CN108660079A - 微芒藻属(micractinium sp.)及其用途 - Google Patents

Abstract

本申请涉及微芒藻属(Micractinium sp.)及其用途，其中所述微芒藻属(Micractinium sp.)包含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的18S rDNA序列与SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的ITS区域序列。本发明涉及一种可在不同材质上生长形成生物膜，且产生高量三酸甘油脂的经分离微芒藻属(Micractinium sp.)。本发明还涉及所述经分离微芒藻属(Micractinium sp.)于生产生质燃料及食用油上的用途。

Description

微芒藻属(MICRACTINIUM SP.)及其用途

技术领域

本发明涉及新颖微芒藻属(Micractinium sp.)分离株，所述分离株可在不同材质上生长形成生物膜(biofilm)，且可利用生物膜培养模式进行培养，以减少对水资源与土地的需求，并简化采收流程，降低采收成本。所述分离株可产生高量的三酸甘油酯(triacylglycerol)，在培养时可吸收二氧化碳，可作为固碳之用，并具有高热值、低灰分与低硫分等特性，可做为生产生质柴油与食用油的料源。

背景技术

自18世纪工业革命以来，人类对石化能源的需求与日俱增，然而石化能源的天然蕴藏量有限，因此逐渐需要寻求新的替代能源。第一代生质能源是以甘蔗、甜菜、玉米、大豆等粮食作物做为原料，利用水解、发酵与转酯化(transesterification)等技术来制造生质能源，但会造成农耕地需求上升、粮食作物价格上昂等问题；第二代生质能源是以稻杆、玉米杆、木屑与蔗渣等非粮食作物为原料，利用纤维素水解等技术来制造生质能源，但此类生质能源具有原料来源有限、处理成本过高等问题；第三代生质能原是起源于公元1970年能源危机爆发时，美国所推动的藻类生质柴油开发计划，以藻类为主要原料，利用油脂萃取、氢化(hydrogenation)与转酯化等技术来制造生质能源。

微藻(microalgae)是属于一种单细胞藻类，其细胞大小介于几微米(μm)到几百微米之间，一般无法以肉眼直接观察，需利用显微镜辅助观察。微藻的分布范围非常广泛，在淡水、海洋或潮湿的土壤中皆可发现其踪迹，据估计，地球上大约有20万到80万种微藻，其中已发现并有记录的仅有3万5千种，其生物多样性非常复杂，无论是以基础研究或是开发的角度而言，为一个几乎未积极开发的领域。

微藻具备生长速度快、二氧化碳利用率高、可高密度培养、受病菌污染机率较小与所需土地面积较小等优点，并可在短时间内蓄积大量的生物质(biomass)，可作为生产生质柴油(biodiesel)、生物乙醇与生物氢等生质燃料(biofuel)的原料。此外，微藻可使用非农耕地、海水、生活废水、农牧废水与烟道气等进行培养，大大减少了土地与淡水的需求，从而减少与粮食与经济作物的资源竞争。加上其细胞结构简单且缺乏细胞分化，相较于棕榈、油菜、大豆与甘蔗等产油作物，其操作性较植物细胞更为简易，且具有与植物相似的醣化后转译修饰机制以利细胞基因表现(颜H.W.等人，基于微藻的生物精炼- 从生质燃料到自然产物，生物资源技术，2013，135:166-174(Yen,H.W.et al., Microalgae-basedbiorefinery–From biofuels to natural products.,Bioresour.Technol.,2013, 135:166-174))。

目前，微藻生物质中所含的醣类(如藻多醣)、类胡萝卜素(carotenoid)、藻胆蛋白(phycobilin)、二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic Acid(EPA))与二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid(DHA))等，已被广泛应用于医疗保健、美容、食品加工、水产养殖与生物能源等产业中(斯波劳雷P.等人，微藻类的商业应用，生物科学与生物工程杂志，2006，101:87-96(Spolaore,P.et al.,Commercial applications of microalgae.,J.Biosci. Bioeng.,2006,101:87-96))。

微藻所产的藻油主要由三酸甘油脂、各式脂肪酸与固醇类所组成，并可通过氢化或转酯化将其转化为液态生物燃料。不同的藻种其藻油的组成成份比例也不相同。因此，有研究指出微藻藻油的脂肪酸图谱可作为筛选藻种的指标之一(拉莫斯M.J.等人，原料的脂肪酸组成对生质柴油特性的影响，生物资源技术，2009，100:261-268(Ramos,M.J.et al.,Influence of fatty acid composition of raw materials on biodieselproperties.,Bioresour. Technol.,2009,100:261-268))。然而，并非所有微藻所产的藻油皆适合用于制备生质燃料，其中所含脂肪酸的不饱和度(degree of unsaturation)与三酸甘油酯的比例，也会影响所述藻油是否适合用于制备生质燃料。有研究文献指出单针藻(Monoraphidium contortum) (SAG 47.8)具备300mg/L/日的生质能产量，其藻体含油量占藻体干重的22.2％(w/w)，藻油主要脂肪酸组成为C16:0到C18:1脂肪酸，可作为制造生质燃料的潜力藻株(博根 C.等人，Monoraphidium contortum作为用于脂质生质燃料生产的潜力藻种的鉴别，生物资源技术，2013，133:622-626)(Bogen,C.et al.,Identification ofMonoraphidium contortum as a promising species for liquid biofuelproduction.Bioresour.Technol.,2013,133: 622-626))。

微藻的生长需仰赖光合作用的进行，故光、二氧化碳、水、氮、磷与钾等是培养微藻所需的要素，其养殖方式包含自营、异营与混营培养等，自营培养是指微藻利用光源与无机碳(如二氧化碳)行光合作用得到生长所需的能量；异营培养是指微藻在无照光的条件下，利用培养基中的有机碳作为碳源(如醋酸钠、葡萄糖)来生长；混营培养则是指微藻可同时进行自营与异营生长。一般而言，微藻的藻体量大约每6到72小时会增加1 倍，微藻生长的速度越快，其可采收的频率越高。然而，通常含油量较高的藻种生长速度较含油量较低的藻种来的慢，故需同时考虑微藻的生长速度与含油量来筛选适宜用于制备生质燃料的藻种。此外，不同的培养方式与培养基成份对微藻生长速度、油脂的累积、产率与组成也会产生不同程度的影响(多普S.与达万V.，氮浓度对于Monoraphidium sp.脂质产率与脂肪酸组合物的影响，生物资源技术，2014，152:572-575(Dhup,S.& Dhawan,V.,Effect of nitrogenconcentration on lipid productivity and fatty acid composition ofMonoraphidium sp.,Bioresour.Technol.,2014,152:572-575))。

目前以微藻作为生质能源的原料，其生产成本与技术上仍有待克服与突破的地方。以自营培养模式为例，微藻自营培养主要是将微藻悬浮培养于培养液中，然而，目前目前现有的养殖技术仍无法将培养液中藻体浓度提升到10g/L(1％)以上。此外，由于培养液中藻体浓度低且藻体细胞微小，导致在藻体回收干燥时，需经由繁复的流程与设备才可将藻体与培养液分离，耗能费时且费用昂贵，使得藻体的回收成本可占微藻生质柴油全部生产成本的20～30％。

微藻生物膜养殖系统是利用微藻可贴附生长于载体表面的养殖模式，最早是应用于 1980年代处理工业废水中的氮与磷(普兹多卡-乔沙M.等人，利用藻类旋转盘与反硝化填料床反应器减少工业废水中的氮，水研究，1984，18:1077-1082)(Przytocka-JusiakM.et al., Removal of nitrogen from industrial waste waters with the use ofalgal rotating disks and denitrification packed bed reactor.,Water Res.,1984,18:1077-1082))。所述养殖模式因不需将微藻悬浮培养于培养液中，且藻体采收时可直接得到高浓度的藻泥，可简化传统上繁复的藻体采收流程，大幅地减少藻体回收的能耗与成本，为极具开发潜力的微藻养殖模式。例如，2010年约翰逊等人开发将绿球藻(Chlorellasp.)培养于废水中以保丽龙作为载体的微藻生物膜贴附养殖模式，发现贴附培养的绿球藻可移除废水中60％以上的氮与磷，且藻体可以直接以刮取的方式进行采收(约翰逊M.B.与闻Z.，用于生产生质燃料的贴附式微藻生长系统的发展，应用微生物与生物技术，2010，82:525-534)(Johnson,M.B. &Wen,Z.,Development of an attached microalgal growthsystem for biofuel production, Appl.Microbiol.Biotechnol.,2010,82:525-534))；2012年欧肯等人以低能耗与低水需求量的微藻生物膜光反应器培养丛粒藻(Botryococcusbraunii)，发现与开放池养殖系统相比，其生物膜光反应器养殖过程减少45％的水需求量，并大幅降低将藻液中水体移除所需能耗的99.7％(欧肯A.等人，通过使用藻类生物膜光反应器来减少藻类培养时水与能量的需求，2012，生物资源技术，114:542-548)(Ozkan,A.etal.,Reduction of water and energy requirement of algae cultivation using analgae biofilm photobioreactor.,2012,Bioresour. Technol.,114:542–548))；匈牙利MFKK工程公司自2012年开始推行ALGADISK计划，目的在开发一种可模块化、易于放大、低运转与低安装成本的自动化微藻生物膜反应器，并于2014年由合作开发的匈牙利Bay-Bio研究所在研讨会中发表，由微藻生物膜反应器所直接采收的藻泥平均浓度可达100 g/L(瑟拜斯汀P.等人，微藻在基于光生物反应器的新生物膜下的生物质与脂质生成，年轻生物技术学家国际学会，2014，塞格德 (Sebestyén,P.et al.,Biomass and lipid production bymicroalgae in a new biofilm based photobioreactor.,presented at YoungBiotechnologist National Conference,2014,Szeged))，此浓度为一般悬浮微藻养殖浓度的10倍以上；以及2013年美国爱荷华大学格罗斯等人利用循环微藻生物膜(RevolvingAlgal Biofilm(RAB))生长系统培养小球藻(Chlorella vulgaris)，发现相较于开放池养殖系统，RAB系统所采收的藻泥含水量约90.3％，接近传统离心后所采收的藻泥含水量(约88.6％)。因此，微藻生物膜养殖模式可以直接刮取的方式重复采收高浓度的藻泥，免除传统沉降、絮凝与离心等采收流程，具备节省时间、空间以及减少水资源、采收成本与能源消耗等优势。然而，上述RAB系统所采收的藻体油脂含量较开放池养殖系统减少约40％(w/w)，且在ALGADISK计划中所采收的藻体油脂含量也较悬浮培养的藻体油脂含量少，两种培养模式的油脂含量皆约为10％(w/w) (格罗斯M.与闻Z.，整年评估试验规模的旋转式藻类生物膜(RAB)培养系统，生物资源技术，2014，171:50-58(Gross,M.&Wen,Z.,Yearlongevaluation of performance and durability of a pilot-scale Revolving AlgalBiofilm(RAB)cultivation system,Bioresour. Technol.,2014,171:50–58)；与瑟拜斯汀P.等人，微藻在基于光生物反应器的新生物膜下的生物质与脂质生成，年轻生物技术学家国际学会，2014，塞格德(Sebestyén,P.et al., Biomass and lipid production bymicroalgae in a new biofilm based photobioreactor, presented at YoungBiotechnologist National Conference,2014,Szeged))。显示以微藻作为生质燃料的料源时，并非所有藻株皆适合以生物膜培养模式进行培养。

以微藻作为生质燃料料源的另一优势在于微藻的热值(calorific value)含量高(大于 25 MJ/Kg)，与发电厂(包含火力发电厂与汽电共生厂)所使用的燃煤相比，微藻的热值约为烟煤(热值23.94 MJ/Kg)的1.044倍以上，约为亚烟煤(热值20.58 MJ/Kg)的1.215倍以上。换句话说，若以25 MJ/Kg的热值含量计算，每1公吨藻体所产生的热值相当于1.044吨烟煤所产生的热值，或1.215吨的亚烟煤所产生的热值。若将微藻以生物膜培养模式进行培养，其采收的藻泥可利用废热进行后续的干燥与焙烧，生产出生质煤炭(biocoal)，可取代部份目前使用的燃煤，进而减少燃煤的使用量。

目前以微藻作为生质燃料的料源的相关研究，主要包含藻种开发/筛选、微藻养殖技术、藻体回收与生物质萃取等。在藻种开发与筛选方面，目前仍需要具有生长快速、生物质产率高、藻油含量高与藻体易于回收等特点的藻种作为制备微藻生质燃料的基础。希冀通过开发具潜力的藻种，以制备生质燃料或高价的活性物质，同时减缓二氧化碳的排放，达到环境保护与产业获利双赢的目标(法雷利D.J.等人，碳吸收与生物固碳的角色:综述，可再生与可持续能源综述，2013，21:712-727(Farrelly,D.J.et al.,Carbon sequestrationand the role of biological carbon mitigation:A review.,Renew.Sust.Energ.Rev.,2013,21:712-727))。

发明内容

本发明是于台湾嘉义阿里山山区采集到含微藻的土壤样品后，以C培养基进行微藻的培养与分离，选取出可以生物膜培养模式进行培养、具高油脂含量与高热值以与耐高温的74C藻株，经鉴定所述藻株属于微芒藻属(Micractinium)的微藻。经藻油含量、组成与藻体热值、灰分、硫分含量等分析，发现74C藻株具有作为生质燃料与食用油的原料的潜力。此外，74C藻株可贴附生长于不同材质的载体表面上，形成生物膜；可藉由生物膜培养模式生产藻油，在藻体采收时仅需将载体表面的藻体刮取下来，即可得到高浓度的藻泥，可简化微藻养殖过程中的采收流程，并降低生产成本。

因此，本发明的一目的是提供一种经分离的微芒藻属分离株，其中所述微芒藻属分离株包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的18S rDNA序列与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的ITS区域序列。

本发明的另一目的是提供一种培养所述经分离的微芒藻属分离株以获得微芒藻属培养产物的方法。

本发明的另一目的是提供一种由上述方法所获得的微芒藻属培养产物，其中所述微芒藻属培养产物可作为生产生质燃料与食用油的料源。

本发明的另一目的是提供一种由上述微芒藻属培养产物中获得三酸甘油酯的方法。

本发明的另一目的是提供一种培养所述经分离的微芒藻属分离株以固定二氧化碳的方法。

本发明在以下部分中详细描述。本发明的其他特征、目的与优点可易见于本发明的实施方式与权利要求书中。

附图说明

图1为74C藻株的显微镜检图。图1A为明视野观察，细胞直径约为3～6μm，显微倍率1,000X；图1B为以Nile Red染色，以荧光显微镜观察，藻体内部有黄色的油滴分布，显微倍率1,000X。

图2为74C藻株18S rDNA与ITS区域序列的演化树分析图。

图3为74C藻株的ITS区域序列的演化树分析图。

图4为74C藻株于不同培养温度下(30℃、35℃、37℃与40℃)的生长情形。

图5为74C藻株于不同培养pH值下(pH4、pH5.5、pH6.5、pH7.5pH8.5与pH9.5) 的生长情形。

图6为74C藻株在不同培养盐度下(0％(w/v)、1.0％(w/v)、1.5％(w/v)、2.0％(w/v)、 2.5％(w/v)、3.0％(w/v)与4.0％(w/v))的生长情形。

图7为74C藻株生长于不同材质的贴附载体的贴附与产油情形。组别A为各种不同材质的贴附载体；组别B为74C藻株贴附于各载体的生长情形；组别C为贴附于各载体的74C藻体的显微镜明视野观察图，显微倍率为400X；组别D为贴附于各载体的74C 藻体经Nilered染色后的荧光显微镜观察图，显微倍率为400X。

具体实施方式

本发明可通过下述实施方式中所公开的各个发明方面、实施例与表列的相关叙述所了解。除非在本文中另作定义，否则与本发明关联使用的术语(包含技术与科学术语)应具有本发明所属技术领域的技术人员所了解的含义。且当可了解，除非本文中提供的定义另作说明，在任何潜在歧义的情况下，术语的定义应与所述普遍使用的术语(如词典中所定义)一致。可进一步了解，本案所使用的术语仅用作描述特定实施方面的目的，而非用于限定。

必须注意的是，除非有清楚的相反指示，于说明书或权利要求书使用的单数格式“一”、“一种”与“所述”还包含复数表示。因此，除非上下文另有需要，单数术语应包含复数，而复数术语还包含单数。

本发明的范围以“自一“约”特定数值及/或到另一“约”特定数值”表示。当范围由上述方式表示时，其包含自一特定数值及/或到另一特定数值的范围。同样地，当数值可通过术语“约”以表示近似值，将可了解其为一特定值的另一个方面。可进一步了解，当提及有关其它端点与其它端点本身而言，每一范围的两端点都为有意义的。根据本发明，“约”可表示±20％，优选地为±10％，更优选地为±5％。

于本发明中，术语“经分离”或“分离”意谓使物质自其原始环境(如果天然存在那么为天然环境)中移出。术语“经分离”或“分离”并不一定指物质是经纯化者。

本发明的一目的是提供一种微芒藻属分离株，其中所述微芒藻属分离株包含SEQID NO:1所示的核苷酸序列的18S rDNA序列与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的ITS区域序列。于本发明优选实施方面中，所述微芒藻属分离株为保藏于中国典型培养物保藏中心且保藏编号为CCTCC M 2016743的藻株，或为与保藏于中国典型培养物保藏中心且保藏编号为CCTCC M 2016743的藻株具有实质上完全相同特征的变异株。

上述术语“变异株”意谓涵盖全体细胞遗传组成已通过如化学突变诱发、自发突变、遗传工程、转化或转染而改变，以致影响其物理或生物化学特性的任何微芒藻属藻株。然而，所述变异株应具有保藏于中国典型培养物保藏中心且保藏编号为CCTCC M 2016743的微芒藻属分离株的所有分类学识别特征。

于本发明中，术语“相似度”意谓两个核酸序列间的相似程度。所述两个核酸序列的差异可出现于参考核苷酸序列的5'或3'末端位置处，或个别散布于参考序列中的核苷酸当中，或散布于参考序列内的一或多个邻近基团中的彼等末端位置之间的任何地方。任何特定核酸分子是否与参考核苷酸序列具至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相似度是指使用此项技术中所熟知的标准算法在两个分子之间所进行的比较，且可常规使用公开可用的计算机程序(诸如BLASTN算法)来判定。

本发明的一目的是在于提供一种制备微芒藻属培养产物的方法。于本发明的实施方面中，所述方法包含将本发明的微芒藻属分离株接种于液态培养基中，在照光与通气下进行培养以获得所述培养产物。于本发明的一优选实施方面中，所述方法包含将本发明的微芒藻属分离株与一或多种载体共同培养于液态培养基中，在照光与通气下进行培养以获得所述培养产物，其中所述微芒藻属分离株与所述一或多种载体是分别加入所述液态培养基中，或先将所述微芒藻属分离株接种于所述一或多种载体上后，再将经接种的载体置入所述液态培养基中。

于本发明中，术语“培养产物”意谓将微藻置于培养基中培养后，所获得富含微藻细胞的产物。于本发明中，所述培养产物中的微藻细胞可不必与培养基分离，且所述培养产物可呈液态、固态或黏稠状。

于本发明中，用于培养微芒藻属分离株的“培养基”可为任何容许微芒藻属分离株生长、繁殖并制造三酸甘油酯及/或脂肪酸的水性培养基，例如C培养基[每100mL中包含15mg Ca(NO₃)₂·4H₂O、10mg-20mg KNO₃、5mgβ-甘油磷酸二钠·5H₂O、4mg MgSO₄·7H₂O、0.01μg维生素B12、0.01μg生物素(Biotin)、1μg噻胺HCl、0.3mL PIV 微量元素溶液(每100mL中包含100mg Na₂EDTA·2H₂O、19.6mg FeCl₃·6H₂O、3.6mg MnCl₂·4H₂O、1.04mg ZnCl₂、0.4μgCoCl₂·6H₂O、0.25μg Na₂MoO₄·2H₂O与水)、50mg 三羟甲基氨基甲烷(Tris)与水]、BG-11培养基[每100mL包含1,500mg NaNO₃、40mg K₂HPO₄、75mg MgSO₄·7H₂O、27.18mg CaCl₂、6mg柠檬酸、6mg柠檬酸铁铵、1mg Na₂·Mg·EDTA·2H₂O、20mg Na₂CO₃、2.86mg HBO₃、1.181mgMnCl₂·4H₂O、0.222mg ZnSO₄·7H₂O、0.39mg Na₂MoO₄·2H₂O、0.0718mg CuSO₄·5H₂O、0.049mg Co(NO₃)₂·6H₂O 与水]，以及MA培养基[每100mL中包含10mg Ca(NO₃)₂·4H₂O、10mgKNO₃、5mg NaNO₃、4mg Na₂SO₄、5mg MgCl₂·6H₂O、10mgβ-甘油磷酸二钠·5H₂O、0.5mgNa₂EDTA·2H₂O、0.05mg FeCl₃·6H₂O、0.5mg MnCl₂·4H₂O、0.05mg ZnCl₂、0.5mg CoCl₂·6H₂O、0.08mg Na₂MoO₄·2H₂O、2mg H₃BO₃与50mg N-二甘氨酸(Bicine)]。

本发明中用于培养微芒藻属分离株的条件意指如培养基的pH值、盐度、培养温度、照光、通气条件与培养时间等条件，其可容许所述微芒藻属分离株生长、繁殖并制造三酸甘油酯及/或脂肪酸。所属技术领域的技术人员可根据既有知识针对培养基的成分与培养条件作调整。

于本发明的实施方面中，用于培养微芒藻属的培养基的pH值可为约pH2.5到约pH11.0(例如约pH2.5、约pH3.0、约pH3.5、约pH4.0、约pH4.5、约pH5.0、约pH5.5、约pH6.0、约pH6.5、约pH7.0、约pH7.5、约pH8.0、约pH8.5、约pH9.0、约pH9.5、约pH10.0、约pH10.5或约pH11.0)，优选为约pH4.0到约pH9.5。

于本发明的实施方面中，微芒藻属培养温度可为约15℃到约60℃(例如约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约40℃、约45℃、约50℃、约55℃或约60℃)，优选为约20℃到约40℃；且照光量可为约100lux到约4,000lux，优选为约2,000lux 的亮度持续照光。

于本发明的实施方面中，可视需要调整培养微芒藻属的培养基的盐度。本文中所谓盐度”意旨溶解于培养基中的盐类含量。本发明中培养基的盐度可为0％(w/w)到约6.0％(w/w)(例如0％(w/w)、约0.5％(w/w)、约1.0％(w/w)、约1.5％(w/w)、约2.0％(w/w)、约2.5％(w/w)、约3.0％(w/w)、约3.5％(w/w)、约4.0％(w/w)、约4.5％(w/w)、约5.0％ (w/w)、约5.5％(w/w)或约6.0％(w/w))，优选为0％(w/w)到约4.0％(w/w)。

于本发明中，术语“通气”意旨于液体培养基中持续地通入含有二氧化碳的空气，而通气量可为约0.05vvm到约1vvm，优选为约0.1vvm到约0.5vvm，最优选为约0.1vvm。所述空气中的二氧化碳的浓度可为约0.04％(v/v)到约20％(v/v)，优选为约0.1％(v/v)到约15％(v/v)，更优选为约5％(v/v)到约10％(v/v)。

于本发明中，术语“载体”意指可供微芒藻属贴附及/或固定于其表面上并生长的任何基质，其包括(但不限于)网状物质(例如，纤维滤纸、棉布、麻布、滤布、木浆布、不织布、牛仔布与碎花布)、泡棉(例如，聚乙烯醇(PVA)泡棉)或其任意的组合；所述载体可呈任何形状，包括(但不限于)片状、球形、环状、螺旋体、正方体、长方体与多边体。

于本发明中，术语“生物膜”意指由本发明的微芒藻属细胞所聚集而形成的膜状群落。

本发明制备微芒藻属培养产物的方法中，可视需要包含分离所述培养产物的步骤，而所述分离步骤可为如离心、过滤、聚集凝结及/或将生物膜从载体上刮下收集等常规的方法步骤。

本发明还提供由上述方法所获得的培养产物。本发明的培养产物中富含三酸甘油酯及/或脂肪酸，特别是三酸甘油酯，可用作获得三酸甘油酯的料源。有研究指出，微藻在贴附生长下所产生的油脂量仅占藻体干重10％(w/w)以下，远低于悬浮生长所产生的油脂量(格罗斯M.与闻Z.，整年评估试验规模的旋转式藻类生物膜(RAB)培养系统，生物资源技术，2014，171:50-58(Gross,M.&Wen,Z.,Yearlong evaluation of performance anddurability of a pilot-scale Revolving Algal Biofilm(RAB)cultivation system,Bioresour. Technol.,2014,171:50–58)；与瑟拜斯汀P.等人，微藻在基于光生物反应器的新生物膜下的生物质与脂质生成，年轻生物技术学家国际学会，2014，塞格德(Sebestyén,P.et al., Biomass and lipid production by microalgae in a new biofilm basedphotobioreactor,Young Biotechnologist National Conference,2014,Szeged))。然而，本发明的微芒藻属分离株于贴附培养下的藻干含油量为52.08％(w/w)，远高于一般藻株于贴附培养下的藻干含油量。

本文中的“三酸甘油酯”意旨具有1个甘油分子与3个脂肪酸分子的酯类化合物，其中所述3个脂肪酸分子可具有完全相同、部份相同或完全相异的碳数与不饱和键。

本文中的“脂肪酸”意旨具有8到30个碳原子与0到6个不饱和键的羧酸化合物，其优选地为具有12到20个碳原子与0到5个不饱和键的羧酸化合物，更优选地为具有 16到18个碳原子与0到3个不饱和键的羧酸化合物。

三酸甘油酯与脂肪酸的获得可使用本技术领域所熟知的任何萃取与分离方法，例如福尔奇等人(福尔奇J.等人，从动物组织分离与纯化总脂质的简单方法，生物化学杂志，1957，23:497-509(Folch,J.et al.,A simple method for the isolation andpurification of total lipids from animal tissue.,J.Bio.Chem.,1957,23:497-509))、巴拉苏布拉马连等人(巴拉苏布拉马连S.等人，利用连续微波系统自Scenedesmusobliquus萃取油脂-设计、最适化与质量量测，生物资源技术，2011，102:3396-3403(Balasubramanian S.et al.,Oil extraction from Scenedesmus obliquus using acontinuous microwave system–design,optimization, and qualitycharacterization.,Bioresour.Technol.,2011,102:3396-3403))与萨迦拉塔等人 (萨迦拉塔M.G.等人，利用反应曲面法进行Spirulina platensis ARM 740γ-次亚麻油酸的超临界CO₂萃取，食品工程杂志，2008，84:321–326(Sajilata M.G.et al.,Supercritical CO₂extraction ofγ-linolenic acid(GLA)from Spirulina platensis ARM 740usingresponse surface methodology.,J.Food Eng.,2008,84:321–326))所公开的方法。简而言之，所述方法可包含将微芒藻属细胞以如研磨法或超音波法等方式击碎，通过适当的溶剂萃取微芒藻属细胞中的三酸甘油酯及/或脂肪酸，再通过如HPLC及/或离子交换树脂的技术获得三酸甘油酯及/或脂肪酸。

本发明的微芒藻属培养产物可经化学转化(如氢化、转酯化、水热碳化(hydrothermal carbonisation)、发酵或裂解等)或萃取而成固态、液态或气态的生质燃料，其包括(但不限于)生质柴油、生物甲醇、生物乙醇、生物丁醇、生物甲烷、生物氢或生质煤炭。

上述生质燃料的获得可使用本技术领域所熟知的任何方法，诸如陈D.T.等人(陈D. T.等人，溶剂与含油量对于Chlorella vulgaris ESP-31湿式含油微藻生物质的直接转酯化以使用固定化脂肪酶作为生物催化剂来合成生质柴油的影响，生物资源技术，2013，135:213-221(Tran D.T.et al.,Effect of solvents and oil content on directtransesterification of wet oil-bearing microalgal biomass of Chlorellavulgaris ESP-31for biodiesel synthesis using immobilized lipase as thebiocatalyst.,Bioresour.Technol.,2013,135:213-221))、郑H. H.等人(郑H.H.等人，从Clostridium acetobutylicum基于微藻生质柴油残余物生产生物丁醇，生物资源技术，2015，184:379-385(Cheng H.H.,et al.,Biological butanol production frommicroalgae-based biodiesel residues by Clostridium acetobutylicum.,Bioresour.Technol.,2015,184:379-385))、萨姆蒲斯提C.等人(萨姆蒲斯提C.等人，根据生物精炼方面藻类可作为用于发酵生物制氢的潜力料源:全面综述，可再生与可持续能源综述，2015，44:20-36(Sambusiti C.,et al.,Algae as promising feedstocks for fermentativebiohydrogen production according to a biorefinery approach:A comprehensivereview.,Renew.Sust. Energ.Rev.,2015,44:20-36))与海尔曼S.M.等人(海尔曼S.M.等人，微藻的水热碳化，生物质与生物能源，2010，34(6):875–88(Heilmann S.M.et al.,Hydrothermal carbonization of microalgae.,Biomass.Bioenerg.,2010,34(6):875–882)与海尔曼S.M.等人，微藻的水热碳化II，脂肪酸、char与藻类营养产品，应用能源，2011，88(10):3286–3290(Heilmann S.M. et al.,Hydrothermal carbonization ofmicroalgae II.Fatty acid,char,and algal nutrient products.,Appl.Energ.,2011,88(10):3286–3290))所公开的方法。

本文所述的所有公开案、专利与专利文献均以全文引用的方式并入本文中。

提供以下实例以辅助所属领域的技术人员实施本发明。即使如此，不应将所述实例视为本发明的限制，因为本发明所属技术领域的技术人员在不背离本发明的精神或范围的情况下对本文所讨论的实施例进行的修改与变化，而仍属于本发明的范围。

实施例

材料与方法

1.C培养基

依序加入Ca(NO₃)₂·4H₂O 15mg、KNO₃ 10mg、β-甘油磷酸二钠·5H₂O 5mg、 MgSO₄·7H₂O 4mg、维生素B12 0.01μg、生物素(Biotin)0.01μg、噻胺(Thismine)HCl 1μg、 PIV微量元素溶液0.3mL与Tris 50mg，随后将其体积补水到100mL，调整pH到7.5 后进行高压灭菌。如果为1.5％(w/v)洋菜固体培养基那么需加入15g的洋菜胶一同灭菌。

PIV微量元素溶液的配制为依序加入Na₂EDTA·2H₂O 100mg、FeCl₃·6H₂O 19.6mg、MnCl₂·4H₂O 3.6mg、ZnCl₂ 1.04mg、CoCl₂·6H₂O 0.4μg与Na₂MoO₄·2H₂O 0.25μg，随后将其体积补水到100mL后进行高压灭菌。

2藻样采集、分离与培养

取台湾嘉义阿里山山区的土壤样品约10g置于50mL离心管中，加入约30mL C 培养基，于25℃下照光培养。培养期间以显微镜观察是否有藻体生长，之后取出适量含藻体的培养液，将其转到平板培养基，于25℃下照光培养。待藻体生长后取单一藻种将其于平板培养基中涂开，以上步骤需重复到筛到单一藻体为止。平板培养则取单一藻落涂到C培养基平板上，于25℃下照光培养。大量培养则自平板培养基上刮取新鲜培养的单一藻体，添加到液态C培养基中(约800mL)，使其培养液吸光值(OD_682nm)约达 0.1～0.15，并于25℃照光通气培养，培养期约30天。

3.油脂染色分析

将培养好的藻体取20μL与1μL尼罗红(于二甲基亚砜中0.1mg/mL)混合以进行油滴染色，染色后于室温静置10分钟，再利用荧光显微镜进行观察。(陈W.等人，用于定量测量微藻类中的中性脂质的高产量尼罗红方法，微生物学方法杂志，2009，77:41–47 (Chen,W.etal.,A high throughput Nile Red method for quantitative measurement of neutrallipids in microalgae.,J.Microbio.Methods,2009,77:41–47)与黄G.H.等人，基于尼罗红荧光在藻类中产生脂质的快速筛选方法，生物质与生物能源，2009，33:1386-1392(Huang, G.H.,et al.,Rapid screening method for lipid production in alga basedon Nile Red fluorescence.,Biomass.Bioenerg.,2009,33:1386-1392))。

4.藻种的分子鉴定

自平板培养基上刮取适量的新鲜培养的藻体，将其收集在2mL微量离心管中，依照ZYMO RESEARCH的ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep^TM说明书操作取得基因体(genomic)DNA，并以NanoDrop(ND-1000分光亮度计)检测DNA的浓度。

将藻体基因体DNA作为PCR模板，以18S rRNA与ITS区域(包含內轉錄間隔區(internal transcribed spacer)1、5.8S核糖體RNA、內轉錄間隔區2與28S核糖體RNA 的前端等序列)的相关引物组(http://biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm)来增幅其基因片段。PCR反应溶液如下：适量的基因体DNA溶液作为PCR模板、10mM dNTP 3 μL、10X PCR缓冲液4μL、10mM 5′端引物与3′端引物各0.5μL与Taq酵素5U。PCR 反应条件为96℃，5分钟；(96℃，30秒、50℃，20秒、72℃，3分钟)共40次循环； 72℃，10分钟；最后保持在4℃。取5μL产物进行电泳跑胶分析。

将PCR产物纯化后以适当引物(http://biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm)进行测序，将测序结果以Vector NTI Suite 9软件(VNTI)与NCBI/Blastn(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行序列重组与序列相似性比对分析。另，分别将测序所得的结果经NCBI/Blastn后所得相近的藻株与数个藻种中心较接近的藻株及藻属列为比较范围，进行演化树分析，以MEGA6.0做比对，接着利用最大概似法(MaximumLikelyhood)以GTR+G+I的方式绘制演化树，Bootstrap则为100次。

5.藻种培养特性分析

5.1培养温度(耐热温度)

将74C藻种于25℃环境下进行分离纯化，之后于20℃下进行长期的继代保存。为测试74C藻株在不同培养温度下的生长耐受性，将适量藻体接种于多个C培养基平板上，并分别于30℃、35℃、37℃与40℃等不同温度下进行照光培养，之后分别于培养第14 天与第21天观察藻体在不同温度下的生长情形。

5.2培养pH值

制备pH4～pH9.5的液态C培养基，分别取适量藻体接种于含有不同pH值的液态C培养基中，在25℃下进行照光培养，分别于培养第1天与第14天观察藻体在不同pH 值下的生长情形。

5.3培养盐度(盐度耐受性)

制备含有0％(w/v)～4％(w/v)NaCl的液态C培养基，取适量藻体分别接种于各盐度的液态培养基中，在25℃下进行照光培养，分别于培养第1天与第14天观察藻体在不同盐度下的生长情形。

5.4藻体贴附培养

观察74C藻株于8种不同材质的载体上的生长贴附情形。所测试的载体包含：(1)纤维滤纸；(2)棉布a；(3)滤布；(4)木浆布；(5)棉布b；(6)不织布；(7)牛仔布；与(8)碎花布。将不同载体分别与74C藻株置于含有50mL C培养基的250mL锥形瓶中，以75 rpm的转速共同振荡培养21天后，将载体取出观察藻体的贴附情形，并将贴附于载体上的藻体以Nile red染色，室温静置10分钟后，以荧光显微镜观察。

6.藻体分析

6.1藻体含油量分析

收集藻体后将其冷冻干燥成藻粉，秤取定量的藻粉，萃取其油脂。油脂萃取方法参考Folch等人所公开的方法(福尔奇J.等人，从动物组织分离与纯化总脂质的简单方法，生物化学杂志，1957，23:497-509(Folch,J.et al.,A simple method for the isolationand purification of total lipids from animal tissue.,J.Bio.Chem.,1957,23:497-509))并经修饰来进行，其过程为将30mg冷冻干燥的藻粉(A值)置入2mL微量离心管，加入约2.0mL 氯仿/甲醇(v:v＝2:1)与适量大颗玻璃珠，以撞击式细胞破碎仪(MM400)振荡约5 分钟，重复两次。以10,000rpm离心5分钟后，取出上清液并将其加入抛弃式15mL离心管中，随即于2mL微量离心管内加入约2.0mL氯仿/甲醇(v:v＝2:1)，再以超音波振荡与离心处理，取出上清液并将其加入另一抛弃式15mL离心管中，重复上述萃取离心步骤直到萃取液无色为止。于装有萃取液的15mL离心管中加入等体积的145mM NaCl 溶液后，以试管旋转混合器混和均匀后，经离心管在4,500rpm下离心10分钟。以玻璃吸管取下层液体到已秤重的玻璃瓶(B值)中。将此玻璃瓶内液体隔夜风干再秤重(C值)，计算藻干含油量的百分比(D值)。藻干含油量计算公式:

6.2脂肪酸图谱分析

刮取适量干燥藻体置于玻璃试管中，加入1mL溶液I(NaOH 45g、甲醇150mL与ddH₂O 150mL)，震散藻体。于100℃加热5分钟，再将所有藻体震散，继续加热25分钟。加入2mL溶液II(6N HCl 325mL与甲醇200mL)，于80℃加热10分钟，完成后迅速冷却。加入1.25mL溶液III(己烷200mL与三级丁基甲基醚200mL)，缓慢混合 10分钟，以玻璃吸管尖吸取下层液体并丢弃。将上层液体加入3mL溶液IV(NaOH 10.8 g与ddH₂O 900mL)，混合5分钟后，吸取上层液体以GC/MS(HP 5973GC/MS System)分析其脂肪酸含量。GC/MS分析方法参考2007年巴伦西亚I.等人的方法(巴伦西亚I.等人，用油从微藻类裂殖壶菌属产生富含二十二碳六烯酸的干燥发酵香肠：对营养特性、感觉质量与氧化稳定性的影响，食物化学，2007，104:1087-1096(Valencia,I.et al.,Development of dry fermented sausages rich indocosahexaenoic acid with oil from the microalgae Schizochytrium sp.:Influence on nutritional properties,sensorial quality and oxidationstability., Food Chem.,2007,104:1087-1096))。GC/Mass分析条件为：毛细管管柱:SP-2560，75m× 0.18mm I.D.，0.14μm；注入口温度:250℃；离子源温度:250℃；管柱烘箱温度:起始温度140℃，保持5分钟后以4℃/min的升温速率升温到240℃，保持2分钟；载送气体：氦；管柱流量:40cm/sec，在175℃下；待分析样品注射体积:1μL；分流比:1/100；脂肪酸标准品:37-Component FAME Mix(Cat.18919-1AMP,西格玛-奥德里奇 (Sigma-Aldrich))。

6.3油脂组成分析

将6.1所萃取的藻油样品以HPLC分析其油脂组成。HPLC分析条件：分离管柱为德国默克(Merck)公司制造的硅胶(Silica gel)(4.6mm id×250mm,颗粒大小5μm)；冲提溶剂A为己烷；冲提溶剂B为己烷/乙酸乙酯/异丙醇(80：10：10(v/v))，在0分钟溶剂 A/B为98：2(v/v)，在8分钟线性增加到溶剂A/B为50：50(v/v)，在8.5分钟线性增加到溶剂A/B为2：98(v/v)，15分钟维持相同梯度，20分钟线性减少到溶剂A/B为98： 2(v/v)；流速：1.2mL/min；蒸发光散射检测器(Evaporative Light Scattering Detector； ELSD)条件：气体流量2.6L/min；蒸发器温度为40℃(詹国靖等人，以甘油与植物油利用脂解酶的转酯化反应生产1,3-双酰甘油。台湾农业化学与食品科学，2010，45:19-25)。

7.藻体贴附培养的生物质产率与产油效率分析

将74C藻株以悬浮培养的方式大量培养后，将藻液浓度调整到其吸光值(OD_682nm)为0.5，再取30mL藻液，以抽气过滤的方式将藻体固定于干燥并完成称重的0.45μm 的硝酸纤维/乙基纤维膜表面，制备2份固定化的藻体。制作1份空白组(含未进行贴附生长的藻体)直接进行冷冻干燥，扣除滤纸干重(W_P)后，作为培养前的藻体干重(W_AI)。取经无菌处理过的吸水载体(如海绵、厚滤纸…等)，置于无菌平板底部，加入适量C液态培养基使其维持湿润，再将含固定化藻体的滤纸平放到吸水载体上方，将平板置于夹链袋中防止水份蒸发流失，于30℃下进行24小时照光培养。培养14天后，将含固定化藻体的滤纸自平板中取出，以冷冻干燥方式将藻体干燥后，称重，并扣除滤纸干重，作为培养后的藻体干重(W_AF)。完成藻体称重后，将藻体自载体表面刮下进行含油量分析，记录贴附藻体含油量(OC_A)。计算藻体生物质产率与油脂含量的计算公式为：

P_AB＝(W_AF-W_AI)/A/T

P_AO＝OC_A×P_AB

P_AB：贴附培养的藻体生物质产率(g/m²/日)

P_AO：贴附培养的藻体油脂产率(g/m²/日)

W_AF：藻体贴附培养后的干重(g)

WAI：藻体贴附培养前的干重(g)

A：藻体贴附培养的面积(m²)

T：藻体贴附培养的天数(日)

OC_A：贴附培养的藻体含油量(％)(w/w)

8.藻体悬浮培养的生物质产率、产油效率分析与固碳效率分析

将适量藻体放入含有1L的C培养基的1L血清瓶中，调整其培养液的吸光值(OD_682nm)达约0.5后，先取50mL液，以抽气过滤方式收集藻体，并将藻体冷冻、烘干与秤重(作为藻体生长的起始点W_AI)。之后置于二氧化碳固碳筛选平台，以体积为1L 的藻液进行监测。固碳筛选平台以通气量为0.1vvm持续通入5％(v/v)二氧化碳到潜力藻株的藻液中，再利用二氧化碳自动监测系统持续监测进流与出流的二氧化碳浓度(浓度单位为％，1％＝10,000ppm)，经由气体浓度转换公式的计算将二氧化碳浓度单位转换为mg/m³，计算每日固定二氧化碳毫克数(Ya-jun H.,Brief Discussion on Conversion Coefficient betweenthe Concentration Units ppm and mg/m³of Nitrogen Oxides(NO_X)., SichuanEnvironment,2010,29(1):24-46)。30℃照光培养后，取50mL藻液(四重复，共取 200mL液)，以抽气过滤方式收集藻体，并将藻体冷冻、烘干与秤重(作为藻体生长的终点W_AF)。另，完成藻体称重后，将藻体自载体表面刮下进行藻干含油量分析，记录其藻干含油量(OC_A)。

二氧化碳气体浓度转换的计算公式：

浓度(mg/m³)＝浓度(ppm)×(分子量/22.4)×[273/(273+t)]

分子量(二氧化碳)：44.01

t：测定温度(30℃)

固碳效率计算公式：

R＝(C_in–C_out)×V×Q×T

R：每日固定毫克数(mg)

V：微藻培养体积(m³)

Q：气体通气量(vvm，volume per volume per minute)

T：每日通气时间(分钟)

C_in：二氧化碳进流浓度(mg/m³)

C_out：二氧化碳出流浓度(mg/m³)

计算藻体生物质产率与产油效率的计算公式为：

P_AB＝(W_AF-W_AI)/A/T

P_AO＝OC_A×P_AB

P_AB：悬浮培养的藻体生物质产率(mg/L/日)

P_AO：悬浮培养的藻体油脂产率(mg/L/日)

W_AF：藻体悬浮培养后的干重(mg)

W_AI：藻体悬浮培养前的干重(mg)

A：藻液体积(L)

T：藻体悬浮培养的天数(日)

OC_A：悬浮培养的藻干含油量(％)(w/w)

9.藻体热值测定

将74C藻株大量培养后，将藻体收集冻干后保存。将1g的冻干藻体置于烘箱，以105℃烘干2小时后，将烘干的藻体置于干燥器中冷却到室温后，以天秤记录藻体烘干后重量(W_HD)。将烘干后的藻体置入燃烧弹热卡计内，再置于附有绝热式燃烧弹夹套的水浴槽中，点火燃烧后，样品所释放的燃烧热，将由外围水浴槽吸收，纪录水浴槽上升的温度，乘上水与燃烧弹热卡计水当量的总和，乘上水的比热，再除以W_HD，即可求得样品的热值。

10.藻体灰分测定

将74C藻株大量培养后，将藻体收集冻干后保存。将1g的冻干藻体置入坩锅，并置于烘箱以105℃烘干2小时后，将烘干的藻体置于干燥器中冷却到室温，以天秤记录干体烘干后重量(W_AD)。将去除水分的干藻体样品与坩锅置于800±50℃的高温炉中加热燃烧3小时，降低炉温到300℃，将坩锅与样品移入干燥器中冷却到室温，秤量燃烧后的残余物重量(W_ASH)，将W_ASH除以W_AD即得藻体灰分含量。

11.藻体硫分测定

将74C藻体在高温纯氧的环境下燃烧，并将燃烧后所产生含有二氧化碳、水、氮化物与二氧化硫的混合气体以氦气输送到铜还原管中，将氮化物还原成氮气，其他气体则依气体吸附特性分别被不同吸附管中的填充物吸附。氮气则直接由氦气输送到热传导侦检器(Thermal conductivity detector；TCD)检测其含量。不同的吸附管则以不同的脱附温度加温分别脱附出二氧化碳、水与二氧化硫，再将该等成分分别引入热传导侦检器来检测个别成分的含量，以求得硫的组成百分比。

实例一、藻株鉴定

于台湾嘉义阿里山山区的土壤样品中分离纯化得到74C藻株。以显微镜(1,000X)观察其形态，发现74C藻株以非群聚的单一藻体存在，其中细胞壁外无刚毛状突起，细胞呈圆形，依其藻体培养天数的不同，细胞直径约为3～6μm(图1A)。经Nile Red染色后，以荧光显微镜观察到藻体内部有大量明显且呈黄色的油滴分布，显示其藻体内可以蓄积油滴(图1B)。

将74C藻株的18S rDNA与ITS区域进行DNA测序，分别得到长度1,744bp的18S rDNA序列(SEQ ID NO:1)与长度674bp的ITS序列(SEQ ID NO:2)。将所述18S rDNA 与ITS序列与NCBI的nr数据库比对后，发现其与以下5株藻株的序列具最高相似度:

(1)Micractinium sp.(Accession No.JX889639.1)，相似度为99％；

(2)Micractinium sp.CCAP 248/2(Accession No.FR865695.1)，相似度为95％；

(3)Micractinium pusillum(Accession No.FM205866.1)，相似度为95％；

(4)Micractinium sp.CCAP 248/7(Accession No.FM205835.1)，相似度为95％；与

(5)Micractinium pusillum(Accession No.FM205872.1)，相似度为95％。

将74C藻株的ITS序列(SEQ ID NO:2)与NCBI的nr数据库进行比对后，则发现其与以下4株藻株的序列具最高相似度:

(1)Chlorella sp.(Accession No.JQ315187.1)，相似度为100％；

(2)Micractinium sp.(Accession No.JX889639.1)，相似度为99％；

(3)Micractinium sp.CCAP 211/92(Accession No.FM205863.1)，相似度为99％；与

(4)Micractinium sp.(Accession No.JQ710681.1)，相似度为98％。

此外，将74C藻株的18S rDNA与ITS区域的DNA序列(全长)经NCBI/Blastn比对分析后，将所得相近的藻株与数个较接近的藻株与藻属列进行演化树分析，结果显示74C 被划分归属于Micractinium sp.群组中(图2)。而在ITS序列的演化树比对分析中，显示 74C藻株也被归属于Micractinium sp.群组中(图3)。以上序列比对分析结果显示，74C 藻株可能属于微芒藻属(Micractinium)。

综合其形态与分子鉴定的结果，初步鉴定74C藻株应属于Micractinium sp.，且极可能为一新种，故命名为Micractinium sp.74C。

Micractinium sp.74C已于2016年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏单位地址为：中国武汉市武昌珞珈山，保藏编号为CCTCC M 2016743。

实例二、74C藻株的培养条件

(1)培养温度(耐热温度)测试

图4的结果显示在30℃到40℃的培养温度下，74C藻株于C培养基平板上可持续且明显的生长。据此，74C藻株可生长于约20℃到约40℃的温度范围中，且可耐热生长于约30℃到约40℃的温度范围中。

(2)培养基pH值测试

图5的结果显示74C藻株在pH4到pH9.5的液态C培养基中可持续且明显的生长。据此，74C藻株可生长在约pH4到约pH9.5的环境中。

(3)培养基盐度测试

图6的结果显示74C藻株在盐度0％(w/v)到4.0％(w/v)的液态C培养基中，有持续且明显的生长现象。因此，74C藻株可在0％(w/v)到至少约4.0％(w/v)的盐度环境下生长。

实例三、74C藻株的贴附培养

将74C藻株分别与以下8种不同材质的载体共同培养:(1)纤维滤纸、(2)棉布a、(3)滤布、(4)木浆布、(5)棉布b、(6)不织布、(7)牛仔布与(8)碎花布，以测试其贴附性。图 7的结果显示，74C藻株可贴附生长于(1)纤维滤纸、(5)棉布b、(6)不织布、(7)牛仔布与 (8)碎花布等载体上，其中以(1)纤维滤纸与(8)碎花布的贴附效果最佳。此外，将贴附于各载体上的74C藻体以Nile red染色后，以荧光显微镜观察，发现藻体内有大量的油滴分布(图7)，故74C藻株极具产油潜力。

实例四、74C藻株的油脂含量与组成分析

分别将74C藻株以悬浮与贴附的方式培养，收集其藻体，将其冷冻干燥成藻粉，秤取定量的藻粉并萃取其中的油脂，分析藻干含油量、油脂成分与脂肪酸组成。结果显示，悬浮培养下74C藻干含油量为47.7％(w/w)，贴附培养下74C藻干含油量为52.08％ (w/w)。相较于一般藻株在贴附培养时其藻干含油量会较悬浮培养时下降到10％以下的情况(格罗斯M.与闻Z.，整年评估试验规模的旋转式藻类生物膜(RAB)培养系统，生物资源技术，2014，171:50-58(Gross,M.&Wen,Z.,Yearlong evaluation of performance and durabilityof a pilot-scale Revolving Algal Biofilm(RAB)cultivation system,Bioresour.Technol.,2014,171:50–58))，贴附培养的74C藻干含油量反而高于悬浮培养的藻干含油量，此特性显示74C藻株更适合以贴附方式培养。

表一

注:TG:三酸甘油酯(triacylglycerol)

FA:脂肪酸(fatty acid)

1,3-DAG:1,3-双酰基甘油酯(1,3-diacylglycerol)

1,2-DAG:1,2-双酰基甘油酯(1,2-diacylglycerol)

MAG:单酰基甘油酯(monoacylglycerol)

-:低于检测极限

表二

注：ND：未检出

DU：不饱和度(Degree of Unsaturation)＝(单不饱和,w％+2(多不饱和, w％)(拉莫斯M.J.等人，原料的脂肪酸组成对生质柴油特性的影响，生物资源技术，2009，100:261-268(Ramos,M.J.,et al.,Influence of fatty acid composition of rawmaterials on biodiesel properties.Bioresour.Technol., 2009,100:261-268))

表一的油脂组成结果显示，74C藻株于悬浮培养与贴附培养下的油脂成分组成并无显着差异，主要以三酸甘油酯(TAG)为主，含量达99.81～99.89％(w/w)，其余则包含少量的1,3-双酰基甘油酯(1,3-DAG，占总油脂含量的0.08～0.17％(w/w))与1,2-双酰基甘油酯(1,2-DAG，占总油脂含量的0.01～0.02％(w/w))，此组成成分适合作为生质燃料的料源。

表二的脂肪酸组成结果显示，悬浮培养与贴附培养下的74C藻体脂肪酸组成主要为 C16与C18脂肪酸，其中各脂肪酸组成比例相似，C16、C18:1与C18:2脂肪酸含量较高。此外，经计算后，74C藻体所含油脂的不饱和度(DU)为109～116，符合欧盟所定的生质柴油标准值(DU值须小于137)(拉莫斯M.J.等人，原料的脂肪酸组成对生质柴油特性的影响，生物资源技术，2009，100:261-268(Ramos,M.J.,et al.,Influence of fatty acidcomposition of raw materials on biodiesel properties.Bioresour.Technol.,2009,100:261-268))。据此，74C藻株不论以悬浮或贴附方式培养皆适合作为提炼生质燃料的料源。此外，根据74C藻株所产油脂中脂肪酸的组成与三酸甘油酯的含量，其还适合作为食用油的料源。

实例五、74C藻株贴附培养的生物质产率与产油效率

将74C藻株以纤维滤纸贴附培养，于30℃下24小时照光培养，收集藻体，计算其载体表面的藻体生物质产率与产油效率，其结果显示以实验室规模贴附培养下的74C藻体生物质产率最高可达6.7g/m²/日，而产油效率可达1.44g/m²/日。其产油效率高于利用循环微藻生物膜生长系统(RAB)所培养的小球藻株(产油效率为0.27g/m²/日)。

实例六、74C藻株悬浮培养的生物质产率、油脂产率与固碳效率

利用二氧化碳固碳效率评估平台进行74C藻株的固碳能力测试，以通气量为0.1vvm 持续通入5％(v/v)二氧化碳到藻液中，再利用二氧化碳自动监测系统持续监测进流与出流的二氧化碳浓度(浓度单位为％，1％＝10,000ppm)，计算每日固定二氧化碳毫克数。以30℃悬浮培养后，收集藻体分析，结果显示74C藻体生物质产率、油脂产率与固碳效率分别为100.4mg/L/日、45.7mg/L/日与508mg/L/日。

实例七、74C藻株生物炭特性分析

将74C藻株大量培养后，收集藻体，冷冻干燥成藻粉，秤取定量的藻粉并量测其热值、灰分与硫分。表三的结果显示藻粉热值达25.41MJ/Kg，灰分与硫分含量则分别为2.07％(w/w)与0.362％(w/w)。此外，相较于目前发电厂所使用的燃煤烟煤与亚烟煤，74C藻株的灰分与硫分仅为发电厂燃煤采购标准的13.8％(w/w)与32.9％(w/w)。而相较于杂草、豆杆或稻草等生质燃料(王岱淇与冯丁树，农产品废弃物焚化物性的研究，农业机械学刊，1993，2:1-11)，74C藻株不仅热值含量高，还具有较低的灰分含量。以上结果可证明，74C藻株也可作为一优质生质燃料(如生质煤炭)的料源，且可大幅减少污染物生成以减少环境污染。

表三

*:无硫分含量的数据。

结论

本发明首先发现经初步鉴定为Micractinium sp.的微芒藻属分离株74C。所述藻株可生长在温度约20℃到约40℃、约pH4到约pH9与盐度0％(w/v)到至少约4％(w/v)的环境中，且具备良好的贴附特性，可贴附生长于不同材质的载体上。此外，74C藻株在悬浮培养下的藻干含油量为47.7％(w/w)，在贴附培养下所形成的生物膜中的藻干含油量为52.08％(w/w)，其反而高于悬浮培养的藻干含油量。在贴附培养下，74C藻体的生物质产率与产油效率分别为6.7g/m²/日与1.44g/m²/日；而在悬浮培养下，74C藻体的生物质产率、油脂产率与固碳效率分别为100.4mg/L/日、45.7mg/L/日与508mg/L/日。此外，不论是以悬浮培养或贴附培养的方式培养，74C藻体三酸甘油酯含量占油脂总含量的 99％(w/w)以上，其中脂肪酸组成以C16与C18脂肪酸为主，脂肪酸不饱和度为109～116。进一步分析发现，74C藻体具备生物炭特性，其热值为25.41MJ/Kg，灰分与硫分含量分别为2.07％(w/v)与0.362％(w/v)。上述结果显示，74C藻株(Micractinium sp.)具有形成生物膜的特性，可以贴附培养的模式来培养；具有高优质的藻油组成，可作为生产生质柴油与食用油的料源；具有固碳的能力，可减少环境中的二氧化碳达到环境减废的作用；并因为具有低灰分与低硫分的特性，可作为生质燃料的料源，并可大幅减少污染物生成以降低环境污染。

【序列表】

<110> 财团法人食品工业发展研究所

<120> 微芒藻属(MICRACTINIUM SP.)及其用途

<130> 294

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1744

<212> DNA

<213> 微芒藻属(Micractinium sp.)

<220>

<221> 18S rDNA

<222> (1)..(1744)

<400> 1

atatgcttgt ctcaaagatt aagccatgca tgtctaagta taaactgctt tatactgtga 60

aactgcgaat ggctcattaa atcagttata gtttatttga tggtacctac tactcggata 120

cccgtagtaa atctagagct aatacgtgcg taaatcccga cttctggaag ggacgtattt 180

attagataaa aggccgaccg ggctctgccc gactcgcggt gaatcatgat aacttcacga 240

atcgcatggc cttgtgccgg cgatgtttca ttcaaatttc tgccctatca actttcgatg 300

gtaggataga ggcctaccat ggtggtaacg ggtgacggag gattagggtt cgattccgga 360

gagggagcct gagaaacggc taccacatcc aaggaaggca gcaggcgcgc aaattaccca 420

atcctgacac agggaggtag tgacaataaa taacaatact gggccttttc aggtctggta 480

attggaatga gtacaatcta aaccccttaa cgaggatcaa ttggagggca agtctggtgc 540

cagcagccgc ggtaattcca gctccaatag cgtatattta agttgctgca gttaaaaagc 600

tcgtagttgg atttcgggtg gggcctgccg gtccgccgtt tcggtgtgca ctggcagggc 660

ccaccttgtt gccggggacg ggctcctggg cttcactgtc cgggactcgg agtcggcgct 720

gttactttga gtaaattaga gtgttcaaag caggcctacg ctctgaatac attagcatgg 780

aataacacga taggactctg gcctatcctg ttggtctgta ggaccggagt aatgattaag 840

agggacagtc gggggcattc gtatttcatt gtcagaggtg aaattcttgg atttatgaaa 900

gacgaactac tgcgaaagca tttgccaagg atgttttcat taatcaagaa cgaaagttgg 960

gggctcgaag acgattagat accgtcctag tctcaaccat aaacgatgcc gactagggat 1020

cggcggatgt ttcttcgatg actccgccgg caccttatga gaaatcaaag tttttgggtt 1080

ccggggggag tatggtcgca aggctgaaac ttaaaggaat tgacggaagg gcaccaccag 1140

gcgtggagcc tgcggcttaa tttgactcaa cacgggaaaa cttaccaggt ccagacatag 1200

tgaggattga cagattgaga gctctttctt gattctatgg gtggtggtgc atggccgttc 1260

ttagttggtg ggttgccttg tcaggttgat tccggtaacg aacgagacct cagcctgcta 1320

aatagtcacg gttggttctc cagccggcgg acttcttaga gggactattg gcgactagcc 1380

aatggaagca tgaggcaata acaggtctgt gatgccctta gatgttctgg gccgcacgcg 1440

cgctacactg atgcattcaa cgagcctagc cttggccgag aggcccgggt aatctttgaa 1500

actgcatcgt gatggggata gattattgca attattaatc ttcaacgagg aatgcctagt 1560

aagcgcaagt catcagcttg cgttgattac gtccctgccc tttgtacaca ccgcccgtcg 1620

ctcctaccga ttgggtgtgc tggtgaagtg ttcggattgg cgaccgggtg cggtctccgc 1680

tctcggccgc cgagaagttc attaaaccct cccacctaga ggaaggagaa gtcgtaacaa 1740

ggtt 1744

<210> 2

<211> 728

<212> DNA

<213> 微芒藻属(Micractinium sp.)

<220>

<221> ITS

<222> (1)..(728)

<400> 2

tccgtaggtg aacctgcgga aggatcattg aatcgatcga atccactctg tgaactaaac 60

gtcccccctt gggtgcgggc ttcggcttgc cccaaggcgt cggttccctg gctggggtct 120

tcggaccgca gttaggtccg gcgggcgcgc cctctggcgt gttggcccta gtggctgccg 180

ccagttgggt tcgctggaaa ttatatccaa ctcaacccac cccaaaccac aatctatact 240

gaagcaatct gtgagcgcac ttcggtgcct cgcttaaacc aaagacaact ctcaacaacg 300

gatatcttgg ctcccgtatc gatgaagaac gcagcgaaat gcgatacgta gtgtgaattg 360

cagaattccg tgaaccatcg aatctttgaa cgcaaattgc gcccaaggct tcggccgagg 420

gcatgtctgc ctcagcgtcg gcttaccccc tcgctccccc tttcctttgg attgggtgtg 480

agcggatctg gctttcccgg ctccgtgctt tggcacgccc gggttggctg aagtgtagag 540

gcttgagcat ggaccccgtt tgtagggcaa tggcttggta ggtagcctag ctacaccgcc 600

tgccgtggcc cgaggggact ttgctggcgg cccagcagga attcgggtgt tgggttaccc 660

cactccgaaa gcttcaaaac ttcgacctga gctcaggcaa gactacccgc tgaacttaag 720

catatcat 728

1

Claims (19)

1.一种微芒藻属(Micractinium sp.)分离株，其包含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的18S rDNA序列与SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的ITS区域序列。

2.根据权利要求1所述的微芒藻属分离株，其中所述微芒藻属分离株为保藏于中国典型培养物保藏中心且保藏编号为CCTCC M 2016743的藻株，或为与保藏于中国典型培养物保藏中心且保藏编号为CCTCC M 2016743的藻株具有实质上完全相同特征的变异株。

3.一种制备微芒藻属(Micractinium sp.)培养产物的方法，其包含将根据权利要求1或2中所述的微芒藻属分离株接种于液态培养基中，在照光与通气下进行培养以获得所述培养产物。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述微芒藻属是与一或多个载体共同培养于所述液态培养基中。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述微芒藻属分离株与所述一或多个载体是分别加入所述液态培养基中，或先将该微芒藻属分离株接种于所述一或多个载体上后，再将经接种的载体置入所述液态培养基中。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述载体是网状物质、泡棉或其任意组合。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述网状物质是纤维滤纸、棉布、滤布、木浆布、不织布、牛仔布、尼龙布、超细纤维织布或帆布。

8.根据权利要求6所述的方法，其中所述泡棉是聚乙烯醇(PVA)泡棉。

9.根据权利要求3到5中任一权利要求所述的方法，其中所述液态培养基的pH值为约pH3.5到约pH10。

10.根据权利要求3到5中任一权利要求所述的方法，其中所述培养是在约25℃到约45℃的温度下进行。

11.根据权利要求3到5中任一权利要求所述的方法，其中所述液态培养基的盐度为0％(w/w)到约4.5％(w/w)。

12.根据权利要求3到5中任一权利要求所述的方法，其进一步包含分离所述培养产物的步骤。

13.根据权利要求3所述的方法，其可用于固定二氧化碳。

14.一种微芒藻属(Micractinium sp.)培养产物，其可由权利要求3到12中任一权利要求所述的方法来获得。

15.根据权利要求14所述的微芒藻属培养产物，其包含三酸甘油酯及脂肪酸。

16.一种制备三酸甘油酯及/或脂肪酸的方法，其包含自根据权利要求14或15所述的微芒藻属培养产物中分离出三酸甘油酯及/或脂肪酸。

17.一种制备生质燃料的方法，其包含使用根据权利要求14或15所述的微芒藻属培养产物作为原料。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述生质燃料为生质柴油。

19.根据权利要求17所述的方法，其中所述生质燃料为生质煤炭。