解液100ml/l，蛋白胨10g/l，酵母粉10g/l，牛肉膏6g/l，MgSO4 0.2g，MnSO4 0.2g/l，NaCl 0.03g/l，FeSO40.01g/l，NaAC 4.0g/l，柠檬酸铵2g/l，KH2PO42g/l，吐温80 1ml/l)中。30℃，160rpm培养24～31h，HPLC分析发酵液结果如下。
该分析结果表明，与对照相比，能够促进S3F4利用木糖产乳酸的能力。与对照相比，在分别添加10mM的阿魏酸和20mM的糠醛的情况下，S3F4发酵24h就达到了乳酸的最高浓度，与对照相比，提前了7小时。上述浓度的阿魏酸和糠醛对S3F4的生长抑制具有协同作用，但是对S3F4产乳酸的能力没有明显的抑制作用。
实施例3短乳杆菌S3F4利用不同碳源生长和乳酸发酵的验证
将培养13h的短乳杆菌S3F4种子液(2×105个/升)，接种于发酵培养基，培养基成分如下：蛋白胨10g/l，酵母粉10g/l，牛肉膏6g/l，MgSO4 0.2g，MnSO4 0.2g/l，NaCl 0.03g/l，FeSO4 0.01g/l，NaAC 4.0g/l，柠檬酸铵2g/l，KH2PO4 2g/l，吐温80 1ml/l。不同碳源根据需求添加，30℃，160rpm培养，HPLC分析结果如下。
表2.S3F4利用葡萄糖和木糖发酵乳酸结果
| 底物* | 时间(h) | 葡萄糖(g/l) | 木糖(g/l) | 乳酸(g/l) | 乙酸(g/l) | QLac(gl-1h-1) | QAce(gl-1h-1) | YLac/s(g/g) | YAce/s(g/g) |
| 葡萄糖 | 24 | 0 | - | 21.6 | 3.6 | 0.90 | 0.15 | 0.86 | 0.14 |
| 木糖 | 30h | - | 0.4 | 17.5 | 10.8 | 0.58 | 0.36 | 0.71 | 0.44 |
| 葡萄糖/木糖(1∶1) | 24h | 0 | 0.3 | 16.9 | 7.5 | 0.70 | 0.31 | 0.68 | 0.30 |
*：初始糖含量为25g/l，木糖/葡萄糖1∶1(W∶W)
QLac乳酸产率，QAce乙酸产率，YLac/s乳酸转化率，YAce/s乙酸转化率
由表2可以看出，菌株S3F4能够有效的利用木糖和葡萄糖，且在葡萄糖存在的情况下，可促进木糖的代谢。为进一步验证，该菌株同时利用木糖和葡萄糖的能力，取木糖/葡萄糖发酵过程中9h和11h的发酵液，HPLC分析结果如图3所示。
图3表明，在发酵过程中，葡萄糖和木糖同时减少，进一步证明该菌同时利用木糖和葡萄糖的能力。
在粉碎的玉米秸秆或玉米芯，与0.1-2体积％的稀硫酸以1∶10-1∶6(W∶V)的比例，混匀。在110-121℃下，保持1-2h，过滤获得上清，以Ca(OH)2调节pH至7.0，110℃灭菌20min，添加浓缩10倍的不含碳源的发酵培养基(木质纤维素稀酸水解液100ml/l，蛋白胨10g/l，酵母粉10g/l，牛肉膏6g/l，MgSO4 0.2g，MnSO4 0.2g/l，NaCl 0.03g/l，FeSO4 0.01g/l，NaAC 4.0g/l，柠檬酸铵2g/l，KH2PO4 2g/l，吐温80 1ml/l)，接种5％的S3F4种子液(3×105个/升)，发酵结果如表3所示。
表3.S3F4利用木质纤维素稀酸水解液发酵乳酸结果
QLac乳酸产率，QAce乙酸产率，YLac/s乳酸转化率，YAce/s乙酸转化率
上表说明，S3F4能够有效的利用未经脱毒处理的木质纤维素稀酸水解液，在水解液初始糖含量达到56.9g/l时，在48h内，转化生成39.1g/l的乳酸，该浓度高于同类菌株利用木质纤维素稀酸水解液生成乳酸的结果。
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<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>1476
<213>短乳杆菌(Lactobacillus brevis)S3F4 CGMCC3051
<400>1
catgcctata catgcaagtc gaacgagctt ccgttgaatg acgtgcttgc actgatttta 60
acaatgaagc gagtggcgaa ctggtgagta acacgtggga aatctgccca gaagcagggg 120
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agccgtctaa ggtgggacag atgattaggg gaagtc 1476
Claims (4)
1.一种短乳杆菌，该短乳杆菌的保藏编号为CGMCC3051，其具有能够直接发酵未经脱毒处理的木质纤维素稀酸水解液而生产乳酸的能力。
2.一种由木质纤维素稀酸水解液发酵生产乳酸的方法，其特征在于，该方法包括：将权利要求1所述的短乳杆菌制成种子液，将所述种子液接种于发酵培养基中进行发酵，所述发酵培养基含有以下组分：木质纤维素稀酸水解液50-200ml/l，蛋白胨5-15g/l，酵母粉5-15g/l，牛肉膏5-10g/l，MgSO40.1-0.5g/l，MnSO4 0.1-0.5g/l，NaCl 0.01-0.05g/l，FeSO4 0.01-0.05g/l，NaAC2-8g/l，柠檬酸铵1-5g/l，KH2PO4 1-5g/l，吐温80 1-5ml/l，所述木质纤维素稀酸水解液的含糖量为20-80g/l。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述发酵使乳酸的产量达到35-45g/l，转化率达到0.7以上，产率达到0.81以上。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，以所述发酵培养基的体积为基准，所述种子液的接种量为所述发酵培养基的体积的1-10％，所述种子液的活菌数为1-5×105个/升，所述发酵的方法包括接种后在温度为25-35℃、摇床转速150-200转/分钟下培养3-6小时，之后添加2-5重量％的碳酸钙作为发酵的中和剂，继续发酵40-48小时。
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