TWI640626B - 柵藻（ｄｅｓｍｏｄｅｓｍｕｓ ｓｐ.）及其在合成油脂及生質燃料上之應用 - Google Patents

Abstract

本發明係關於一種新穎的經分離柵藻(Desmodesmus sp.)及其在油脂與生質燃料合成及二氧化碳固定之應用。

Description

柵藻( DESMODESMUS SP.)及其在合成油脂及生質燃料上之應用

本發明係關於新穎柵藻(Desmodesmus sp.)分離株，該分離株可產生高量的三酸甘油酯及C16~C18脂肪酸，且具有高效的固碳作用，故該分離株可做為生產健康油脂及生質柴油的原料，亦可應用於二氧化碳的減量。

微藻(microalgae)係屬於一種單細胞藻類，其分佈範圍非常廣泛，在淡水、海洋或潮濕的土壤中皆可發現其蹤跡，其生長形式包括單獨生長、鏈狀或是團狀生長(Thurman H.V.& Burton E.A.,Introductory Oceanography,Prentice Hall,New Jersey,1997)。根據不同的微藻物種，其尺寸範圍可從幾微米(μm)至幾百微米。微藻能夠行光合作用，吸收二氧化碳，產生大氣中一半的氧氣量，對地球上的生命至關重要。微藻的生物多樣性非常複雜，無論是以基礎研究或是開發的角度而言，微藻為一個幾乎未積極開發的資源。據估計，地球上大約有20萬至80萬種微藻，其中已發現並有記錄的僅有5萬種(Borowitzka M.A.,Commercial production of microalgae：ponds,tanks,tubes and fermenters.,Journal of biotechnology,1999,70：313-321)。大多數微藻所產生的化合物包括類胡蘿蔔素、抗氧化劑、脂肪酸、酶、聚合物、胜肽、藻毒素及固醇類等，目前已有超過1.5萬個新化合物是從微藻 藻體萃取後經化學分析確認(Thompson P.A.,Harrison P.J.& Whyte J.N.,Influence of irradiance on the fatty acid composition of phytoplanktonl.,Journal of Phycology,1990,26：278-288)。

脂質是微藻的次級代謝產物，具有保持細胞膜通透性之功能，以及因應環境變化作為細胞訊息傳遞途徑之功能。微藻所生產之油脂量與組成會因周遭環境而產生變化(Thompson P.A.,Harrison P.J.& Whyte J.N.,Influence of irradiance on the fatty acid composition of phytoplanktonl.,Journal of Phycology,1990,26：278-288；及Borowitzka M.A.,Commercial production of microalgae：ponds,tanks,tubes and fermenters.,Journal of biotechnology,1999,70：313-321)。當環境條件不利於微藻生長時，微藻藻體所吸收之碳將轉變成油脂之能量形式儲存起來，而其油脂含量、組成及所含各種脂肪酸比例亦會根據培養環境條件，包括光強度、生長階段、光週期、溫度、鹽度、二氧化碳濃度、氮及磷濃度等，而有所不同(Dunstan G.et al.,Changes in the lipid composition and maximisation of the polyunsaturated fatty acid content of three microalgae grown in mass culture.,Journal of Applied Phycology,1993,5：71-83；及Wu H.,et al.,In vivo lipidomics using single-cell Raman spectroscopy.,Proceedings of the National Academy of Sciences,2011,108：3809-3814)。一般而言，微藻富含三酸甘油酯(triacylglycerol，TG)、雙酸甘油酯、磷脂、醣脂、碳氫化合物及其他脂類，依照微藻種類及培養條件不同，其微藻含油總量可佔藻體乾重的1至90%(w/w)(Spolaore P.,et al.,Commercial applications of microalgae,.Journal of bioscience and bioengineering,2006,101：87-96；及Chisti Y.,Biodiesel from microalgae.,Biotechnology advances,2007,25：294-306)。有研究報導指出微藻產生之油脂量及油脂組成因隨其藻種之不同，而可作為鑑別藻種之參考依據(Berglund O.,et al., The effect of lake trophy on lipid content and PCB concentrations in planktonic food webs.,Ecology,2001,82：1078-1088)。

微藻由於其不凡的潛力，已經引起世界關注。作為一個可持續發展的綠色能源之一，微藻能夠解決世界上最緊迫的問題。微藻具備生長速度快、二氧化碳利用率高、可高密度培養及受病菌污染機率較小等優點，並可在短時間內蓄積大量的生物質，可作為生產生質柴油、生物乙醇及生物氫等生質燃料的原料。加上其細胞結構簡單且缺乏細胞分化，相較於棕梠、油菜、大豆及甘蔗等產油作物，其操作性更為簡易。此外，微藻可使用非農耕地、苦鹹水及廢水等進行培養，大大減少了土地與淡水的利用，從而減少與糧食及經濟作物的資源競爭。因此，各國政府及私營機構已紛紛投入微藻及其衍生物包括生質燃料、化學品及高價商品等研究與開發。

微藻可用來生成一系列的可再生燃料，包括生質柴油(Hu Q,et al.,Microalgal triacylglycerols as feedstocks for biofuel production：perspectives and advances.,The Plant Journal,2008,54：621-639；Tran D.T.,Chen C.L.& Chang J.S.,Effect of solvents and oil content on direct transesterification of wet oil-bearing microalgal biomass of Chlorella vulgaris ESP-31 for biodiesel synthesis using immobilized lipase as the biocatalyst.,Bioresource technology,2013,135：213-221；及Cheng H.H.,et al.,Biological butanol production from microalgae-based biodiesel residues by Clostridium acetobutylicum.,Bioresource technology,2015,184：379-385)、生物乙醇(Harun R.& Danquah M.K.,Influence of acid pre-treatment on microalgal biomass for bioethanol production.,Process Biochemistry,2011,46：304-309；Ho S.H.,et al.,Bioprocess development on microalgae-based CO₂ fixation and bioethanol production using Scenedesmus obliquus CNW-N., Bioresource technology,2013,145：142-149；及Ho S.H.,et al.,Bioethanol production using carbohydrate-rich microalgae biomass as feedstock.,Bioresource technology,2013,135：191-198)、生物氫(Sambusiti C.,et al.,Algae as promising feedstocks for fermentative biohydrogen production according to a biorefinery approach：A comprehensive review.,Renewable and Sustainable Energy Reviews,2015,44：20-36；Oncel S.,et al.,Biohydrogen production from model microalgae Chlamydomonas reinhardtii：A simulation of environmental conditions for outdoor experiments.,International Journal of Hydrogen Energy,2015,40：7502-7510；及Batista A.P.,et al.,Combining urban wastewater treatment with biohydrogen production-An integrated microalgae-based approach.,Bioresource technology,2015,184：230-235)、甲烷(Caporgno M.,et al.,Microalgae cultivation in urban wastewater：Nutrient removal and biomass production for biodiesel and methane.,Algal Research,2015,10：232-239；Ajeej A.,et al.,An overview of bio augmentation of methane by anaerobic co-digestion of municipal sludge along with microalgae and waste paper.,Renewable and Sustainable Energy Reviews,2015,50：270-276；及Kim J.& Kang C.M.,Increased anaerobic production of methane by co-digestion of sludge with microalgal biomass and food waste leachate.,Bioresource technology,2015,189：409-412)及合成氣(Raheem A.,et al.,Optimization of the microalgae Chlorella vulgaris for syngas production using central composite design.,RSC Advances,2015,5：71805-71815；Raheem A.,et al.,Thermogravimetric study of Chlorella vulgaris for syngas production.,Algal Research,2015,12：52-59；及Hu Z.,Ma X.& Li L.,The synergistic effect of co-pyrolysis of oil shale and microalgae to produce syngas.,Journal of the Energy Institute,2015)。這些能源形式，若以便利性而言，微藻生質柴油因其油品性質與石化柴油相近，適合用於柴油車輛上，且僅需將化油器等裝置進行些微修改；又因為生質柴油屬於高能量密度，且較為清潔的燃料，因此適合作為運輸燃料。然而，目前將微藻生質燃料商品化之技術尚未成熟，其量產成本亦較為高昂，故仍需具有環境耐受度高、生長快速、光合效率佳、固碳效率佳、生物質產率高、藻體易於回收等特點之優良藻種。

預計到2050年時，全世界人口將達到90億，這將導致全球糧食之供應面臨挑戰(Foley J.A.,et al.,Solutions for a cultivated planet.,Nature,2011,478：337-342；及Tilman D.,et al.,Global food demand and the sustainable intensification of agriculture.,Proceedings of the National Academy of Sciences,2011,108：20260-20264)。微藻近年來已成為生產糧食、飼料、燃料及化學品之明星原料，相較於傳統糧食作物，微藻的產量是高等植物的6~7倍，且可生長在非農耕地或鹹水中，所需要的養殖土地面積少，可以減少對淡水資源及農耕地的需求，為蛋白質、碳水化合物及脂質的來源(Becker E.,Micro-algae as a source of protein.,Biotechnology advances,2007,25：207-210)。

許多藻種生產脂質是以蓄積三酸甘油酯之形式為主，具有類似於植物油之脂肪酸的組成(Gunstone F.,Vegetable oils in food technology：composition,properties and uses,John Wiley & Sons,2011；及Draaisma R.B.,et al.,Food commodities from microalgae.,Current opinion in biotechnology,2013,24：169-177)，此外還能生產一些高價脂肪酸，例如二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic Acid，EPA)及二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，DHA)(Guschina I.A.& Harwood J.L.,Algal lipids and effect of the environment on their biochemistry.,Lipids in aquatic ecosystems,Springer,New York,2009,1-24；及Mühlroth A., et al.,Pathways of lipid metabolism in marine algae,co-expression network,bottlenecks and candidate genes for enhanced production of EPA and DHA in species of Chromista.,Marine drugs,2013,11：4662-4697)。在不利的生長條件下，例如氮剝奪時，微藻所大量蓄積的脂質約可佔藻體乾重20%(w/w)至60%(w/w)(Griffiths M.J.& Harrison S.T.,Lipid productivity as a key characteristic for choosing algal species for biodiesel production.,Journal of Applied Phycology,2009,21：493-507)。另，部分微藻能生成人體必需脂肪酸，包括n6系列之亞麻油酸(C18：2)及n3系列之次亞麻油酸(C18：3)(Lang I.,et al.,Fatty acid profiles and their distribution patterns in microalgae：a comprehensive analysis of more than 2000 strains from the SAG culture collection.,BMC plant biology,2011,11：124)。美國一家以藻類合成生質油之生物科技公司Solazyme於2013年通過美國FDA對於其藻油產品GRAS之認證(FDA U.RE：High Lipid Chlorella protothecoides S106 Flour GRAS 2013.)，說明藻油能夠運用於日常烹調與烘焙中，故微藻可說是生產天然食用油於日常烹飪及保健品的最佳選擇。惟，生產植物油的成本相對較為低廉，市場價格約在0.50-1.00歐元/公斤(即17.9~35.9元台幣/公斤)，而微藻油脂的生產成本，目前估計約為8.30歐元/公斤(即298元台幣/公斤)(Mühlroth A.,et al.,Pathways of lipid metabolism in marine algae,co-expression network,bottlenecks and candidate genes for enhanced production of EPA and DHA in species of Chromista.,Marine drugs,2013,11：4662-4697)。因此，在進入食品市場之前仍須大幅降低其生產成本，否則難與其他油品競爭，且勢必更難與價格更低之燃料用油競爭(Chisti Y.,Constraints to commercialization of algal fuels.,Journal of biotechnology,2013；167：201-214)。故而使得以微藻生產食用油成為以微藻生產燃料油的 一個過渡標的，意即可從微藻生產食用油之過程中，以較能獲利之副產品，例如色素、蛋白質和長鏈ω-3多不飽和脂肪酸(Wijffels R.H.,Barbosa M.J.& Eppink M.H.,Microalgae for the production of bulk chemicals and biofuels.,Biofuels,Bioproducts and Biorefining,2010,4：287-295)，來逐步降低其製造成本，以實現未來微藻燃油之商品化。

人類文明發展活動，例如燃燒化石燃料、毀林及能源生產，進而造成大量的溫室氣體排放。美國環保局(USEPA)指出，能源生產及消費主要來自交通運輸，從1990年開始至2010年，因交通運輸所產生的溫室氣體佔全球溫室氣體排放量已增加了35%，其中光是2010年一整年交通運輸所產生的溫室氣體排放量就佔全年溫室氣體排放量的71%(Wilbanks T.J.,et al.,Climate Change and Infrastructure,Urban Systems,and Vulnerabilities.Technical Report for the US Department of Energy in Support of the National Climate Assessment.,Island Press,2014)。自18世紀工業革命至2013年以來，二氧化碳在大氣中之濃度已從280ppm上升至390ppm(Rahaman M.S.A.,et al.,A review of carbon dioxide capture and utilization by membrane integrated microalgal cultivation processes.,Renewable and Sustainable Energy Reviews,2011,15：4002-4012；及Singh U.B.& Ahluwalia A.,Microalgae：a promising tool for carbon sequestration.,Mitigation and Adaptation Strategies for Global Change,2013,18：73-95)。雖然地球上植物行光合作用時需要二氧化碳，惟二氧化碳可於大氣中留存50-200年，而不斷增加的二氧化碳為造成溫室效應的主要氣體之一，目前已知造成全球暖化現象有52%係歸咎於大氣中二氧化碳濃度升高所致(Van Den Hende S.,Vervaeren H.& Boon N.,Flue gas compounds and microalgae：(Bio-)chemical interactions leading to biotechnological opportunities.,Biotechnology advances,2012,30：1405-1424；及Wilbanks T.J.,et al.,Climate Change and Infrastructure,Urban Systems,and Vulnerabilities.Technical Report for the US Department of Energy in Support of the National Climate Assessment.,Island Press,2014)。溫室效應所造成的全球暖化已引起全球關注，因而提出以微藻為基礎的二氧化碳封存，旨在降低大氣中二氧化碳濃度以減少溫室效應。

陸生植物估計只能削減約3-6%全球二氧化碳排放量(Ho S.H.,et al.,Perspectives on microalgal CO₂-emission mitigation systems-a review.,Biotechnology advances,2011,29：189-198；及Kao C.Y.,et al.,Utilization of carbon dioxide in industrial flue gases for the cultivation of microalga Chlorella sp.,Bioresource technology,2014,166：485-493)，而微藻固定二氧化碳的效率是陸生植物的10-50倍(Lam M.K.,Lee K.T.& Mohamed A.R.,Current status and challenges on microalgae-based carbon capture.,International Journal of Greenhouse Gas Control,2012,10：456-469；及Cheng J.,et al.,Improving CO₂ fixation efficiency by optimizing Chlorella PY-ZU1 culture conditions in sequential bioreactors.,Bioresource technology,2013,144：321-327)。微藻每產生1公斤微藻生物質約可固定1.83公斤的二氧化碳(Jiang Y.,et al.,Utilization of simulated flue gas for cultivation of Scenedesmus dimorphus.,Bioresource technology,2013,128：359-364)。由於微藻行光合作用時轉化二氧化碳的效率高，故除了可捕捉大氣中的二氧化碳，亦可直接引用含有二氧化碳之工業廢氣進行培養，進而減少工業二氧化碳排放量(Maeda K.,et al.,CO₂ fixation from the flue gas on coal-fired thermal power plant by microalgae.,Energy Conversion and Management,1995,36：717-720；及Doucha J.,Straka F.& Lívanský K.,Utilization of flue gas for cultivation of microalgae (Chlorella sp.)in an outdoor open thin-layer photobioreactor.,Journal of Applied Phycology,2005,17：403-412)。此外，微藻行光合作用所產生的脂質等生物質產率高，可作為生產生質燃料如生質柴油、生物乙醇及生物氫等的原料，亦可生產可再生能源及有價值的非燃料副產品(Xie Y.P.,et al.,Simultaneous enhancement of CO₂ fixation and lutein production with thermo-tolerant Desmodesmus sp.F51 using a repeated fed-batch cultivation strategy.,Biochemical Engineering Journal,2014,86：33-40)。因此，利用生長快速之微藻來固定二氧化碳，同時將其所產生之生物質轉化為生質能源與燃料，已被視為最有前景之能源替代方案。

本發明係於花蓮富里採集到含柵藻的樣品後，以C培養基進行柵藻的培養與分離，選取出可產生藻油，且經鑑定為Desmodesmus sp.之C71藻株，經藻油含量、脂肪酸圖譜、油脂組成以及二氧化碳固定等分析，發現該C71藻株可作為再生能源產業與二氧化碳減量應用之潛力藻種。

本發明之一目的係在於提供一種柵藻分離株，該柵藻分離株之培養物可用做生產健康油脂及生質柴油的原料，並可固定二氧化碳作為減碳之工具。

本發明之另一目的係在於提供一種培養該柵藻分離株以獲得柵藻培養產物的方法。

本發明之另一目的係在於提供一種由上述方法所獲得的柵藻培養產物。

本發明之另一目的係在於提供一種由上述柵藻培養產物中獲得三酸甘油酯及/或脂肪酸之方法。

本發明在以下部分中詳細描述。本發明之其他特徵、目的及優點 可易見於本發明之實施方式及申請專利範圍中。

圖1為C71藻株的顯微鏡檢圖。圖1A為明視野觀察，细胞為圓球狀，直徑約為4~7μm，顯微倍率1,000X；圖1B為以Nile Red染色，以螢光顯微鏡觀察，藻體內部有橘黃色之油滴分佈，顯微倍率1,000X。

圖2為C71藻株之18S rDNA及ITS全長序列之親源樹狀圖。

圖3為以C培養基為基礎，C71藻株在不同培養溫度(20℃、30℃及40℃)下之生長結果。

圖4為C71藻株在含有不同鹽度(0%(w/w)、1.5%(w/w)及3%(w/w))之C培養基中之生長結果。

圖5為C71藻株在含有不同pH值(pH4、pH7及pH9)之C培養基中之生長結果。

圖6為C71藻株在不同二氧化碳濃度(0.04%(v/v)及5%(v/v))下之生長曲線。

圖7為C71藻株在不同二氧化碳濃度(0.04%(v/v)及5%(v/v))下之生物質產率。

本發明可藉由下述實施方式中所揭示之各種發明態樣、實施例及表列之相關敘述所瞭解。除非在本文中另作定義，否則與本發明關聯使用之術語(包含技術及科學術語)應具有本發明所屬技術領域中具有通常知識者所瞭解之含義。且當可瞭解，除非本文中提供之定義另作說明，在任何潛在歧義之情況，術語之定義應與該等普遍使用之術語(如詞典中所定義)一致。可進一步瞭解者，本案所使用的術語僅係用作描述特定實施態樣之目的，而非用於限定。

必須注意的是，除非有清楚的相反指示，於說明書或申請專利範圍使用之單數格式「一種」及「該」亦包含複數表示。因此，除非上 下文另有需要，單數術語應包含複數，而複數術語亦包含單數。

本發明的範圍以「自一『約』特定數值及/或至另一『約』特定數值」表示。當範圍藉上述方式表示時，其包含自一特定數值及/或至另一特定數值之範圍。同樣地，當數值可藉由術語「約」以表示近似值，將可了解其為一特定值的另一個態樣。可進一步了解，當提及有關其它端點及其他端點本身而言，每一範圍的兩端點皆為有意義的。根據本發明，「約」可表示±20%，較佳為±10%，更佳為±5%。

於本發明中，術語「經分離」或「分離」意謂使物質自其原始環境(若天然存在則為天然環境)中移出。術語"經分離"或"分離"並不一定指物質係經純化者。

本發明之目的一在於提供一種柵藻分離株，其包含與SEQ ID NO：1所示核苷酸序列具有至少95%相似度之ITS區域序列，且與SEQ ID NO：2所示核苷酸序列具有至少95%相似度之18S rDNA區域序列。換言之，該柵藻分離株中之ITS區域序列與SEQ ID NO：1所示核苷酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%之相似度，且18S rDNA序列與SEQ ID NO：2所示核苷酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%之相似度。

兩個核酸序列間的差異可出現於參考核苷酸序列之5'或3'末端位置處，或個別散布於參考序列中之核苷酸當中，或散布於參考序列內之一或多個鄰近基團中之彼等末端位置之間的任何地方。任何特定核酸分子是否與參考核苷酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相似係指使用此項技術中所熟知之標準演算法在兩個分子之間所進行的比較，且可常規使用公開可用之電腦程式(諸如BLASTN演算法)來判定。

於本發明之一較佳實施態樣中，該柵藻分離株為寄存於財團法人食品工業發展研究所且寄存編號為BCRC980039之藻株，或為與寄 存於財團法人食品工業發展研究所且寄存編號為BCRC980039之藻株具有實質上完全相同特徵之變異株。

上述「變異株」意謂涵蓋全體細胞遺傳組成已藉由如化學突變誘發、自發突變、遺傳工程、轉化或轉染而改變，以致影響其物理或生物化學特性之任何柵藻株。然而，該變異株應具有寄存於財團法人食品工業發展研究所且寄存編號為BCRC980039之柵藻株的所有識別特徵。

本發明之另一目的係在於提供一種製備柵藻培養產物之方法，其包含將本發明之柵藻分離株接種於pH為約pH6至約pH10之液態培養基中，在溫度約15℃至約40℃、照光及以通氣導入含有二氧化碳濃度為約0.04%(v/v)至約20%(v/v)之空氣下進行培養以獲得該培養產物。本發明亦提供由上述方法所獲得之培養產物。

本發明中所述用於培養柵藻分離株之「培養基」可為任何容許柵藻分離株生長、繁殖並製造三酸甘油酯及/或脂肪酸之培養基，例如C培養基[每100mL中包含15mg Ca(NO₃)₂‧4H₂O、10mg-20mg KNO₃、5mg β-甘油磷酸二鈉‧5H₂O、4mg MgSO₄‧7H₂O、0.01μg維生素B12、0.01μg生物素(Biotin)、1μg噻胺HCl、0.3mL PIV微量元素溶液(每100mL中包含100mg Na₂EDTA‧2H₂O、19.6mg FeCl₃‧6H₂O、3.6mg MnCl₂‧4H₂O、1.04mg ZnCl₂、0.4μg CoCl₂‧6H₂O、0.25μg Na₂MoO₄‧2H₂O及水)、50mg Tris(hydroxymethyl)aminomethane及水]、BG-11培養基[每100mL包含1,500mg NaNO₃、40mg K₂HPO₄、75mg MgSO₄．7H₂O、27.18mg CaCl₂、6mg檸檬酸、6mg檸檬酸鐵銨、1mg Na₂．Mg．EDTA．2H₂O、20mg Na₂CO₃、2.86mg HBO₃、1.181mg MuCl₂‧4H₂O、0.222mg ZnSO₄‧7H₂O、0.39mg Na₂MoO₄‧2H₂O、0.0718mg CuSO₄‧5H₂O、0.049mg Co(NO₃)₂．6H₂O及水]，以及MA培養基[每100mL中包含10mg Ca(NO₃)₂‧4H₂O、10mg KNO₃、5 mg NaNO₃、4mg Na₂SO₄、5mg MgCl₂‧6H₂O、10mg β-甘油磷酸二鈉‧5H₂O、0.5mg Na₂EDTA‧2H₂O、0.05mg FeCl₃‧6H₂O、0.5mg MnCl₂‧4H₂O、0.05mg ZnCl₂、0.5mg CoCl₂‧6H₂O、0.08mg Na₂MoO₄‧2H₂O、2mg H₃BO₃及50mg Bicine]。

本發明中用於培養柵藻分離株之條件意指如培養基之pH值、培養溫度、照光、二氧化碳濃度及培養時間等條件，其可容許該柵藻分離株生長、繁殖並製造三酸甘油酯及/或脂肪酸。本技術領域之人士可根據既有知識針對培養基的成分及培養條件作調整。

於本發明之實施態樣中，其柵藻培養基之pH值可為約pH6、約pH6.5、約pH7、約pH7.5、約pH8、約pH8.5、約pH9、約pH9.5或約pH10，較佳為約pH7至約pH9。

於本發明之實施態樣中，其柵藻培養溫度可為約15℃至約40℃，較佳為約20℃至約30℃；且照光量可為約100lux至約4,000lux，較佳為約2,000lux。

本文中所謂「通氣」意旨於液體培養基中持續地通入含有二氧化碳之空氣，而通氣量可為約0.05vvm至約1vvm，較佳為約0.1vvm至約0.5vvm，最佳為約0.1vvm。該空氣中之二氧化碳的濃度可為約0.04%(v/v)至約20%(v/v)，較佳為約0.1%(v/v)至約15%(v/v)，更佳為約5%(v/v)至約10%(v/v)。於本發明之實施態樣中，通氣中的二氧化碳濃度可為約0.04%(v/v)、約0.1%(v/v)、約0.5%(v/v)、約1%(v/v)、約2%(v/v)、約3%(v/v)、約4%(v/v)、約5%(v/v)、約6%(v/v)、約7%(v/v)、約8%(v/v)、約9%(v/v)、約10%(v/v)、約11%(v/v)、約12%(v/v)、約13%(v/v)、約14%(v/v)、約15%(v/v)、約16%(v/v)、約17%(v/v)、約18%(v/v)、約19%(v/v)或約20%(v/v)。

在本發明之另一實施態樣中，可視需要調整柵藻培養基之鹽度。本文中所謂「鹽度」意旨溶解於培養基中之鹽類含量。本發明中 柵藻培養基之鹽度可為0%(w/w)、0%(w/w)至約0.5%(w/w)、約0.5%(w/w)至約1%(w/w)或約0.5%(w/w)至約1.5%(w/w)。

本發明製備柵藻培養產物之方法中，可視需要包含分離該培養產物的步驟，而該分離步驟可為如離心及/或過濾等習知的方法步驟。

由於本發明的柵藻培養產物中富含三酸甘油酯及/或脂肪酸，故可用作獲得三酸甘油酯及/或脂肪酸的原料，進而分別用於製作健康油脂及/或生質燃料。

本文中之「三酸甘油酯」意旨具有1個甘油分子及3個脂肪酸分子之酯類化合物，其中該3個脂肪酸分子可具有完全相同、部份相同或完全相異之碳數及不飽和鍵。

本文中之「脂肪酸」意旨具有8至30個碳原子及0至6個不飽和鍵的羧酸化合物，其較佳為具有12至20個碳原子及0至5個不飽和鍵的羧酸化合物，更佳為具有16至18個碳原子及0至3個不飽和鍵的羧酸化合物。

三酸甘油酯及脂肪酸之獲得可使用本技術領域所熟知的任何萃取及分離方法，例如Folch等人(The Journal of biological Chemistry,1956,23：497-509)、Balasubramanian等人(Bioresource Technology,2011,102：3396-3403)及Sajilata等人(Journal of Food Engineering,2008,84：321-326)的方法。簡而言之，該方法可包含將柵藻細胞以如研磨法或超音波法等方式擊碎，藉由適當的溶劑萃取柵藻細胞中之三酸甘油酯及/或脂肪酸，再藉由如HPLC及/或離子交換樹脂的技術獲得三酸甘油酯及/或脂肪酸。

本文所述之所有公開案、專利及專利文獻均以全文引用的方式併入本文中。

提供以下實例以輔助熟習此項技術者實施本發明。即使如此， 不應將該等實例視為本發明之限制，因為本發明所屬技術領域中具有通常知識者在不背離本發明之精神或範疇的情況下對本文所討論之實施例進行的修改及變化，而仍屬於本發明之範圍。

實施例 材料與方法 1. C培養基

依序加入Ca(NO₃)₂‧4H₂O 15mg、KNO₃ 10mg、β-甘油磷酸二鈉‧5H₂O 5mg、MgSO₄‧7H₂O 4mg、維生素B12 0.01μg、生物素(Biotin)0.01μg、噻胺HCl 1μg、PIV微量元素溶液0.3mL與Tris(hydroxymethyl)aminomethane 50mg，隨後將其體積補水至100mL，調整pH至7.5後進行高壓滅菌。若為1.5%(w/v)洋菜固體培養基則需加入15g的洋菜膠一同滅菌。

PIV微量元素溶液的配製為依序加入Na₂EDTA‧2H₂O 100mg、FeCl₃‧6H₂O 19.6mg、MnCl₂‧4H₂O 3.6mg、ZnCl₂ 1.04mg、CoCl₂‧6H₂O 0.4μg與Na₂MoO₄‧2H₂O 0.25μg，隨後將其體積補水至100mL後進行高壓滅菌。

2 藻樣採集、分離與培養

將台灣花蓮富里的有機稻田之水樣品與土壤樣品均勻混合後，取約10mL置於50mL的離心管中，加入約30mL C培養基，於25℃照光培養。培養期間以顯微鏡觀察是否有藻體生長，之後取出適量含藻體之培養液，將其轉至平板培養基，於25℃照光培養。待藻體生長後取單一藻種將其於平板培養基中塗開，以上步驟需重覆至篩到單一藻體為止。平板培養則取單一藻落塗至C培養基平板上，於25℃照光培養。

3. 油脂染色分析

將培養好的藻體取20μL與1μL Nile Red(於二甲基亞碸中0.1 mg/mL)混合以進行油滴染色，染色後於室溫靜置5分鐘，再利用螢光顯微鏡進行觀察。(Chen,W.et al.,A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae.,Journal of Microbiological Methods,2009,77：41-47及Huang,G.H.,et al.,Rapid screening method for lipid production in alga based on Nile red fluorescence.,Biomass and bioenergy,2009,33：1386-1392)。

4. 藻種之分子鑑定

4.1 藻體基因體(genomic)DNA之抽取

自平板刮取下新鮮培養的藻體，將其收集在2mL微量離心管中，依照ZYMO RESEARCH的ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep^TM kit說明書操作取得基因體DNA，並以NanoDrop(ND-1000分光光度計)檢測DNA之濃度。

4.2 PCR增幅

將藻體基因體DNA作為PCR模板，以18S rRNA與ITS區域(包含18S核糖體RNA的後端、內轉錄間隔區1、5.8S核糖體RNA、內轉錄間隔區2與28S核糖體RNA的前端等序列)的相關引子組(http：//biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm)來增幅其基因片段。PCR反應溶液如下：適量的基因體DNA溶液作為PCR模板、10mM dNTP 8μL、10X PCR緩衝液10μL、5'端引子與3'端引子各10 pmole及Taq酵素5U。PCR反應條件為95℃，3分鐘；(95℃，30秒、50℃，30秒、72℃，2分鐘30秒)共30次循環；72℃，10分鐘；最後保持在4℃。取5μL產物進行電泳跑膠分析。

4.3 定序分析

將PCR產物純化後以適當引子(http：//biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm)進行定序，將序列結果以Vector NTI Suite 10軟體(VNTI)與NCBI/Blastn進行序列重組與序列相似性比對分析。 另，分別將定序所得的結果經NCBI/Blastn後所得相近的藻株還有藻屬，以及數個藻種中心較接近的藻株及藻屬列為比較範圍，以MEGA 6.0做比對，接著利用最大似然估計(Maximum Likelihood)以GTR+G+I的方式繪製演化樹，Bootstrap則為100次。

5. 藻體分析

5.1 藻體含油量分析

C71藻株以800mL C培養基培養於1L血清瓶中，並通入無菌空氣，於30℃照光培養一個月。收集藻體後將其冷凍乾燥成藻粉，秤取定量之藻粉，萃取其油脂。油脂萃取方法參考修飾Folch等人的方法(Folch,J.et al.,A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissue.,The Journal of biological Chemistry,1957,23：497-509)來進行，其過程為取30mg冷凍乾燥的藻粉(A值)至2mL微量離心管，加入約2.0mL氯仿/甲醇(v：v=2：1)與適量大顆玻璃珠，以撞擊式細胞破碎儀(Retsch® MM400)振盪約5分鐘，重複兩次。以10,000rpm離心5分鐘後，取上清液到拋棄式15mL離心管中，隨即於2mL微量離心管內加入約2.0mL氯仿/甲醇(v：v=2：1)，再以超音波振盪與離心，取上清液到拋棄式15mL離心管中，直到萃取液無色為止。於裝有萃取液的15mL離心管中加入等體積的145mM NaCl溶液後，以試管旋轉混合器混和均勻後，經4,500rpm離心10分鐘，以玻璃吸管取下層液體到已秤重的玻璃瓶(B值)中。將此玻璃瓶內液體隔夜風乾再秤重(C值)，計算藻乾含油量的百分比(D值)。藻乾含油量計算公式：

5.2 油脂組成分析

將抽取的藻油樣品以HPLC分析其油脂組成，HPLC分析條 件：分離管柱為德國Merck公司製造之Silica gel(4.6mm id×250mm，顆粒大小5μm)；沖提溶劑A為己烷；沖提溶劑B為己烷/乙酸乙酯/異丙醇(80：10：10(v/v))，在0分鐘溶劑A/B為98：2(v/v)，在8分鐘線性增加至溶劑A/B為50：50(v/v)，在8.5分鐘線性增加至溶劑A/B為2：98(v/v)，15分鐘維持相同梯度，20分鐘線性減少至溶劑A/B為98：2(v/v)；流速：1.2mL/min；蒸發光散射檢測器(Evaporative Light Scattering Detector；ELSD)條件：氣體流量2.6L/min；蒸發器溫度為40℃(詹國靖等人，以甘油與植物油利用脂解酶之轉酯化反應生產1,3-雙醯甘油。台灣農業化學與食品科學，2010，45：19-25)。

5.3 脂肪酸圖譜分析

刮取適量乾燥藻體置於玻璃試管中，加入1mL溶液I(NaOH 45g、甲醇150mL及ddH₂O 150mL)，震散藻體。於100℃加熱5分鐘，再將所有藻體震散，繼續加熱25分鐘。加入2mL溶液II(6N HCl 325mL及甲醇200mL)，於80℃加熱10分鐘，完成後迅速冷卻。加入1.25mL溶液III(己烷200mL、三級丁基甲基醚200mL)，緩慢混合10分鐘，以玻璃吸管尖吸取下層液體並丟棄。將上層液體加入3mL溶液IV(NaOH 10.8g及ddH₂O 900mL)，混合5分鐘後，吸取上層液體以GC/MS(HP 5973 GC/MS System)分析其脂肪酸含量。GC/MS分析方法參考2007年Valencia,I.等人的方法(Valencia,I.et al.,Development of dry fermented sausages rich in docosahexaenoic acid with oil from the microalgae Schizochytrium sp.：Influence on nutritional properties,sensorial quality and oxidation stability.,Food Chemistry,2007,104：1087-1096)，GC/Mass分析條件為：毛細管管柱：SP-2560，75m x 0.18mm I.D.，0.14μm；注入口温度：250℃；離子源温度：250℃；管 柱烘箱溫度：起始溫度140℃，保持5分鐘後以4℃/min之昇温速率昇温至240℃，保持2分鐘；載送氣體：He；管柱流量：40cm/sec；待分析樣品注射體積：1μL；分流比：1/100；脂肪酸標準品：37-Component FAME Mix(Cat.18919-1AMP,Sigma-Aldrich)。設定好條件後，先分析標準品確認圖譜正確後再進行樣品分析。分析完成之結果整理在表格中以方便比對。

6. 藻種培養特性分析

6.1 培養溫度

藻體均勻塗佈於C培養基平板上，放入含10%(v/v)二氧化碳之密封袋中，以20℃、30℃與40℃進行照光培養，之後於培養第1天及第14天觀察藻體生長情形。

6.2 培養鹽度

以C培養基作為基礎，分別製作含有0%(w/w)、1.5%(w/w)及3%(w/w)之鹽度的培養基。作法為添加海水素(佳欣，台灣)至C培養基中，並充分溶解後，以鹽度計(ATAGO CO.,LTD，MASTER-S/Millα，日本)量測鹽度，培養基再以高溫高壓滅菌後製成平板。將藻種均勻塗佈於各鹽度平板培養基上，以30℃進行照光培養，於培養第1天及第14天觀察藻體生長情形。

6.3 培養pH值

以C培養基作為基礎，分別製作pH4、pH7及pH9之培養基。作法為以HCl調整至pH4，以NaOH調整至pH9，培養基以高溫高壓滅菌後製作平板。將藻種均勻塗佈於不同pH值之平板培養基上，以30℃進行照光培養，於培養第1天及第14天觀察藻體生長情形。

6.4 固碳效率測定

C71藻株於二氧化碳固碳篩選平台上，以體積為1L之C培養 基(KNO₃之總添加量為20mg，使其含氮量為原培養基之2倍)，在30℃全日照光條件下進行監測。固碳篩選平台以通氣量為0.1vvm持續通入5%(v/v)二氧化碳至潛力藻株藻液中，再利用二氧化碳自動監測系統持續監測進流及出流之二氧化碳濃度(濃度單位為%，1%=10,000ppm)，經由氣體濃度轉換公式之計算將二氧化碳濃度單位轉換為毫克/立方米，計算每日固定二氧化碳毫克數(Ya-jun H.,Brief Discussion on Conversion Coefficient between the Concentration Units ppm and mg/m³ of Nitrogen Oxides(NO_X).,Sichuan Environment,2010,29(1)：24-46)。

二氧化碳氣體濃度轉換之計算公式：

分子量(二氧化碳)：44.01

i：測定溫度(30℃)

固碳效率計算公式：R=(C_in-C_out)×V×Q×T

R：每日固定毫克數(mg)

V：柵藻培養體積(m³)

Q：氣體通氣量(vvm，volume per volume per minute)

T：每日通氣時間(min)

C_in：二氧化碳進流濃度(mg/m³)

C_out：二氧化碳出流濃度(mg/m³)

6.5 二氧化碳濃度

將C71藻株之藻液添加至1L含C培養基的培養瓶中，再以0.1vvm之條件，分別通入空氣(0.04%(v/v)二氧化碳)及5%(v/v)二氧 化碳氣體，在30℃下照光培養，比較在不同二氧化碳濃度下，藻體乾重變化及藻株生長之差異。藻體乾重之量測：取定量之藻液，以乾燥後已秤重之0.45μm之硝酸纖維濾紙進行抽氣過濾後，以10mL之去離子水洗去藻體殘留之鹽類，再以80℃烘乾藻體及濾紙5小時，置於乾燥箱中回溫，待回復至室溫後秤重，扣除濾紙重量後記錄藻體乾重(DW)，記錄後可計算生物質產率及藻體產量。

DW_F：培養後藻體乾重

DW_I：培養前藻體乾重

實例一、藻株鑑定

於台灣花蓮富里的有機稻田土壤與水樣樣品中，分離純化得到藻株C71。以1,000X顯微鏡觀察，此藻株以非群聚之單一藻體存在，细胞為圓球狀，直徑約為4~7μm(圖1A)，經Nile Red染色後，以螢光顯微鏡觀察到藻體內部有大量明顯且呈現橘黃色之油滴分佈，顯示其藻體內可以蓄積油滴(圖1B)。

將C71藻株的ITS序列(SEQ ID NO：1)和NCBI的nr資料庫比對後，發現與3株藻株Desmodesmus sp.AKS-13(Accession no.KF537774)、Desmodesmus sp.GM4j(Accession no.AB917137)及Desmodesmus sp.GM4c(Accession no.AB917130)具有高達99%以上之覆蓋率(coverage)及相似度，顯示C71藻株屬於Desmodesmus屬。進一步分析C71藻株之18S rDNA序列(SEQ ID NO：2)，並與Desmodesmus sp.GM4j或Desmodesmus sp.GM4c進行比對，發現僅具有84%的覆蓋率，其中僅1,043bp與前述兩種藻株具有99%之相似度，其餘相似度最高為91%。由於Desmodesmus sp.GM4j或Desmodesmus sp.GM4c的18S rDNA序列分別各含有2個內含子(intron)，其序列與相對應的C71藻株18S rDNA序列不同，故上述比對結果顯示C71藻株與Desmodesmus sp.GM4j及Desmodesmus sp.GM4c為不同的藻種。

進一步以18S rDNA及ITS全長序列分析C71藻株與其它藻種之親源關係，結果顯示C71藻株之18S rDNA及ITS全長序列與Desmodesmus sp.GM4j及Desmodesmus sp.GM4c等藻種最為接近(圖2)。由於C71藻株之形態與Desmodesmus sp.GM4j相似(Hoshina R.,DNA analyses of a private collection of microbial green algae contribute to a better understanding of microbial diversity.,BMC research notes,2014,7：592)，因此綜合其形態與分子鑑定之結果，C71藻株應屬於Desmodesmus sp.，且極可能為一新種，故命名為Desmodesmus sp.C71。

Desmodesmus sp.C71已於2016年4月18日寄存於財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，其寄存編號為BCRC980039；且其亦於2016年3月28日寄存於中國典型培養物保藏中心，其寄存編號為CCTCC M 2016153。

實例二、C71藻株之油脂組成分析

將C71藻株以800mL C培養基培養於1L血清瓶中，並通入無菌空氣，於30℃照光培養一個月。收集藻體後將其冷凍乾燥成藻粉，秤取定量之藻粉萃取其油脂，發現其油脂含量佔藻體乾重的45%(w/w)，分析其油脂成分及含量，結果如下表一及表二所示。

表一之結果顯示，C71藻體中所含之油脂組成包含三酸甘油酯(TG)87.19%(w/w)、脂肪酸(FA)9.96%(w/w)、1,2-雙醯基甘油酯(1,2- DAG)1.37%(w/w)及單醯基甘油酯(MAG)1.23%(w/w)，其中並未檢測到含有1,3-雙醯基甘油酯(1,3-DAG)。表二之結果顯示，C71藻體中所含脂肪酸的組成，其中C16：0佔16.8%(w/w)、C17：0佔5.4%(w/w)、C18：1佔2.6%(w/w)、C18：2佔40.9%(w/w)及C18：3佔27.9%(w/w)；飽和脂肪酸比例為22.2%(w/w)；單元不飽和脂肪酸比例為2.6%(w/w)；多元不飽和脂肪酸比例為68.8%(w/w)。又其C18：2為ω-6形式，C18：3為ω-3形式，皆是屬於食用油脂中對人體較好之多元不飽和脂肪酸。此外，經計算後，其不飽和程度(Degree of Unsaturation)值為140.2，接近歐盟之生質柴油標準值。上述結果顯示，C71藻株所含的油脂適合作為生質柴油的原料，且所含有的豐富多元不飽和脂肪酸，亦可作為食用油之原料。

實例三、C71藻株培養特性分析 (1)培養溫度測試

將藻體均勻塗佈於C培養基平板上，將平板放入含10%(v/v)二氧化碳之密封袋中，分別以不同溫度(20℃、30℃及40℃)進行照光培養，並於培養第1天與第14天觀察藻體生長情形。結果顯示C71藻株於20℃~40℃之培養溫度下，藻體可持續生長，然而，於40℃之培養條件下，藻體生長情形較差(圖3)。

(2)培養基鹽度測試

將藻體分別均勻塗佈於含有不同鹽度(0%(w/w)、1.5%(w/w)及3%(w/w))之C培養基平板上，並於培養第1天與第14天觀察C71藻株於不同鹽度培養基中之生長狀況。結果顯示C71藻株在鹽度0%(w/w)之C培養基中，其生長速率較在鹽度1.5%(w/w)之培養基中快，而在鹽度3%(w/w)之培養基中並未觀察到有藻體生長的情形(圖4)。根據上述結果顯示，C71藻株適合生長在鹽度為0%(w/w)之環境中，雖耐受於鹽度1.5%(w/w)之培養環境，但其藻體生長速度較為緩慢。

(3)培養基pH值測試

將藻體分別均勻塗佈於含有不同pH值(pH4、pH7及pH9)之C培養基平板上，並於培養第1天與第14天觀察C71藻株於不同pH值培養基中之生長狀況。結果顯示C71藻株在pH7及pH9之培養基中生長情況良好，但在pH4之培養基中則未觀察到有藻體生長的情形(圖5)。根據上述結果，C71藻株適合生長在約pH7至約pH9之環境中。

(4)固碳效率測試

在30℃全日照光條件下，將C71藻株培養於1L C培養基(KNO₃總添加量為20mg，使其含氮量為原培養基之2倍：)中，並持續通入通氣量為0.1vvm之5%(v/v)二氧化碳氣體，定時收取藻液及監測進流及出流之二氧化碳濃度(濃度單位為%，1%=10,000ppm)。藻體經測定得其重量後，帶入公式計算得到C71藻株之固碳效率為283.1±48.8mg/L/d。

(5)不同二氧化碳濃度對藻體生長的影響

將C71藻株之藻液添加至1L含C培養基的培養瓶中，再以0.1vvm之條件，分別通入空氣(0.04%(v/v)二氧化碳)及5%(v/v)二氧化碳氣體，在30℃下照光培養，並測量在不同二氧化碳濃度下之藻體乾重及生長情況。結果顯示培養於5%(v/v)二氧化碳中之C71藻株其藻體乾重在第7天達到1,313mg/L，為培養於空氣中之C71藻株第12天所達最高藻體乾重(411mg/L)的3.2倍(圖6)。此外，培養於5%(v/v)二氧化碳中之C71藻株在第7天之生物質產率可達176.19mg/L/d，而培養於空氣中之C71藻株則於第9天達到最高生物質產率63.80mg/L/d(圖7)。故相較於以空氣培養，C71之藻液以5%(v/v)二氧化碳通氣培養可顯著增加其生物質產率達2.8倍，且亦可縮短其培養時間。

結論

本發明首先發現經初步鑑定為Desmodesmus sp.之新穎柵藻分離 株C71。此藻株可生長在溫度約20℃至約40℃、鹽度0%(w/w)至約1.5%(w/w)及約pH7至約pH9之環境中，惟，在鹽度1.5%(w/w)或溫度40℃之環境下生長速度較為緩慢。其次，在空氣培養條件下，其C71藻體含油量佔藻體乾重的45%(w/w)；油脂的脂肪酸組成以C16~C18脂肪酸為主，佔總組成的88.2%(w/w)，其中C18：2(ω-6)及C18：3(ω-3)分別佔40.9%(w/w)及27.9%(w/w)；脂肪酸DU值為140.2；固碳效率為283.1±48.8mg/L/d。進一步發現，相較於以空氣培養，C71藻株在5%(v/v)二氧化碳之培養條件下，生長速度較快，且可產生較高的生物質產率。以上結果顯示，C71藻株(Desmodesmus sp.)可作為生產生質柴油與食用油之原料，亦可作為固碳之用，以減少二氧化碳之排放濃度。

<110> 財團法人食品工業發展研究所

<120> 柵藻(DESMODESMUS SP.)及其在合成油脂及生質燃料上之應用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 571

<212> DNA

<213> 柵藻

<220>

<221> ITS

<222> (1)..(571)

<400> 1

<210> 2

<211> 2969

<212> DNA

<213> 柵藻

<220>

<221> 18S rDNA

<222> (1)..(2969)

<400> 2

Claims (14)

1. 一種柵藻分離株(Desmodesmus sp.)，其為寄存於財團法人食品工業發展研究所且寄存編號為BCRC980039之藻株。
2. 一種製備柵藻培養產物之方法，其包含將如請求項1之柵藻分離株接種於pH值為約6至約10之液態培養基中，且在溫度為約15℃至約40℃、照光及以通氣導入含有二氧化碳濃度為約0.04%(v/v)至約20%(v/v)之空氣下進行培養以獲得該培養產物。
3. 如請求項2之方法，其中該pH值為約7至約9。
4. 如請求項2之方法，其中該溫度為約20℃至約30℃。
5. 如請求項2之方法，其中該二氧化碳濃度為約5%(v/v)至約10%(v/v)。
6. 如請求項2之方法，其進一步包含分離該培養產物的步驟。
7. 如請求項2至5中任一項之方法，其可用於固定二氧化碳。
8. 一種柵藻培養產物，其可由請求項2至6中任一項之方法來獲得。
9. 如請求項8之柵藻培養產物，其可用於製備生質柴油。
10. 如請求項8之柵藻培養產物，其可用於製備食用油。
11. 一種製備三酸甘油酯及/或脂肪酸之方法，其包含自如請求項8之柵藻培養產物中分離出三酸甘油酯及/或脂肪酸。
12. 如請求項11之方法，其中該三酸甘油酯所含有之3個脂肪酸具有完全相同、部份相同或完全相異之碳數及不飽和鍵。
13. 如請求項11或12之方法，其中該脂肪酸具有8至30個碳原子及0至6個不飽和鍵。
14. 如請求項13之方法，其中該脂肪酸具有16至18個碳原子及0至3個不飽和鍵。