CN104726364A - 一种红球菌及其在降解木质素方面的应用 - Google Patents

一种红球菌及其在降解木质素方面的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种红球菌及其在降解木质素方面的应用，属于微生物技术领域；该菌种从中国南海海泥中进行分离、纯化获得，为红球菌属的一个变种，命名为（Rhodococcus sp.）L17，经鉴定该菌为革兰氏阳性，不形成分生孢子，好氧，过氧化氢酶阳性，芳香基硫酸脂酶阴性；并且其16S rDNA序列已经提交至NCBI数据库，登录号为 KM215139，并于2014年3月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC8943；经实验验证，该菌种具有降解木质素的能力，降解率可达90%-100%，可将其应用于环保领域，尤其是应用于生物降解木质素中。

Description

一种红球菌及其在降解木质素方面的应用
技术领域
本发明涉及一种红球菌及其在降解木质素方面的应用，属于微生物技术领域。
背景技术
木质素是自然界中含量丰富的三大生物质之一，占陆生植物干重的15%-40%，其结构为由苯丙烷单元结构通过醚键和碳碳键组成的具有三维空间结构无定型芳香类化合物，与纤维素和半纤维素构成植物骨架的主要成分。木质素与纤维素、半纤维素结合十分稳定，不易降解，是生物质能源利用的关键瓶颈之一，同时木质素也是木材水解工业和造纸工业的副产物以及城市生活垃圾中一种较难降解的物质, 采用化学试剂处理这些废弃物会造成严重的环境污染。
尽管针对木质素的降解方法已经有了几十年的研究，但是仍然存在许多的问题, 例如化学法不能够解决污染问题，物理法又有高能耗的挑战，而生物降解由于其低成本，反应条件温和，无二次污染的优点被广泛应用于各种有害有机物的降解。据报道，目前发现的能够降解木质素的细菌有鞘氨醇单胞菌（Sphingomonassp.）、假单胞菌（Pseudomonas sp.）等。
本发明从南海海泥中筛选到一株红球菌（Rhodococcus sp.）L17，能够在高盐分等极端环境中生长，并且能够高效降解木质素。红球菌具有强大的降解底物能力，能降解多种底物，并生成具有生物活性的类固醇、丙烯酰胺以及丙烯酸。最近还发现红球菌能够降解木质素生成三酰甘油，是生产生物能源的有效候选菌株。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种红球菌（Rhodococcussp.）L17。
本发明的另一目的在于提供所述红球菌（Rhodococcussp.）L17在环保领域中的应用，特别是在降解木质素中的应用。
本发明通过下述技术方案实现：
一种红球菌（Rhodococcussp.）L17，于2014年3月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.8943。
所述红球菌（Rhodococcussp.）L17具有如下的形态和生理生化特性：
采用常规的细菌生理生化鉴定方法和透射电镜观察，为革兰氏阳性，不形成分生孢子，好氧，过氧化氢酶阳性，芳香基硫酸脂酶阴性，不能降解酪蛋白、纤维糖等。
所述红球菌（Rhodococcussp.）L17的16S rDNA序列（如SEQ ID NO.1所示）已经提交至NCBI数据库，登录号为 KM215139。
SEQ ID NO.1：
GGCTGGTGGGGCCTGGCTTTACACATGCCAAGTCGAACGATGAAGCCCAGCTTGCTGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCACTCTGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACCTCGGGATGCATGTTCTGGGGTGGAAAGTTTTTCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCACCCATGACGAAGCGCAAGTGACGGTAGTGGGAGAAGAAGCACCGGCCAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCGTCTGTGAAATCCCGCAGCTCAACTGCGGGCTTGCAGGCGATACGGGCAGACTCGAGTACTGCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGCAGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCGCTAGGTGTGGGTTTCCTTCCACGGGATCCGTGCCGTAGCCAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGTTTGACATGTACCGGACGACTGCAGAGATGTGGTTTCCCTTGTGGCCGGTAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTGTGTTGCCAGCACGTGATGGTGGGGACTCGCAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACACATGCTACAATGGTCGGTACAGAGGGCTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCCCTTAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATCGGGGTCTGCAACTCGACCCCGTGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCCTTGTGGGAGGGAGCACGTTCGAAAGGGGGATTAGGGGGGGG。
所述红球菌（Rhodococcussp.）L17应用于降解木质素，按照以下步骤进行：将含有木质素的无机盐培养基pH调为6.5-8.5，然后将OD600值为0.4-0.5（对数增长期）的红球菌（Rhodococcussp.）L17按体积比10%-40%的接种量接种，于25-42℃进行反应；所述的含有木质素的无机盐培养基中的木质素的浓度优选为20-100mg/L；所述反应为振荡反应，振荡速度为100-250rpm；所述反应的时间为72-108h。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
（1）本发明首次从中国南海海泥中筛选到具有降解木质素能力的红球菌（Rhodococcussp.）L17，能够在极端环境下生长。
（2）本发明的红球菌（Rhodococcussp.）L17能够降解木质素，降解率可达90%-100%。
（3）本发明的红球菌（Rhodococcussp.）L17降解木质素相对于物理化学法成本低，且无二次污染。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：
本发明所述的具有降解木质素能力的红球菌（Rhodococcussp.）L17从中国南海海泥中进行分离、纯化而得。
其分离纯化方法如下：所用的驯化培养基为无机盐培养基，组分为（g/L）：6.2g Na2HPO4， 3.0g KH2PO4，0.5g NaCl，1.0g NH4Cl，pH7.0。首先将3g污泥加入100mL含20mg/L木质素的无机盐培养基，37℃驯化60天后，以体积百分比10%接种量接入含木质素40mg/L的无机盐培养基接着驯化一周，依次类推逐步提高木质素的浓度进行驯化，木质素的浓度分别为40mg/L、60mg/L、80mg/L。
驯化结束后将驯化液涂布于琼脂平板（牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，琼脂粉20g/L，pH7.0）上37℃培养48h，挑选单菌落于牛肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，pH7.0）进行富集培养，然后测定降解率，选择降解率最高的菌种进行纯化。
降解率的测定：将富集培养18h后的培养物以体积百分比15%的接种量接入含有20mg/L木质素的无机盐培养基中，在37℃，pH7.0的条件下在150rpm的摇床反应108h，定时取样通过紫外分光光度法测定降解率。
降解率=（初始浓度-终浓度）/初始浓度。
紫外分光光度法用以测定木质素的浓度，以超纯水为对照，紫外分光光度计检测波长为280nm。
将纯化得到的菌落进行鉴定，鉴定结果如下：
（1）菌体的形态特性及生理生化特性：采用常规的细菌生理生化鉴定方法和电子显微镜观察，为革兰氏阳性，不形成分生孢子，好氧，过氧化氢酶阳性，芳香基硫酸脂酶阴性，不能降解酪蛋白、纤维糖等。
（2）采用DNA提取方法提取细菌总DNA。采用细菌的16S rDNA通用引物，上游引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3’），下游引物1492R（5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’），扩增其16S rRNA基因。PCR扩增体系总体积为50μL，超纯水37.5μL，10×buffer5μL，氯化镁3μL，dNTP1μL，Taq酶0.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，模板DNA1μL。PCR反应30个循环，94℃变性4min后进入循环，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min。PCR产物直接测序，得出红球菌（Rhodococcussp.）L17的16S rDNA序列（如SEQ ID NO.1所示）已经提交至NCBI数据库，登录号为 KM215139。
由以上菌株的16S rDNA序列与GenBank中已登录的基因序列进行比对后用邻接法（Neighbor-Joining）构建系统发育树，可知该菌株与红球菌属的典型株在一个分支，系统位置最接近。
根据16S rRNA基因同源性分析可以判断该菌种为红球菌属（Rhodococcussp.）的一个变种。
综合上述的生理生化特性、16S rRNA基因序列测定结果，本发明所筛选的细菌应归为红球菌属（Rhodococcussp.），且为该属的一个变种，命名为红球菌（Rhodococcussp.）L17，于2014年3月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.8943。
实施例2：
将红球菌（Rhodococcussp.）L17单菌落接种于3mL牛肉膏蛋白胨培养基中，培养18h的培养物（OD600为0.45）以体积百分比为20%的接种量接入木质素浓度为20mg/L、pH为8.0的无机盐培养基中，在37℃，150rpm的摇床反应96h，通过紫外分光光度法测定降解率。降解率的测定同实施例1，检测结果为降解率为78%。
实施例3：
将红球菌（Rhodococcus sp.）L17单菌落接种于3mL牛肉膏蛋白胨培养基中，培养18h的培养物以体积百分比40%的接种量接入木质素浓度为60mg/L、pH为7.0的无机盐培养基中，在25℃、100rpm的摇床反应108h，通过紫外分光光度法测定降解率，测定方法同实施例1，检测结果为降解率为82%。
实施例4：
将红球菌（Rhodococcus sp.）L17单菌落接种于3mL牛肉膏蛋白胨培养基中，培养18h的培养物以体积百分比30%的接种量接入木质素浓度为80mg/L、pH为7.0的无机盐培养基中，在42℃、200rpm的摇床反应72h，通过紫外分光光度法测定降解率，测定方法同实施例1，检测结果为降解率为84%。
实施例5：
将红球菌（Rhodococcussp.）L17单菌落接种于3mL牛肉膏蛋白胨培养基中，培养18h的培养物以体积百分比10%的接种量接入木质素浓度为100mg/L、pH为7.0的无机盐培养基中，在35℃、250rpm的摇床反应96h，通过紫外分光光度法测定降解率，测定方法同实施例1，检测结果为降解率为84%。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何为背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
                         SEQUENCE LISTING
 
<110>  江苏大学
 
<120>  一种红球菌及其在降解木质素方面的应用
 
<130>  一种红球菌及其在降解木质素方面的应用
 
<160>  1    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  1440
<212>  DNA
<213>  南海海泥
 
<400>  1
ggctggtggg gcctggcttt acacatgcca agtcgaacga tgaagcccag cttgctgggt        60
ggattagtgg cgaacgggtg agtaacacgt gggtgatctg ccctgcactc tgggataagc       120
ctgggaaact gggtctaata ccggatatga cctcgggatg catgttctgg ggtggaaagt       180
ttttcggtgc aggatgagcc cgcggcctat cagcttgttg gtggggtaat ggcctaccaa       240
ggcgacgacg ggtagccggc ctgagagggc gaccggccac actgggactg agacacggcc       300
cagactccta cgggaggcag cagtggggaa tattgcacaa tgggcgcaag cctgatgcag       360
cgacgccgcg tgagggatga cggccttcgg gttgtaaacc tctttcaccc atgacgaagc       420
gcaagtgacg gtagtgggag aagaagcacc ggccaactac gtgccagcag ccgcggtaat       480
acgtagggtg cgagcgttgt ccggaattac tgggcgtaaa gagctcgtag gcggtttgtc       540
gcgtcgtctg tgaaatcccg cagctcaact gcgggcttgc aggcgatacg ggcagactcg       600
agtactgcag gggagactgg aattcctggt gtagcggtga aatgcgcaga tatcaggagg       660
aacaccggtg gcgaaggcgg gtctctgggc agtaactgac gctgaggagc gaaagcgtgg       720
gtagcgaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacggtgggc gctaggtgtg       780
ggtttccttc cacgggatcc gtgccgtagc caacgcatta agcgccccgc ctggggagta       840
cggccgcaag gctaaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg cggagcatgt       900
ggattaattc gatgcaacgc gaagaacctt acctgggttt gacatgtacc ggacgactgc       960
agagatgtgg tttcccttgt ggccggtaga caggtggtgc atggctgtcg tcagctcgtg      1020
tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttgtcctgtg ttgccagcac      1080
gtgatggtgg ggactcgcag gagactgccg gggtcaactc ggaggaaggt ggggacgacg      1140
tcaagtcatc atgcccctta tgtccagggc ttcacacatg ctacaatggt cggtacagag      1200
ggctgcgata ccgtgaggtg gagcgaatcc cttaaagccg gtctcagttc ggatcggggt      1260
ctgcaactcg accccgtgaa gtcggagtcg ctagtaatcg cagatcagca acgctgcggt      1320
gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacgtc atgaaagtcg gtaacacccg      1380
aagccggtgg cctaacccct tgtgggaggg agcacgttcg aaagggggat tagggggggg      1440

Claims (8)

1.一种红球菌（Rhodococcussp.）L17，于2014年3月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.8943。
2.权利要求1所述的红球菌（Rhodococcus sp.）L17的16s rDNA序列，如SEQ ID NO.1所示。
3. 权利要求1所述红球菌（Rhodococcus sp.）L17在降解木质素方面的应用。
4. 根据权利要求3所述的红球菌（Rhodococcussp.）L17在降解木质素方面的应用，其特征在于，包含以下步骤：将含有木质素的无机盐培养基pH值调为6.5-8.5，然后将OD600值为0.4-0.5的红球菌（Rhodococcussp.）L17按体积百分比10%-40%的接种量添加，于25-42℃进行反应，使木质素降解。
5. 根据权利要求4所述的红球菌（Rhodococcussp.）L17在降解木质素方面的应用，其特征在于，所述含有木质素的无机盐培养基中木质素的浓度为20-100mg/L。
6. 根据权利要求4所述的红球菌（Rhodococcussp.）L17在降解木质素方面的应用，其特征在于，所述的反应为振荡反应，振荡速度为100-250rpm。
7. 根据权利要求4所述的红球菌（Rhodococcussp.）L17在降解木质素方面的应用，其特征在于，所述的反应时间为72-108h。
8. 根据权利要求5所述的红球菌（Rhodococcussp.）L17在降解木质素方面的应用，其特征在于，所述的无机盐培养基的组分为（g/L）：6.2g Na2HPO4， 3.0g KH2PO4，0.5g NaCl，1.0g NH4Cl。
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