KR101176560B1

KR101176560B1 - 로더박터 속 광합성 세균을 이용한 바이오오일 생산 방법

Info

Publication number: KR101176560B1
Application number: KR1020120035055A
Authority: KR
Inventors: 김미선; 김동훈
Original assignee: 한국에너지기술연구원
Priority date: 2012-04-04
Filing date: 2012-04-04
Publication date: 2012-08-23

Abstract

본원은 로도박터 스페로이즈 를 이용한 바이오오일 생산방법에 관한 것으로, 탄소원으로서, 아세트산, 부티르산, 락트산, 말레산 또는 숙신산 중 하나 이상; 및 질소원으로 암모늄 설페이트를 포함하는 배지에서 로도박터 스페로이즈 를 접종하는 단계; 및 상기 배양물을 광합성이 가능한 조건에서 준호기 또는 혐기 상태에서 배양하는 단계를 포함한다. 본원의 방법은 바이오오일 생산에 최적화된 조건을 제공하여, 로도박터 스페로이즈 의 지방산 함량의 증가는 물론 생산된 지방산 구성에서 있어서도 바이오디젤의 생산에 적합한 양질의 바이오오일 생산을 가능하게 한다.

Description

로더박터 속 광합성 세균을 이용한 바이오오일 생산 방법 {Method for producing bio-oil using photosyntheic bacteria belonging to the genus Rhodobacter}

본원은 바이오오일 제조기술에 관한 것으로 구체적으로 로더박터 속의 광합성세균을 이용한 바이오오일 제조 방법에 관한 것이다.

세계적으로 화석연료 과다 사용으로 인한 에너지 고갈 및 지구온난화 문제를 해결하기 위해서 환경적, 경제적으로 지속 가능한 신 재생에너지 개발에 관심이 집중되고 있다. 바이오오일은 식물 및 미생물에서 유래하며 적절한 공정(esterification using acid/alkali catalyst)을 거쳐 바이오디젤로 전환되어 수송용으로 사용될 수 있는 바이오에너지이며, 저장과 운송이 용이하며, 환경 친화적인 에너지원으로 주목받고 있다 (Rittmann, B. E. (2008) Opportunities for renewable bioenergy using microorganisms. Biotechnol. Bioeng. 100: 203-212; Park, H. J. et al (2009) Research and development trends on bio-oil upgrading via catalytic vapor cracking. J. Korea Ind. Eng. Chem. 20: 1-8; 및 Shay E. G. (1993) Diesel fuel vegetable oil: status and opportunities. Biomass Bioenerg. 4: 227-242).

바이오오일 생산에 대한 연구는 원료물질, 생산기술을 중심으로 많이 이루어져왔는데, 원료물질로서 식물자원은 성장 속도가 늦고 지리적 영향을 받으며 대규모 생산을 위해 많은 재배면적이 필요하고 또한 식량 자원 문제를 지니고 있다 [Chisti, Y. (2007) Biodiesel from microalgae. Biotechnol . Adv . 25: 294-306]. 반면, 지방을 함유하고 있는 미생물, 즉 미세조류, 효모, 곰팡이, 세균 등은 식물자원과 달리 기후 및 지형에 따른 제약이 없고 성장속도가 빨라서 적합한 생산기술을 적용한다면 오일 생산속도를 높일 수 있다.

또한 표준화된 배양 공정을 통해 바이오오일 생산 규모 대형화가 용이하다는 장점이 있다. 일반적으로 바이오오일 생산을 위해 많이 연구된 미세조류는 식물자원에 비해 성장 속도가 빠르고 오일 함량이 높지만, 세균에 비해 넓은 재배면적과 긴 발효시간을 요구한다. 광합성세균의 하나인 퍼플박테리아는 미세조류와 달리 지방을 축적하는 세포 내 기관은 없지만 광합성 세포막에 존재하는 인지질이 균체 중량의 약 30% 이상을 차지하고 있다고 보고되었다 (Carlozzi, P. et al.,(2010) Production of bio-fuels (hydrogen and lipids) through a photofermentation process. Bioresour. Technol . 101: 3115-3120).

Wood (Wood, B.J.B. et al.,(1965) The lipids and fatty acid metabolism of photosynthetic bacteria. Biochim. Biophys. Acta 106: 261-273) 는 다양한 광합성세균이 구성하는 주요 인지질과 광/혐기와 암/호기조건에서 균을 키웠을 때 구성 지방산 비율 변화를 조사하였고, Calozzi [ibid]는 광합성세균 Rhodopseudomonas palustris의 지방 함량을 보고하였다.

그러나 아직까지 광합성세균의 지방 함량이나 성장 조건 조절에 따른 지방의 정량적 분석과 관련되서는 개시된 바 없다. 또한 바이오오일의 대량 생산을 통한 바이오 디젤과 같은 수송 바이오에너지의 생산에 세균을 사용하기 위해서는 빠른 생장과 높은 지질 생산량 및 오일의 구성이 중요하나, 이에 관한 연구는 없는 실정이다.

본원은 상기 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 광합성세균, 특히 로도박터 스페로이즈를 이용하여 균체 성장 및 지질 생산량을 최적화하여 바이오오일 생산을 극대화하고자 한다.

본원은 탄소원으로서, 아세트산, 부티르산, 락트산, 말레산 또는 숙신산 중 하나 이상; 및 질소원으로 암모늄 설페이트를 포함하는 배지에서 로도박터 속 균주, 예를 들면 로도박터 스페로이즈를 접종하는 단계; 및 상기 배양물을 광합성이 가능한 조건에서 준호기 또는 혐기 상태에서 배양하는 단계를 포함하는 로도박터 속 미생물을 이용한 바이오오일 생산방법을 제공한다.

본원은 또한 상기 로도박터 스페로이즈는 로도박터 스페로이즈 KD131 KCTC 12085인, 바이오오일 생산 방법을 제공한다.

본원은 또한 상기 탄소원은 숙신산인, 바이오오일 생산방법을 제공한다.

본원은 또한 상기 광합성이 가능한 조건은 50 내지 600W/m²이고, 준호기 조건에서 수행되고, 상기 배양은 약 섭씨 30도에서 최대 성장 시점까지 배양되는 것인, 바이오오일 생산방법을 제공한다.

본원은 또한 상기 최대 성장 시점은 배양 개시 후 최소 24시간, 특히 약 18 내지 24시간 동안 수행되는 것인, 바이오오일 생산방법을 제공한다.

본원은 또한 본원의 방법에 따라 생산된 바이오오일을 제공한다.

본원은 또한 상기 바이오오일은 주 지방산으로 박신산 (C18:1), 스테아르산(C18) 및 팔미트산 (C16)을 포함하는, 바이오오일을 제공한다.

본원은 또한 본원의 방법에 의해 제조된 바이오 오일을 사용하여 생산된 바이오디젤을 제공한다.

본원의 로도박터 스페로이즈 KD131을 사용한 바이오오일 생산방법은 바이오오일의 생산에 최적화된 조건을 제공하며, 광합성 (54 W/m²) 조건에서, 준호기 조건으로 24시간 동안 배양했을 때, 배양 초기 (0시간)에 비해 건조 균체량 3배, 건조 균체당 지방산 함량 최대 약 1.5배, 배양액 부피당 지방산 함량 최대 약 3.5배 증가하였다. 또한 오일구성에 있어서도, 바이오디젤의 생산에 최적의 지방산 구성을 나타내었다.

도 1은 로도박터 스페로이즈 KD131을 숙신산과 (NH₄)₂SO₄(암모늄설페이트)를 각각 탄소원과 질소원으로 사용한 광합성 혐기배양 조건에서 배양시간에 따른 균체 성장 및 지방산 축적 변화를 나타낸 그래프이다.
도 2는 빛의 강도에 따른 로도박터 스페로이즈 KD131 지방산 축적에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 3a는 빛의 유무 및 호기 조건에 따른 로도박터 스페로이즈 KD131 균체 성장 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3b는 빛의 유무 및 호기 조건에 따른 로도박터 스페로이즈 KD131 지방산 축적 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4는 빛/혐기와 빛/준호기에서 배양시간에 따른 지방산 축적 변화를 나타낸 그래프이다.

한 양태에서 본원은 로도박터 속 미생물, 특히 로도박터 스페로이즈 (Rhodobacter sphaeroides )를 사용한 바이오오일의 생산방법에 관한 것이다.

본원의 방법은 탄소원으로서, 아세트산, 부티르산, 락트산, 말레산 또는 숙신산 중 하나 이상; 및 질소원으로 암모늄 설페이트를 포함하는 배지에서 로도박터 스페로이즈를 접종하는 단계; 및 상기 배양물을 광합성이 가능한 조건에서 준호기 또는 혐기 상태에서 배양하는 단계를 포함한다.

바이오에너지란 바이오매스를 활용하여 생성되는 에너지를 의미하며, 그 변환시스템에 따라 바이오에탄올, 바이오디젤, 바이오오일, 바이오가스, 바이오수소 등으로 분류된다. 이 중 바이오오일은 친환경적 수송 에너지인 바이오디젤의 원료가 되는 것으로 그 경세성과 에너지 효율 측면에서 성장 가능성이 높다.

본원의 바이오오일은 광합성 균주, 특히 홍색비유황세균 (purple non-sulfur bacteria)에 속하는 로도박터 스페로이즈 이용하여 생산된다. 로도박터 스페로이즈는 공기 중 이산화탄소를 고정할 수 있을 뿐만 아니라, 광합성조건에서 유기성 폐기물로부터의 배양이 가능하기 때문에 환경처리와 에너지 생산기술 등 산업적으로 이용이 가능하다. 또한, 미세조류나 다른 광합성 세균에 비하여 성장속도가 빠르며 배양이 용이하고 유전자 조작을 통해 배양액 중으로 오일 분비를 유도할 수 있다. 로도박터 스페로이즈 세포막의 주요 인지질은 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜콜린 및 설포리피드로 알려져 있으며, 주로 지방산 팔미트산 (palmitate) (C16), 팔미톨레산 (palmitoleate) (C16:1), 스테아르산(stearate)(C18), 박신산(vaccinate)(C18:1)으로 구성되어있다.

본원에서는 특히 국내 토착환경에서 분리한 로도박터 스페로이즈 KD131을 이용한 최적의 바이오오일 생산 방법을 제공한다. 상기 균주는 본 참조에 의해 본원에 그 내용이 포함되는 대한민국 등록특허 제0680624호에 기재되어 있다. 최적이란, 탄소원, 배양시간, 빛 세기 조절을 통해 균체 성장을 최대화할 수 있는 조건, 빛 세기, 산소 조절에 따른 균주의 양질의 최대 지방산 축적을 위한 최적 배양조건 수립하는 것이다.

일정 배지에서 단위 시간, 배지의 부피에서 최대의 균체 성장은 물론, 균체에 포함된 지방산의 함량을 최대로 할 수 있는 조건을 확립하는 것이 대량 바이오오일 생산 및 이를 이용한 바이오디젤의 생산에 중요하다. 본원에서 사용한 탄소원으로는 아세트산, 부티르산, 락트산, 말레산 또는 숙신산 중 하나 이상이 사용될 수 있으나, 그 이외의 것을 제한하는 것은 아니다. 한 구현예에서는 숙신산이 사용된다. 본원의 사용되는 탄소원의 농도는 질소원의 농도에 따라 달라진다. 본원의 한 구현예에서는 숙신산이 사용되며, 질소원의 농도에 따라 약 20 내지 70mM의 농도로 사용되며, 특히 약 30mM가 사용된다. 예를 들면 질소원으로 암모늄설페이트를 약 4mM로 고정할 때 약 30-60mM 숙신산이 사용될 수 있다. 한 구현 예에서 아세트산은 질소원의 농도에 따라 약 30 내지 120mM로 사용되며, 특히 약 60mM로 사용된다. 다른 구현예에서는 락트산, 말레산이 사용되며 질소원의 농도에 따라 약 20 내지 70mM로 사용되며, 특히 각 약 30mM로 사용된다.

본 발명에 사용되는 로도박터 스페로이즈는 광합성 조건에서 배양되며, 광합성이 가능한 조건이란, 광합성이 일어날 수 있는 빛이 있는 조건을 의미한다. 빛의 강도는 광합성세균의 균체 성장보다는 지방산 축적량 및 인지질의 구성에 영향을 주는 것으로 나타났으며, 빛의 조사량에 따라 지질을 포함하고 있는 세포막 합성이 영향을 받는 것으로 판단된다. 광도의 세기가 예를 들면 약 50 내지 600W/m²이다. 한 구현예에서는 약 50 내지 100W/m²이다. 다른 구현예에서는 약 54W/m²이다.

로도박터 스페로이즈는 일반적으로 혐기, 호기 또는 준호기 조건에서 배양될 수 있다. 본원의 로도박터 스페로이즈를 사용한 바이오오일의 생산방법에서, 빛/호기 조건에서는 산소 분압이 높아 로도박터 스페로이즈가 광합성을 하지 못해 균체 성장이 억제되며, 빛/준호기에서는 산소 분압이 광기구 형성에 저해를 주지 않을 만큼 낮아서 균체 성장이 활발하게 이루어진다. 또한, 광합성조건에서 산소의 공급 양에 따라 배양액 내의 산소 분압에 영향을 주어서 과다한 산소의 공급은 균체 성장뿐만 아니라 지방산 축적에도 영향을 줄 수 있다. 하지만 낮은 분압으로 존재하는 산소는 로도박터 스페로이즈 KD131의 균체 성장 및 지방산 함량에 부정적인 영향을 끼치지 않는다. 본원의 한 구현예에서는 배양액 중에 축적된 지방산 함량은 지방산을 배양액 부피 기준으로 환산하였을 때, 빛/혐기와 빛/준호기 조건에서 각각 486, 476 mg FA/L-broth으로 다른 배양조건과 비교하여 2.0-3.4 배 높게 나타났다. 다른 구현예에서는 빛/혐기, 빛/준호기, 암/혐기, 암/준호기, 빛/호기 배양조건에서 지방산을 분석한 결과 각각 310, 293, 266, 196, 255 mg FA(fatty acid) /g dcw(dry cell weight)로 빛/혐기에서 지방산 함량이 가장 높았지만 빛/준호기와 큰 차이를 보이지 않았다. 따라서 본원의 한 구현예에서는 빛/혐기, 빛/준호기 또는 빛/호기 조건이 사용된다. 배양온도는 로도박터 스페로이즈 배양에 최적의 온도를 사용할 수 있으며, 예를 들면 섭씨 30도에서 배양될 수 있다.

본원 방법에 사용되는 로도박터 스페로이즈의 배양시간은 균체의 성장 및/또는 지방산 축적을 최대화 할 수 있는 조건으로 조절된다. 균체의 성장과 지방산 함량은 적응기 또는 유도기에 해당하는 생장 초기에는 비례하나. 균체의 생장주기가 지수적 증가 주기를 지나 정체기로 진입하면 균체의 생장이 정체됨에 따라 지방산 함량의 변화는 미미하다. 본원의 한 구현예에 따르면 정체기 진입전 또는 정체기 진입시까지 배양되는 것이 바람직하다. 구체적 배양시간은 초기 접종 농도에 따라 달라 질 수 있다. 특히 성장 최대 시점까지 또는 정점을 지나 성장이 정지한 시점까지 배향한다. 한 구현예에서는 초기 접종농도가 흡광도 (약 660nm)에서 1.0인 경우, 약 12시간 내지 약 72시간이 배양된다. 한 구현예에서는 최소 약 24시간 배양된다. 한 구현예에서는 약 18 내지 24시간 동안 배양된다.

다른 양태에서 본원은 또한 본원의 방법에 따라 생산된 바이오오일을 제공한다. 본원의 방법에 따라 생산된 바이오오일은 예를 들면 바이오디젤의 생산에 사용될 수 있다.

바이오오일을 사용한 바이오디젤로 전환하는 공정은 공지된 것으로 예를 들면 촉매를 사용하거나, 산성 촉매 에스테르화 반응을 이용한 공정, 초임계 메탄올을 이용한 공정을 포함한다 (J. Biosci. Biotech. 2001 91-406-416, Renew.Sustain. Energy Rev. 2006, 10:248-268, ACS Symp. Ser 1997;666. 172-208). 본원의 방법에 따라 생산된 지방산은 주성분이 박신산 (C18:1), 스테아르산(C18) 및 팔미트산 (C16)을 포함한다. 구체적으로 C18:1 69-79%, C18 12-16%, C16 8-14%의 구성을 가진다. 바이오디젤은 탄소수 12개-22개인 지방산으로 구성되는 오일이며, 본 균주에서 생산된 지방산은 다량의 C16과 C18:1을 함유하고 있어 바이오디젤 생산에 적합한 양질의 바이오오일을 제공할 수 있다.

이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며 본 발명의 내용을 한정하는 것은 아니다.

실시예 1 균주 배양

국내 토착환경에서 분리된 홍색비유황 광합성세균인 로도박터 스페로이즈 KD131(대한민국 등록특허 제0680624호 참조)를 사용하여 다양한 탄소원, 배양시간 및 빛 세기 조절에 따른 균체 성장을 조사하였다.

기본적 배양조건은 다음과 같다. 배양의 기본배지로는 30 mM 숙신산, 4 mM (NH₄)₂SO₄가 첨가되고 pH가 7.0인 변형된 시스트롬 배지 [Sistrom, W. R. (1960) A requirement for sodium in the growth of Rhodopseudomonas sphaeroides. J. Gen. Microbiol. 22: 778-785] 배지 100 ml (serum bottle, 총 부피 250 ml)를 사용하였고, 초기 균체 농도가 1 (Abs. 660 nm)이 되도록 접종하였다. 고무마개와 알루미늄 캡으로 밀폐한 뒤 알곤 가스로 20분간 치환하여 혐기 상태로 만들어 주었고, 자석교반기를 이용하여 80~100 rpm으로 교반하였다. 광원으로는 할로겐램프를 광학 측정용 피라노미터 센서가 장착된 라이트미터(LI-COR. LI-250A)를 이용하여 108 W/m²으로 조절하였으며, 배양실 온도는 30^oC를 유지하며 배양하였다.

균주 성장에 미치는 탄소원 영향은 시스트롬 배지에 동일 비율의 탄소원/질소원으로 아세트산 60 mM과 부티르산, 락트산, 말레산, 숙신산 각 30 mM을 첨가한 후 48시간 동안 배양하였다. 배양시간에 따른 균체 성장은 배양 72시간 동안 일정 시간 간격으로 균체 농도 (Abs. 660 nm) 측정을 통해 확인하였으며, 빛 세기에 따른 영향은 할로겐램프로 조절 된 54, 108, 162, 216, 500 W/m²에서 24시간 배양 후 균체 성장을 측정하였다.

지방산 축적에 미치는 배양시간 및 빛 세기의 영향은 탄소원과 질소원으로 각각 30 mM 숙신산, 4 mM (NH₄)₂SO₄이고 첨가되고 초기 pH7.0인 시스트롬 배지에 균주를 배양하였으며 배양 조건은 위에서 제시한 바와 동일하다. 또한, 균체의 지방산 축적에 대한 빛과 산소의 영향 실험에서는 light/anaerobic (빛/혐기), light/semi-aerobic (빛/준호기), dark/anaerobic (암/혐기), dark/semi-aerobic (암/준호기), light/aerobic (빛/호기)조건에서, 빛은 할로겐램프 54 W/m²를 제공하거나 알루미늄 호일을 이용하여 차단하였다. 혐기조건은 위에서 설명한 것과 동일하게 알곤 가스를 이용하였으며, 준호기 조건은 멸균된 솜마개를 덮어서 조성하였고, 호기 배양조건은 공기 펌프를 통해 공기를 400 ml/min으로 배양액 중에 공급하였다.

실시예 2 균주로부터 지방산의 추출 및 분석

2-1 지방산 추출

로도박터 스페로이즈 KD131의 지방산 추출은 용매 추출 방법 [Benning, C., and C. R. Somerville (1992) Isolation and genetic complementation of a sulfolipid-deficient mutant of Rhodobacter sphaeroides. J. Bacteriol. 171: 2352-2360]을 사용하였으며, 균 배양 후 원심분리 (8000 rpm, 10 분)하고 균체 펠렛에 클로로포름-메탄올 (2:1, vol/vol)을 첨가하여 2시간 동안 100 rpm으로 섞어주었다. 반응 후 원심 분리하여 지방산이 추출된 클로로포름 층을 취하고 1 M KCl-0.2 M H₃PO₄를 첨가한 후 교반하여 다시 원심분리기를 이용하여 층을 분리하였다. 분리된 층중에서 클로로포름 층은 질소 가스를 이용해 농축하여, 지방을 추출하였고, 추출된 지방산에 참조표준물질 (internal standard)로서 헵타데카노산 (heptadecanoic acid) (C17)을 첨가한 후, 1M methanolic HCl과 79^oC 수조에서 1시간 반응시켜 지방산 메틸 에스테르 (fatty acid methyl ester)(FAME)로 전환시킨 후 가스 크로마토그래피로 분석하였다.

2-2 지방산 분석

지방산 분석은 실시예 2-1의 시료 1㎕를 HP-INNOWAX 모세관 컬럼 (30 m*0.32 mm*0.5μm )이 장착된 가스크로마토그래피 (Agilent 6890A, USA)로 분석하였다. GC injector 온도는 250^oC, 오븐 온도는 250^oC (50^oC 1 min, 15^oC/min 내지 200^oC 9 min, 2^oC/min 내지 250^oC 2 min), flame ionized detector (FID) 온도는 275^oC이고, 캐리어 가스 헬륨의 흐름속도는 2.2 ml/min으로 하였다 [Wang, Z. M., J. S. Lee, J. Y. Park, C. Z. Wu, and Z. H. Yuan (2008) Optimization of biodiesel production from trap grease via acid catalysis. Korean J. Chem. Eng. 25: 670-674].

유기산 분석은 원심 분리한 균체 상등액을 0.2μm 필터로 여과한 후 Aminex HPX-87H (BioRad, USA) 컬럼이 장착된 High Performance Liquid Chromatography (Model VP, Shimadzu, Japan)로 분석하였다. 측정은 UV 검출기를 이용하여 파장 215 nm에 대해 시행되었고, 이동상은 10 mM 황산이 사용되었다. 흐름속도는 0.6 ml/min, 컬럼은 35^oC에서 유지되었다. 균체량은 UV-VIS 분광광도계 (Shimadzu UV-1601, Japan)로 660 nm에서 흡광도 (optical density, O.D.)를 측정하였으며, 건조 균체량은 균체 농도별로 105^oC에서 50분간 건조 후 측정한 정량식으로부터 계산하였다.

실시예 3 균체 성장 최적화

실시예 1에서와 같이 로도박터 스페로이즈 KD131를 배양하여 탄소원, 배양시간 및 빛의 세기를 조절하여 최적의 균체 성장 조건을 결정하였다. 구체적으로, 탄소원으로 아세트산, 부티르산, 락트산, 말레산 및 숙신산과 배양시간, 및 할로겐램프를 이용한 빛 세기를 조절하여 본 광합성세균이 최대로 균체를 생산할 수 있는 조건을 확보하였다.

배양시간 및 빛의 세기는 시스트롬 배지에 탄소원으로 30 mM 숙신산 및 질소원으로 4mM (NH₄)₂SO₄를 첨가하여 측정하였다. 결과는 도 1 및 도 2에 기재되어 있다. 초기 균체 농도를 1 (Abs. 660 nm)로 30^oC에서 할로겐램프를 이용한 빛 세기 108 W/m²와 광합성 혐기조건으로 배양하였을 때, 배양 8-20시간에 지수성장을 보였으며, 약 20-24시간 배양 후 균체 농도가 1.5 g dcw/l으로 최대에 도달하였다. 이 후 배양시간이 경과함에 따라 균체 성장은 더 이상 일어나지 않았다.

빛의 세기에 따른 균체 성장 실험 결과는 도 2에 기재되어 있다. 할로겐램프로 0, 54, 108, 162, 216, 500 W/m²을 조사하였을 때 균체 성장은 빛을 주지 않았을 때를 제외한 나머지 빛 세기에서 큰 차이가 나지 않았다는 이에 따라 향후 실험에서는 빛 세기를 54 W/m²으로 설정하였다.

다양한 탄소원을 이용한 배양 시 최종 pH, 균체 성장, 및 유기산 분해율 결과를 표 1에 제시하였다. 동일한 비율의 탄소원/질소원을 첨가하였을 때, 아세트산, 부티르산, 락트산, 말레산, 숙신산은 균체 성장이 약 배양 48시간 동안 2.1-2.8 g dcw/l이었으나, 락트산, 말레산 및 숙신산은 80% 이상 분해된 반면 아세트산과 부티르산은 각각 49%, 23% 분해되었다. 첨가된 탄소원에 따른 배양 중 분해율의 차이는 여러 가지 요인에 영향을 받는다. 30 mM 숙신산을 첨가하였을 때 초기 pH7.0에서 배양 48시간 후 pH가 8.15로 상승하였고, 반면 아세테이트나 부티르산을 탄소원으로 사용하였을 때는 배양 8시간 후부터 pH가 9.0 이상으로 상승되었다. 이와 같은 현상은 탄소원으로 아세트산이 공급될 때, 로도박터 스페로이즈 에 존재하는 PHB (Poly(3-hydroxybutyrate)) 합성 대사가 활성화되어 세포막의 지방산 합성보다는 세포 내에 PHB가 다량 축적됨을 나타낸다.

[표 1]

상기 표에서 배양은 초기 pH7.0이고, 질소원으로 (NH₄)₂SO₄를 첨가하여, 할로겐램프 108 W/m²을 이용하여 48시간 배양 혐기조건에서 배양하였다.

실시예 4 지방산 분석

4-1 배양시간에 따른 지방산 축적 및 지방산 구성

탄소원과 질소원으로 각각 30 mM 숙신산과 4 mM (NH₄)₂SO₄을 첨가한 시스트롬 배지의 초기 pH를 7.0으로 조절하여 로도박터 스페로이즈 KD131을 초기 균체 농도 1 (흡광도 Abs. 660 nm)로 첨가한 후, 혐기조건으로 30^oC에서 광합성조건 (108 W/m²)에서 배양하였다. 일정한 시간 간격으로 시료를 채취해 배양시간에 따른 지방산 함량을 분석하였다. 배양 중 초기 균체 농도 0.54 g dcw/l는 배양 24시간에 1.6 g dcw/l에 도달하였으며, 그 후에는 서서히 감소하여 배양 72시간까지 1.3 g dcw/l이었다.

균체 내의 지방산 함량도 이와 비례하여 증가하였다. 즉 배양 초기의 균체는 244 mg FA/g dcw을 함유하였지만 배양시간이 경과함에 따라 배양 24시간에는 단위 균체당 지방산 함량이 약 314 mg FA/g dcw까지 증가하였고, 이후 72시간까지는 증가하지 않았다 (도 1). 따라서 배양액 1L의 균체로부터 추출할 수 있는 바이오오일은 배양초기에 154 mg FA/L-broth이었지만, 배양 24시간에는 그 양이 약 2.7배 증가하였으며 지방산의 조성에 변화가 없었고 최대 31% 지방산이 건조 균체에 존재하였다.

로도박터 스페로이즈 KD131의 지방산 분석 결과 C16, C16:1, C18, C18: 1이 나타났고, 주요 지방산은 C18:1 69-79%, C18 12-16%, C16 8-14% 순서인 것으로 나타났다. 바이오디젤은 탄소수 12개-22개인 지방산으로 구성되는 오일이며, 본 균주에서 생산된 지방산의 조성으로 보아 C16과 C18:1을 다량 함유하고 있어, 바이오디젤을 생산할 수 있는 양질의 바이오오일임을 나타내는 것이다.

4-2 빛 세기와 지방산 축적

탄소원과 질소원으로 각각 30 mM 숙신산과 4 mM (NH₄)₂SO₄를 함유하는 시스트롬 배지에서 로도박터 스페로이즈 KD131을 할로겐램프로 조사하면서 광합성 배양하였다. 빛 세기를 (0-500 W/m²)조절하면서 24시간 후에 균체 성장과 지방산 함량을 분석하였다. 이때 배양액의 초기 pH는 7.0으로 조절하였고, 초기 균체 농도는 1 (Abs. 660 nm)이며 배양온도는 30℃로 유지하였다. 할로겐램프로 빛 세기를 0, 54, 108, 162, 216, 500 W/m²로 조절하여 균체 성장과 지방산 축적을 분석한 결과는 도 2와 같다. 배양 24시간에 54, 108 W/m²에서 균체는 1.6 g dcw/l로 증가하였으며, 균체 내 축적된 지방산은 각각 312, 317 mg FA/g dcw이었다. 빛 세기가 높은 162-500 W/m²일 때, 균체 성장은 1.5 g dcw/l 정도로 큰 변화가 없었으나, 균체 내 축적된 지방산 함량은 54 W/m²와 비교하여 15-42% 낮게 나타났다. 이때 본 실험에서 주어진 빛 세기는 광합성세균의 균체 성장에는 큰 영향을 미치지 않았지만 지방산 축적에는 영향을 주어서 빛 조사량이 높아질 때 광합성 세포막 합성에 영향을 받는 것이기 때문이다. 본 실험에서 54 W/m²에서 축적된 지방산의 양이 162 W/m²이상에서보다 더 높았다는 결과는 빛 세기가 낮을 때 세포막을 구성하는 지방이 증가했기 때문이다.

4.3 빛/산소와 지방산 축적

로도박터 스페로이즈 KD131 광합성 배양 중 생산하는 균체의 지방산 축적에 빛과 산소의 영향을 연구하기 위하여 5가지로 배양조건을 나누었다. 즉, 빛을 제공하면서 알곤 가스를 이용하여 배양액 중 산소를 제거한 혐기조건 (빛/혐기), 멸균된 솜마개를 덮은 준호기조건 (빛/준호기) 또는 공기를 공급하여 산소를 제공하는 (빛/호기) 배양조건과 아울러 빛을 제공하지 않는 경우에도 산소를 제공하는 유무에 따라 배양조건을 암/혐기와 암/준호기로 설정하였다.

결과는 도 3에 있다. 도 3(a)에 나타난 바와 같이 빛을 제공했을 때는 로도 박터 스페로이즈 KD131이 광합성작용으로 균체가 자라는 반면, 빛을 제공하지 않았을 때는 광합성을 하지 않아서 균체가 성장하지 않았다. 그러나 빛이 있어도 산소가 지속적으로 공급된 경우에는 세포가 광합성을 하지 않았다. 따라서 로도박터 스페로이즈 KD131은 광합성작용을 하기 위해서 산소와 빛의 영향을 받는 것으로 나타났다. 로도박터 세포막은 호기적 성장 조건에서는 광합성을 하지 않고, 산소 분압이 2.5% 이하로 낮아질 때 세포막이 안쪽으로 만입되어 형성된 세포질내막 (intracytoplasmic membrane,ICM)에서 광합성을 한다고 알려져 있다. 따라서, 본 실험에서 빛/호기는 산소 분압이 높아 로도박터 스페로이즈 KD131이 광합성을 하지 못해 균체 성장이 억제되었고, 빛/준호기에서는 산소 분압이 광기구 형성에 저해를 주지 않을 만큼 낮아서 균체 성장이 활발하게 이루어졌기 때문이다.

암/준호기를 제외한 조건에서 균체는 배양 20-24시간까지 이루어졌으며, 균체 성장 종료 후 빛/혐기, 빛/준호기, 암/혐기, 암/준호기, 빛/호기 배양조건에서 지방산을 분석한 결과 각각 310, 293, 266, 196, 255 mg FA/g dcw로 /빛혐기에서 지방산 함량이 가장 높았지만 빛/준호기와 큰 차이를 보이지 않았다 (도 3(b)). 또한, 광합성조건에서 산소의 공급 양에 따라 배양액 내의 산소 분압에 영향을 주어서 과다한 산소의 공급은 균체 성장뿐만 아니라 지방산 축적에도 영향을 주었다. 배양액 중에 축적된 지방산 함량을 알아보기 위해서 지방산을 배양액 부피 기준으로 환산하였을 때, 빛/혐기와 빛/준호기는 각각 486, 476 mg FA/L-broth으로 다른 조건과 비교하여 2.0-3.4배 높게 나타났다. 빛과 산소 조절은 로도박터 스페로이즈 KD131 지방산 축적에 큰 영향을 미쳤지만, 주요 지방산 구성과 비율은 일정하였다.

조건 빛/혐기와 빛/준호기에서 로도박터 스페로이즈 KD131의 균체 성장과 지수성장기 말 지방산 함량은 큰 차이가 없었다. 따라서 두 조건에서 균 배양시간에 따라 축적된 지방산을 비교한 결과 (도 4), 배양 24시간에 각각 314, 306 mg FA/g dcw으로 높은 지방산 함량을 나타냈다. 이러한 결과로 낮은 분압으로 존재하는 산소는 로도박터 스페로이즈 KD131의 균체 성장 및 지방산 함량에 부정적인 영향을 끼치지 않음을 알 수 있었다.

결과를 요약하면, 로도박터 스페로이즈 KD131는 30 mM 숙신산이 첨가된 시스트롬배지에서 54 W/m²(할로겐램프) 광합성 배양할 때 20-24시간에 균체 성장이 1.5 g dcw/l까지 증가하였다. 이때, 배양 초기의 균체 지방산 함량 (244 mg FA/g dcw)은 배양 24시간에 314 mg FA/g dcw으로 증가하였고, 주요 지방산은 C16, C18, C18:1이었다.

24시간 동안 배양한 로도박터 스페로이즈 KD131은 빛 세기 (0, 54, 108, 162, 216, 500 W/m²)에 따른 균체 성장에는 큰 차이가 없었으나, 지방산 함량은 54 W/m²에서 배양한 균체가 가장 지방산 함량이 높았으며, 빛을 공급한 혐기 또는 준호기 배양조건에서 24시간 배양했을 때 1.5g dcw/l의 균체 성장과 293-310 mg FA/g dcw 지방산 축적이 이루어졌다.

따라서, 로도박터 스페로이즈 KD131을 광합성 (54 W/m²) 준호기 조건으로 24시간 동안 배양했을 때, 배양 초기 (0시간)에 비해 건조 균체량 3배, 건조 균체당 지방산 함량 최대 1.28배, 배양액 부피당 지방산 함량 최대 3.24배 증가하였다.

본 발명은 상술한 실시예로만 한정되는 것이 아니라 본 발명의 요지를 벗어나지 않는 범위내에서 수정 및 변형하여 실시할 수 있고, 그러한 수정 및 변형이 가해진 기술사상 역시 이하의 특허청구범위에 속하는 것으로 보아야 한다.

Claims

로도박터 스페로이즈 를 이용한 바이오오일 생산방법으로,
탄소원으로서, 아세트산, 부티르산, 락트산, 말레산 또는 숙신산 중 하나 이상; 및 질소원으로 암모늄 설페이트를 포함하는 배지에서 로도박터 스페로이즈 를 접종하는 단계; 및
상기 배양물을 빛의 존재하에서 준호기 또는 혐기 상태에서 배양하는 단계를 포함하는 로도박터 스페로이즈 를 이용한 바이오오일 생산방법.
제 1 항에 있어서, 상기 로도박터 스페로이즈는 로도박터 스페로이즈 KD131 KCTC 12085인, 바이오오일 생산 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 탄소원은 숙신산인, 바이오오일 생산방법.
제 1 항에 있어서, 상기 빛의 광도는 50 내지 600W/m²이고, 배양온도는 30℃이며, 상기 균주는 균주 생장주기의 정체기 진입시까지 배양되는 것인, 바이오오일 생산방법.
제 4 항에 있어서, 상기 균주의 정체기 진입시점은 배양 시작 후 18 내지 24시간인, 바이오오일 생산방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따라 생산된 바이오오일.
제 6 항에 있어서, 바이오오일은 주 지방산으로 박신산, 스테아르산 및 팔미트산을 포함하는, 바이오오일.
제 6 항에 따른 바이오 오일을 사용하여 생산된 바이오디젤.