CN102191197A - 一株高效降解石油的桔黄假单胞菌菌株 - Google Patents

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万芳
杜茂安
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杨雪
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一株高效降解石油的桔黄假单胞菌菌株，它涉及一株桔黄假单胞菌菌株。本发明提供了一株桔黄假单胞菌菌株，可高效降解石油，该菌株在石油污染土壤的修复中具有较高的应用价值。本发明高效降解石油的桔黄假单胞菌菌株为桔黄假单胞菌D7，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2011年1月15日，保藏号为CGMCC No.4710。本发明桔黄假单胞菌D7能够高效降解石油，对石油污染的土壤具有修复作用。

Description

一株高效降解石油的桔黄假单胞菌菌株
技术领域
本发明涉及一株桔黄假单胞菌菌株。
背景技术
石油污染土壤是一个长期存在的环境问题，针对石油污染土壤的修复技术的研究是环境保护领域的研究热点。目前，石油污染土壤的修复方法包括物理法、化学法及生物法。比较而言，生物法具有物理法和化学法不可比拟的优势，首先是处理费用低，其处理成本大约只有物化方法的三分之一；其次是修复操作简单，可以原位进行修复；再次生物法修复对环境的二次污染小。生物修复法本身包括动物修复、植物修复及微生物修复，这三种方法中由于微生物资源丰富、易于培养、对环境的耐受性较强，故微生物修复被认为具有广阔的应用前景。菌株产生生物表面活性剂是其代谢原油的机制之一，生物表面活性剂具有乳化原油能力、可生物降解性的优点，在原油污染土壤的修复中具有很高的应用价值，高效产表面活性剂的降解菌的筛选已经引起了国内外学者的关注。
发明内容
本发明提供了一株桔黄假单胞菌(Pseudomonas aurantiaca)菌株，可高效降解石油，该菌株在石油污染土壤的修复中具有较高的应用价值。
本发明高效降解石油的桔黄假单胞菌菌株为桔黄假单胞菌D7(Pseudomonas aurantiaca D7)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2011年1月15日，保藏号为CGMCC No.4710；本发明桔黄假单胞菌D7为革兰氏阴性菌，杆状，细胞大小为(0.6μm～0.7μm)×(2.2μm～2.4μm)，菌体表面凸凹不平，有明显的凹陷，无鞭毛，运动能力弱；在以石油为唯一碳源的固体无机盐培养基上培养，菌落呈圆形，颜色为淡黄色，不透明，表面光滑。
本发明桔黄假单胞菌D7氧化酶反应呈阳性，明胶实验结果呈阳性，淀粉水解实验结果呈阳性。本发明桔黄假单胞菌D7能够以石油烃为碳源进行生长代谢，能够利用NH4Cl为氮源。
本发明桔黄假单胞菌D7(Pseudomonas aurantiaca D7)通过16S rRNA基因序列比对分析，与假单胞菌属(Pseudomonas)的16S rRNA基因序列的同源性最高，相似性为97％，通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定桔黄假单胞菌D7属于假单胞菌属(Pseudomonas)，为桔黄假单胞菌(Pseudomonas aurantiaca)菌株。
本发明桔黄假单胞菌D7可在以石油为唯一碳源的无机盐培养基上生长，桔黄假单胞菌D7的最适温度为28～32℃，最适合生长环境的pH值为5.5～8.0。
本发明桔黄假单胞菌D7能够高效降解石油，将桔黄假单胞菌D7接入含有100mg原油的20mL无机盐培养基中，在30℃、120rpm条件下摇床培养15d，总石油烃含量从100mg降至60mg左右，石油的去除率接近40％；本发明桔黄假单胞菌D7对石油污染的土壤具有修复作用。
本发明桔黄假单胞菌D7(Pseudomonas aurantiaca D7)属于假单胞菌属(Pseudomonas)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2011年1月15日，保藏号为CGMCC No.4710。
附图说明
图1为本发明桔黄假单胞菌D7的扫描电镜照片；图2为桔黄假单胞菌D7原子力显微镜图片；图3为通过桔黄假单胞菌D7和相近菌株的16S rRNA基因序列进行同源性比对构建的系统发育树图；图4为具体实施方式二中桔黄假单胞菌D7对原油中总石油烃的降解曲线图；图5为具体实施方式二中桔黄假单胞菌D7产生的肽脂类生物表面活性剂的分析图。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式高效降解石油的桔黄假单胞菌菌株为桔黄假单胞菌D7(Pseudomonas aurantiaca D7)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2011年1月15日，保藏号为CGMCC No.4710。
本实施方式桔黄假单胞菌D7(Pseudomonas aurantiaca D7)为革兰氏阴性菌，杆状，细胞大小为(0.6μm～0.7μm)×(2.2μm～2.4μm)，菌体表面凸凹不平，有明显的凹陷，无鞭毛(如图1和图2所示)，运动能力弱；在以石油为唯一碳源的固体无机盐培养基上培养，菌落呈圆形，颜色为淡黄色，不透明，表面光滑。
参照《伯杰细菌鉴定手册》第八版和《常见细菌系统鉴定手册》对桔黄假单胞菌D7(Pseudomonas aurantiaca D7)进行生理生化鉴定：桔黄假单胞菌D7氧化酶反应呈阳性，明胶实验结果呈阳性，淀粉水解实验结果呈阳性。
本实施方式桔黄假单胞菌D7可在以石油为唯一碳源的无机盐培养基培养基上生长。以石油为唯一碳源的无机盐培养基(1L)由1.0g NaCl、0.1gKCl、1.0g NH4Cl、0.02gFeCl2·4H2O、0.5g KH2PO4、1.0g K2HPO4、0.5g MgCl2、0.02g CaCl2·2H2O、1mL微量元素溶液和余量的去离子水组成，调pH至7.0；其中微量元素溶液(1L)由3g FeSO4·7H2O、0.01g H3BO3、0.01g Na2MoO4·2H2O、0.02g MnSO4·H2O、0.01g CuSO4·5H2O、0.01g ZnSO4、0.5g EDTA、5g原油和余量的去离子水组成。
本实施方式桔黄假单胞菌D7的最适温度为28～32℃，最适合生长环境的pH值为5.5～8.0。
具体实施方式二：本实施方式桔黄假单胞菌D7(Pseudomonas aurantiaca D7)由受石油长期污染的土壤中筛选得到。筛选按以下步骤进行：取1g受石油长期污染的土壤加入到100mL LB培养基中，同时加入少量玻璃珠，在100rpm摇床上培养3d；然后取上层液体进行梯度稀释(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5)，均匀涂布在以石油为唯一碳源的固体无机盐培养基上，于生化培养箱中30℃恒温培养7d；挑取单菌落到以石油为唯一碳源的液体无机盐培养基中，在100rpm摇床上培养10d，以石油的降解率为指标，进行高效菌株筛选；最后利用平板划线法重复纯化、分离，即得到桔黄假单胞菌D7。
对筛选得到的桔黄假单胞菌D7进行分子鉴定，按以下步骤进行：采用上海华舜细菌基因组小量提取试剂盒提取菌株的基因组DNA，采用细菌16S rRNA基因通用引物，以菌株的基因组DNA为模板进行PCR扩增。然后利用胶回收试剂盒(购自于大连宝生物工程有限公司)回收纯化PCR产物，之后进行克隆、转化，筛选阳性克隆子菌落，采用ABI3730测序仪进行双向测序。
桔黄假单胞菌D7的16S rRNA基因序列长度为1346bp，其序列在GenBank的登陆号为AY23123，测序结果与GenBank中的已有序列进行Blast比对，然后采用MEGA3.1软件绘制系统发育树(如图3所示)，以确定菌株的种属关系。同源性分析结果表明，该序列与假单胞菌属(Pseudomonas)的16S rRNA基因序列的同源性最高，相似性为97％，通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定桔黄假单胞菌D7属于假单胞菌属(Pseudomonas)，为桔黄假单胞菌(Pseudomonas aurantiaca)。
PCR引物购买自上海生工生物技术有限公司，其他试剂购自于大连宝生物工程有限公司。
与现有的石油降解菌株相比，桔黄假单胞菌D7是从实际石油污染土壤中筛选获得，属于土壤中的土著菌，对实际土壤环境的耐受性较强。
利用静态试验考察桔黄假单胞菌D7对石油的降解能力，具体方法为：在装有20mL无机盐培养基和100mg原油的培养瓶中，接入1mL菌液，在30℃、120rpm条件下摇床培养15d，总石油烃含量从100mg降至60mg左右，石油的去除率接近40％，如图4所示。
利用气-质联机分析桔黄假单胞菌D7降解前后的原油组分变化，如图5所示，可以看出桔黄假单胞菌D7对C30以下的石油烃类有机物具有明显的去除效果。桔黄假单胞菌D7在降解石油过程中产生了肽脂类生物表面活性剂，由于生物表面活性剂在环境修复中具有环境安全性及二次污染小等特点及优势，因此桔黄假单胞菌D7在石油污染土壤修复中具有较高的应用价值。

Claims (1)

1.一株高效降解石油的桔黄假单胞菌菌株，其特征在于高效降解石油的桔黄假单胞菌菌株为桔黄假单胞菌D7(Pseudomonas aurantiaca D7)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2011年1月15日，保藏号为CGMCC No.4710。
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