CN102533616A

CN102533616A - 对镉具有高抗性的皮氏罗尔斯通氏菌及其提取方法及应用

Info

Publication number: CN102533616A
Application number: CN2012100427578A
Authority: CN
Inventors: 谢学辉; 付瑾; 柳建设; 陈小光; 王兆慧; 范凤霞; 袁学武; 刘娜; 朱文祥; 平婧
Original assignee: Donghua University
Current assignee: Donghua University
Priority date: 2012-02-23
Filing date: 2012-02-23
Publication date: 2012-07-04

Abstract

本发明涉及一种对镉具有高抗性的皮氏罗尔斯通氏菌及其提取方法及应用，该菌株对镉具有高抗性并且具有降解苯酚能力。本发明的菌株对重金属镉的耐受性在液体培养基中最高可达18mM/L，在固体培养基上最高可达16mM/L，显示了很强的抗镉特性。本发明的菌株对500mg/L及以下的苯酚在60h内降解率为100％。本发明的菌株可在苯酚和重金属镉复合污染的环境中100h内对1000mg/L以下苯酚降解率达75％以上，同时可耐受1mM/L(112mg/L)的Cd²⁺。

Description

对镉具有高抗性的皮氏罗尔斯通氏菌及其提取方法及应用

技术领域

本发明属于皮氏罗尔斯通氏菌菌株领域，特别涉及一种对镉具有高抗性的皮氏罗尔斯通氏菌及其提取方法及应用。

背景技术

苯酚是造纸、炼油、制药、焦化等工业过程中产生的一种有机污染物，会对动、植物产生有毒甚至致命的作用。大量酚类物质及其衍生物在土壤和水体中的排放和积累导致了生态环境的日趋恶化，许多国家已将其列入环境优先控制污染物的黑名单中。近年来，随着生物新技术的发展，利用微生物降解法处理高浓度含酚废水是一种经济高效且不会产生二次污染的方法，相关方面的研究越来越受到人们的关注。但含酚工业废水中往往含有较高浓度的重金属离子，而高浓度重金属离子的存在会抑制微生物对苯酚的生物降解。因此，获得有一定耐受重金属能力的苯酚降解菌在含酚工业废水的生物处理中将具有突出的应用潜力。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种对镉具有高抗性的皮氏罗尔斯通氏菌及其提取方法及应用，该菌株对Cd²⁺的耐受性高达1mmol/L(112mg/L)，对1000mg/L以下苯酚降解率可达75％以上，营养要求不高，在生物治理含酚工业废水和重金属双重污染中具有重要应用潜力；获得方法简便快捷，成本低，对环境友好。

本发明的一种对镉具有高抗性的皮氏罗尔斯通氏菌，其特征在于：该菌株对镉具有高抗性并且具有降解苯酚能力；其16S rDNA序列见序列表SEQ.ID.NO1。

本发明的一种对镉具有高抗性的皮氏罗尔斯通氏菌的提取方法，包括：

(1)通过Cd²⁺在0.1×PTYG培养液中梯度压力式驯化法驯化，多次平板涂布法分离直至得到耐受性较高的单菌落DX-T3-01。在不同Cd²⁺浓度的0.1×PTYG培养液中观察其生长状况；并通过0.1×PTYG固体培养基检测筛选菌株对重金属镉的最低抑制浓度；

(2)对0.4mM/L Cd²⁺浓度培养24h后菌体进行SEM-EDX、FTIR分析，结果验证了菌体表面对Cd²⁺的吸附作用。

所述步骤(1)中的0.1×PTYG培养基成分为：每升培养基包含0.25g蛋白胨，0.25g胰蛋白胨，0.5g酵母浸膏，0.5g葡萄糖，30mg MgSO₄·7H₂O，3.5mg CaCl₂·2H₂O，0.3g放线菌酮，蒸馏水定容至1L，1×10⁵Pa灭菌30min，pH＝7。

所述步骤(1)中的梯度压力式驯化法为在0.1×PTYG培养基中，分别依次加入Cd²⁺使其浓度为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20mM/L，改变浓度的间隔时间为5-7d，于30℃，150r/min条件下进行驯化培养。

所述步骤(1)中的不同Cd²⁺浓度为0、1、2、3、4、5、6、8、10mM/L，0.1×PTYG固体培养基为0.1×PTYG液体培养基基础上加入质量分数1.5％的琼脂，1×10⁵Pa灭菌30min，筛选菌株对重金属镉的最低抑制浓度为4mM/L。

本发明的一种对镉具有高抗性的皮氏罗尔斯通氏菌的应用，包括：

将皮氏罗尔斯通氏菌置于无机盐培养基中，无机盐培养基中均含有苯酚和Cd²⁺的样品中，在30℃、150r/min的条件下进行培养，培养时间为100h，即能降解苯酚。

所述步骤无机盐培养基为KH₂PO₄ 1.0g，(NH₄)₂SO₄ 1.0g，NaCl 1.0g，CaCl₂·2H₂O 0.1g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，蒸馏水定容至1L，1×10⁵Pa灭菌30min，pH值为7。

菌株16S rDNA的基因全序列在NCBI数据库中分析比较，鉴定为皮氏罗尔斯通氏菌，系统进化树见图3，同源性达到99％以上，命名为Ralstonia pickettii DX-T3-01。

本发明所提供的皮氏罗尔斯通氏菌Ralstonia pickettii DX-T3-01已于2012年1月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.5726。

所述的皮氏罗尔斯通氏菌Ralstonia pickettii DX-T3-01，革兰氏染色为阴性，专性需氧，营养要求不高；该菌为短杆菌，菌体大小为(0.5～0.8)μm×(1.2～2.0)μm，其电镜扫描见图4；菌落直径大小为1mm～2mm，不透明，米白色，拱顶球状，表面光滑湿润，边缘整齐，较粘稠，易挑起，专性需氧，营养要求不高，革兰氏染色为阴性；最适生长条件pH为6.0～7.0，温度为30～35℃，摇床震荡速率为150r/min。

该皮氏罗尔斯通氏菌(Ralstonia pickettii)DX-T3-01质粒检测结果表明该菌不携带质粒，因此降解基因编码于染色体上，这一特性使得在利用质粒进行水平基因转移的过程中，避免了质粒的不相容性，是构建具备多种降解能力的基因工程菌的良好材料。

本发明的皮氏罗尔斯通菌(Ralstonia pickettii)DX-T3-01不仅可以利用苯酚作为唯一的碳、氮源进行新陈代谢，而且能在相对较高浓度的苯酚基质条件下(苯酚浓度约为1000mg/L)良好生长；它对苯酚的去除主要通过生物吸附和生物降解两个阶段，从而对苯酚达到很高的去除率，对500mg/L及以下的苯酚在60h内降解率为100％，见图5；在苯酚和重金属镉复合污染的环境中该菌株100h内对1000mg/L以下苯酚降解率达75％以上，同时可耐受1mM/L(112mg/L)的Cd²⁺，见图6。另外适量的外加碳源不但不会影响本发明的菌株对苯酚降解作用，而且对其降解具有促进作用。

有益效果

(1)本发明从土壤中提取抗重金属苯酚降解菌株，提取到的菌株对重金属镉的耐受性在液体培养基中最高可达18mM/L，在固体培养基上最高可达16mM/L，显示了很强的抗镉特性。菌种来源易得且分离纯化方法简便快捷，成本低，对环境友好；同时是一种很好的构建耐重金属镉基因工程菌资源；

(2)提取的皮氏罗尔斯通氏菌(Ralstonia pickettii)DX-T3-01可以高效降解苯酚同时具有抗镉特性，对500mg/L及以下的苯酚在60h内降解率为100％，在重金属镉浓度为1mmol/L条件下100h内对1000mg/L以下苯酚降解率可达75％；这对菌株在含重金属污染的含酚工业废水的处理应用中的作用十分重要，在生物治理含酚工业废水和重金属双重污染中具有重要应用潜力。

附图说明

图1为0.4mM/L Cd²⁺浓度培养24h后SEM-EDX图；

图2为0.4mM/L Cd²⁺浓度培养24h后FTIR图；

图3为Ralstoniapickettii strain DX-T3-01的遗传发育树；

图4为Ralstoniapickettii strain DX-T3-01的扫描电镜图；

图5为Ralstoniapickettii strain DX-T3-01对不同初始浓度苯酚降解率图。

图6为Cd²⁺对菌株Ralstonia pickettii strain DX-T3-01生长和苯酚降解的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

控制投加高抗镉菌于重金属Cd²⁺浓度4mM/L的0.1×PTYG培养液中，0.1×PTYG培养液为蛋白胨0.25g，胰蛋白胨0.25g，酵母粉0.5g，葡萄糖0.5g，MgSO₄·7H₂O 30mg，CaCl₂·2H₂O 3.5mg，放线菌酮0.3g，蒸馏水定容至1L，1×10⁵Pa灭菌30min，pH约7。12h培养后菌体生长良好。接菌体涂布于含Cd²⁺的0.1×PTYG固体平板中，0.1×PTYG固体平板为对应培养液加入1.5％的琼脂。5d内筛选菌株能在16mM/L的0.1×PTYG固体平板中良好生长。

实施例2

控制投加高抗镉菌于浓度为300、400、500、600、700、800mg/L的苯酚无机盐培养基中，观察其降解率。其中无机盐培养基为KH₂PO₄ 1.0g，(NH₄)₂SO₄ 1.0g，NaCl 1.0g，CaCl₂·2H₂O 0.1g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，蒸馏水定容至1L，1×10⁵Pa灭菌30min，pH值约为7。48h测试结果表明：浓度为300、400、500mg/L时，苯酚能够在60h几乎完全降解。

实施例3

分别挑取经分离纯化后的单一菌落于各自的无机盐培养基中，各无机盐培养基中均含有700mg/L的苯酚和1mmol/LCd²⁺，在30℃、150r/min、250mL锥形瓶中装填量100mL的条件下进行培养，培养时间为100h，培养后通过电子显微镜观察细菌生长情况以及测定溶液中苯酚的剩余浓度，从而确定出具有抗镉特性的苯酚高效降解菌株。本发明所提供的一种具有抗镉特性的苯酚高效降解菌在初始pH值为6.5～7.0，温度为30℃，振荡速率为150r/min，250mL锥形瓶的装液量为100mL的条件下，菌株接种量为1％，苯酚初始浓度为700mg/L，重金属Cd²⁺为1mmol/L培养时间100h，然后利用4-氨基安替比林法对苯酚浓度进行测定，测定波长为510nm；苯酚的降解率高达100％。

Claims

1.一种对镉具有高抗性的皮氏罗尔斯通氏菌，其特征在于：该菌株对镉具有高抗性并且具有降解苯酚能力；其16S rDNA序列见序列表SEQ.ID.NO1，保藏号为CGMCC No.5726。

2.一种对镉具有高抗性的皮氏罗尔斯通氏菌的提取方法，包括：

3.根据权利要求2所述的一种对镉具有高抗性的皮氏罗尔斯通氏菌的提取方法，其特征在于：所述步骤(1)中的0.1×PTYG培养基成分为：每升培养基包含0.25g蛋白胨，0.25g胰蛋白胨，0.5g酵母浸膏，0.5g葡萄糖，30mg MgSO₄·7H₂O，3.5mg CaCl₂·2H₂O，0.3g放线菌酮，蒸馏水定容至1L，1×10⁵Pa灭菌30min，pH＝7。

4.根据权利要求2所述的一种对镉具有高抗性的皮氏罗尔斯通氏菌的提取方法，其特征在于：所述步骤(1)中的梯度压力式驯化法为在0.1×PTYG培养基中，分别依次加入Cd²⁺使其浓度为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20mM/L，改变浓度的间隔时间为5-7d，于30℃，150r/min条件下进行驯化培养。

5.根据权利要求4所述的一种对镉具有高抗性的皮氏罗尔斯通氏菌的提取方法，其特征在于：所述步骤(1)中的不同Cd²⁺浓度为0、1、2、3、4、5、6、8、10mM/L，0.1×PTYG固体培养基为0.1×PTYG液体培养基基础上加入质量分数1.5％的琼脂，1×10⁵Pa灭菌30min，筛选菌株对重金属镉的最低抑制浓度为4mM/L。

6.一种对镉具有高抗性的皮氏罗尔斯通氏菌的应用，包括：

7.根据权利要求6的一种对镉具有高抗性的皮氏罗尔斯通氏菌的应用，其特征在于：所述步骤无机盐培养基为KH₂PO₄ 1.0g，(NH₄)₂SO₄ 1.0g，NaCl 1.0g，CaCl₂·2H₂O 0.1g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，蒸馏水定容至1L，1×10⁵Pa灭菌30min，pH值为7。