TW201837166A - 微芒藻屬（ｍｉｃｒａｃｔｉｎｉｕｍ ｓｐ．）及其用途 - Google Patents

Abstract

本發明係關於一種可在不同材質上生長形成生物膜，且產生高量三酸甘油酯之經分離微芒藻屬(Micractinium sp.)。本發明亦係關於該經分離微芒藻屬(Micractinium sp.)於生產生質燃料及食用油上之用途。

Description

微芒藻屬( MICRACTINIUM SP. )及其用途

本發明係關於新穎微芒藻屬(Micractinium sp.)分離株，該分離株可在不同材質上生長形成生物膜(biofilm)，且可利用生物膜培養模式進行培養，以減少對水資源及土地的需求，並簡化採收流程，降低採收成本。該分離株可產生高量的三酸甘油酯(triacylglycerol)，於培養時可吸收二氧化碳，可作為固碳之用，並具有高熱值、低灰分及低硫分等特性，可作為生產生質柴油及食用油的料源。

自18世紀工業革命以來，人類對石化能源的需求與日俱增，然而石化能源之天然蘊藏量有限，因此逐漸需要尋求新的替代能源。第一代生質能源係以甘蔗、甜菜、玉米、大豆等糧食作物做為原料，利用水解、發酵及轉酯化(transesterification)等技術來製造生質能源，但會造成農耕地需求上升、糧食作物價格上昂等問題；第二代生質能源係以稻桿、玉米桿、木屑及蔗渣等非糧食作物為原料，利用纖維素水解等技術來製造生質能源，但此類生質能源具有原料來源有限、處理成本過高等問題；第三代生質能原係起源於西元1970年能源危機爆發時，美國所推動的藻類生質柴油開發計畫，以藻類為主要原料，利用油脂萃取、氫化(hydrogenation)及轉酯化等技術來製造生質能源。

微藻(microalgae)係屬於一種單細胞藻類，其細胞大小介於幾微米(μm)至幾百微米之間，一般無法以肉眼直接觀察，需利用顯微鏡輔助 觀察。微藻之分佈範圍非常廣泛，在淡水、海洋或潮濕的土壤中皆可發現其蹤跡，據估計，地球上大約有20萬至80萬種微藻，其中已發現並有記錄的僅約有3萬5千種，其生物多樣性非常複雜，無論是以基礎研究或是開發的角度而言，為一個幾乎未積極開發的領域。

微藻具備生長速度快、二氧化碳利用率高、可高密度培養、受病菌污染機率較小及所需土地面積較小等優點，並可在短時間內蓄積大量的生物質(biomass)，可作為生產生質柴油(biodiesel)、生物乙醇及生物氫等生質燃料(biofuel)的原料。此外，微藻可使用非農耕地、海水、生活廢水、農牧廢水及煙道氣等進行培養，大大減少了土地與淡水的需求，從而減少與糧食及經濟作物的資源競爭。加上其細胞結構簡單且缺乏細胞分化，相較於棕櫚、油菜、大豆及甘蔗等產油作物，其操作性較植物細胞更為簡易，且具有與植物相似的醣化後轉譯修飾機制以利細胞基因表現(Yen,H.W.et al.,Microalgae-based biorefinery-From biofuels to natural products.,Bioresour.Technol.,2013,135：166-174)。

目前，微藻生物質中所含的藻多醣、類胡蘿蔔素(carotenoid)、藻膽蛋白(phycobilin)、二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic Acid(EPA))及二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid(DHA))等，已被廣泛應用於醫療保健、美容、食品加工、水產養殖及生物能源等產業中(Spolaore,P.et al.,Commercial applications of microalgae.,J.Biosci.Bioeng.,2006,101：87-96)。

微藻所產的藻油主要由三酸甘油酯、各式脂肪酸及固醇類所組成，並可藉由氫化或轉酯化將其轉化為液態生物燃料。不同的藻種其藻油的組成成份比例亦不相同，因此，有研究指出微藻藻油的脂肪酸圖譜可作為篩選藻種的指標之一(Ramos,M.J.et al.,Influence of fatty acid composition of raw materials on biodiesel properties.,Bioresour. Technol.,2009,100：261-268)。然而，並非所有微藻所產的藻油皆適合用於製備生質燃料，其中所含脂肪酸的不飽和度(degree of unsaturation)及三酸甘油酯的比例，亦會影響該藻油是否適合用於製備生質燃料。有研究文獻指出單針藻(Monoraphidium contortum)(SAG 47.8)具備300mg/L/日的生質能產量，其藻體含油量佔藻體乾重的22.2%(w/w)，藻油主要脂肪酸組成為C16：0到C18：1脂肪酸，可作為製造生質燃料的潛力藻株(Bogen,C.et al.,Identification of Monoraphidium contortum as a promising species for liquid biofuel production.Bioresour.Technol.,2013,133：622-626)。

微藻的生長需仰賴光合作用的進行，故光、二氧化碳、水、氮、磷及鉀等係培養微藻所需之要素，其養殖方式包含自營、異營及混營培養等，自營培養係指微藻利用光源及無機碳(如二氧化碳)行光合作用得到生長所需之能量；異營培養係指微藻在無照光之條件下，利用培養基中的有機碳作為碳源(如醋酸鈉、葡萄糖)來生長；混營培養則係指微藻可同時進行自營及異營生長。一般而言，微藻之藻體量大約每6至72小時會增加1倍，微藻生長的速度越快，其可採收的頻率越高。然而，通常含油量較高的藻種生長速度較含油量較低的藻種來的慢，故需同時考量微藻的生長速度及含油量來篩選適宜用於製備生質燃料之藻種。此外，不同的培養方式及培養基成份對微藻生長速度、油脂的累積、產率及組成亦會產生不同程度的影響(Dhup,S.& Dhawan,V.,Effect of nitrogen concentration on lipid productivity and fatty acid composition of Monoraphidium sp.,Bioresour.Technol.,2014,152：572-575)。

目前以微藻作為生質燃料之原料，其生產成本與技術上仍有待克服與突破之處。以自營培養模式為例，微藻自營培養主要是將微藻懸浮培養於培養液中，然而目前現有的養殖技術仍無法將培養液中藻體 濃度提升至10g/L(1%)以上。此外，由於培養液中藻體濃度低且藻體細胞微小，導致在藻體回收乾燥時，需經由繁複的流程及設備才可將藻體與培養液分離，耗能費時且費用昂貴，使得藻體的回收成本可占微藻生質柴油全部生產成本的20~30%。

微藻生物膜養殖系統係利用微藻可貼附生長於載體表面之養殖模式，最早係應用於1980年代處理工業廢水中的氮及磷(Przytocka-Jusiak M.et al.,Removal of nitrogen from industrial waste waters with the use of algal rotating disks and denitrification packed bed reactor.,Water Res.,1984,18：1077-1082)。該養殖模式因不需將微藻懸浮培養於培養液中，且藻體採收時可直接得到高濃度之藻泥，可簡化傳統上繁複的藻體採收流程，大幅地減少藻體回收之能耗及成本，為極具開發潛力的微藻養殖模式。例如，2010年Johnson等人開發將綠球藻(Chlorella sp.)培養於廢水中以保麗龍作為載體之微藻生物膜貼附養殖模式，發現貼附培養之綠球藻可移除廢水中60%以上的氮及磷，且藻體可以直接以刮取之方式進行採收(Johnson,M.B.& Wen,Z.,Development of an attached microalgal growth system for biofuel production,Appl.Microbiol.Biotechnol.,2010,82：525-534)；2012年Ozkan等人以低能耗及低水需求量之微藻生物膜光反應器培養叢粒藻(Botryococcus braunii)，發現與開放池養殖系統相比，其生物膜光反應器養殖過程減少45%之水需求量，並大幅降低將藻液中水體移除所需能耗的99.7%(Ozkan,A.et al.,Reduction of water and energy requirement of algae cultivation using an algae biofilm photobioreactor.,2012,Bioresour.Technol.,114：542-548)；匈牙利MFKK工程公司自2012年開始推行ALGADISK計畫，目的在開發一種可模組化、易於放大、低運轉及低安裝成本的自動化微藻生物膜反應器，並於2014年由合作開發的匈牙利Bay-Bio研究所在研討會中發表，由微藻生物膜反 應器所直接採收之藻泥平均濃度可達100g/L(Sebestyén,P.et al.,Biomass and lipid production by microalgae in a new biofilm based photobioreactor.,presented at Young Biotechnologist National Conference,2014,Szeged)，此濃度為一般懸浮微藻養殖濃度的10倍以上；以及2013年美國愛荷華大學Gross等人利用循環微藻生物膜(Revolving Algal Biofilm(RAB))生長系統培養小球藻(Chlorella vulgaris)，發現相較於開放池養殖系統，RAB系統所採收之藻泥含水量約90.3%，接近傳統離心後所採收之藻泥含水量(約88.6%)。因此，微藻生物膜養殖模式可以直接刮取之方式重覆採收高濃度之藻泥，免除傳統沉降、絮凝及離心等採收流程，具備節省時間、空間以及減少水資源、採收成本及能源消耗等優勢。然而，上述RAB系統所採收之藻體油脂含量較開放池養殖系統減少約40%(w/w)，且在ALGADISK計畫中所採收的藻體油脂含量亦較懸浮培養的藻體油脂含量少，兩種培養模式之油脂含量皆約為10%(w/w)(Gross,M.& Wen,Z.,Yearlong evaluation of performance and durability of a pilot-scale Revolving Algal Biofilm(RAB)cultivation system,Bioresour.Technol.,2014,171：50-58；及Sebestyén,P.et al.,Biomass and lipid production by microalgae in a new biofilm based photobioreactor,presented at Young Biotechnologist National Conference,2014,Szeged)。顯示以微藻作為生質燃料之料源時，並非所有藻株皆適合以生物膜培養模式進行培養。

以微藻作為生質燃料料源之另一優勢在於微藻的熱值(calorific value)含量高(大於25MJ/Kg)，與發電廠(包含火力發電廠及汽電共生廠)所使用之燃煤相比，微藻的熱值約為煙煤(熱值23.94MJ/Kg)的1.044倍以上，約為亞煙煤(熱值20.58MJ/Kg)的1.215倍以上。換言之，若以25MJ/Kg之熱值含量計算，每1公噸藻體所產生之熱值相當 於1.044噸煙煤所產生之熱值，或1.215噸的亞煙煤所產生之熱值。若將微藻以生物膜培養模式進行培養，其採收之藻泥可利用廢熱進行後續的乾燥與焙燒，生產出生質煤炭(biocoal)，可取代部份目前使用之燃煤，進而減少燃煤的使用量。

目前以微藻作為生質燃料之料源的相關研究，主要包含藻種開發/篩選、微藻養殖技術、藻體回收及生物質萃取等。在藻種開發及篩選方面，目前仍需要具有生長快速、生物質產率高、藻油含量高及藻體易於回收等特點的藻種作為製備微藻生質燃料的基礎。希冀藉由開發具潛力之藻種，以製備生質燃料或高價之活性物質，同時減緩二氧化碳的排放，達到環境保護與產業獲利雙贏之目標(Farrelly,D.J.et al.,Carbon sequestration and the role of biological carbon mitigation：A review.,Renewable and Sustainable Energy Reviews,2013,21：712-727)。

本發明係於台灣嘉義阿里山山區採集到含微藻的土壤樣品後，以C培養基進行微藻的培養與分離，選取出可以生物膜培養模式進行培養、具高油脂含量及高熱值以及耐高溫之74C藻株，經鑑定該藻株屬於微芒藻屬(Micractinium)之微藻。經藻油含量、組成及藻體熱值、灰分、硫分含量等分析，發現74C藻株具有作為生質燃料及食用油之原料的潛力。此外，74C藻株可貼附生長於不同材質之載體表面上，形成生物膜；可藉由生物膜培養模式生產藻油，在藻體採收時僅需將載體表面之藻體刮取下來，即可得到高濃度之藻泥，可簡化微藻養殖過程中的採收流程，並降低生產成本。

因此，本發明之一目的係提供一種經分離之微芒藻屬分離株，其中該微芒藻屬分離株包含SEQ ID NO：1所示之核苷酸序列的18S rDNA序列及SEQ ID NO：2所示之核苷酸序列的ITS區域序列。

本發明之另一目的係提供一種培養該經分離之微芒藻屬分離株以獲得微芒藻屬培養產物的方法。

本發明之另一目的係提供一種由上述方法所獲得的微芒藻屬培養產物，其中該微芒藻屬培養產物可作為生產生質燃料及食用油的料源。

本發明之另一目的係提供一種由上述微芒藻屬培養產物中獲得三酸甘油酯之方法。

本發明之另一目的係提供一種培養該經分離之微芒藻屬分離株以固定二氧化碳之方法。

本發明在以下部分中詳細描述。本發明之其他特徵、目的及優點可易見於本發明之實施方式及申請專利範圍中。

圖1為74C藻株的顯微鏡檢圖。圖1A為明視野觀察，藻細胞直徑約為3~6μm，顯微倍率1,000X；圖1B為以Nile Red染色，以螢光顯微鏡觀察，藻體內部有黃色之油滴分佈，顯微倍率1,000X。

圖2為74C藻株18S rDNA及ITS區域序列的演化樹分析圖。

圖3為74C藻株之ITS區域序列之演化樹分析圖。

圖4為74C藻株於不同培養溫度下(30℃、35℃、37℃及40℃)之生長情形。

圖5為74C藻株於不同培養pH值下(pH4、pH5.5、pH6.5、pH7.5 pH8.5及pH9.5)之生長情形。

圖6為74C藻株在不同培養鹽度下(0%(w/v)、1.0%(w/v)、1.5%(w/v)、2.0%(w/v)、2.5%(w/v)、3.0%(w/v)及4.0%(w/v))之生長情形。

圖7為74C藻株生長於不同材質之貼附載體之貼附與產油情形。組別A為各種不同材質之貼附載體；組別B為74C藻株貼附於各載體之生 長情形；組別C為貼附於各載體之74C藻體的顯微鏡明視野觀察圖，顯微倍率為400X；組別D為貼附於各載體之74C藻體經Nile red染色後的螢光顯微鏡觀察圖，顯微倍率為400X。

本發明可藉由下述實施方式中所揭示之各種發明態樣、實施例及表列之相關敘述所瞭解。除非在本文中另作定義，否則與本發明關聯使用之術語(包含技術及科學術語)應具有本發明所屬技術領域中具有通常知識者所瞭解之含義。且當可瞭解，除非本文中提供之定義另作說明，在任何潛在歧義之情況，術語之定義應與該等普遍使用之術語(如詞典中所定義)一致。可進一步瞭解者，本案所使用的術語僅係用作描述特定實施態樣之目的，而非用於限定。

必須注意的是，除非有清楚的相反指示，於說明書或申請專利範圍使用之單數格式「一」、「一種」及「該」亦包含複數表示。因此，除非上下文另有需要，單數術語應包含複數，而複數術語亦包含單數。

本發明的範圍以「自一『約』特定數值及/或至另一『約』特定數值」表示。當範圍藉上述方式表示時，其包含自一特定數值及/或至另一特定數值之範圍。同樣地，當數值可藉由術語「約」以表示近似值，將可了解其為一特定值的另一個態樣。可進一步了解，當提及有關其它端點及其他端點本身而言，每一範圍的兩端點皆為有意義的。根據本發明，「約」可表示±20%，較佳為±10%，更佳為±5%。

於本發明中，術語「經分離」或「分離」意謂使物質自其原始環境(若天然存在則為天然環境)中移出。術語"經分離"或"分離"並不一定指物質係經純化者。

本發明之一目的係提供一種微芒藻屬分離株，其中該微芒藻屬分離株包含SEQ ID NO：1所示之核苷酸序列的18S rDNA序列及SEQ ID NO：2所示之核苷酸序列的ITS區域序列。於本發明較佳實施態樣中，該微芒藻屬分離株為寄存於財團法人食品工業發展研究所且寄存編號為BCRC 980044之藻株，或為與寄存於財團法人食品工業發展研究所且寄存編號為BCRC 980044之藻株具有實質上完全相同識別特徵之變異株。

上述術語「變異株」意謂涵蓋全體細胞遺傳組成已藉由如化學突變誘發、自發突變、遺傳工程、轉化或轉染而改變，以致影響其物理或生物化學特性之任何微芒藻屬藻株。然而，該變異株應具有寄存於財團法人食品工業發展研究所且寄存編號為BCRC 980044之微芒藻屬分離株的所有分類學識別特徵。

於本發明中，術語「相似度」意謂兩個核酸序列間的相似程度。該兩個核酸序列之差異可出現於參考核苷酸序列之5'或3'末端位置處，或個別散布於參考序列中之核苷酸當中，或散布於參考序列內之一或多個鄰近基團中之彼等末端位置之間的任何地方。任何特定核酸分子是否與參考核苷酸序列具至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相似度係指使用此項技術中所熟知之標準演算法在兩個分子之間所進行的比較，且可常規使用公開可用之電腦程式(諸如BLASTN演算法)來判定。

本發明之一目的係在於提供一種製備微芒藻屬培養產物之方法。於本發明之實施態樣中，該方法包含將本發明之微芒藻屬分離株接種於液態培養基中，在照光及通氣下進行培養以獲得該培養產物。於本發明之一較佳實施態樣中，該方法包含將本發明之微芒藻屬分離株與一或多種載體共同培養於液態培養基中，在照光及通氣下進行培養以獲得該培養產物，其中該微芒藻屬分離株與該一或多種載體係分別加入該液態培養基中，或先將該微芒藻屬分離株接種於該一或多種載體上後，再將經接種之載體置入該液態培養基中。

於本發明中，術語「培養產物」意謂將微藻置於培養基中培養後，所獲得富含微藻細胞的產物。於本發明中，該培養產物中之微藻細胞可不必與培養基分離，且該培養產物可呈液態、固態或黏稠狀。

於本發明中，用於培養微芒藻屬分離株之「培養基」可為任何容許微芒藻屬分離株生長、繁殖並製造三酸甘油酯及/或脂肪酸之水性培養基，例如C培養基[每100mL中包含15mg Ca(NO₃)₂˙4H₂O、10mg KNO₃、5mg β-甘油磷酸二鈉˙5H₂O、4mg MgSO₄˙7H₂O、0.01μg維生素B12、0.01μg生物素(Biotin)、1μg噻胺HCl、0.3mL PIV微量元素溶液(每100mL中包含100mg Na₂EDTA˙2H₂O、19.6mg FeCl₃˙6H₂O、3.6mg MnCl₂˙4H₂O、1.04mg ZnCl₂、0.4μg CoCl₂˙6H₂O、0.25μg Na₂MoO₄˙2H₂O及水)、50mg Tris(hydroxymethyl)aminomethane及水]、BG-11培養基[每100mL包含1,500mg NaNO₃、40mg K₂HPO₄、75mg MgSO₄．7H₂O、27.18mg CaCl₂、6mg檸檬酸、6mg檸檬酸鐵銨、1mg Na₂．Mg．EDTA．2H₂O、20mg Na₂CO₃、2.86mg HBO₃、1.181mg MnCl₂˙4H₂O、0.222mg ZnSO₄˙7H₂O、0.39mg Na₂MoO₄˙2H₂O、0.0718mg CuSO₄˙5H₂O、0.049mg Co(NO₃)₂．6H₂O及水]，以及MA培養基[每100mL中包含10mg Ca(NO₃)₂˙4H₂O、10mg KNO₃、5mg NaNO₃、4mg Na₂SO₄、5mg MgCl₂˙6H₂O、10mg β-甘油磷酸二鈉˙5H₂O、0.5mg Na₂EDTA˙2H₂O、0.05mg FeCl₃˙6H₂O、0.5mg MnCl₂˙4H₂O、0.05mg ZnCl₂、0.5mg CoCl₂˙6H₂O、0.08mg Na₂MoO₄˙2H₂O、2mg H₃BO₃及50mg Bicine]。

本發明中用於培養微芒藻屬分離株之條件意指如培養基之pH值、鹽度、培養溫度、照光、通氣條件及培養時間等條件，其可容許該微芒藻屬分離株生長、繁殖並製造三酸甘油酯及/或脂肪酸。本技術領域之人士可根據既有知識針對培養基的成分及培養條件作調整。

於本發明之實施態樣中，用於培養微芒藻屬之培養基的pH值可為約pH2.5至約pH11.0(例如約pH2.5、約pH3.0、約pH3.5、約pH4.0、約pH4.5、約pH5.0、約pH5.5、約pH6.0、約pH6.5、約pH7.0、約pH7.5、約pH8.0、約pH8.5、約pH9.0、約pH9.5、約pH10.0、約pH10.5或約pH11.0)，較佳為約pH4.0至約pH9.5。

於本發明之實施態樣中，微芒藻屬培養溫度可為約15℃至約60℃(例如約15℃、約20℃、約25℃、約30℃、約35℃、約40℃、約45℃、約50℃、約55℃或約60℃)，較佳為約20℃至約40℃；且照光量可為約100lux至約4,000lux，較佳為約2,000lux之亮度持續照光。

於本發明之實施態樣中，可視需要調整培養微芒藻屬之培養基的鹽度。本文中所謂「鹽度」意旨溶解於培養基中之鹽類含量。本發明中培養基之鹽度可為0%(w/w)至約6.0%(w/w)(例如0%(w/w)、約0.5%(w/w)、約1.0%(w/w)、約1.5%(w/w)、約2.0%(w/w)、約2.5%(w/w)、約3.0%(w/w)、約3.5%(w/w)、約4.0%(w/w)、約4.5%(w/w)、約5.0%(w/w)、約5.5%(w/w)或約6.0%(w/w))，較佳為0%(w/w)至約4.0%(w/w)。

於本發明中，術語「通氣」意旨於液體培養基中持續地通入含有二氧化碳之空氣，而通氣量可為約0.05vvm至約1vvm，較佳為約0.1vvm至約0.5vvm，最佳為約0.1vvm。該空氣中之二氧化碳的濃度可為約0.04%(v/v)至約20%(v/v)，較佳為約0.1%(v/v)至約15%(v/v)，更佳為約5%(v/v)至約10%(v/v)。

於本發明中，術語「載體」意指可供微芒藻屬貼附及/或固定於其表面上並生長之任何基質，其包括(但不限於)網狀物質(例如，纖維濾紙、棉布、麻布、濾布、木漿布、不織布、牛仔布、尼龍布、超細纖維織布及帆布)、泡棉(例如，聚乙烯醇(PVA)泡棉)或其任意的組合；該載體可呈任何形狀，包括(但不限於)片狀、球形、環狀、螺旋 體、正方體、長方體及多邊體。

於本發明中，術語「生物膜」意指由本發明之微芒藻屬細胞所聚集而形成之膜狀群落。

本發明製備微芒藻屬培養產物之方法中，可視需要包含分離該培養產物的步驟，而該分離步驟可為如離心、過濾、聚集凝結及/或將生物膜從載體上刮下收集等習知的方法步驟。

本發明亦提供由上述方法所獲得之培養產物。本發明之培養產物中富含三酸甘油酯及/或脂肪酸，特別是三酸甘油酯，可作為製造生質燃料及食用油之料源。有研究指出，微藻在貼附生長下所產生之油脂量僅佔藻體乾重10%(w/w)以下，遠低於懸浮生長所產生之油脂量(Gross,M.& Wen,Z.,Yearlong evaluation of performance and durability of a pilot-scale Revolving Algal Biofilm(RAB)cultivation system,Bioresour.Technol.,2014,171：50-58；及Sebestyén,P.et al.,Biomass and lipid production by microalgae in a new biofilm based photobioreactor,presented at Young Biotechnologist National Conference,2014,Szeged)。然而，本發明之微芒藻屬分離株於貼附培養下之藻乾含油量為52.08%(w/w)，遠高於一般藻株於貼附培養下之藻乾含油量。

本文中之「三酸甘油酯」意旨具有1個甘油分子及3個脂肪酸分子之酯類化合物，其中該3個脂肪酸分子可具有完全相同、部份相同或完全相異之碳數及不飽和鍵。

本文中之「脂肪酸」意旨具有8至30個碳原子及0至6個不飽和鍵的羧酸化合物，其較佳為具有12至20個碳原子及0至5個不飽和鍵的羧酸化合物，更佳為具有16至18個碳原子及0至3個不飽和鍵的羧酸化合物。

三酸甘油酯及脂肪酸之獲得可使用本技術領域所熟知的任何萃 取及分離方法，例如Folch等人(Folch,J.et al.,A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissue.,J.Bio.Chem.,1957,23：497-509)、Balasubramanian等人(Balasubramanian S.et al.,Oil extraction from Scenedesmus obliquus using a continuous microwave system-design,optimization,and quality characterization.,Bioresour.Technol.,2011,102：3396-3403)及Sajilata等人(Sajilata M.G.et al.,Supercritical CO₂ extraction of γ-linolenic acid(GLA)from Spirulina platensis ARM 740 using response surface methodology.,J.Food Eng.,2008,84：321-326)所述的方法。簡而言之，該方法可包含將微芒藻屬細胞以如研磨法或超音波法等方式擊碎，藉由適當的溶劑萃取微芒藻屬細胞中之三酸甘油酯及/或脂肪酸，再藉由如HPLC及/或離子交換樹脂的技術獲得三酸甘油酯及/或脂肪酸。

本發明之微芒藻屬培養產物可經化學轉化(如氫化、轉酯化、水熱碳化(hydrothermal carbonisation)、發酵或裂解等)或萃取而成固態、液態或氣態之生質燃料，其包括(但不限於)生質柴油、生物甲醇、生物乙醇、生物丁醇、生物甲烷、生物氫或生質煤炭。

上述生質燃料之獲得可使用本技術領域所熟知的任何方法，諸如Tran D.T.等人(Tran D.T.et al.,Effect of solvents and oil content on direct transesterification of wet oil-bearing microalgal biomass of Chlorella vulgaris ESP-31 for biodiesel synthesis using immobilized lipase as the biocatalyst.,Bioresour.Technol.,2013,135：213-221)、Cheng H.H.等人(Cheng H.H.,et al.,Biological butanol production from microalgae-based biodiesel residues by Clostridium acetobutylicum.,Bioresour.Technol.,2015,184：379-385)、Sambusiti C.等人(Sambusiti C.,et al.,Algae as promising feedstocks for fermentative biohydrogen production according to a biorefinery approach：A comprehensive review.,Renew.Sust.Energ.Rev.,2015,44：20-36)及Heilmann S.M.等人(Heilmann S.M.et al.,Hydrothermal carbonization of microalgae.,Biomass.Bioenerg.,2010,34(6)：875-882及Heilmann S.M.et al.,Hydrothermal carbonization of microalgae II.Fatty acid,char,and algal nutrient products.,Appl.Energ.,2011,88(10)：3286-3290)所述之方法。

本文所述之所有公開案、專利及專利文獻均以全文引用的方式併入本文中。

提供以下實例以輔助熟習此項技術者實施本發明。即使如此，不應將該等實例視為本發明之限制，因為本發明所屬技術領域中具有通常知識者在不背離本發明之精神或範疇的情況下對本文所討論之實施例進行的修改及變化，而仍屬於本發明之範圍。

實施例 材料與方法

1.C培養基

將Ca(NO₃)₂˙4H₂O 15mg、KNO₃ 10mg、β-甘油磷酸二鈉˙5H₂O 5mg、MgSO₄˙7H₂O 4mg、維生素B12 0.01μg、生物素(Biotin)0.01μg、噻胺(Thiamine)HCl 1μg、PIV微量金屬溶液0.3mL與Tris 50mg混合後將其體積補水至100mL，調整pH至7.5後進行高壓滅菌。若為1.5%(w/v)洋菜固體培養基則需加入15g的洋菜膠一同滅菌。

PIV微量金屬溶液的配製為依序加入Na₂EDTA˙2H₂O 100mg、FeCl₃˙6H₂O 19.6mg、MnCl₂˙4H₂O 3.6mg、ZnCl₂ 1.04mg、CoCl₂˙6H₂O 0.4μg與Na₂MoO₄˙2H₂O 0.25μg，隨後將其體積補水至100mL後進行高壓滅菌。

2.藻樣採集、分離及培養

取台灣嘉義阿里山山區之土壤樣品約10g置於50mL離心管中，並加入約30mL C培養基，於25℃下照光培養。培養期間以顯微鏡觀察是否有藻體生長，之後取出適量含藻體之培養液，將其轉至平板培養基，於25℃下照光培養。待藻體生長後取單一藻種將其於平板培養基中塗開，以上步驟需重覆至篩到單一藻體為止。平板培養則取單一藻落塗至C培養基平板上，於25℃下照光培養。大量培養則自平板培養基上刮取新鮮培養之單一藻體，添加至液態C培養基中(約800mL)，使其培養液吸光值(OD_682nm)約達0.1~0.15，並於25℃照光充氣培養，培養期約30天。

3.油脂染色分析

將培養好的藻體取20μL與1μL Nile Red(於二甲基亞碸中0.1mg/mL)混合以進行油滴染色，染色後於室溫靜置10分鐘，再利用螢光顯微鏡進行觀察(Chen,W.et al.,A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae.,J.Microbio.Methods,2009,77：41-47及Huang,G.H.,et al.,Rapid screening method for lipid production in alga based on Nile red fluorescence.,Biomass.Bioenerg.,2009,33：1386-1392)。

4.藻種之分子鑑定

自平板培養基上刮取適量之新鮮培養的藻體，將其收集在2mL微量離心管中，依照ZYMO RESEARCH的ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep^TM kit說明書操作取得基因體(genomic)DNA，並以NanoDrop(ND-1000分光光度計)檢測DNA濃度。

將藻體基因體DNA作為PCR模板，以18S rRNA與ITS區域(包含內轉錄間隔區(internal transcribed spacer)1、5.8S核糖體RNA、內轉錄間隔區2與28S核糖體RNA的前端等序列)的相關引子組(http：//biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm)來擴增其 基因片段。PCR反應溶液如下：適量的基因體DNA溶液作為PCR模板、10mM dNTP 3μL、10X PCR緩衝液4μL、10mM 5'端引子與3'端引子各0.5μL及Taq酵素5U。PCR反應條件為96℃，5分鐘；(96℃，30秒；50℃，20秒；72℃，3分鐘)共40次循環；72℃，10分鐘；最後保持在4℃。取5μL產物進行電泳跑膠分析。

將PCR產物純化後以適當引子(http：//biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm)進行定序，將定序結果以Vector NTI Suite 9軟體(VNTI)與NCBI/Blastn(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進行序列重組與序列相似性比對分析。另，分別將定序所得的結果經NCBI/Blastn後所得相近的藻株與數個藻種中心較接近的藻株及藻屬列為比較範圍，進行演化樹分析，以MEGA 6.0做比對，接著利用最大概似法(Maximum Likelihood)以GTR+G+I的方式繪製演化樹，Bootstrap則為100次。

5.藻種培養特性分析

5.1 培養溫度(耐熱溫度)

將74C藻種於25℃環境下進行分離純化，之後於20℃下進行長期的繼代保存。為測試74C藻株在不同培養溫度下之生長耐受性，將適量藻體接種於多個C培養基平板上，並分別於30℃、35℃、37℃及40℃等不同溫度下進行照光培養，之後分別於培養第14天及第21天觀察藻體在不同溫度下之生長情形。

5.2 培養pH值

製備pH4~pH9.5之液態C培養基，分別取適量藻體接種於含有不同pH值之液態C培養基中，在25℃下進行照光培養，分別於培養第1天及第14天觀察藻體在不同pH值下之生長情 形。

5.3 培養鹽度(鹽度耐受性)

製備含有0%(w/v)~4%(w/v)NaCl之液態C培養基，取適量藻體分別接種於各鹽度之液態培養基中，在25℃下進行照光培養，分別於培養第1天及第14天觀察藻體在不同鹽度下之生長情形。

5.4. 藻體貼附培養

觀察74C藻株於8種不同材質之載體上之生長貼附情形。所測試之載體包含：(1)纖維濾紙；(2)棉布a；(3)濾布；(4)木漿布；(5)棉布b；(6)不織布；(7)牛仔布；及(8)碎花布。將不同載體分別與74C藻株置於含有50mL C培養基之250mL錐形瓶中，以75rpm之轉速共同振盪培養21天後，將載體取出觀察藻體之貼附情形，並將貼附於載體上之藻體以Nile red染色，室溫靜置10分鐘後，以螢光顯微鏡觀察。

6.藻體分析

6.1 藻體含油量分析

收集藻體後將其冷凍乾燥成藻粉，秤取定量之藻粉，萃取其油脂。油脂萃取方法參考Folch等人的方法(Folch,J.et al.,A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissue.,J.Bio.Chem.,1957,23：497-509)並經修飾來進行，其過程為將30mg冷凍乾燥的藻粉(A值)置入2mL微量離心管，加入約2.0mL氯仿/甲醇(v：v=2：1)與適量大顆玻璃珠，以撞擊式細胞破碎儀(Retsch® MM400)振盪約5分鐘，重複兩次。以10,000rpm離心5分鐘後，取出上清液並將其加入拋棄式15mL離心管中，隨即於2mL微量離心管內加入約2.0mL氯仿/甲醇(v：v=2：1)，再以超音波振盪與離心處理，取出上清 液並將其加入另一拋棄式15mL離心管中，重複上述萃取離心步驟直到萃取液無色為止。於裝有萃取液的15mL離心管中加入等體積的145mM NaCl溶液後，以試管旋轉混合器混和均勻後，經離心管在4,500rpm下離心10分鐘。以玻璃吸管取下層液體到已秤重的玻璃瓶(B值)中。將此玻璃瓶內液體隔夜風乾再秤重(C值)，計算藻乾含油量的百分比(D值)。藻乾含油量計算公式：

6.2 脂肪酸圖譜分析

刮取適量乾燥藻體置於玻璃試管中，加入1mL溶液I(NaOH 45g、甲醇150mL及ddH₂O 150mL)，震散藻體。於100℃加熱5分鐘，再將所有藻體震散，繼續加熱25分鐘。加入2mL溶液II(6N HCl 325mL及甲醇200mL)，於80℃加熱10分鐘，完成後迅速冷卻。再加入1.25mL溶液III(己烷200mL及三級丁基甲基醚200mL)，緩慢混合10分鐘，以玻璃吸管尖吸取下層液體並丟棄。將上層液體加入3mL溶液IV(NaOH 10.8g及ddH₂O 900mL)，混合5分鐘後，吸取上層液體並將上層液體以GC/MS(HP 5973 GC/MS System)分析其脂肪酸含量。GC/MS分析方法參考2007年Valencia,I.等人的方法(Valencia,I.et al.,Development of dry fermented sausages rich in docosahexaenoic acid with oil from the microalgae Schizochytrium sp.：Influence on nutritional properties,sensorial quality and oxidation stability.,Food Chem.,2007,104：1087-1096)。GC/Mass分析條件為：毛細管管柱：SP-2560，75m x 0.18mm I.D.，0.14μm；注入口温度：250℃； 離子源温度：FID 250℃；管柱烘箱溫度：起始溫度140℃，保持5分鐘後以4℃/min之昇温速率昇温至240℃，保持2分鐘；載送氣體：氦；管柱流量：40cm/sec@175℃；待分析樣品注射體積：1μL；分流比：1/100；脂肪酸標準品：37-Component FAME Mix(Cat.18919-1AMP,Sigma-Aldrich)。

6.3 油脂組成分析

將6.1所萃取的藻油樣品以HPLC分析其油脂組成。HPLC分析條件：分離管柱為德國Merck公司製造之Silica gel(4.6mm id×250mm，顆粒大小5μm)；沖提溶劑A為己烷；沖提溶劑B為己烷/乙酸乙酯/異丙醇(80：10：10(v/v))；在0分鐘溶劑A/B為98：2(v/v)，在8分鐘線性增加至溶劑A/B為50：50(v/v)，在8.5分鐘線性增加至溶劑A/B為2：98(v/v)，15分鐘維持相同梯度，20分鐘線性減少至溶劑A/B為98：2(v/v)；流速：1.2mL/min；蒸發光散射檢測器(Evaporative Light Scattering Detector；ELSD)條件：氣體流量2.6L/min；蒸發器溫度為40℃(詹國靖等人，以甘油與植物油利用脂解酶之轉酯化反應生產1,3-雙醯甘油。台灣農業化學與食品科學，2010，45：19-25)。

7.藻體貼附培養之生物質產率及產油效率分析

將74C藻株以懸浮培養之方式大量培養後，將藻液濃度調整至其吸光值(OD_682nm)為0.5，再取30mL藻液，以抽氣過濾的方式將藻體固定於乾燥並完成稱重的0.45μm之硝酸纖維/乙基纖維膜表面，製備2份固定化之藻體。製作1份空白組(含未進行貼附生長的藻體)直接進行冷凍乾燥，扣除濾紙乾重(W_P)後，作為培養前之藻體乾重(W_AI)。取經無菌處理過之吸水載體(如海棉、厚濾紙...等)，置於無菌平板底部，加入適量液態C培養基使其維持濕潤，再將含固定化 藻體之濾紙平放至吸水載體上方，將平板置於夾鏈袋中防止水份蒸發流失，於30℃下進行24小時照光培養。培養14天後，將含固定化藻體之濾紙自平板中取出，以冷凍乾燥方式將藻體乾燥後，稱重，並扣除濾紙乾重，作為培養後之藻體乾重(W_AF)。完成藻體稱重後，將藻體自載體表面刮下進行含油量分析，記錄貼附藻體含油量(OC_A)。計算藻體生物質產率及油脂含量之計算公式為：P_AB=(W_AF-W_AI)/A/T P_AO=OC_A×P_AB

P_AB：貼附培養之藻體生物質產率(g/m²/日)

P_AO：貼附培養之藻體油脂產率(g/m²/日)

W_AF：藻體貼附培養後之乾重(g)

W_AI：藻體貼附培養前之乾重(g)

A：藻體貼附培養之面積(m²)

T：藻體貼附培養之天數(日)

OC_A：貼附培養之藻體含油量(%)(w/w)

8.藻體懸浮培養之生物質產率、產油效率分析及固碳效率分析

將適量藻體放入含有1L之C培養基的1L血清瓶中，調整其培養液之吸光值(OD_682nm)達約0.5後，先取50mL液，以抽氣過濾方式收集藻體，並將藻體冷凍、烘乾及秤重(作為藻體生長的起始點W_AI)。之後置於二氧化碳固碳篩選平台，以體積為1L之藻液進行監測。固碳篩選平台以通氣量為0.1vvm持續通入5%(v/v)二氧化碳至潛力藻株之藻液中，再利用二氧化碳自動監測系統持續監測進流及出流之二氧化碳濃度(濃度單位為%，1%=10,000ppm)，經由氣體濃度轉換公式之計算將二氧化碳濃度單位轉換為mg/m³，計算每日固定二氧化碳毫克數(Ya-jun H.,Brief Discussion on Conversion Coefficient between the Concentration Units ppm and mg/m³ of Nitrogen Oxides(NO_X).,Sichuan Environment,2010,29(1)：24-46)。30℃照光培養後，取50mL藻液(四重複，共取200mL液)，以抽氣過濾方式收集藻體，並將藻體冷凍、烘乾及秤重(作為藻體生長的終點W_AF)。另，完成藻體稱重後，將藻體自載體表面刮下進行藻乾含油量分析，記錄其藻乾含油量(OC_A)。

二氧化碳氣體濃度轉換之計算公式：濃度(mg/m³)=濃度(ppm)×(分子量/22.4)×[273/(273+t)]

分子量(二氧化碳)：44.01

t：測定溫度(30℃)

固碳效率計算公式：R=(C_in-C_out)×V×Q×T

R：每日固定毫克數(mg)

V：微藻培養體積(m³)

Q：氣體通氣量(vvm，volume per volume per minute)

T：每日通氣時間(分鐘)

C_in：二氧化碳進流濃度(mg/m³)

C_out：二氧化碳出流濃度(mg/m³)

計算藻體生物質產率及產油效率之計算公式為：P_AB=(W_AF-W_AI)/A/T P_AO=OC_A×P_AB

P_AB：懸浮培養之藻體生物質產率(mg/L/日)

P_AO：懸浮培養之藻體油脂產率(mg/L/日)

W_AF：藻體懸浮培養後之乾重(mg)

W_AI：藻體懸浮培養前之乾重(mg)

A：藻液體積(L)

T：藻體懸浮培養之天數(日)

OC_A：懸浮培養之藻乾含油量(%)(w/w)

9.藻體熱值測定

將74C藻株大量培養後，將藻體收集凍乾後保存。將1g之凍乾藻體置於烘箱，以105℃烘乾2小時後，將烘乾之藻體置於乾燥器中冷卻至室溫後，以天秤記錄藻體烘乾後重量(W_HD)。將烘乾後之藻體置入燃燒彈熱卡計內，再置於附有絕熱式燃燒彈夾套之水浴槽中，點火燃燒後，樣品所釋放之燃燒熱，將由外圍水浴槽吸收，紀錄水浴槽上昇之溫度，乘上水及燃燒彈熱卡計水當量之總和，乘上水之比熱，再除以W_HD，即可求得樣品之熱值。

10.藻體灰分測定

將74C藻株大量培養後，將藻體收集凍乾後保存。將1g之凍乾藻體置入坩鍋，並置於烘箱以105℃烘乾2小時後，將烘乾之藻體置於乾燥器中冷卻至室溫，以天秤記錄乾體烘乾後重量(W_AD)。將去除水分之乾藻體樣品及坩鍋置於800±50℃之高溫爐中加熱燃燒3小時，降低爐溫至300℃，將坩鍋及樣品移入乾燥器中冷卻至室溫，秤量燃燒後之殘餘物重量(W_ASH)，將W_ASH除以W_AD即得藻體灰分含量。

11.藻體硫分測定

將74C藻體在高溫純氧之環境下燃燒，並將燃燒後所產生含有二氧化碳、水、氮化物及二氧化硫之混合氣體以氦氣輸送至銅還原管中，將氮化物還原成氮氣，其他氣體則依氣體吸附特性分別被不同吸附管中之填充物吸附。氮氣則直接由氦氣輸送至熱傳導偵檢器(Thermal conductivity detector；TCD)檢測其含量。不同的吸附管則以不同之脫附溫度加溫分別脫附出二氧化碳、水及二氧化硫，再將該等成分分別引入熱傳導偵檢器來檢測個別成分之含量，以求得硫之組成百分比。

實例一、藻株鑑定

於台灣嘉義阿里山山區的土壤樣品中分離純化得到74C藻株。以顯微鏡(1,000X)觀察其形態，發現74C藻株以非群聚之單一藻體存在，其中細胞壁外無剛毛狀突起，細胞呈圓形，依其藻體培養天數之不同，細胞直徑約為3~6μm(圖1A)。經Nile Red染色後，以螢光顯微鏡觀察到藻體內部有大量明顯且呈黃色之油滴分佈，顯示其藻體內可以蓄積油滴(圖1B)。

將74C藻株之18S rDNA及ITS區域進行DNA定序，分別得到長度1,744bp之18S rDNA序列(SEQ ID NO：1)及長度674bp之ITS序列(SEQ ID NO：2)。將該18S rDNA及ITS序列與NCBI的nr資料庫比對後，發現其與以下5株藻株之序列具最高相似度：(1)Micractinium sp.(Accession No.JX889639.1)，相似度為99%；(2)Micractinium sp.CCAP 248/2(Accession No.FR865695.1)，相似度為95%；(3)Micractinium pusillum(Accession No.FM205866.1)，相似度為95%；(4)Micractinium sp.CCAP 248/7(Accession No.FM205835.1)，相似度為95%；及(5)Micractinium pusillum(Accession No.FM205872.1)，相似度為95%。

將74C藻株的ITS序列(SEQ ID NO：2)與NCBI的nr資料庫進行比對後，則發現其與以下4株藻株之序列具最高相似度：(1)Chlorella sp.(Accession No.JQ315187.1)，相似度為100%；(2)Micractinium sp.(Accession No.JX889639.1)，相似度為99%；(3)Micractinium sp.CCAP 211/92(Accession No.FM205863.1)，相似度為99%；及 (4)Micractinium sp.(Accession No.JQ710681.1)，相似度為98%。

此外，將74C藻株的18S rDNA及ITS區域的DNA序列(全長)經NCBI/Blastn比對分析後，將所得相近的藻株與數個較接近的藻株及藻屬列進行演化樹分析，結果顯示74C被劃分歸屬於Micractinium sp.群組中(圖2)。而在ITS序列的演化樹比對分析中，顯示74C藻株亦被歸屬於Micractinium sp.群組中(圖3)。以上序列比對分析結果顯示，74C藻株可能屬於微芒藻屬(Micractinium)。

綜合其形態與分子鑑定之結果，初步鑑定74C藻株應屬於Micractinium sp.，且極可能為一新種，故命名為Micractinium sp.74C。

實例二、74C藻株之培養條件

(1)培養溫度(耐熱溫度)測試

圖4之結果顯示在30℃至40℃之培養溫度下，74C藻株於C培養基平板上可持續且明顯的生長。據此，74C藻株可生長於約20℃至約40℃之溫度範圍中，且可耐熱生長於約30℃至約40℃之溫度範圍中。

(2)培養基pH值測試

圖5之結果顯示74C藻株在pH4至pH9.5之液態C培養基中可持續且明顯的生長。據此，74C藻株可生長在約pH4至約pH9.5之環境中。

(3)培養基鹽度測試

圖6之結果顯示74C藻株在鹽度0%(w/v)至4.0%(w/v)之液態C培養基中，有持續且明顯的生長現象。因此，74C藻株可在0%(w/v)到至少約4.0%(w/v)之鹽度環境下生長。

實例三、74C藻株之貼附培養

將74C藻株分別與以下8種不同材質之載體共同培養：(1)纖維濾紙、(2)棉布a、(3)濾布、(4)木漿布、(5)棉布b、(6)不織布、(7)牛仔布及(8)碎花布，以測試其貼附性。圖7之結果顯示，74C藻株可貼附 生長於(1)纖維濾紙、(5)棉布b、(6)不織布、(7)牛仔布及(8)碎花布等載體上，其中以(1)纖維濾紙及(8)碎花布的貼附效果最佳。此外，將貼附於各載體上之74C藻體以Nile red染色後，以螢光顯微鏡觀察，發現藻體內有大量的油滴分佈(圖7)，故74C藻株極具產油潛力。

實例四、74C藻株之油脂含量及組成分析

分別將74C藻株以懸浮及貼附之方式培養，收集其藻體，將其冷凍乾燥成藻粉，秤取定量之藻粉並萃取其中之油脂，分析藻乾含油量、油脂成分及脂肪酸組成。結果顯示，懸浮培養下74C藻乾含油量為47.7%(w/w)，貼附培養下74C藻乾含油量為52.08%(w/w)。相較於一般藻株在貼附培養時其藻乾含油量會較懸浮培養時下降至10%以下的情況(Gross,M.& Wen,Z.,Yearlong evaluation of performance and durability of a pilot-scale Revolving Algal Biofilm(RAB)cultivation system,Bioresour.Technol.,2014,171：50-58)，貼附培養之74C藻乾含油量反而高於懸浮培養之藻乾含油量，此特性顯示74C藻株更適合以貼附方式培養。

表一之油脂組成結果顯示，74C藻株於懸浮培養及貼附培養下的油脂成分組成並無顯著差異，主要以三酸甘油酯(TAG)為主，含量達99.81~99.89%(w/w)，其餘則包含少量的1,3-雙醯基甘油酯(1,3-DAG，佔總油脂含量的0.08~0.17%(w/w))及1,2-雙醯基甘油酯(1,2-DAG，佔總油脂含量的0.01~0.02%(w/w))，此組成成分適合作為生質燃料的料源。

表二之脂肪酸組成結果顯示，懸浮培養及貼附培養下之74C藻體脂肪酸組成主要為C16及C18脂肪酸，其中各脂肪酸組成比例相似，C16、C18：1及C18：2脂肪酸含量較高。此外，經計算後，74C藻體所含油脂的不飽和度(DU)為109~116，符合歐盟所定之生質柴油標準值(DU值須小於137)(Ramos,M.J.,et al.,Influence of fatty acid composition of raw materials on biodiesel properties.Bioresour.Technol.,2009,100：261-268)。據此，74C藻株不論以懸浮或貼附方式 培養皆適合作為提煉生質燃料的料源。此外，根據74C藻株所產油脂中脂肪酸之組成及三酸甘油酯之含量，其亦適合作為食用油之料源。

實例五、74C藻株貼附培養之生物質產率及產油效率

將74C藻株以纖維濾紙貼附培養，於30℃下24小時照光培養，收集藻體，計算其載體表面之藻體生物質產率及產油效率，其結果顯示以實驗室規模貼附培養下之74C藻體生物質產率最高可達6.7g/m²/日，而產油效率可達1.44g/m²/日。其產油效率高於利用循環微藻生物膜生長系統(RAB)所培養之小球藻株(產油效率為0.27g/m²/日)。

實例六、74C藻株懸浮培養之生物質產率、油脂產率及固碳效率

利用二氧化碳固碳效率評估平台進行74C藻株的固碳能力測試，以通氣量為0.1vvm持續通入5%(v/v)二氧化碳至藻液中，再利用二氧化碳自動監測系統持續監測進流及出流之二氧化碳濃度(濃度單位為%，1%=10,000ppm)，計算每日固定二氧化碳毫克數。以30℃懸浮培養後，收集藻體分析，結果顯示74C藻體生物質產率、油脂產率及固碳效率分別為100.4mg/L/日、45.7mg/L/日及508mg/L/日。

實例七、74C藻株生物炭特性分析

將74C藻株大量培養後，收集藻體，冷凍乾燥成藻粉，秤取定量之藻粉並量測其熱值、灰分及硫分。表三之結果顯示藻粉熱值達25.41MJ/Kg，灰分及硫分含量則分別為2.07%(w/w)及0.362%(w/w)。此外，相較於目前發電廠所使用之燃煤煙煤及亞煙煤，74C藻株的灰分及硫分僅為發電廠燃煤採購標準的13.8%(w/w)及32.9%(w/w)。而相較於雜草、豆桿或稻草等生質燃料(王岱淇及馮丁樹，農產品廢棄物焚化物性之研究，農業機械學刊，1993，2：1-11)，74C藻株不僅熱值含量高，亦具有較低之灰分含量。以上結果可證明，74C藻株亦可作為一優質生質燃料(如生質煤炭)的料源，且可大幅減少污染物生成以減少環境污染。

結論

本發明首先發現經初步鑑定為Micractinium sp.之微芒藻屬分離株74C。該藻株可生長在溫度約20℃至約40℃、約pH4至約pH9及鹽度0%(w/v)到至少約4%(w/v)之環境中，且具備良好的貼附特性，可貼附生長於不同材質之載體上。此外，74C藻株在懸浮培養下之藻乾含油量為47.7%(w/w)，在貼附培養下所形成之生物膜中的藻乾含油量為52.08%(w/w)，其反而高於懸浮培養之藻乾含油量。在貼附培養下，74C藻體之生物質產率及產油效率分別為6.7g/m²/日及1.44g/m²/日；而在懸浮培養下，74C藻體之生物質產率、油脂產率及固碳效率分別為100.4mg/L/日、45.7mg/L/日及508mg/L/日。此外，不論是以懸浮培養或貼附培養之方式培養，74C藻體三酸甘油酯含量佔油脂總含量的99%(w/w)以上，其中脂肪酸組成以C16及C18脂肪酸為主，脂肪酸不飽和度為109~116。進一步分析發現，74C藻體具備生物炭特性，其熱值為25.41MJ/Kg，灰分及硫分含量分別為2.07%(w/v)及0.362%(w/v)。上述結果顯示，74C藻株(Micractinium sp.)具有形成生物膜之特性，可以貼附培養之模式來培養；具有高優質之藻油組成，可作為生產生質柴油及食用油之料源；具有固碳之能力，可減少環境中之二氧化碳達到環境減廢之作用；並因為具有低灰分及低硫分之特 性，可作為生質燃料的料源，並可大幅減少污染物生成以降低環境污染。

【生物材料寄存】

國內寄存資訊

財團法人食品工業發展研究所，2017年1月24日，BCRC 980044。

國外寄存資訊

中國，中國典型培養物保藏中心，2016年12月12日，CCTCC M 2016743。

<110> 財團法人食品工業發展研究所

<120> 微芒藻屬(MICRACTINIUM SP.)及其用途

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<220>

<221> ITS

<222> (1)..(728)

<400> 2

Claims (19)

1. 一種微芒藻屬( Micractinium sp.)分離株，其包含SEQ ID NO：1所示核苷酸序列之18S rDNA序列及SEQ ID NO：2所示核苷酸序列之ITS區域序列。
2. 如請求項1之微芒藻屬分離株，其中該微芒藻屬分離株為寄存於財團法人食品工業發展研究所且寄存編號為BCRC 980044之藻株，或為與寄存於財團法人食品工業發展研究所且寄存編號為BCRC 980044之藻株具有實質上完全相同特徵之變異株。
3. 一種製備微芒藻屬( Micractinium sp.)培養產物之方法，其包含將如請求項1或2之微芒藻屬分離株接種於液態培養基中，在照光及通氣下進行培養以獲得該培養產物。
4. 如請求項3之方法，其中該微芒藻屬分離株係與一或多個載體共同培養於該液態培養基中。
5. 如請求項4之方法，其中該微芒藻屬分離株與該一或多個載體係分別加入該液態培養基中，或先將該微芒藻屬分離株接種於該一或多個載體上後，再將經接種之載體置入該液態培養基中。
6. 如請求項4或5之方法，其中該載體係網狀物質、泡棉或其任意組合。
7. 如請求項6之方法，其中該網狀物質係纖維濾紙、棉布、麻布、濾布、木漿布、不織布、牛仔布、尼龍布、超細纖維織布或帆布。
8. 如請求項6之方法，其中該泡棉係聚乙烯醇(PVA)泡棉。
9. 如請求項3至5中任一項之方法，其中該液態培養基之pH值為約pH3.5至約pH10。
10. 如請求項3至5中任一項之方法，其中該培養係在約25℃至約45 ℃之溫度下進行。
11. 如請求項3至5中任一項之方法，其中該液態培養基之鹽度為0%(w/w)至約4.5%(w/w)。
12. 如請求項3至5中任一項之方法，其進一步包含分離該培養產物的步驟。
13. 如請求項3之方法，其可用於固定二氧化碳。
14. 一種微芒藻屬( Micractinium sp.)培養產物，其可由請求項3至12中任一項之方法來獲得。
15. 如請求項14之微芒藻屬培養產物，其包含三酸甘油酯及脂肪酸。
16. 一種製備三酸甘油酯及/或脂肪酸之方法，其包含自如請求項14或15之微芒藻屬培養產物中分離出三酸甘油酯及/或脂肪酸。
17. 一種製備生質燃料之方法，其包含使用如請求項14或15之微芒藻屬培養產物作為原料。
18. 如請求項17之方法，其中該生質燃料為生質柴油。
19. 如請求項17之方法，其中該生質燃料為生質煤炭。