CN110295125A - 一株类产碱假单胞菌nyj3.6及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株类产碱假单胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)NYJ3.6。本发明还涉及上述菌在石油降解中的应用以及一种含有上述的NYJ3.6的漂浮碳固定化菌剂，并提供了该菌剂的制备方法及应用。本发明提供的类产碱假单胞菌NYJ3.6，具有促进石油降解的作用，可用于解决石油污染的问题；其次含有上述产碱假单胞菌NYJ3.6的漂浮碳固定化菌剂，以100目以上800℃芦苇杆为生物碳固定化载体，该生物碳在其自身沉淀之前可以更高效的吸附石油，吸附石油后其漂浮力在提高的同时更能降低石油的表面粘力，可以更有效的促进石油降解。

Description

一株类产碱假单胞菌NYJ3.6及其应用

技术领域

本发明属于微生物领域，涉及一株类产碱假单胞菌NYJ3.6及其应用，特别涉及一株能够促进盐碱地石油降解的一株类产碱假单胞菌NYJ3.6及其应用。

背景技术

石油是生活中很多产品的重要原材料，这种不可再生资源在给人类带来便利的同时因为很多不当操作或意外而威胁着生态环境及人类的健康。石油的主要成分为烷烃、环烷烃、芳香烃等的混合物，其中有很多对人类有害的成分，在对环境的污染后同样会经过物质循环进入生物机体内。作为石油之城的大庆来说，其特点是湿地面积大、地表水充足、水中盐碱成分高且常年平均气温为4℃，导致水体自洁能力变弱。当面对石油泄露威胁时会直接导致水生动植物及人类健康水平下降。目前处理地表水石油污染的方法大体可分为物理打捞法、化学分解法、生物降解法或以上几种方法的混合利用。生物降解法以其对环境二次污染小、资金费用低等特点脱颖而出，但高效石油降解菌因其与土著菌种的相互影响或环境的不确定因素影响而很难对解决石油污染问题递交满意的答卷。固定化技术能通过物理或化学的方式将菌株制备成为不易从固定化载体流失的状态，很好地解决单菌时所面对的各种不确定因素，而且固定化载体可以使污染物进行富集并增加其相对表面积，进而大大的提高了高效菌的降解效率。目前固定化技术可分为吸附法、共价结合法、包埋法、交联法等形式，吸附法以其制备方法简单、极高的保留目的菌株活性、制作成本低等方面能够广泛的应用于紧急的环境污染等情况中。在固定材料的选择上，生物碳具有高吸附力、生物质原料种种类繁杂且丰富、生产成本低廉等的优势引起了广大研究者的注意。虽然生物碳对土壤环境有增加含碳量等好处，但在地表水石油污染吸附法处理后固定化载体回收的不便也是目前技术上的难题。

发明内容

本发明的第一目的是提供一株类产碱假单胞菌NYJ3.6，具有促进盐碱地石油降解的作用，对于修复石油污染提供微生物资源。

本发明的第二目的是提供上述类产碱假单胞菌NYJ3.6的用途。

本发明的第三目的是提供一种含有上述类产碱假单胞菌NYJ3.6的漂浮碳固定化菌剂。

本发明的第四目的是提供一种含有上述类产碱假单胞菌NYJ3.6的漂浮碳固定化菌剂的制备方法。

本发明的第五目的是提供上述漂浮碳固定化菌剂的用途。

本发明通过以下技术方案来实现：

一、一株类产碱假单胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)NYJ3.6，其保藏编号为CGMCC No.17570。

二、上述类产碱假单胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)NYJ3.6在石油降解中的应用。

三、一种漂浮碳固定化菌剂，含有权利要求1所述的类产碱假单胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)NYJ3.6。

具体的，所述的一种漂浮碳固定化菌剂，选取粒径100目以上的800℃芦苇杆为生物碳固定化载体。

四、上述漂浮碳固定化菌剂的制备方法，具体步骤如下：

步骤一、制备800°芦苇杆生物碳；

步骤二、筛选粒径100目以上的生物炭；

步骤三、离心获得处于生长对数区的类产碱假单胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)NYJ3.6并配置菌悬液；

步骤四、目标生物碳与菌悬液充分吸附制备漂浮碳固定化菌剂。

五、上述漂浮碳固定化菌剂在石油降解中的应用。

采用上述技术方案的积极效果：本发明提供一株类产碱假单胞菌NYJ3.6，具有促进石油降解的作用，可用于解决石油污染的问题；其次本发明还提供含有上述产碱假单胞菌NYJ3.6的漂浮碳固定化菌剂，该漂浮碳固定化菌剂以100目以上800℃芦苇杆为生物碳固定化载体，与产碱假单胞菌NYJ3.6充分吸附混匀，用于解决石油污染问题，该生物碳在其自身沉淀之前可以更高效的吸附石油，吸附石油后其漂浮力在提高的同时更能降低石油的表面粘力，遇到紧急的大面积水上石油泄漏时，生物碳降低石油粘力的性质在前期物理打捞法的应用时也能提供很高的便利，从而解决生物碳在地表水石油污染吸附法处理后，固定化载体回收的不便的难题。

附图说明

图1是本发明石油标准曲线图；

图2是本发明NYJ1.13、NYJ3.4、NYJ3.6、NYJ3.7在油平板上的生长状况图；

图3是本发明NYJ1.13、NYJ3.4、NYJ3.6、NYJ3.7的革兰氏染色镜检的形态图；

图4是本发明菌株NYJ3.6PCR产物的电泳图；

图5是本发明菌株NYJ3.6系统发育树图；

图6是本发明800℃芦苇杆作为生物碳研究时间对漂浮率的影响；

图7是本发明800℃芦苇杆作为生物碳研究粒径对漂浮率的影响；

图8是本发明不同生物碳添加量与石油吸附的关系图。

本发明所涉及的类产碱假单胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)NYJ3.6，于2019年4月15日在中国专利局或国际专利组织承认的保藏中心进行了专利程序保藏，保藏单位全称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏单位地址：中国.北京.中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.17570。

具体实施方式

下面结合具体实施例和试验例对本发明的技术方案做进一步说明，但不应理解为对本发明的限定。

实施例1

实施例1说明菌种的分离纯化和筛选：

从辽宁渤海胜利油田的石油污染土中，分别称取三种不同程度的石油污染土壤，无菌操作将其接种于已灭菌的90mL无机盐培养基中，37℃、150r/min条件下，振荡培养7d，取富集液10mL于新的原油培养基中，连续培养4至5次，所述原油培养基配置方法为：取0.2g原油于100mL无机盐培养基中高温灭菌制得，驯化过程中培养基的pH、盐度和油量具体参数，如表1所示：

表1驯化过程中的参数设置

在驯化完成之后，取适量培养液稀释涂布于LB固体平板，24h时间左右菌落长出，挑取形态，颜色不同的单菌落，分离纯化3至4次，分离出单菌，将单菌放入LB液体培养基中进行培养后，制成菌悬液后稀释涂布于油平板上，挑取油平板上长势较好的菌落接种于新鲜的LB培养基，待长势较好时，将其进行甘油保存：在灭菌后的2.0mL离心管中加入750μL菌悬液和750μL已灭菌的50％甘油中，混匀后放入-80℃冰箱中保存。

实施例2

实施例2不同分离纯化菌种对石油的降解率：

将菌悬液平皿置于-16℃冰箱中预冻4h后转入真空冷冻干燥机中于真空度54-60Pa，-45℃干燥48h，得菌干粉。加入0.2g原油于100mL无机盐培养基中高温灭菌，制备原油培养基，冷却后加入制作好的菌干粉。将菌干粉以每100mL培养基加入0.2g菌干粉的接种量加入已经灭菌原油培养基中，每株菌作三组，并有三瓶不加菌的原油培养基作为空白对照，在摇床恒温振荡培养7d，观察菌株降解石油的效果并测定降解率。

在已振荡培养7d后的培养液中加入10至20mL沸程为60至90℃的石油醚，振荡至原油全部溶于石油醚中，转入分液漏斗中进行萃取，待分层后去除下层液体，将上层液体经无水硫酸钠过滤，去除其中的水溶性物质和水，多次少量用石油醚清洗，收集并合并上层液体于50mL定容瓶中。

制作石油标准曲线：运用紫外分光光度法，分别用50ml的容量瓶配置浓度0.01g/ml、0.02g/ml、0.03g/ml、0.04g/ml的石油标准曲线梯度液，稀释10倍。用紫外分光光度计在350nm处测各自吸光度值(用OD₃₅₀表示)。以石油浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得到石油标准曲线，如图1所示，所有样品经稀释10倍后测定分光光度值，计算其石油降解率，对数据进行记录整理，结果如表2所示：

石油降解率＝(对照样品石油浓度-处理样品石油浓度)/对照样品石油浓度*100％

表2三十株耐盐碱菌的石油降解率结果

对石油降解率的测定结果能够得出，在以石油为唯一碳源的培养基中NYJ1.13、NYJ3.4、NYJ3.6、NYJ3.7为降解率最高的几株菌，在筛选出的30株耐盐碱的菌中，降解率较低的有NYJ1.7、NYTJ3.17等不到20％，因此也可以看出，在同一位置和相同条件下筛选出的细菌，对石油的降解能力相差很大，但可以从表中看出，石油降解能力较强的菌株多数是从重度污染土中筛选得出的。

为了反向验证菌株的降解能力，在油平板上进行稀释涂布培养，其在油平板上的生长状况如图2所示，在能以原油为唯一碳源生长的菌株被认定为石油降解菌，实验验证了4株高效耐盐碱的石油降解菌，名称分别为NYJ1.13、NYJ3.4、NYJ3.6、NYJ3.7。

实施例3

实施例3说明菌株的形态及生化特征鉴定：

观察分离筛选得到4株高效石油降解菌NYJ1.13、NYJ3.4、NYJ3.6、NYJ3.7的培养基平板上菌落的边缘形状、大小、颜色、隆起情况，透明度等形态特征，参照伯杰氏细菌分类鉴定手册制备细菌涂片，进行革兰氏染色，并在显微镜下观察个体形态与大小，4株菌的菌落形态如表3所示。使用传统的细菌鉴定方法以及细菌生化鉴定管(杭州微生物有限公司)较系统地检测石油降解菌相关的理化特征指标，对石油降解菌株进行生化鉴定管鉴定，所得菌株特征结果如表4所示。

表3四株菌的菌落形态特征

其中NYJ1.13为革兰氏阳性杆菌，NYJ3.4为革兰氏阴性杆菌，NYJ3.6为革兰氏阴性杆菌，NYJ3.7为革兰氏阴性杆菌。

4株菌的革兰氏染色镜检的形态图如图3所示，4株菌均为杆菌，菌株的形态较为相似，其中NYJ1.13为短杆菌，NYJ3.7为长杆菌。

对石油降解菌株进行生化鉴定管鉴定，所得菌株特征结果如表4所示：

表4四株菌的生化特征

4株细菌的生化特征基本相同，精氨酸均为阳性；鸟氨酸、赖氨酸、七叶苷、靛基质、ONPG、蔗糖、麦芽糖、木糖、硫化氢均显示为阴性；枸橼酸盐除NYJ1.13显示为阳性，其余均显示为阴性；硝酸盐除NYJ3.7显示阳性外，其余均显示为阴性。

根据生理生化管鉴定的结果，对照非发酵细菌生化鉴定编码手册(杭州微生物试剂有限公司)，可得出这4株菌的菌属，如表5所示：

表5四株菌的生化鉴定结果

结果表明，这4株耐盐碱的高效石油降解菌均为假单胞菌，这一现象表示假单胞菌可能是石油污染区域中的优势菌株。

实施例4

实施例4对菌株NYJ3.6的生物学分析：

实验选取生长能力较强，生长活力较强的一株代表性菌株NYJ3.6进行基因提取和生物学分析。

细菌基因组DNA的提取：将菌株NYJ3.6送至上海桑尼生物科技有限公司进行DNA的提取和测定序列，实验具体步骤按照该公司的试剂盒说明书进行操作。以NYJ3.6DNA为总模板，使用细菌的16S rDNA通用引物(27F的序列：

5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R的序列为：

5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行PCR。经测定所得，NYJ3.6的16S rDNA序列的有效扩增片段为1346bp。

序列测定与分析：取各个菌种纯化后的PCR产物，使用测序仪DNA测序，通过软件从GenBank数据库中检索与16S rDNA基因同源性较高的细菌基因序列，并从中选取与所待测细菌16S rDNA基因同源序列，使用DNASTAR软件计算16S rDNA基因的序列相似性，用系统发生推断软件包MEGA4.0，进行系统发育分析。

实验选取降解石油速率相对稳定、生长状况良好的耐盐碱高效石油降解菌NYJ3.6作为代表菌株，进行细菌DNA的提取和生物学分析，其PCR产物电泳图如图4所示，其电泳条带很亮，表明菌株NYj3.6的DNA提取及16S rDNA成功。

根据所得的NYJ3.6的序列在NCBI中进行blast的序列比对，结果显示，NYJ3.6与pseudomonas pseudoalcaligenes伪假产碱假单胞菌的亲缘关系较近，该菌株在GenBank中已有的序列的相似性可达到99％。菌株NYJ3.6的近缘模式种及相似性结果如表6所示。使用软件MEGA4.0将NYJ3.6与亲缘关系较近的菌株建立系统发育树，如图5所示。

表6基因序列鉴定结果

本发明筛选出4株耐盐碱的石油降解菌NYJ3.4、NYJ3.6、NYJ3.7、NYJ1.13，通过生理生化鉴定4株菌分别为伪产碱假单胞菌，产碱假单胞菌/伪产碱假单胞菌，伪产碱假单胞菌/绿脓假单胞菌，伪产碱假单胞菌/产碱假单胞菌，本发明选取的降解能力较强且稳定的NYJ3.6进行更为深入的研究，其16S rDNA鉴定为伪产碱假单胞菌(pseudomonaspseudoalcaligenes)。

实施例5

实施例5说明生物碳的制备及漂浮率的测定：

分别取芦苇杆、大豆皮、玉米秆以及松针为生物质原料进行简单的洁净、裁剪处理，去除明显差别杂物等，将处理后的材料放置电热恒温干燥箱80℃下烘至恒重后取出粉碎机粉碎，粉碎后再次放入电热恒温干燥箱备用，选取所需的生物质原料分别加入到瓷舟中压实，抽至真空-0.1Pa。放置于真空管式炉中，以10℃/min升温速率碳化，到达烧碳温度后恒温碳化10分钟后自然降温至室温取出，对四种生物质分别设置组别ABCD四组：A组芦苇杆；B组大豆皮；C组玉米秆；D组松针杆；烧碳温度分别设置abc三组，记作a：400℃、b：600℃、c：800℃；结合四种生物质、三种烧碳温度共设十二小组，每小组3个平行对照。

将烧制好的生物碳放置80℃的电热恒温干燥箱内干燥至恒重，分别取冷却至室温约0.005g生物碳样品于40ml试管中，生物碳质量记作m₁，加入30ml的蒸馏水后混匀，放置于全温震荡器，设置15℃、150r/min后进行24h的震荡，将培养皿标记，标记与各组生物碳标记一致，将滤纸剪成扇形捞取漂浮在试管水面上的样品，用蒸馏水将样品冲洗至漏斗内的滤纸上，多次进行至试管内水面样品全部捞出，将收集有生物碳的滤纸放入对应培养皿内，于电热恒温干燥箱进行干燥至恒重，降至室温称量质量为m₂，漂浮率可用下式计算：

漂浮率(％)＝m₂/m₁×100％

为挑选出漂浮效果最佳的生物碳，测定不同生物质不同温度对漂浮率的影响。

为测定时间对漂浮率的影响，在上述实验中挑选出漂浮效果最佳的生物碳进行7d的漂浮率并进行对比。

为测定粒径对漂浮率的影响，在上述实验中挑选出漂浮效果最佳的生物碳进行以小于100目和100目以上为标准的漂浮率并进行对比。

由表7横向比较相同生物质不同温度得出，生物碳的漂浮率与温度具有正相关的趋势，其中烧制温度为800℃时对生物碳的漂浮率的影响最显著(p<0.05)。这是因为随着烧制温度的增加，生物碳孔隙度及表面积升高导致漂浮率升高。

表7不同生物质不同温度对于生物碳漂浮率的影响

注：大写字母表示相同生物质不同温度，不同处理组中的显著性差异，(P<0.05)。小写字母表示相同温度不同生物质，不同处理组中的显著性差异，(P<0.05)。

生物质种类也是影响其烧制生物碳漂浮率的主要因素之一。纵向比较相同温度不同生物质可知，这四种生物碳的总体漂浮率关系是玉米秆<大豆皮<松针<芦苇杆，在这四种生物碳中芦苇杆生物碳漂浮率最显著(p<0.05)。

由于石油表面张力的原因，地表水石油污染具有面积广、浓度低等现象，选取漂浮率高的生物碳制作高效菌剂载体能够更持久地停留在水面，通过吸附石油再次增强漂浮能力、降低石油粘性、提高菌种降解效率等，因此选择800℃芦苇杆作为生物碳。

在得到漂浮能力最强的800℃芦苇杆生物碳后，分别进行了漂浮率与时间及生物碳粒径之间关系的进一步实验。

时间对漂浮率的影响如图6所示，结果表明时间的增加对800℃芦苇杆生物碳漂浮率影响很低，从而对其稳定性得到了肯定。

生物碳粒径与漂浮率影响如图7所示，结果表明粒径100目以上的生物碳漂浮率明显高于粒径小于100目的生物碳。因此，在后期的实验中，选取粒径100目以上的800℃芦苇杆生物碳为固定化载体。

试验例1

试验例1说明不同生物碳量对于吸附石油的影响：

准备4个三角瓶，分别在其中加入0.2g石油及100ml蒸馏水。121℃高温灭菌20分钟，冷却至室温后分别加入0.05、0.075、0.1、0.125g漂浮效果最佳的生物碳，进行7d的震荡，拍照观察动态吸附状况并大致分析吸附比率，结果如图8所示。

在进行为期7d的动态吸附后，观察各实验组得出在加入0.1g选中生物碳吸附0.2g石油可大致达到吸附饱和。

试验例2

试验例2说明漂浮碳固定化菌剂对石油降解率的测定：

石油标准曲线测定：与实施例2标准曲线相同。

空白试验组：每100ml石油发酵培养基中接种量为1ml浓度为0.2g/ml的NYJ3.6菌悬液。

正常实验组：用0.1g选定生物碳与1ml浓度为0.2g/ml的NYJ3.6菌悬液充分吸附混匀,每100ml石油发酵培养基中接种量为1ml浓度为0.2g/ml的混合液。

对照实验组：每100ml石油发酵培养基中接入0.1g选定生物碳。

每组制作3个平行，在摇床中150r/min培养7d；培养液中加入10ml石油醚充分振摇2min，将其一并倒入分液漏斗中，静置分层2min；将石油醚层反复萃取3次，将萃取液用塞有少许脱脂棉上面放有无水硫酸钠的漏斗过滤。

运用紫外分光光度法，将萃取液收集于50ml的容量瓶中，用石油醚定容至刻度，稀释10倍。用紫外分光光度计在350nm处测各自吸光度值(用OD₃₅₀表示)。

降解率(％)＝(A-B)/A×100％

式中：A为对照吸光度，B为样品吸光度。结果如表8所示：

表8不同处理对于石油降解率的影响

注：相同字母表示不同实验材料处理下，不同处理组中的显著性差异，(P<0.05)。

通过实验测定发现三种方法对应的降解率差异性显著(p<0.05)，其中三种方法降解率单加碳<单加菌<碳加菌，说明我们利用碳加菌应用于石油污染效果显著。实验分析发现，单碳在吸附方面可以通过一定的吸附从而减少石油的扩散，单菌在降解方面面临着环境适应性、与土著菌群竞争等方面问题，在实际应用中其降解能力会有所降低，由于生物碳具有高孔隙度等特点，固定化菌剂能提供高效菌前期的适应环境、氧气，使起在陌生的环境中更好的生存，从而提高其石油降解率。同时生物碳吸附石油也能解决地表水石油污染面积广、低浓度这些特点，使菌能在碳的周围进行降解，达到一个效果较好的现象。

在如今，资源短缺，污染严重，且国家开始注重生态环境的保护和修复，微生物作为三大修复方式中，最清洁的一条途径，可通过研究充分发挥其不可替代的作用，减轻石油污染对生态环境带来的影响。本发明筛选出的菌株，将可在耐盐碱土地，以及海洋石油污染问题中发挥均发挥重要作用。本实验研究表明，筛选出的4株菌经过驯化，在3％盐度、原油量1％、pH为9时，仍具有一定程度上的耐受力，仍具有较高的石油降解能力。

为解决大庆地区地表水石油污染问题，本试验以黑龙江地区常见的芦苇杆、大豆皮、玉米秆以及松针为生物质材料在不同温度下制备生物碳，并且探究这四种生物质所烧制的漂浮率最好的生物碳所需的条件及不同处理对高效菌株NYJ3.6降解率的影响。试验分析得出生物碳的产率随温度的升高而降低，但生物质种类对生物碳的产率及灰分没有显著性的影响。对于地表水石油的污染，漂浮率高的生物碳能在其自身沉淀之前更高效的吸附石油，吸附石油后其漂浮力在提高的同时更能降低石油的表面粘力。试验分析得出，粒径100目以上的800℃芦苇杆生物碳漂浮率高达62.2％且稳定性强。在探究不同处理对高效菌株NYJ3.6降解率的影响时得出，生物碳固定高效菌后能提高其17.1％的石油降解率。本试验将芦苇杆作为生物碳的最佳生物质来源，试验成本低，在有效利用废物的同时也为治理地表水石油污染问题提供思想路线。

Claims (6)

1.一株类产碱假单胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)NYJ3.6，其保藏编号为CGMCC No.17570。

2.权利要求1所述的类产碱假单胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)NYJ3.6在石油降解中的应用。

3.一种漂浮碳固定化菌剂，其特征在于：含有权利要求1所述的类产碱假单胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)NYJ3.6。

4.根据权利要求3所述的一种漂浮碳固定化菌剂，其特征在于：选取粒径100目以上的800℃芦苇杆为生物碳固定化载体。

5.一种权利要求3或4所述的漂浮碳固定化菌剂的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：

步骤一、制备800°芦苇生物碳；

步骤二、筛选100目以上；

步骤三、离心获得处于生长对数区的类产碱假单胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)NYJ3.6并配置菌悬液；

步骤四、目标生物碳与菌液充分吸附制备漂浮碳固定化菌剂。

6.权利要求3或4所述的漂浮碳固定化菌剂在石油降解中的应用。